Summary
هنا، فإننا نقدم متجانسة وقت حل الحنق (هترف) كطريقة فعالة للكشف السريع عن الأنسولين يفرز من الخلايا.
Abstract
الكشف عن إفراز الأنسولين ضروري لتوضيح آليات إفراز الخاضعة للتنظيم، وكذلك كما هو الحال في دراسات الأيض. على الرغم من أن العديد من فحوصات الأنسولين كانت موجودة منذ عقود، مبسطة الأخيرة ظهور التكنولوجيا فورستر الرنين الطاقة نقل (هترف) حل الوقت متجانسة إلى حد كبير هذه القياسات. وهذا هو مقايسة ضوئية السريعة والفعالة من حيث التكلفة واستنساخه وقوية تعتمد على الأجسام المضادة مترافق ل fluorophores مشرق مع الانبعاثات طويلة الأمد التي يسهل حلها وقت "فورستر الرنين الطاقة نقل". وعلاوة على ذلك، اكتشاف الأنسولين هترف قابلة لتطوير فحوصات الفرز الفائق. هنا نستخدم هترف للكشف عن إفراز الأنسولين في الخلايا الإضافية-1E، خط خلية المستمدة من insulinoma الفئران. وهذا يسمح لنا تقدير المستويات القاعدية للأنسولين، وهذه التغييرات استجابة للتحفيز الجلوكوز. وبالإضافة إلى ذلك، نحن نستخدم هذا النظام اكتشاف الأنسولين لتأكيد دور الدوبامين كمنظم سلبية لإفراز الأنسولين الجلوكوز-وحفز (نظام خدمات التأمين الحكومية). بطريقة مماثلة أخرى الدوبامين د2-مثل يضع مستقبلات وكوينبيرولي وبروموكريبتين، خفض نظام خدمات التأمين الحكومية بطريقة تعتمد على التركيز. نتائجنا إبراز فائدة تنسيق المقايسة الأنسولين هترف في تحديد دور المخدرات عديدة في نظام خدمات التأمين الحكومية وملفاتهم الدوائي.
Introduction
وقد جرى ضبطه تنظيم استقلاب الطاقة بهرمون الابتنائية رئيسية، الأنسولين. الأنسولين هو توليف وصدر عن خلايا البنكرياس بيتا ردا على مستويات الغلوكوز خارج الخلية زيادة. مشغلات الأنسولين المفرج عنهم امتصاص الجلوكوز من الأنسجة حساسة للأنسولين1،2. الناحية الفسيولوجية، وهذا يرتبط بارتفاع تركيز الجلوكوز بعد تناول وجبة، متبوعاً بإفراز الأنسولين لتنظيم امتصاص الجلوكوز. اضطرابات في التوازن الجلوكوز تؤدي إلى الاعتلالات الأيضية التي توجت بمقاومة الأنسولين، وفي نهاية المطاف في بداية نوع 2 مرض السكري2،،من34.
على الرغم من إفراز الأنسولين وقد درست على نطاق واسع، وآلياتها التنظيمية تظل غير مفهومة. وكان مجالاً حيويا للتحقيق تحديد رواية المغيرون من إفراز الأنسولين من خلايا بيتا5،6،،من78. وتتطلب هذه الدراسات إلى فهم أفضل للعلاقة اقتران بين تنشيط الجلوكوز وإفراز الأنسولين. ولذلك كان من الضروري القدرة على دقة رصد وقياس مستويات إفراز الأنسولين الجلوكوز-وحفز (نظام خدمات التأمين الحكومية). حتى الآن، ومع ذلك، سوى عدد محدود من الأساليب متاحة للسماح للتحديد الكمي لنظام خدمات التأمين الحكومية باستخدام خطوط الخلايا إفراز الأنسولين و/أو جزيرات البنكرياس. واحد هو radioimmunoassay (ريا)، الذي يستخدم الأنسولين معلم النظائر المشعة والأجسام المضادة. وتشمل أوجه القصور الرئيسية في هذا النهج قضايا السلامة بسبب معالجة والتخلص من المواد المشعة. بالإضافة إلى ذلك، هذا الأسلوب ذات العمالة الكثيفة، التي تشمل الغسيل الطويل وحضانة خطوات متعددة. المرتبط بالانزيم المرتبط بالانزيم (ELISA) هو نهج آخر مكلف وكثيفة العمالة التي تستخدم الأجسام المضادة لاكتشاف الأنسولين. التباين في الانتماءات جسم وكفاءة الاعتراف بالانسولين تعمل على الحد من العوامل لهذا الأسلوب، ويمكن أن تؤثر على إمكانية تكرار نتائج نتائج. أليسا ولا ريا صمم لتجارب الفائق. الفاسكرين مقايسة متجانسة المستخدمة لكشف وقياس مستويات إفراز الأنسولين. وتستند التكنولوجيا الفاسكرين تحويل الأكسجين المحيطة إلى دولة القميص الأوكسجين السعادة التي يمكن أن تتفاعل مع الأنواع تشيميلومينيسسينت، أدى إلى توليد تشيميلومينيسسينسي. نظراً للفحص متجانسة، تم القضاء على العديد من الخطوات الغسيل المرتبطة ريا وإليزا. عدم استقرار إشارة نظراً لطبيعة رد الفعل غير عاملاً يحد من التي قد تؤثر قراءات المقايسة. (TR-الكماشة، وضعته هييدوك والزملاء9، نهج متجانس آخر لقياس الأنسولين استناداً إلى ربط اثنين أضداد منفصل لمختلفة [ابيتوبس] في جزيء الأنسولين. الأضداد: هي كل الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل مرتبطة كيميائيا لمزدوجة مع قصيرة متكاملة واحدة الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي يتدلى. يجمع لهم ملزمة من الأجسام المضادة للأنسولين ويؤدي إلى مزدوجة الاتجاه الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل. كل جسم مضاد يرتبط أيضا مع fluorophore المانحة أو يقبلون كل منهما، ورابطة الحمض النووي مزدوج يجمع بين هذه فلوروفوريس لتوليد فورستر الرنين نقل الطاقة (الحنق). ومع ذلك، واحد الحد المحتملة من TR-الكماشة، تقع على عاتق الحنق نفسه. قد يؤدي عدم القدرة على سرعة تبديد fluorescence الخلفية أثناء عملية التفاعل الحنق إلى مستويات عالية نسبيا من الأسفار الخلفية وإشارة منخفضة إلى نسبة الضوضاء داخل المقايسة. ولذلك، لا يزال موجوداً حاجة مقايسة موثوق بها وقوية وفعالة من حيث التكلفة للتحديد الكمي لنظام خدمات التأمين الحكومية بطريقة الفائق.
توجت التقدم الذي أحرز مؤخرا في الفيزياء الحيوية في تطوير متجانسة الأسفار وقت حل الطاقة الرنين نقل (هترف) على أساس المقايسة. على وجه التحديد، بينما نقل الطاقة داخل الإنزيم قد يمكن وصفها بأنها المستندة إلى الحنق، أكثر دقة، هترف يعتمد على التﻷلؤ الطاقة الرنين نقل (بعيد)10 الذي هو غير الإشعاعي نقل الطاقة بين المانحين ويقبلون الأنواع11،،من1213. هذا التمييز مهم، منذ توقيت الأسفار أو تبريد استناداً إلى الحنق التفاعل يختلف كثيرا مما عليه للانتقال، على الرغم من أن يمكن استخدام نفس أنواع النابضة للحنق والانتقال. وعلاوة على ذلك، استخدام التراب النادر لانثانيدات كريبتاتي المركبات مثل اليوروبيوم أو كريبتاتي تيربيوم في هترف تنتج fluorescence طويلة نصف عمر12،14. وهذا يوفر ميزة فريدة من نوعها للأخذ بتأخير زمني (µsec) بين المانحين الإثارة، وقياس الانبعاثات من يقبلون (أي حل وقت الفحص). يسمح هذا التأخير الزمني لوقت كاف للأسفار الخلفية لتبديد قبل قياس يقبلون الانبعاثات الأسفار. ونتيجة لذلك، هو قراءات مجاناً من الأسفار غير محددة، وهكذا، هو تحقيق نسبة الإشارة إلى الضوضاء عالية (الشكل 1). وعلاوة على ذلك، طبيعة متجانسة هترف يلغي الحاجة للغسيل الخطوات يغسل الأنواع غير منضم، مما يجعل المقايسة الكثير أكثر سرعة من أليسا أو الأساليب المستندة إلى ريا.
رقم 1: التخطيطي لآلية لاكتشاف الأنسولين هترف- الأجسام المضادة التي تم إنشاؤها بشكل مستقل اثنين تعترف على وجه التحديد، وربط للأنسولين في مواقع منفصلة. يتم مترافق هذه الأجسام المضادة إلى الجهة المانحة كريبتاتي يوروبيوم أو يقبلون XL665. الإثارة للجهات المانحة في نتائج نانومتر 337 في الانبعاثات في 620 نانومتر. نقل الطاقة الناتجة عن أسباب XL665 تنبعث منها في طول موجي أطول، 665 شمال البحر الأبيض المتوسط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
هنا، نحن نقدم بروتوكول مفصل لاستخدام نهج القائم على هترف لتحديد مستويات نظام خدمات التأمين الحكومية من الخلايا الإضافية-1E، راسخة الأنسولين إفراز المستمدة من خلية بيتا الفئران insulinoma الخلية خط15. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذا التحليل لتحديد التشكيل الجانبي الدوائي من المنظمين الجزيئية لإفراز الأنسولين. نقوم بتطبيق هذا التحليل الأنسولين المستندة إلى هترف لدراسة الدوبامين د2-مثل تنظيم مستقبلات نظام خدمات التأمين الحكومية. وأظهرت الدراسات زيادة أن الدوبامين العصبي منظم هام لنظام خدمات التأمين الحكومية8،،من1617،،من1819،20، 21 , 22-الدوبامين يؤثر على نظام خدمات التأمين الحكومية بطريقة أوتوكريني/باراكريني سلبية عبر إجراءات على الدوبامين د2-مثل مستقبلات (د2، د3، د4 مستقبلات) أعربت في سطح خلايا البنكرياس بيتا8 , 16 , 19-استخدام هذا الفحص، تأكيد دور الدوبامين في كمنظم سلبية لنظام خدمات التأمين الحكومية، وإثبات أن الدوبامين د2-مثل مستقبلات يضع بروموكريبتين وكوينبيرولي أيضا الحد من نظام خدمات التأمين الحكومية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-الوظائف-1E الخلايا: صيانة وطلاء
- الحفاظ على وظائف-1E الخلايا في هوميديفيد 37 ˚C/5% CO2 حاضنة ومثقف مع المتوسط RPMI 1640 تستكمل مع 5% (v/v) إبطال الحرارة الجنين البقري المصل، مم 2 لتر-الجلوتامين، 10 مم حبيس، بيروفات صوديوم 1 مم، 100 يو/مليلتر البنسلين/ستربتوميسين الحل, 50 ميكرومتر β-ميركابتوثانول. ثقافة الخلايا في المتوسط RPMI 1640 كاملة 10 مل (لكل لوحة)، حتى تصل إلى التقاء 80-90%، وعندما يمكن أن تريبسينيزيد وباساجيد أو المستخدمة لفحص إفراز الأنسولين.
- يوم 1: نضح وسائط الإعلام ويغسل خلايا مرة واحدة مع 5 مل من برنامج تلفزيوني المعالجون مسبقاً. إضافة 0.5 مل التربسين (0.025%) المخفف 1:1 في 0.5 مل برنامج تلفزيوني تريبسينيزي الخلايا واحتضان لمدة 3-4 دقائق في 37 ˚C. قم بإلغاء تنشيط التربسين بإضافة 9 مل كامل وسائل الإعلام ونقل الخلايا إلى أنبوب الطرد مركزي 15 مل من بيبيتينج.
- بيليه الخلايا بالطرد المركزي، وإعادة تعليق بيليه الخلية في حوالي 5 مل وسائط جديدة.
- تأخذ 10 ميليلتر من الخلايا إعادة تعليق وتخلط مع 10 ميليلتر تريبان الأزرق صبغ الحيوية للتحقق من صلاحية الخلية. عد الخلايا الحية والميتة في 10 ميليلتر من هذا الخليط باستخدام هيموسيتوميتير. ينبغي أن يكون مستوى صلاحية أكثر من 90 في المائة. تمييع الخلايا إعادة معلقة في وسائط جديدة للخلايا 1 مليون كل مل.
- قبل المغلفة بذور الخلايا الإضافية-1E 0.5 مل كل بئر في بولي-L-يسين لوحة 24-جيدا، وفي كثافة الخلايا 500,000/جيدا.
- يوم 2: قم بإزالة الوسائط ح 18-24 بعد الطلاء وإضافة 500 ميليلتر/بئر جديدة RPMI 1640 الوسائط. احتضان الخلايا لآخر 24 ساعة للسماح للخلايا التعافي تماما من الخطوة السابقة باساجينج. ويسمح هذا الوقت الإضافي الخلايا إلى نشر على لوحة زراعة الأنسجة.
2-الأنسولين إفراز الإنزيم (اليوم الثالث)
- إعداد المخزن المؤقت كربوفانتسي: مم 132.2 كلوريد الصوديوم، 3.6 ملم بوكل، 5 مم ناكو3، 0.5 مم نة2بو40.5 مم مجكل2، كاكل 1.5 مم2والبومين المصل البقري 0.001 غ/مل (BSA)، الرقم الهيدروجيني 7.4.
- نضح وسائل الإعلام من الخلايا ويغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني المعالجون مسبقاً.
- الخطوة المجاعة الجلوكوز، إضافة 450 ميليلتر/بئر كربوفانتسي (التي تحتوي على جيش صرب البوسنة) دون الجلوكوز ح 1 في 37 ˚C/5% CO2.
- أثناء الخطوة المجاعة الجلوكوز، يعد تخفيف المسلسل من drug(s) في كربوفانتسي التي تحتوي على 200 ملم الجلوكوز (تركيز 10 x).
- تعد المخدرات في 10 × التركيز النهائي في كربوفانتسي تستكمل مع الجلوكوز 200 ملم (أيضا 10 × تركيز الجلوكوز الفحص النهائي). إذا كان المخزون المخدرات (بالإضافة إلى 10 وأضاف x الجلوكوز) هو في [دمس]، تأكد من يتم الاحتفاظ بنسبة مئوية [دمس] متسقة في جميع أنحاء المقايسة (النسبة المئوية النهائية من الناحية المثالية لأقل من 0.1% [دمس]).
- لعلاجات الدوبامين وكوينبيرولي، استخدام المخدرات مقايسة الختامية تركيز يتراوح من 100 ميكرومتر إلى 100 م (من أعلى إلى أدنى تركيز)، مع النقطة الأخيرة استجابة الجرعة التي تحتوي على أي دواء. بروموكريبتين، استخدم تركيز تحليل نهائي يتراوح بين 10 ميكرون إلى 10:00 م، مع النقطة الأخيرة استجابة الجرعة يجري التحكم خالية من المخدرات.
- بعد الجلوكوز المجاعة، إضافة تخفيف المسلسل المخدرات للمقايسة لإنتاج استجابة جرعة.
- إضافة 50 ميليلتر/جيدا من كل تمييع المسلسل إلى الآبار المقابلة (مقايسة إجمالي حجم 500 ميليلتر).
- الخطوة الجلوكوز التحفيز، احتضان الخلايا مع تخفيف المخدرات كل منها مسلسل (حضور الجلوكوز 20 ملم) لمدة 90 دقيقة في ˚C/5% 37 شركة2- وتشمل مجموعة من الآبار التحكم: (1) تحفيز مع الجلوكوز 20 مم وحدها في الغياب أي المخدرات الإضافية و (2) الخلايا التي لا تحفز بالمخدرات لا الجلوكوز (الذي يوفر معدل إفراز القاعدية).
- بعد هذه الخطوة التحفيز، بعناية إزالة سوبيرناتانتس (استخدام مباشرة أو مخزن في 4 ˚C).
ملاحظة: خطوة الطرد المركزي لطيف 5 دقائق إضافية (600 x ز، 1 دقيقة) يمكن إدخال في هذه المرحلة لإزالة أي الخلايا المتبقية في supernatants المقايسة.
3-هترف لإفراز الأنسولين التدبير
- تمييع الإنزيم supernatants 01:10 في كربوفانتسي (بدون جيش صرب البوسنة)، يفضل أن يكون ذلك في لوحات واضحة 96-جيدا.
- إعداد المنحنى المعياري الأنسولين للمقايسة الأنسولين هترف (الجدول 1).
| حل الأسهم القياسية 500 نانوغرام/مليلتر | تخفيف المسلسل | تعمل [الأنسولين] نانوغرام/مليلتر |
| الأمراض المنقولة جنسياً 7 | 30 ميليلتر الأسهم + 140 ميليلتر كربوفانتسي | 150 |
| الأمراض المنقولة جنسياً 6 | 30 ميليلتر STD 7 + 45 كربوفانتسي ميليلتر | 60 |
| الأمراض المنقولة جنسياً 5 | 30 ميليلتر STD 6 + 45 كربوفانتسي ميليلتر | 24 |
| الأمراض المنقولة جنسياً 4 | 30 ميليلتر STD 5 + 45 كربوفانتسي ميليلتر | 9.6 |
| الأمراض المنقولة جنسياً 3 | 30 ميليلتر STD 4 + 45 كربوفانتسي ميليلتر | 3.84 |
| الأمراض المنقولة جنسياً 2 | 30 ميليلتر STD 3 + 45 كربوفانتسي ميليلتر | 1.54 |
| الأمراض المنقولة جنسياً 1 | 30 ميليلتر الأمراض المنقولة جنسياً 2 + 45 كربوفانتسي ميليلتر | 0.61 |
| الأمراض المنقولة جنسياً 0 | كربوفانتسي ميليلتر 45 | 0 |
| ملاحظة: تقييم الأمراض المنقولة جنسياً 500 نانوغرام/مليلتر | ||
الجدول 1. مسلسل تخفيف جعل المنحنى القياسي الأنسولين.
- إضافة العينات المنحنى المعياري و supernatants المقايسة المخفف للوحة هترف. يمكن القيام بقياس الأنسولين يفرز من هترف في 96-بئر أو شكل لوحة 384، حسنا، مع الأخذ في الاعتبار حجم مقايسة لديه إعادة ضبط. استخدام 10 ميليلتر/بئر عينة في أبيض 96-بئر النصف-منطقة لوحات أو 5 ميليلتر/بئر في لوحة صغيرة الحجم، مستديرة القاع أبيض 384-جيدا (انظر الجدول للمواد).
- إعداد مزيج الأجسام المضادة في الكشف عن المخزن المؤقت (انظر الجدول للمواد) في إحدى الجهات مانحة 1:2 (كريبتاتي)/نسبة يقبلون (XL-665).
ملاحظة: كذلك تفاصيل محددة حول الإنزيم هترف المتوفرة من الشركة المصنعة. - إضافة مزيج الأجسام المضادة للانزيم في 30 ميليلتر/جيدا (على شكل 96 جيدا--لوحة فحص) أو 15 ميليلتر/جيدا (لتنسيق مقايسة لوحة 384-جيدا).
- ختم اللوحة واحتضان في درجة حرارة الغرفة.
- قراءة لوحة بعد ح 2، ح 4، و/أو الحضانة بين عشية وضحاها مع الأجسام المضادة باستخدام قارئ لوحة ووحدة الألياف البصرية هترف المناسبة (337 665 620 شمال البحر الأبيض المتوسط) (انظر الجدول للمواد وإرشادات الشركة المصنعة). تعيين بدء التكامل في المايكروثانيه 60 والوقت التكامل في المايكروثانيه 400-200 استخدام ومضات كل بئر.
ملاحظة: تستند هذه المعلمات إلى استخدام قارئ معين. قراءات في 620 نانومتر و 665 شمال البحر الأبيض المتوسط قد تختلف بين مختلف الصكوك. وهذا أحد الأسباب التي نقترح استخدام نسبة 665/620. في حساب هذه النسبة، أي الاختلافات المحتملة من قارئ إلى قارئ سوف يكون تطبيع وتوفير قيم متسقة بغض النظر عن الوسيلة المستخدمة لقياس هترف.
4-بيانات التحليل والتطبيع
- حساب تركيزات الأنسولين من الآبار بالانزيم عن طريق استقراء راتيوميتريك قراءات الأسفار (665 nm nm/620) إلى ثانية ترتيب متعدد الحدود منحنى (الشكل 2).
الشكل 2 : المنحنى المعياري الأنسولين. مخزون الأنسولين البشري من تركيزات معروفة استخدمت لإنشاء المنحنى المعياري الأنسولين. نسب هترف الناتجة (665 نانومتر/620 نانومتر) وقد تآمروا ضد الأنسولين تركيزات. البيانات أفضل احتواء على منحنى ترتيب متعدد الحدود التربيعية ثانية (ص2 = 0.99996). وهذا منحنى قياسي ممثل. أشرطة الخطأ = sem. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
- مع البيانات المستنتجة نانوغرام/مل للأنسولين ويفرز، وتطبيع (الأنسولين يفرز استجابة لتزايد تركيزات يجند) إلى متوسط قيمة % الأنسولين أقصى إفراز الإنزيم الآبار (شرط وحدها الجلوكوز من عيار 20 ملم).
- استخدام ملائمة منحنى (ص2) من تجربة واحدة لحساب التباين الصفائحية. داخل التجربة، تستمد القيم الفردية2 R التكرارات داخل التجريبية، يسمح حساب الخطأ المعياري للوسط للمنحنى تناسب.
- لتحديد الاختلاف إينتيربلاتي، استخدام البيانات من ثلاثة على الأقل من التجارب الفردية لحساب الخطأ المعياري للوسط بقيمة2 R المنحنى الجماعية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
علينا التحقق من صحة لدينا الإنزيم هترف الأنسولين عن طريق توليد منحنى المعياري الأنسولين استخدام معايير تنقية الأنسولين البشري من التركيزات المحددة مسبقاً (الشكل 2). جيل من المنحنى القياسي يسمح لنا باستقراء القراءات الأسفار راتيوميتريك، ومن ثم تحديد مستويات الأنسولين يفرز استجابة للعلاجات المخدرات (الشكل 2). تباين الصفائحية للمنحنى المناسب الحد الأدنى (ص2 = 0.99996 ± 5.0 × 10-5) كما كان الاختلاف إينتيربلاتي (ص2 = 0.947 ± 5.5 × 10-5; n = 3 لوحات).
نحن التالية تحدد المستويات القاعدية لإفراز الأنسولين من الخلايا الإضافية-1E. استخدام بذر كثافة 5 × 105 خلايا كل بئر في شكل لوحة 24-جيدا، وجدنا أن يفرز خلايا 54.53 ± 2.2 نانوغرام/مليلتر من الأنسولين نظراً لغياب الجلوكوز عبر مدة الحضانة 90 دقيقة في حمام ثابت. إضافة الجلوكوز 20 مم لحفز نظام خدمات التأمين الحكومية أدت إلى زيادة كبيرة في نظام خدمات التأمين الحكومية (112.4 ± 5، 2 نانوغرام/مليلتر الأنسولين؛ ف < 0.0001) (الشكل 3).
الشكل 3 : تقدير القاعدية مقابل إفراز الأنسولين يحفز. وعولج الخلايا الإضافية-1E في الغياب أو وجود التحفيز الجلوكوز عالية (20 ملم) لمدة 90 دقيقة. مضاعفة في مستويات إفراز الأنسولين تم الكشف عن استجابة للتحفيز الجلوكوز عالية بالنسبة إلى الخلايا أونستيمولاتيد (حالة إفراز القاعدية؛ * * * ف < 0.0001، مزاوج ثنائي الطرف تي-اختبار). N = 5؛ وأجريت فحوصات جميع في تريبليكاتيس. أشرطة الخطأ = sem. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
للتحقيق في دور تتميز د2-مثل تحفيز مستقبلات في نظام خدمات التأمين الحكومية داخل نظامنا الخلية الإضافية-1E، نحن المحتضنة الخلايا حضور د2-مثل المخدرات مؤثر مستقبلات الدوبامين (وكوينبيرولي بروموكريبتين) خلال 90 دقيقة فترة التحفيز مع الجلوكوز 20 مم (الشكل 4).
الشكل 4 : الكشف عن هترف الدوبامين د2 --مثل تثبيط مستقبلات مؤثر من نظام خدمات التأمين الحكومية. 1E وظائف الخلايا تعامل مع زيادة تركيز الدوبامين د2-مثل يضع مستقبلات لمدة 90 دقيقة حضور الجلوكوز عالية (20 مم؛ 37 ˚C). (أ) الدوبامين إعاقة نظام خدمات التأمين الحكومية مع IC50= 1.78 ± 3.9 ميكرومتر (ص2 = 0.4355). (ب) بروموكريبتين كان أكثر فعالية من الدوبامين في الحد من نظام خدمات التأمين الحكومية (IC50 = 13.9 ± 2.4 نانومتر، ص2 = 0.7501). (ج) الفاعلية في كوينبيرولي كان مماثلة إلى الدوبامين (IC50 = 3.3 ± 3 ميكرومتر، ص2 = 0.3617). وكانت جميع البيانات أفضل احتواء على منحنى ثلاثة-المعلمة سيجمويدال تناسب. '0 مم الجلوكوز' تشير إلى إفراز الأنسولين القاعدية بالخلايا الإضافية-1E في الغياب التحفيز الجلوكوز عالية (20 مم). N > 3؛ وأجريت فحوصات جميع في تريبليكاتيس في أيام تجريبية منفصلة. أشرطة الخطأ = sem. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
كفاءة وفاعلية هذه الأدوية مؤثر مصممة بالرسوم البيانية منحنيات إفراز الأنسولين. وجدنا أنه في غياب التحفيز مع ارتفاع الجلوكوز، الخلايا الإضافية-1E تابع لإفراز الأنسولين، وأن يكن بدرجة أقل بشكل ملحوظ (المشار إليها بواسطة الشرط 0 ملم)، تتسق مع التقارير السابقة التي15. أظهرت النتائج التي توصلنا إليها أن الدوبامين، مؤثر الذاتية لمد2-مثل مستقبلات، تحول دون نظام خدمات التأمين الحكومية بطريقة تعتمد على التوافق (IC دا50 = 1.78 ± 3.9 ميكرومتر؛ الشكل 4A). وفي المقابل، بروموكريبتين، مخدرات وافق على التعامل مع نوع 2 مرض السكري23،24، كان ملحوظا أكثر فعالية من الدوبامين في إنتاج نظام خدمات التأمين الحكومية تثبيط (IC50 = 13.9 ± 2.4 نانومتر؛ الشكل 4). وأخيراً، على الرغم من أقل نجاعة من بروموكريبتين، كوينبيرولي أظهرت فاعلية مماثلة إلى الدوبامين في تثبيط نظام خدمات التأمين الحكومية (IC50 = 3.3 ± 3 ميكرومتر؛ الشكل 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تحليل الأنسولين هترف الموصوفة هنا يوفر نظام سريع وفعال لقياس إفراز الأنسولين من نظام قائم على الخلايا المزروعة. من بين أهم مزاياها، يوفر هذا التحليل إشارة خلفية منخفضة بسبب ارتفاع نسبة الإشارة إلى الضجيج. بالإضافة إلى ذلك، ونحن قد أكدت أن إشارة هترف مستقرة لفترات طويلة من الزمن (> ح 24)7. ومع ذلك، نظراً للأجسام المضادة الأنسولين ملزم الوصول بسرعة إلى تشبع ملزم بعد، بالإضافة إلى الفحص، حركية جسم ملزمة قد تتأثر بدرجة الحرارة المحيطة أو الاختلافات في مستويات يفرز الأنسولين. ولذلك، نحن قراءة لوحة الفحص في نقاط زمنية متعددة (ح 2، ح 4، وبين عشية وضحاها) دقة تحديد عند الأجسام المضادة قد وصلت إلى الإشباع الكامل، وهو إشارة هترف أقوى7. ونحن أيضا في الآونة الأخيرة أظهرت أضداد الأنسولين لا كروسريكت إلى حد كبير مع بروينسولين أو ج-الببتيد، مما يدل على أن المقايسة محددة تماما للأنسولين ناضجة7.
خطوة هامة في الاستغلال الأمثل للمقايسة بإنشاء مجموعة واسعة نطاق ديناميكي من إفراز الأنسولين. ويعرف الفرق في الكشف عن الأنسولين أثناء القاعدية (أونستيمولاتيد) مقابل إفراز الأنسولين يحفز هذا النطاق الديناميكي. ونحن نجد أن خطوة مجاعة جلوكوز مختصر أولية (الجلوكوز 0 ملم، ح 1) السابقة لحفز ارتفاع الجلوكوز يوسع النطاق الديناميكي فتيلة 1E وظائف الخلايا لإفراز المزيد من الأنسولين أثناء نظام خدمات التأمين الحكومية. في عمل سابق، واظهرنا الديناميكي التحليل من 0.17 نانوغرام/مليلتر (حد كشف) ليصل إلى ~ 110 نانوغرام/مليلتر الأنسولين مع إشارة إلى نسبة الضوضاء 10.027. بالإضافة إلى ذلك، كمية الأنسولين يفرز اعتماداً على عدد الخلايا الأولية مطلي كل بئر. كذلك نحن الأمثل المقايسة بتوحيد باساجينج والتعامل مع الخلايا الإضافية-1E. الحفاظ على الاتساق في باساجينج الجدول الزمني والطلاء في نوع لوحة محددة (مثل أطباق 10 سم) أمر ضروري للحصول على مستويات الأنسولين يفرز متسقة.
بين المصادر المحتملة للفحص هو السطح تقلب في الحلول بالانزيم الذي يتداخل مع قراءات هترف. مصدر هام لهذه الفقاعات هي وجود ألبومين المصل البقري (BSA) في مختلف الحلول المستندة إلى كربوفانتسي المقايسة. لاستكشاف هذه المشكلة المحتملة، تقليل أو حتى القضاء على جيش صرب البوسنة يقلل إلى حد كبير من فقاعات في الحل وذلك تحسين موثوقية إشارة هترف. هذا مهم خاصة عند إنشاء المنحنى المعياري الأنسولين وتخفيف المخدرات. مرور الخلية تعتمد على عدد الاختلافات في إفراز الأنسولين القاعدي تعتبر مصدرا آخر لتقلب المقايسة المحتملة (البيانات لا تظهر). وهذا يتسق مع الأعمال السابقة ميرجلين والزملاء الذين اقترحوا أيضا أن يوجد إفراز الأنسولين الأمثل بين أرقام مرور الخلية 1E وظائف ~ 60-10015. ولذلك، نوصي للتقليل إلى أدنى حد ممكن تقلب في إفراز الأنسولين المتصلة بعدد مرور الخلية، يحد من إفراز معبراً لهذا النطاق مرور خلية محددة تحديداً جيدا.
القيد الرئيسي لفحص إفراز الأنسولين يستند إلى الخلية هو تباين إفراز القاعدية الجوهرية للخلايا الإضافية-1E. قد تكون ذات صلة بخلايا إفراز الأنسولين المتزايد خارج سياق فيزيولوجية البنكرياس جزيرة ليلى. والواقع أن أنواع الخلايا الأخرى داخل هذه الجزيرة الصغيرة بما في ذلك خلايا ألفا ودلتا تفرز العديد من العوامل التي قد تعدل إفراز الأنسولين القاعدية وحفز من خلايا بيتا في باراكريني محلية، نحو25. نظراً لغياب هذه أنواع الخلايا جزيرة أخرى قد يؤدي إلى الإخلال تنظيم محكم لإفراز الأنسولين، مما يؤدي إلى تباين أكبر من خلاف ذلك لاحظ فسيولوجيا. قيد محتمل آخر هو نطاق خطي صغيرة نسبيا للمقايسة، حيث كان تشبع الأنسولين يفرز استجابة الجلوكوز 20 مم تقريبا في بعض الحالات. نتيجة لذلك في supernatants خلية غير مخفف، قد تكون آثار secretagogues الأنسولين على إفراز الأنسولين يحفز خارج الجزء الخطي من منحنى المعايرة. هذا، ومع ذلك، تجنبت بإضعاف المادة المحتوية على الأنسولين طافية بما فيه الكفاية للسماح للأنسولين أن تندرج في نطاق خطي منحنى المعايرة.
نحن يقرها لدينا التحليل يظهر أن أجونيسم الدوبامين د2-إعاقة العلاج بروموكريبتين وكوينبيرولي مثل المستقبلات عن طريق الدوبامين، نظام خدمات التأمين الحكومية بطريقة تعتمد على التركيز. هذه البيانات يسمح لنا بتحديد الخواص الدوائية لهذه العقاقير (أي IC50 ونجاعة) من حيث آثارها على نظام خدمات التأمين الحكومية. نتائجنا تتسق مع مجموعة متزايدة من الأدلة التي تشير إلى دور مهم الدوبامين وتتميز الإشارات خارج الجهاز العصبي المركزي20،21،،من2226، 27. جدير بالذكر أن النتائج التي توصلنا إليها تظهر أن الدوبامين د2-مستقبلات بروموكريبتين مؤثر حقاً يحول دون نظام خدمات التأمين الحكومية، بعد تم مؤخرا بموافقة إدارة الأغذية والعقاقير لعلاج مرض السكري نوع 224، يثير مسألة هامة: كيف يمكن علاج المخدرات هذا النوع 2 مرض السكري (T2D) إذا فإنه يقلل من إفراز الأنسولين، على الأقل حدة؟ أحد التفسيرات المحتملة قد تكون ذات صلة إلى بروموكريبتين للقدرة على تحمل "بقية خلية بيتا". وفقا لهذه الفرضية، نظراً لواحدة من السمات الأساسية ل T2D أوفيرسيكريشن العام للأنسولين، أن في نهاية المطاف قد تسهم في فشل خلايا بيتا28. وعلاوة على ذلك، فإننا نقترح أن الأنسولين قد أوفيرسيكريتيون أثناء T2D أيضا من تفاقم مقاومة الأنسولين بتقليل حساسية الأنسولين من الأجهزة بما في ذلك الهيكل العظمى والعضلات والكبد والأنسجة الدهنية. وبالتالي، قد يؤدي منع أو التقليل من نظام خدمات التأمين الحكومية ريسينسيتيزيشن التدريجي لهذه الأنسجة المستهدفة، وجعلها أكثر استجابة للأنسولين، وبالتالي تحسين حساسية الأنسولين. وجود نظام مقايسة قابلة للفرز الفائق يفتح الباب للعمل في المستقبل على حد سواء تشريح مسارات الإشارات داخل الخلايا بوساطة الدوبامين د2-مثل مستقبلات في البنكرياس من خلايا بيتا التي المسؤولة عن باراكريني/ أوتوكريني تثبيط نظام خدمات التأمين الحكومية، وكذلك فيما يتعلق بمزيد من توضيح الآليات التي المخدرات مثل بروموكريبتين قد يحسن أعراض مرض السكري.
تطوير مقايسة إفراز الأنسولين يستند إلى الخلية التي يستفيد من التكنولوجيا هترف لإفراز الأنسولين ويمثل تقدما كبيرا في الكشف السريع والفعال للأنسولين في شكل ملحوظ يقلل التكلفة النسبية و/أو زيادة سلامة مقارنة بكبار السن فحوصات الكشف عن الأنسولين الاعتماد على ريا والنهج المستندة إلى أليسا. في الواقع، على الرغم من أن فحوصات الأنسولين أليسا وريا حساسة ومحددة نسبيا للمقايسة الأنسولين هترف، يلغي طبيعة متجانسة للكشف عن، العديد من الخطوات الإضافية الغسيل الموجودة في هذه الأخرى فحص نظم7. وعلاوة على ذلك، يوفر الاستقرار النسبي في إشارة هترف ميزة رئيسية أخرى لقياس الأنسولين يمكن الاعتماد عليها.
أخذت معا، هترف في مقايسة إفراز الأنسولين لديه القدرة على سرعة التمييز بين الخصائص الدوائية لأدوية متعددة في سياق إفراز الأنسولين الخلوية. وعلاوة على ذلك، هذا التحليل نسبيا سهولة الاستخدام وإشارة قوية جعلها قابلة للفرز الفائق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ونحن نشكر بيار نيكولا (المقايسة سيسبيو) للحصول على مشورة مفيدة والدكتور بيير ماكلير (جامعة جنيف) لسخاء تقديم الخلايا الإضافية-1E. تم دعم هذا العمل بتمويل من وزارة الدفاع (منحة PR141292 إلى Z.F.)، جون ف. وألف-نانسي اميرلينج الصندوق في مؤسسة بيتسبرغ (إلى Z.F.).
Acknowledgments
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well white half area plate | Greiner Bio-One | 82050-042 | |
| 384-well white low-volume, round-bottom plate | Corning | 15100157 | |
| Insulin High Range Kit | Cisbio Bioassays | 62IN1PEH | 10,000 test HTRF-based insulin assay kit |
| PHERAstar FSX plate reader | BMG Labtech | FSX | Plate reader adapted for HTRF-based assay readings |
| Plate sealers | Fisher Scientific | DY992 | To seal plate while antibodies incubate |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| RPMI Medium 1640 (1x) | Gibco | 11875-093 | [+] L-glutamine |
| Trypsin 0.05% | Corning | 25-052-CI | 0.53 mM EDTA, (-) sodium bicarbonate |
| DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline) | Corning | 21-031-CV | Without calcium and magnesium |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| HEPES | Gibco | 156-30-080 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| Penicillin/Streptomycin solution 100x | Corning | 30-002 CT | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M1348 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Dopamine hydrochloride | Sigma | 8502 | |
| Bromocriptine mesylate | Tocris | 427 | |
| (-)-Quinpirole hydrochloride | Tocris | 1061 | |
| Bovine Serum Albumin | Calbiochem | 12659 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4832 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma | 276855 |
References
- Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. Critical nodes in signalling pathways: Insights into insulin action. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (2), 85-96 (2006).
- Vetere, A., Choudhary, A., Burns, S. M., Wagner, B. K. Targeting the pancreatic beta-cell to treat diabetes. Nat Rev Drug Discov. 13 (4), 278-289 (2014).
- Despres, J. P., Lemieux, I. Abdominal obesity and metabolic syndrome. Nature. 444 (7121), 881-887 (2006).
- Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).
- Barg, S. Mechanisms of exocytosis in insulin-secreting B-cells and glucagon-secreting A-cells. Pharmacol Toxicol. 92 (1), 3-13 (2003).
- Braun, M., Ramracheya, R., Rorsman, P. Autocrine regulation of insulin secretion. Diabetes Obes Metab. 14 Suppl 3, 143-151 (2012).
- Farino, Z. J., et al. Development of a rapid insulin assay by homogenous time-resolved fluorescence. PLoS One. 11 (2), e0148684 (2016).
- Simpson, N., et al. Dopamine-mediated autocrine inhibitory circuit regulating human insulin secretion in vitro. Mol Endocrinol. 26 (10), 1757-1772 (2012).
- Heyduk, E., Moxley, M. M., Salvatori, A., Corbett, J. A., Heyduk, T. Homogeneous insulin and C-Peptide sensors for rapid assessment of insulin and C-peptide secretion by the islets. Diabetes. 59 (10), 2360-2365 (2010).
- Heyduk, T. Measuring protein conformational changes by FRET/LRET. Curr Opin Biotechnol. 13 (4), 292-296 (2002).
- Degorce, F. HTRF((R)): Pioneering technology for high-throughput screening. Expert Opin Drug Discov. 1 (7), 753-764 (2006).
- Degorce, F., et al. HTRF: A technology tailored for drug discovery - a review of theoretical aspects and recent applications. Curr Chem Genomics. 3, 22-32 (2009).
- Mathis, G. HTRF(R) Technology. J Biomol Screen. 4 (6), 309-314 (1999).
- Daijo, J. E., Sportsman, J. R. A time-resolved fluorescence immunoassay for insulin in rodent plasma. J Pharm Biomed Anal. 19 (3-4), 335-342 (1999).
- Merglen, A., et al. Glucose sensitivity and metabolism-secretion coupling studied during two-year continuous culture in INS-1E insulinoma cells. Endocrinology. 145 (2), 667-678 (2004).
- Ustione, A., Piston, D. W. Dopamine synthesis and D3 receptor activation in pancreatic beta-cells regulates insulin secretion and intracellular [Ca(2+)] oscillations. Mol Endocrinol. 26 (11), 1928-1940 (2012).
- Ustione, A., Piston, D. W. A simple introduction to multiphoton microscopy. J Microsc. 243 (3), 221-226 (2011).
- Ustione, A., Piston, D. W., Harris, P. E. Minireview: Dopaminergic regulation of insulin secretion from the pancreatic islet. Mol Endocrinol. 27 (8), 1198-1207 (2013).
- Rubi, B., et al. Dopamine D2-like receptors are expressed in pancreatic beta cells and mediate inhibition of insulin secretion. J Biol Chem. 280 (44), 36824-36832 (2005).
- Garcia-Tornadu, I., et al. Disruption of the dopamine d2 receptor impairs insulin secretion and causes glucose intolerance. Endocrinology. 151 (4), 1441-1450 (2010).
- Garcia-Tornadu, I., et al. New insights into the endocrine and metabolic roles of dopamine D2 receptors gained from the Drd2 mouse. Neuroendocrinology. 92 (4), 207-214 (2010).
- Lopez Vicchi, F., et al. Dopaminergic drugs in type 2 diabetes and glucose homeostasis. Pharmacol Res. 109, 74-80 (2016).
- Kalra, S., Kalra, B., Agrawal, N., Kumar, S. Dopamine: The forgotten felon in type 2 diabetes. Recent Pat Endocr Metab Immune Drug Discov. 5 (1), 61-65 (2011).
- Mahajan, R. Bromocriptine mesylate: FDA-approved novel treatment for type-2 diabetes. Indian J Pharmacol. 41 (4), 197-198 (2009).
- Caicedo, A. Paracrine and autocrine interactions in the human islet: more than meets the eye. Semin Cell Dev Biol. 24 (1), 11-21 (2013).
- Ballon, J. S., Pajvani, U., Freyberg, Z., Leibel, R. L., Lieberman, J. A. Molecular pathophysiology of metabolic effects of antipsychotic medications. Trends Endocrinol Metab. , (2014).
- Freyberg, Z., Aslanoglou, D., Shah, R., Ballon, J. S. Intrinsic and antipsychotic drug-induced metabolic dysfunction in schizophrenia. Front Neurosci. 11, 432 (2017).
- de Leeuw van Weenen, E. J., et al. The dopamine receptor D2 agonist bromocriptine inhibits glucose-stimulated insulin secretion by direct activation of the alpha2-adrenergic receptors in beta cells. Biochem Pharmacol. 79 (12), 1827-1836 (2010).
