Summary
Burada, homojen mevcut zaman hücrelerden salgılanan insülin hızlı algılama için etkili bir yöntem olarak FRET (HTRF) çözüldü.
Abstract
İnsülin salgılanması tespiti düzenlenmiş salgılanmasını de çalışmalar olduğu gibi metabolizma elucidating mekanizmaları için önemlidir. Çok sayıda insülin deneyleri yıllardır varmışsın, homojen zaman çözüldü Förster rezonans enerji transferi (HTRF) teknolojisi son gelişiyle önemli ölçüde bu ölçümler basitleştirdi. Bu hızlı, uygun maliyetli, tekrarlanabilir ve güçlü optik tahlil zaman çözüldü Förster enerji rezonans Transfer kolaylaştırır uzun süreli emisyon ile parlak fluorophores için Birleşik antikorları üzerine bağımlı olduğunu. Ayrıca, HTRF insülin algılama yüksek üretilen iş tarama testleri geliştirme için mükellef olduğunu. Burada HTRF insülin salgılanması INS-1E hücrelerde, bir sıçan insülinoma türetilmiş hücre kültürünü algılamak için kullanır. Bu bize Bazal düzeyde insülin ve glikoz stimülasyon cevaben yaptıkları değişiklikleri tahmin etmek izin verir. Buna ek olarak, bu insülin algılama sistemi dopamin rol glikoz uyarılmış insülin salgılanması (GSIS) negatif bir düzenleyici olarak onaylamak için kullanın. Benzer bir şekilde, diğer dopamin D2-reseptör agonistleri, quinpirole ve bromokriptin, GSIS bir konsantrasyon bağımlı şekilde azaltmak gibi. Sonuçlarımız HTRF insülin tahlil biçiminin GSIS ve farmakolojik kendi profilleri çok sayıda uyuşturucu rolünü belirlemede yardımcı programı vurgulayın.
Introduction
Enerji metabolizmasının büyük bir anabolik hormon tarafından insülin ince ayar. İnsülin sentezlenmiş ve yanıt olarak artan hücre dışı şekeri pankreas beta hücreleri tarafından yayımlanan. Yayımlanan insülin glukoz alımını insülin duyarlı dokular1,2tarafından tetikler. Fizyolojik açıdan, bu glikoz konsantrasyonu glukoz alımını düzenleyen insülin salgılanmasını tarafından takip bir yemekten sonra yükselmesine bağlı olduğu. İnsülin direnci ile sonuçlanan metabolik bozukluklar glikoz homeostazı bozuklukları neden olabiliyor ve sonuçta, tip 2 diyabet2,3,4başlangıcı.
Her ne kadar insülin salgılanması kapsamlı eğitimi aldı, onun düzenleyici mekanizmaları kötü anlaşılır kalır. Soruşturmanın kritik bir alan kimliği roman modülatörler insülin salgılanması beta hücreleri5,6,7,8tarafından olmuştur. Bu çalışmalar glikoz stimülasyon ve insülin salgılanması kaplin ilişkisi daha iyi anlaşılmasını gerektirir. Bu nedenle, doğru bir şekilde izlemek ve glikoz uyarılmış insülin salgılanması (GSIS) düzeylerini ölçmek için yetenek gerekli olmuştur. Bugüne kadar ancak, sınırlı sayıda yöntemleri GSIS insülin salgılayan hücre satırları ve/veya pankreas adacıkları kullanarak miktar izin vermek mevcut idi. Radioimmunoassay (RIA), hangi Radyoizotop öğesini insülin ve antikorlar biridir. Bu yaklaşımın ana sınırlamaları nedeniyle işleme ve bertaraf radyoaktif malzemelerin güvenlik sorunları içerir. Ayrıca, bu emek yoğun, birden çok uzun çamaşır ve kuluçka adımları içeren bir yöntemdir. Enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) insülin algılama için antikorlar kullanan başka bir pahalı ve emek yoğun bir yaklaşımdır. Varyasyon antikor benzeşim ve insülin tanıma verimliliğini faktörler bu yöntemin sınırlama var ve tekrarlanabilirlik sonuçları etkileyebilir. Ne ELISA ne de RIA yüksek üretilen iş deneyler için tasarlanmıştır. AlphaScreen algılama ve insülin salgılanması düzeylerini ölçmek için kullanılan homojen bir tahlil olduğunu. AlphaScreen teknoloji ortam oksijen dönüşüm Kemiluminesan üretimi kaynaklanan chemiluminescent türleri ile tepki verebilir bir heyecanlı oksijen singlet durumuna dayanır. Tahlil homojen olduğundan, RIA ve ELISA ile ilgili çamaşır adımlardan ortadan kalkar. Ancak, sinyal tepki doğası gereği istikrarsızlık tahlil okuma etkileyebilecek bir sınırlayıcı faktördür. (TR-KISKAÇ, Heyduk ve meslektaşları9tarafından geliştirilen başka bir homojen insülin molekül üzerinde farklı epitopları için iki ayrı antikorların bağlama göre insülin ölçüm yaklaşımdır. Antikorlar her kimyasal olarak bağlantılı çift telli DNA'sı ile kısa tamamlayıcı tek iplikçikli DNA çıkıntılar vardır. İnsülin antikorları bağlama onları bir araya getirir ve bir çift telli DNA dubleks için yol açar. Her antikor da ilgili bir donör veya alıcısı fluorophore ile ilişkilidir ve DNA çift yönlü Derneği Förster rezonans enerji transferi (FRET) oluşturmak için bu fluorophores buluşturuyor. TR-KISKAÇ, bir potansiyel sınırlama ancak, perde ile aittir. Arka plan Floresans FRET reaksiyon sırasında hızla dağılmaya yetersizlik arka plan Floresans nispeten yüksek düzeyde ve düşük sinyal gürültü oranı tahlil içinde neden olabilir. Bu nedenle, bir ihtiyaç GSIS bir yüksek-den geçerek şekilde miktarının için güvenilir, sağlam ve uygun maliyetli bir tahlil için devam eder.
Biyofizik son gelişmeler bir homojen zaman çözüldü floresan enerji rezonans transferi (HTRF) dayalı tahlil gelişiminde sonuçlandı. Enerji aktarım içinde özellikle, tahlil daha doğru bir şekilde donör ve alıcısı arasındaki enerji transferi ışınımsal olmayan ışıma enerji rezonans transferi (LRET)10 HTRF dayanan FRET dayalı olarak açıklanan olabilir tür11,12,13. Bu ayrım bir floresan zamanlama beri önemli, ya da perdeleme aynı türleri FRET ve LRET için kullanılan temel perde etkileşim Şoklama LRET için daha çok farklı olsa da. Ayrıca, nadir toprak lanthanide cryptate kullanımı Evropyum gibi maddeler ve birleşimler veya uzun floresan yarı-hayat12,14HTRF terbium cryptate üretir. Bu belirli bir gecikme süresiyle (µsn) donör uyarma ve alıcısı (Yani, zaman çözüldü tahlil) emisyon ölçümü arasında giriş benzersiz avantajı sunuyor. Bu gecikme süresini alıcısı emisyon Floresans ölçüm önce dağılımı arka plan floresan için yeterli zaman sağlar. Sonuç olarak, okuma non-spesifik Floresans ücretsiz ve böylece, bir yüksek sinyal gürültü oranı elde edilir mi (şekil 1). Ayrıca, HTRF homojen doğası çok tahlil yapmak ilişkisiz türler ELISA veya RIA tabanlı yöntemleri daha daha fazla hızlı yıkama adımları yıkamak için gereksinimini ortadan kaldırır.
Şekil 1: HTRF insülin algılama için mekanizmasının şematik. İki bağımsız olarak oluşturulan monoklonal antikorlar özellikle tanımak ve insülin ayrı sitelerde bağlayın. Bu antikorlar Evropyum cryptate donör veya XL665 alıcısı için Birleşik. Uyarma 337 nm sonuçlara emisyon 620, içinde bağış nm. Elde edilen enerji transferi bir daha uzun dalga boyu, 665 yayılmasını sağlamak XL665 neden olan nm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Burada, detaylı bir protokol sağlar GSIS INS-1E hücrelerden düzeylerini belirlemek için HTRF dayalı bir yaklaşım kullanmak için insülinoma hücre satır15sıçan bir iyi kurulmuş insülin salgılayan beta hücre kaynaklı. Buna ek olarak, bu tahlil insülin salgılanması moleküler düzenleyiciler farmakolojik profili tanımlamak için kullanılabilir. Dopamin D2incelemek için bu HTRF tabanlı insülin testin uyguladığımız-reseptör düzenleme GSIS, hangi tarihlerde. Artan çalışmalar nörotransmitter dopamin GSIS8,16,17,18,19,20, önemli bir düzenleyicisidir indirdik 21 , 22. dopamin bir negatif otokrin/parakrin şekilde dopamin D2eylemler yoluyla GSIS etkiler-tarihlerde beta pankreas hücreleri8 yüzeyde ifade reseptörleri (D2, D3, D4 reseptörleri) , 16 , 19. bu tahlil kullanarak, biz GSIS olumsuz bir düzenleyici olarak dopamin'ın rolü onaylamak ve gösteren dopamin D2-reseptör agonistleri bromokriptin ve quinpirole da GSIS azaltmak gibi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. INS-1E hücreleri: bakım ve kaplama
- INS-1E hücreleri oksijen 37 ˚C/5% CO2 kuluçka ve kültürlü RPMI 1640 orta ile %5 (v/v) ısı inaktive fetal sığır serum ile 2 mM L-glutamin, 10 mM HEPES, 1 mM sodyum pyruvate, 100 U/mL penisilin/streptomisin takıma korumak çözüm, 50 µM β-mercaptoethanol. 10 mL tam RPMI 1640 orta (plaka), başına hücrelerde kültür % 80-90 izdiham ulaşana kadar ne zaman onlar trypsinized ve pasajlı veya insülin salgısı tahlil için kullanılan.
- 1. gün: Medya Aspire edin ve hücreleri bir kez 5 mL de önceden ısıtılmış PBS ile yıkayın. Tripsin (% 0,025) 0.5 mL 1:1 0.5 ml hücreleri trypsinize ve 3-4 dk 37 ˚C az için kuluçkaya için PBS seyreltilmiş ekleyin. Tripsin 15 mL santrifüj tüpü 9 mL tam medya ve transfer hücreleri ekleyerek pipetting tarafından devre dışı bırakın.
- Hücreleri tarafından Santrifüjü cips ve hücre Pelet yaklaşık 5 mL taze medyada yeniden askıya alma.
- Yeniden askıya alınan hücre 10 µL alıp Trypan mavi hayati boya için hücre canlılığı kontrol etmek için 10 µL ile karıştırın. Bu karışımdan bir hemasitometre kullanarak 10 µL canlı ve ölü hücreleri saymak. Canlılığı düzeyi %90 üzerinde olmalıdır. Taze medya mL başına 1 milyon hücrelere yeniden askıya alınmış hücrelerde sulandırmak.
- Poli-L-lizin bir kuyu başına tohum 0.5 mL INS-1E hücre 24-şey plaka, 500.000 hücreler/iyi bir yoğunluğu ön kaplamalı.
- Gün 2: Medya 18-24 h kaldırmak sonra kaplama ve 500 µL/iyi taze RPMI 1640 medya ekleyin. Hücreler hücreleri tamamen önceden passaging adımından kurtarmak izin vermek başka bir 24 h için kuluçkaya. Bu ek süre hücre doku kültürü plaka üzerinde yaymak için izin verir.
2. insülin salgısı tahlil (3. gün)
- KRB arabellek hazırlamak: 132,2 mM NaCl, 3.6 mM KCl, 5 mM NaHCO3, 0,5 mM NaH2PO4, 0,5 mM MgCl2, 1.5 mM CaCl2ve 0,001 g/mL sığır serum albumin (BSA), pH 7.4.
- Medya hücreleri Aspire edin ve iki kez Önceden ısıtılmış PBS ile yıkayın.
- Glukoz açlık adım için 450 µL/iyi KRB (içeren BSA) 1 h için glikoz olmadan 37 ˚C/5% CO2' de ekleyin.
- Glukoz açlık adım sırasında ilaç (lar) 200 mM içeren KRB içinde seri dilutions glikoz hazırlama (10 x konsantrasyon).
- 10 x 200 mM glikoz (de 10 final tahlil glikoz konsantrasyonu x) ile takıma KRB son konsantrasyon uyuşturucu hazırlayın. Eğer uyuşturucu hisse senedi (ek 10 artı glikoz x) olduğunu DMSO, DMSO yüzde tahlil (ideal olarak son yüzdesi % 0,1 DMSO daha az) tutarlı tutulur emin olun.
- Dopamin ve quinpirole tedavisi için 100 100 µM bir son tahlil ilaç konsantrasyonu aralığını kullanmak hiç uyuşturucu içeren doz yanıtı son nokta ile (yüksekten en düşük konsantrasyon), pM. Bromokriptin için bir son tahlil konsantrasyon aralığını 10 µM ile 22 saatleri, ilaçsız kontrolü doz yanıt son nokta ile kullanmak.
- Glukoz açlık sonra uyuşturucu seri dilutions bir doz yanıt üretmek için tahlil için ekleyin.
- Her seri seyreltme 50 µL/kuyu karşılık gelen wells (Toplam tahlil birim 500 µL) ekleyin.
- 37 ˚C/5% CO, 90 dk için ilgili uyuşturucu seri dilutions (huzurunda 20 mM glikoz) içeren hücreleri glikoz stimülasyon adım için kuluçkaya2. Bir denetim wells içerir: (1) uyarılması ile 20 mM glikoz yokluğunda yalnız herhangi bir ek ilaç ve (2) hücreleri, ne uyuşturucu ne de (salgı Bazal oranında sağlayan) glikoz ile uyarılır.
- Stimülasyon adımdan sonra supernatants (doğrudan kullanım veya 4 ˚C mağazasında) dikkatli bir şekilde çıkarın.
Not: Bir ek 5 dk nazik Santrifüjü adım (600 x g, 1 dk) bu noktada herhangi bir kalan hücreleri tahlil supernatants kaldırmak için tanıttı.
3. ölçü insülin salgılanması için HTRF
- Tahlil supernatants 1:10 KRB (olmadan BSA), tercihen temiz 96-şey levha oranında seyreltin.
- İnsülin standart eğri HTRF insülin tahlil (tablo 1) için hazır olun.
| Standart stok çözüm 500 ng/ml | Seri dilutions | [İnsülin] ng/ml çalışma |
| STD 7 | 30 µl stok + 140 µl KRB | 150 |
| STD 6 | 30 µl STD 7 + 45 µl KRB | 60 |
| STD 5 | 30 µl STD 6 + 45 µl KRB | 24 |
| STD 4 | 30 µl STD 5 + 45 µl KRB | 9.6 |
| STD 3 | 30 µl STD 4 + 45 µl KRB | 3.84 |
| STD 2 | 30 µl STD 3 + 45 µl KRB | 1,54 |
| STD 1 | 30 µl STD 2 + 45 µl KRB | 0,61 |
| STD 0 | 45 µl KRB | 0 |
| Not: STD hisse senedi 500 ng/mL'dir | ||
Tablo 1. İnsülin standart eğri yapmak için seri dilutions.
- Standart eğri örnekleri ve seyreltilmiş tahlil supernatants HTRF plakasına ekleyin. HTRF tarafından salgılanan insülin ölçümü bir 96-kuyu veya yeniden ayarlanması için tahlil birim olan göz önünde bulundurarak bir 384-şey plaka biçim yapılabilir. Kullanım 10 µL/iyi örnek 96-şey beyaz yarı-alan plakaları veya 5 µL/iyi 384-şey beyaz bir düşük hacimli, yuvarlak alt plaka ( Tablo malzemelerigörmek).
- Antikor mix algılama arabelleği hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek) 1:2 donör (cryptate) içinde / alıcısı (XL-665) oranı.
Not: Daha fazla HTRF tahlil ilgili belirli ayrıntıları üreticisinden mevcuttur. - 30 µL/iyi (için 96 iyi-plaka tahlil biçimi) veya 15 µL/iyi (384-şey plaka tahlil biçimi için) tahlil için antikor karışımı ekleyin.
- Plaka mühür ve oda sıcaklığında kuluçkaya.
- Plaka plaka okuyucu ve uygun HTRF optik modülü kullanarak antikorlar ile 2 h, 4 h ve/veya gece kuluçka sonra okumak (337 665 620 nm) ( Tablo malzeme ve üretici yönergelerine bakın). 60 µs entegrasyon başlangıç ayarlamak ve entegrasyon anda 400 µs. kullanım 200 iyi yanıp söner.
Not: Bu parametreler belirli bizim okuyucu kullan seçeneğine göre. Okuma, 620 nm ve 665 nm farklı enstrümanlar arasında farklı olabilir. 665/620 oranı kullanmanızı öneririz nedenlerinden biridir. Bu oran hesaplama, herhangi bir potansiyel farkları okuyucudan okuyucuya normalleştirilmiş ve HTRF ölçmek için kullanılan alet bakılmaksızın tutarlı değerleri sağlar.
4. veri analizi ve normalleştirme
- Tahlil kuyu ratiometric ekstrapolasyon yoluyla insülin konsantrasyonları hesaplamak Floresans okuma (665 nm/620 nm) için ikinci sırada ikinci dereceden bir polinom eğrisi (Şekil 2).
Resim 2 : İnsülin standart eğri. Bilinen konsantrasyonları stokunun insan insülin, insülin standart eğri oluşturmak için kullanılmıştır. Elde edilen HTRF oranları (665 nm / 620 nm) insülin konsantrasyonları karşı çizildi. Verileri ikinci sırada ikinci dereceden bir polinom eğrisi için en uygun olduğunu (R2 0.99996 =). Bu temsili bir standart eğri var. Hata çubukları SEM = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
- Ng/mL salgılanan insülin olarak ekstrapole verilerle (ligand konsantrasyonu artan karşılık salgılanan insülin) % maksimum insülin salgısı tahlil wells (20 mM glikoz yalnız koşulu) ortalama değerine normalleştirmek.
- Eğrisi hastalık nöbeti (R2) tek bir deneme intraplate varyasyon hesaplamak için kullanın. Deney içinde uygun eğrisi için ortalama, standart hata hesaplama sağlayan intra deneysel çoğaltmaları bireysel R2 değerleri türetilen.
- İnterplate varyasyon belirlemek için en az üç bireysel deney verileri toplu eğrisi R2 değeri için ortalama, standart hata hesaplamak için kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biz bizim insülin HTRF tahlil önceden tanımlanmış konsantrasyonları (Şekil 2) saf insan insülin Standartlar kullanılarak bir insülin standart eğri üreterek geçerliliği. Üretimi ratiometric floresan okuma ulaşmak için bize izin verilen standart eğri ve bu nedenle ilaç tedavileri (Şekil 2) yanıt olarak salgılanan insülin düzeylerini belirlemek. Intraplate değişim eğrisi montaj için en az (R2 0.99996 ± 5.0 x 10-5=) interplate varyasyon olduğu gibi (R2 = 0.947 ± 5.5 x 10-5; n 3 tabak =).
Biz sonraki insülin salgılanması INS-1E hücrelerden bazal düzeyleri belirlenir. 24-şey plaka biçimi bir kuyu başına tohum yoğunluğu 5 x 105 hücre kullanarak, hücreleri insülin glukoz yokluğu 54.53 ± 2.2 ng/mL üzerinde statik bir banyoda 90 dk kuluçka süresi salgılanan buldum. GSIS (112,4 ± 5.2 ng/mL insülin; önemli bir donanım GSIS uyarmak için 20 mM glikoz ilavesi sonuçlandı p < 0.0001) (şekil 3).
Şekil 3 : Tahmini karşı uyarılmış insülin salgılanması Bazal. INS-1E hücrelerin olmaması veya yüksek glikoz (20 mM) stimülasyon 90 dk için varlığı tedavi edildi. Bir insülin salgı seviyelerinde katlama yanıt yüksek glikoz stimülasyon unstimulated hücreleri göreli olarak tespit edildi (Bazal salgı durum; *** p < 0.0001, iki kuyruklu unpaired t-test). N = 5; Tüm deneyleri triplicates içinde gerçekleştirilmiştir. Hata çubukları SEM = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Dopaminerjik D2rolünü araştırmak için-reseptör stimülasyon gibi GSIS içinde bizim INS-1E hücre sistemi içinde biz hücreleri D2huzurunda inkübe-reseptör agonist ilaçlar (dopamin, quinpirole ve bromokriptin) 90-min sırasında hangi tarihlerde stimülasyon nokta ile 20 mM glikoz (şekil 4).
Şekil 4 : HTRF algılama dopamin D2 -hangi tarihlerde reseptör agonist GSIS inhibisyonu. INS-1E hücreleri dopamin D2konsantrasyonları artan ile tedavi-tarihlerde reseptör agonistleri yüksek glikoz (20 mM; 37 ˚C) huzurunda 90 dk için. (A) dopamin GSIS IC50ile inhibe 1.78 ± 3.9 µM = (R2 0.4355 =). (B) bromokriptin dopamin GSIS azaltılmasında daha güçlü (IC50 13.9 ± 2.4 nM, R2 = 0.7501 =). (C) Quinpirole'nın kudret için dopamin benzer (IC50 3.3 ± 3 µM, = R2 0.3617 =). Tüm verileri bir üç parametreli uygun sigmoidal eğrisi için en uygun olduğunu. ' 0 mM glikoz ' noktası yüksek glikoz (20 mM) stimülasyon yokluğunda INS-1E hücreleri tarafından Bazal insülin salgılanması gösterir. N > 3; Tüm deneyleri triplicates içinde ayrı deneysel günlerde uygulanmıştır. Hata çubukları SEM = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Etkinlik ve bu agonist ilaçların potens insülin salgısı eğrilerinin grafiklerini çizerek kararlıydım. Yüksek glikoz, insülin, salgılaması için de olsa (0 mM koşulla belirtilir) belirgin daha düşük bir dereceye ile tutarlı raporlar daha önce15devam INS-1E hücreleri ile stimülasyon yokluğunda bulduk. Sonuçlarımız bu dopamin, D2endojen agonist gösterdi-reseptörleri gibi GSIS concertation bağlı bir şekilde inhibe (DA IC50 1.78 ± 3.9 µM; = Şekil 4A). Aksine, bromokriptin, tip 2 diyabet23,24, tedavisi için onaylanmış bir uyuşturucu GSIS inhibisyon üreten dopamin daha belirgin daha güçlü (IC50 13.9 ± 2.4 nM; = Şekil 4B). Son olarak, yine de daha az etkili bromokriptin, quinpirole dopamin GSIS inhibisyonu için benzer etki gücü sergiledi (IC50 3.3 ± 3 µM; = Şekil 4 c).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan HTRF insülin tahlil insülin salgılanması kültürlü hücre tabanlı sistemden ölçmek için hızlı, verimli bir sistem sunmaktadır. En önemli avantajları arasında bu tahlil yüksek sinyal gürültü oranı nedeniyle düşük arka plan sinyal sunmaktadır. Buna ek olarak, biz HTRF sinyal uzun bir süre için kararlı olduğunu doğruladı (> 24 h)7. Yine de, insülin bağlama monoklonal antikorlar, hızlı bir şekilde tahlil için ek sonra bağlama doygunluk ulaşmak beri Kinetik antikor bağlama ortam sıcaklığı veya salgılanan insülin düzeylerini değişimler tarafından etkilenebilir. Bu nedenle, birden fazla zaman puan (2 h, 4 h ve geceleme) antikor tam doygunluk ulaştı ve HTRF sinyal en sağlam7olduğunda tam olarak tanımlamak, tahlil plaka okuduk. Biz de son zamanlarda insülin antikorları önemli ölçüde proinsulin veya c-peptid, cross-react değil tahlil oldukça olgun insülin7için özel olduğunu düşündüren göstermiştir.
Tahlil çok çeşitli dinamik insülin salgılanması kurulması dahil optimizasyon önemli bir adım. Bu dinamik alan tespit edilen insülin sırasında Bazal (unstimulated) karşı uyarılmış insülin salgılanması farkı olarak tanımlanır. Bir ilk kısa glukoz açlık adım (0 mM glikoz, 1 h) onu bulabileceğimizi yüksek glikoz stimülasyon önceki INS-1E GSIS sırasında daha fazla insülin salgılar hücrelere Macun tarafından dinamik aralığı genişletir. Daha önceki çalışmalarda, 0,17 ng / mL (algılama sınırı) olmak için tahlil'ın dinamik alan gösterdik ~ 110 ng/mL insülin sinyal gürültü oranı 10.027olarak yüksek. Ayrıca, salgılanan insülin miktarı iyi kaplama ilk hücre sayısına bağlıdır. Biz daha fazla tahlil passaging standartlaştırılması ve INS-1E hücreleri işleme en iyi duruma getirilmiş. Zamanlama passaging ve bir özel plaka türü (Örneğin, 10 cm yemekleri) kaplama tutarlılığını sağlamak tutarlı salgılanan insülin seviyeleri elde etmek için esastır.
Tahlil olası kaynaklar arasında değişkenlik HTRF okuma ile müdahale tahlil çözümlerinde köpüren. Bu baloncuklar önemli bir kaynağıdır sığır serum albumin (BSA) çeşitli tahlil KRB tabanlı çözümleri varlığıdır. Bu olası sorunu gidermek için azaltılması ya da bile BSA ortadan kaldırarak önemli ölçüde çözüm kabarcıkları en aza indirir ve bu nedenle HTRF sinyal güvenilirlik geliştirir. Bu, özellikle insülin standart eğri ve uyuşturucu dilutions oluştururken önemlidir. Bazal insülin salgısı hücre geçiş numarası bağımlı farklılıkları potansiyel tahlil değişkenliği (veri gösterilmez) başka bir kaynaktır. Bu Merglen ve aynı zamanda en uygun insülin salgılanması ~ 60-10015INS-1E hücre geçit sayıları arasında bulunur önerdi meslektaşları tarafından önceki çalışma ile tutarlıdır. Bu nedenle, insülin salgısı hücre geçiş sayısı için ilgili olası değişkenlik en aza indirmek için salgı deneyleri için bu iyi tanımlanmış hücre geçiş aralığını sınırlayarak öneririz.
Birincil hücre tabanlı insülin salgısı tahlil Bazal salgı INS-1E hücrelere içsel değişkenliği kısıtlamasıdır. Bunu büyüyen insülin salgılayan hücreler pankreas adacık fizyolojik bağlamı dışında bağlı olabilir. Nitekim, Alfa ve delta hücreleri de dahil olmak üzere adacık içinde diğer hücre tipleri Bazal ve uyarılmış insülin salgılanması beta hücreleri bir yerel, parakrin şekilde25modüle çok sayıda faktör salgılar. Bu diğer adacık hücre tipleri yokluğu insülin salgılanması, aksi halde fizyolojik olarak gözlenen daha büyük değişkenlik önde gelen sıkı Yönetmeliği rahatsız. 20 mM glikoz karşılık olarak salgılanan insülin neredeyse bazı durumlarda doyurarak beri başka bir potansiyel tahlil nispeten küçük doğrusal dizi kısıtlamadır. Sonuç olarak, su katılmamış hücre supernatants kalibrasyon eğrisi doğrusal kısmını dışarı uyarılmış insülin salgılanması üzerine insülin secretagogues etkileri olabilir. Bu ancak, yeterince insülin kalibrasyon eğrisi doğrusal aralığı düşmek izin vermek için insülin içeren süpernatant sulandrarak obviated ki.
Biz o agonism dopamin D2göstererek bizim tahlil doğrulanmış-yolu ile dopamin reseptörleri gibi bromokriptin ve quinpirole bakımları GSIS bir konsantrasyon bağımlı şekilde inhibe. Bu veriler bize GSIS üzerindeki etkileri açısından bu ilaçların (Yani, IC50 ve etkinliği) farmakolojik özellikleri belirlemek izin verdi. Sonuçlarımız dopamin ve merkezi sinir sistemi20,21,22,26dışındasinyal dopaminerjik için önemli bir rol düşündüren kanıt büyüyen bir vücut ile uyumludur, 27. Özellikle, bizim bulgular bu gösteren dopamin D2-reseptör agonist bromokriptin kuvvetli GSIS engeller, henüz son zamanlarda tip 2 diyabet24tedavisinde FDA tarafından onaylanmış, önemli soruyu da gündeme getiriyor: nasıl bu uyuşturucu tedavi türü 2 diyabet (insülin salgılanması en az akut düşürür Eğer T2D)? Bir potansiyel açıklaması "beta hücre rest." uğramak bromokriptin'ın kapasite ile ilgili İnsülin, genel bir oversecretion olduğu için T2D Kardinal özelliklerinden biri bu varsayıma göre bu sonuçta beta hücre hatası28için katkıda bulunabilir. Ayrıca, biz bu insülin öneririz T2D sırasında oversecretion Ayrıca azdırmak insülin direnci insülin duyarlılığı iskelet kas, karaciğer ve yağ dokusu gibi organların azalan tarafından. Böylece, engelleme veya GSIS azalan içinde yapım onları daha çok insülin cevap ve böylece insülin duyarlılığı artırmak bu hedef dokuların kademeli resensitization neden olabilir. Bir tahlil sistem yüksek üretilen iş tarama açar kapıyı her ikisine de gelecekte yapılacak çalışmalar için dopamin D2tarafından aracılı hücre içi sinyal yolları incelemek için mükellef olan-reseptörleri parakrin için sorumlu pankreas beta hücrelerinde hangi tarihlerde / daha fazla olarak otokrin GSIS inhibisyon de aydınlatmak mekanizmaları tarafından bromokriptin gibi ilaçlar şeker hastalığı belirtileri artırabilir.
HTRF teknoloji insülin salgılanması için yararlanır ve önemli ölçüde insülin hızlı ve verimli algılama önemli bir ilerleme gösteren bir hücre tabanlı insülin salgısı tahlil geliştirme maliyeti göreli ve/veya daha fazla azalmış RIA ve ELISA tabanlı yaklaşımlar güvenerek büyük insülin algılama deneyleri göre Emanet. Nitekim, ELISA ve RIA insülin deneyleri kıyaslanabilir duyarlı ve spesifik HTRF insülin tahlil için olsa, algılama, homojen doğası ortadan kaldırır çok sayıda ek yıkama adımları bu diğer tahlil sistemleri7' de mevcut. Ayrıca, HTRF sinyal göreli istikrar güvenilir insülin ölçüm için başka bir önemli avantaj sağlar.
Birlikte, HTRF alınan insülin salgısı tahlil hızla hücresel insülin salgılanması bağlamında birden çok ilaçların farmakolojik özellikleri arasında ayrımcılık yeteneğine sahiptir. Ayrıca, bu tahlil'ın nispeten kullanım kolaylığı ve güçlü sinyal mükellef yüksek üretilen iş tarama yapmak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz Nicolas Pierre (Cisbio BİYOANALİZLER) için faydalı tavsiyeler ve Dr. Pierre Maechler (Cenevre Üniversitesi) cömertçe INS-1E hücreleri verdiğiniz için teşekkür ederiz. Bu eser Savunma Bakanlığı (grant PR141292 Z.F. için) ve John F. ve Nancy A. Emmerling Fonu (için Z.F.) Pittsburgh Vakfın fon tarafından desteklenmiştir.
Acknowledgments
Yazarlar ifşa gerek yok.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well white half area plate | Greiner Bio-One | 82050-042 | |
| 384-well white low-volume, round-bottom plate | Corning | 15100157 | |
| Insulin High Range Kit | Cisbio Bioassays | 62IN1PEH | 10,000 test HTRF-based insulin assay kit |
| PHERAstar FSX plate reader | BMG Labtech | FSX | Plate reader adapted for HTRF-based assay readings |
| Plate sealers | Fisher Scientific | DY992 | To seal plate while antibodies incubate |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| RPMI Medium 1640 (1x) | Gibco | 11875-093 | [+] L-glutamine |
| Trypsin 0.05% | Corning | 25-052-CI | 0.53 mM EDTA, (-) sodium bicarbonate |
| DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline) | Corning | 21-031-CV | Without calcium and magnesium |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| HEPES | Gibco | 156-30-080 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| Penicillin/Streptomycin solution 100x | Corning | 30-002 CT | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M1348 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Dopamine hydrochloride | Sigma | 8502 | |
| Bromocriptine mesylate | Tocris | 427 | |
| (-)-Quinpirole hydrochloride | Tocris | 1061 | |
| Bovine Serum Albumin | Calbiochem | 12659 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4832 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma | 276855 |
References
- Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. Critical nodes in signalling pathways: Insights into insulin action. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (2), 85-96 (2006).
- Vetere, A., Choudhary, A., Burns, S. M., Wagner, B. K. Targeting the pancreatic beta-cell to treat diabetes. Nat Rev Drug Discov. 13 (4), 278-289 (2014).
- Despres, J. P., Lemieux, I. Abdominal obesity and metabolic syndrome. Nature. 444 (7121), 881-887 (2006).
- Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).
- Barg, S. Mechanisms of exocytosis in insulin-secreting B-cells and glucagon-secreting A-cells. Pharmacol Toxicol. 92 (1), 3-13 (2003).
- Braun, M., Ramracheya, R., Rorsman, P. Autocrine regulation of insulin secretion. Diabetes Obes Metab. 14 Suppl 3, 143-151 (2012).
- Farino, Z. J., et al. Development of a rapid insulin assay by homogenous time-resolved fluorescence. PLoS One. 11 (2), e0148684 (2016).
- Simpson, N., et al. Dopamine-mediated autocrine inhibitory circuit regulating human insulin secretion in vitro. Mol Endocrinol. 26 (10), 1757-1772 (2012).
- Heyduk, E., Moxley, M. M., Salvatori, A., Corbett, J. A., Heyduk, T. Homogeneous insulin and C-Peptide sensors for rapid assessment of insulin and C-peptide secretion by the islets. Diabetes. 59 (10), 2360-2365 (2010).
- Heyduk, T. Measuring protein conformational changes by FRET/LRET. Curr Opin Biotechnol. 13 (4), 292-296 (2002).
- Degorce, F. HTRF((R)): Pioneering technology for high-throughput screening. Expert Opin Drug Discov. 1 (7), 753-764 (2006).
- Degorce, F., et al. HTRF: A technology tailored for drug discovery - a review of theoretical aspects and recent applications. Curr Chem Genomics. 3, 22-32 (2009).
- Mathis, G. HTRF(R) Technology. J Biomol Screen. 4 (6), 309-314 (1999).
- Daijo, J. E., Sportsman, J. R. A time-resolved fluorescence immunoassay for insulin in rodent plasma. J Pharm Biomed Anal. 19 (3-4), 335-342 (1999).
- Merglen, A., et al. Glucose sensitivity and metabolism-secretion coupling studied during two-year continuous culture in INS-1E insulinoma cells. Endocrinology. 145 (2), 667-678 (2004).
- Ustione, A., Piston, D. W. Dopamine synthesis and D3 receptor activation in pancreatic beta-cells regulates insulin secretion and intracellular [Ca(2+)] oscillations. Mol Endocrinol. 26 (11), 1928-1940 (2012).
- Ustione, A., Piston, D. W. A simple introduction to multiphoton microscopy. J Microsc. 243 (3), 221-226 (2011).
- Ustione, A., Piston, D. W., Harris, P. E. Minireview: Dopaminergic regulation of insulin secretion from the pancreatic islet. Mol Endocrinol. 27 (8), 1198-1207 (2013).
- Rubi, B., et al. Dopamine D2-like receptors are expressed in pancreatic beta cells and mediate inhibition of insulin secretion. J Biol Chem. 280 (44), 36824-36832 (2005).
- Garcia-Tornadu, I., et al. Disruption of the dopamine d2 receptor impairs insulin secretion and causes glucose intolerance. Endocrinology. 151 (4), 1441-1450 (2010).
- Garcia-Tornadu, I., et al. New insights into the endocrine and metabolic roles of dopamine D2 receptors gained from the Drd2 mouse. Neuroendocrinology. 92 (4), 207-214 (2010).
- Lopez Vicchi, F., et al. Dopaminergic drugs in type 2 diabetes and glucose homeostasis. Pharmacol Res. 109, 74-80 (2016).
- Kalra, S., Kalra, B., Agrawal, N., Kumar, S. Dopamine: The forgotten felon in type 2 diabetes. Recent Pat Endocr Metab Immune Drug Discov. 5 (1), 61-65 (2011).
- Mahajan, R. Bromocriptine mesylate: FDA-approved novel treatment for type-2 diabetes. Indian J Pharmacol. 41 (4), 197-198 (2009).
- Caicedo, A. Paracrine and autocrine interactions in the human islet: more than meets the eye. Semin Cell Dev Biol. 24 (1), 11-21 (2013).
- Ballon, J. S., Pajvani, U., Freyberg, Z., Leibel, R. L., Lieberman, J. A. Molecular pathophysiology of metabolic effects of antipsychotic medications. Trends Endocrinol Metab. , (2014).
- Freyberg, Z., Aslanoglou, D., Shah, R., Ballon, J. S. Intrinsic and antipsychotic drug-induced metabolic dysfunction in schizophrenia. Front Neurosci. 11, 432 (2017).
- de Leeuw van Weenen, E. J., et al. The dopamine receptor D2 agonist bromocriptine inhibits glucose-stimulated insulin secretion by direct activation of the alpha2-adrenergic receptors in beta cells. Biochem Pharmacol. 79 (12), 1827-1836 (2010).
