Summary
Здесь мы представляем однородной время решена ладу (HTRF) как эффективный метод для быстрого обнаружения инсулина выделяется из клеток.
Abstract
Обнаружение секреции инсулина имеет решающее значение для разъяснения механизмов регулируется секреции также как и исследования метаболизма. Хотя многочисленные анализы инсулина существовали на протяжении десятилетий, недавние появлением однородных время решена Фёрстер передачи энергии резонанса (HTRF) технологии значительно упростила эти измерения. Это быстрый, экономически эффективным, воспроизводимые и надежные оптических пробирного зависит от антител, конъюгированных яркие флуорофоров с длительной выбросов, которая облегчает время решена Фёрстер резонанс передачи энергии. Кроме того для разработки высокопроизводительного скрининга анализов поддается HTRF инсулина обнаружения. Здесь мы используем HTRF для обнаружения секреции инсулина в INS-1E клеток, крысы линии инсулинома производные ячейки. Это позволяет нам оценить базальный уровень инсулина и их изменения в ответ на стимуляцию глюкозы. Кроме того мы используем эту систему обнаружения инсулина для подтверждения роли допамина как негативный регулятор секреции инсулина глюкоза стимулирует (ССГС). Аналогичным образом, другие допамина D2-как агонистами рецепторов, quinpirole и Бромокриптин, уменьшить ССГС в зависимости от концентрации. Наши результаты подчеркивают полезность формата пробирного инсулин HTRF в определении роли многочисленных лекарств в ССГС и их фармакологические профили.
Introduction
Регулирование энергии метаболизма скорректировать основных анаболический гормон инсулин. Инсулин синтезируется и выпущенное бета клеток поджелудочной железы в ответ на увеличение внеклеточного глюкозы. Выпустила инсулин вызывает усвоение глюкозы, инсулина чувствительных тканей1,2. Физиологически это связано с повышение концентрации глюкозы после еды, следуют секрецию инсулина, чтобы регулировать глюкозы. Нарушения гомеостаза глюкозы приводят к метаболические расстройства, кульминацией которых сопротивление инсулина и в конечном итоге в начале типа 2 диабет2,3,4.
Хотя широко изучены секреции инсулина, ее механизмы регулирования по-прежнему осознаются. Критической областью исследования было выявление романа Модуляторы секрецию инсулина бета-клеток5,6,,78. Эти исследования требуют лучшего понимания муфта отношения между глюкозы стимуляции и секреции инсулина. Таким образом способность точно контролировать и количественную оценку уровней инсулина глюкоза стимулирует секрецию (ССГС) весьма важное значение. На сегодняшний день, однако, лишь ограниченное количество методов были доступны дать количественную оценку данной ССГС с помощью секреции инсулина клеточных линий и/или панкреатических островков. Один является радиоиммуноанализ (RIA), которая использует радиоизотопные тегами инсулина и антител. Основные ограничения такого подхода включают вопросы безопасности за счет обработки и утилизации радиоактивных материалов. Кроме того этот метод является трудоемким, с участием нескольких долго стирки и инкубации шаги. Энзим соединенный assay иммуносорбента (ELISA) является другой дорогостоящие и трудоемкие подход, который использует антитела для обнаружения инсулина. Вариации в антитела сродства и эффективности признания инсулина сдерживающими факторами этого метода и может повлиять на воспроизводимость результатов. ELISA ни РИА был разработан для высокой пропускной способности экспериментов. AlphaScreen является однородной пробирного используется для обнаружения и измерения уровня секреции инсулина. Технология AlphaScreen основана на преобразование атмосферного кислорода в состояние синглетно возбужденных кислорода, которые могут реагировать с хемилюминесцентный видов, что приводит к генерации хемилюминесценции. Потому что assay однородной, многие из стиральной шаги, связанные с РИА и ELISA устраняются. Однако нестабильность сигнала благодаря характер реакции является ограничивающим фактором, который может повлиять на значение индикации assay. (TR-клещи, разработанный Heyduk и коллеги9, является другой однородной подход к инсулина измерения, основанные на связывание двух отдельных антител к различным эпитопам на молекуле инсулина. Антитела являются каждого химически связаны с двойной мель ДНК с короткие дополнительные одного мель ДНК свесы. Связывание антител к инсулину объединяет их и приводит к двойной дуплекс мель ДНК. Каждое антитело также связан с соответствующими донорами или акцепторной Флюорофор, и Ассоциация ДНК дуплекс объединяет эти флуорофоров для создания передачи энергии резонанса Фёрстер (лад). Одним из потенциальных ограничений TR-клещи, однако, лежит на ладу, сам. Невозможность быстро рассеивать флуоресценции фон во время реакции лад может привести к относительно высоким уровнем фона флуоресценции и низкое соотношение сигнал-шум в assay. Таким образом по-прежнему существует необходимость для надежные, надежной и рентабельной assay для количественной оценки ССГС в духе высокой пропускной способности.
Последние достижения в биофизике привели к разработке однородной флуоресценции время решена энергии резонанса передачи (HTRF) на основе анализа. В частности в то время как энергия передачи в пределах assay можно охарактеризовать как основанные на ладу, более точно, HTRF опирается на люминесценции энергии резонанса передачи (среде)10 , который является не радиационное передачи энергии между доноров и акцепторов видов11,12,13. Это различие имеет важное значение, поскольку сроки флуоресценции или тушения на основе взаимодействия ладу сильно отличается, чем для его, хотя для ладу и его могут использоваться те же типы стробирования. Кроме того использование редкоземельных лантаноиды cryptate соединений например европий или Тербий cryptate в HTRF производит длинные флуоресценции полураспада12,14. Это дает уникальные преимущества введения задержки (µsec) между донорами возбуждения и измерения выбросов от акцептор (то есть, время решена проба). Эта задержка позволяет достаточно времени для флуоресценции фон для рассеивания до измерения флуоресценции акцептора выбросов. Следовательно, индикация является бесплатным неспецифичные флуоресценции и таким образом, достигается высокое соотношение сигнал шум (рис. 1). Кроме того однородный характер HTRF устраняет необходимость для мытья шаги смыть несвязанных видов, что делает assay намного более быстрым чем ELISA или методы, основанные на РИА.
Рисунок 1: схема механизма обнаружения инсулин HTRF. Два самостоятельно сгенерированный моноклональные антитела конкретно признать и привязку к инсулина на отдельных участках. Эти антитела конъюгированных европий cryptate доноров или акцепторной XL665. Возбуждения донора в 337 нм приводит к эмиссии на 620 Нм. Результате переноса энергии вызывает XL665 выпустить на больше длины волны, 665 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Здесь, мы предоставляем подробный протокол для использования подхода на основе HTRF для определения уровней ССГС от клеток INS-1E, устоявшихся инсулин секреции бета клеток крыса инсулинома клеток линии15. Кроме того этот assay может использоваться для идентификации фармакологических профиль молекулярных регуляторов секреции инсулина. Мы применяем этот assay на основе HTRF инсулина для изучения допамина D2-как рецептор регулирование ССГС. Все исследования показали, что нейротрансмиттеров допамина является важным регулятором ССГС8,16,,1718,19,20, 21 , 22. допамина влияет ССГС отрицательным образом Аутокринный/паракринными через действия на допамин D2-как рецепторы (Д-2, D3, D4 рецепторов) выразил на поверхности бета-клеток поджелудочной железы8 , 16 , 19. используя этот assay, мы подтверждаем допамина в роли как негативный регулятор ССГС и продемонстрировать, что допамина D2-как Бромокриптин агонистами рецепторов и quinpirole также уменьшить ССГС.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. INS-1E клетки: техническое обслуживание и покрытие
- Сохранять INS-1E клетки в увлажненные 37 ˚C/5% CO2 инкубатора и культивировали среду RPMI 1640 дополнена 5% (v/v) тепло инактивированная плода бычьим сывороточным, 2 мм L-глютамином, 10 HEPES, пируват натрия 1 мм, 100 ед/мл пенициллина/стрептомицина решение, 50 мкм β-меркаптоэтанол. Культура клетки в 10 мл полного среднего RPMI 1640 (на пластину), до тех пор, пока они достигают 80-90% слияния, когда они могут быть trypsinized и пассированной или использоваться для assay секреции инсулина.
- День 1: Аспирационная СМИ и вымыть клетки один раз с 5 мл подогретым PBS. Добавьте 0,5 мл трипсина (0,025%) разводят 1:1 в 0,5 мл PBS trypsinize клетки и Инкубируйте 3-4 мин на 37 градусов. Деактивируйте трипсина, добавив 9 мл полные средства массовой информации и передачи клетки для пластиковых пробирок 15мл, закупорить.
- Пелле клетки центрифугированием и вновь приостановить Пелле клеток в приблизительно 5 мл свежего СМИ.
- Возьмите 10 мкл вновь приостановлено клеток и смешать с 10 мкл жизненно Трипановый синий краситель для проверки жизнеспособности клеток. Граф живые и мертвые клетки в 10 мкл этой смеси с помощью Горяева. Жизнеспособность уровень должен быть выше 90%. Разбавьте вновь приостановлено клетки в свежих СМИ 1 миллион клеток / мл.
- Семя 0,5 мл INS-1E ячеек на скважину в поли L-лизин предварительно покрытием 24-ну пластины, на плотности 500 000 клеток/хорошо.
- 2-й день: Удалите медиа 18-24 ч после покрытия и добавить 500 мкл/хорошо свежие RPMI 1640 средств массовой информации. Инкубируйте клетки для еще 24 часа позволить клетки, чтобы полностью оправиться от предварительного passaging шаг. Это дополнительное время позволяет клетки для распространения на пластину культуры ткани.
2. инсулин секрецию Assay (день 3)
- Подготовить KRB буфера: 132.2 мм NaCl, 3,6 мм KCl, 5 мм NaHCO3, 0.5 мм NaH2PO4, 0,5 мм MgCl2, CaCl 1,5 мм2и 0,001 г/мл, бычьим сывороточным альбумином (БСА), рН 7,4.
- Аспирационная СМИ от клеток и мыть дважды с подогретым PBS.
- Для шага голода глюкозы добавьте 450 мкл/хорошо KRB (содержащий BSA) без глюкозы в течение 1 ч 37 ˚C/5% CO2.
- Во время голодания шага глюкозы, подготовить серийных разведений препаратом в KRB, содержащие 200 мм глюкозы (10 x концентрации).
- Подготовьте наркотиков в 10 x конечная концентрация в KRB дополнена 200 мм глюкозы (также 10 x концентрации глюкозы окончательный анализ). Если запасы наркотиков (плюс добавлен 10 x глюкоза) находится в ДМСО, убедитесь, что ДМСО процент остается несогласованной пробирного (идеально окончательный процент меньше, чем 0.1% ДМСО).
- Для допамина и quinpirole лечения, использовать окончательный анализ наркотиков диапазон концентраций 100 мкм до 100 м (от высокой к низкой концентрации), с последней точки доза ответ, содержащий без наркотиков. Для Бромокриптин используйте окончательный анализ концентрации диапазон 10 мкм до 10 вечера, с последней точки ответа дозу, будучи свободной от наркотиков управления.
- После голодания глюкозы добавьте наркотиков серийных разведений в assay производить дозы ответ.
- Добавьте 50 мкл/хорошо каждый серийный разбавления соответствующий скважин (всего пробирного объем 500 мкл).
- Для стимуляции шаг глюкозы, клетки с серийных разведений соответствующих наркотиков (в присутствии 20 мм глюкозы) Инкубируйте 90 мин на 37 ˚C/5% CO2. Включает в себя набор контроля скважин: (1) стимуляции с 20 мм глюкозы только в отсутствие каких-либо дополнительных наркотиков и (2) клетки, которые стимулируются ни с наркотиками, ни глюкозы (которая обеспечивает базальный уровень секреции).
- После стимуляции шага осторожно удалите supernatants (использование непосредственно или хранить при 4 ° c).
Примечание: Дополнительные 5 мин мягкое центрифугирование шаг (600 x g, 1 мин) могут быть введены в этот момент чтобы удалить все оставшиеся ячейки в supernatants пробирного.
3. HTRF для измерения секреции инсулина
- Разбавьте пробирного supernatants 1:10 в KRB (без BSA), предпочтительно в ясно 96-луночных пластины.
- Подготовьте калибровочной кривой инсулина для assay инсулин HTRF (таблица 1).
| Стандартный раствор 500 нг/мл | Серийных разведений | Работа [инсулина] нг/мл |
| STD 7 | 30 мкл фондовой + 140 KRB мкл | 150 |
| STD 6 | 30 мкл STD 7 + 45 мкл KRB | 60 |
| STD 5 | 30 мкл STD 6 + 45 мкл KRB | 24 |
| STD 4 | 30 мкл STD 5 + 45 мкл KRB | 9.6 |
| STD 3 | 30 мкл STD 4 + 45 мкл KRB | 3.84 |
| STD 2 | 30 мкл STD 3 + 45 мкл KRB | 1.54 |
| STD 1 | 30 мкл STD 2 + 45 мкл KRB | 0,61 |
| STD 0 | KRB 45 мкл | 0 |
| Примечание: STD фондовая-500 нг/мл | ||
Таблица 1. Серийных разведений для сделать стандартной кривой инсулина.
- Добавьте образцы калибровочной кривой и разбавленных пробирного supernatants HTRF пластины. Измерение выделяется инсулина, HTRF может осуществляться в 96-луночных или формат 384-ну пластины, имея в виду, что пробирного объем должен корректироваться повторно. Использование 10 мкл/хорошо образец в 96-луночных белая половина площадь пластин или 5 мкл/колодец в 384-ну белый низким объемом, раунд нижней плиты (см. Таблицу материалы).
- Приготовить смесь антител в буфере обнаружения (см. Таблицу материалы) в донором 1:2 (cryptate) / акцептора (XL-665) отношение.
Примечание: Дальнейшие подробные сведения о HTRF assay доступны от производителя. - Добавьте смесь антител к assay 30 мкл/хорошо (для 96 хорошо плита пробирного формата) или 15 мкл/скважины (для формата пробирного 384-ну пластины).
- Печать пластину и инкубации при комнатной температуре.
- Читайте пластины после 2 h, 4 h или ночь инкубации с антителами, используя читателя пластины и соответствующий модуль оптического HTRF (337 665 620 Нм) (см. Таблицу материалы и инструкции производителя). Задать начало интеграции на 60 МКС и время интеграции на 400 МКС. Использование 200 вспышки за хорошо.
Примечание: Эти параметры были основаны на использовании нашего конкретного читателя. Индикация в 620 Нм и 665 нм могут варьироваться между различными инструментами. Это одна из причин, почему мы рекомендуем использовать соотношение 665/620. При расчете этого показателя, любые потенциальные различия от читателя к читателю будет нормализована и обеспечивают согласованные значения независимо от того, инструмент, используемый для измерения HTRF.
4. анализ данных и нормализации
- Рассчитать концентрации инсулина пробирного скважин через экстраполяция ratiometric чтений (665 нм/620 Нм) флуоресценции для второго порядка полиномиальной кривой (рис. 2).
Рисунок 2 : Калибровочной кривой инсулина. Инсулин человеческий запас известных концентрациях был использован для создания стандартной кривой инсулина. Результате соотношения HTRF (665 нм / 620 Нм) были заговоре против концентрации инсулина. Данные были лучше всего подходят для второго порядка полиномиальной кривой (R2 = 0.99996). Это представитель калибровочной кривой. Планки погрешностей = SEM. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
- С экстраполяции данных как нг/мл секретируемых инсулина нормализовать (инсулина в ответ на повышение концентрации лигандом) среднее значение % максимальный инсулина секрецию пробирного скважин (20 мм глюкозы только условие).
- Используйте кривая fit (R2) от одного эксперимента для вычисления межплитовых вариации. В рамках эксперимента производными внутри экспериментальной дубликаты, позволяя расчет Среднеквадратичная ошибка среднего для кривой отдельные значения R2 .
- Для определения interplate вариации, используйте данные из по меньшей мере три отдельных экспериментов для вычисления стандартной ошибки означают для R значение2 коллективного кривой.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы проверяются нашего анализа HTRF инсулина путем создания инсулина калибровочной кривой с использованием очищенного инсулина человека стандартов предопределенных концентрации (рис. 2). Поколение стандартной кривой, позволил нам экстраполировать чтений флуоресценции ratiometric и, таким образом, чтобы определить уровень выделяется инсулина в ответ на медикаментозного лечения (рис. 2). Межплитовых вариации для кривой было минимальным (R2 = 0.99996 ± 5,0 x 10-5) как было interplate вариации (R2 = 0.947 ± 5.5 x 10-5; n = 3 пластины).
Далее мы определили уровень базальной секреции инсулина из INS-1E клеток. Используя плотность посева 5 x 105 клеток на хорошо в формате 24-ну пластины, мы обнаружили, что клетки секретным 54.53 ± 2,2 нг/мл инсулина при отсутствии глюкозы длительностью 90 минут инкубации в ванну статической. Добавление глюкозы 20 мм для стимулирования ССГС обеспечило значительное повышение в ССГС (112,4 ± 5.2 нг/мл инсулин; p < 0.0001) (рис. 3).
Рисунок 3 : Оценка базальной против секреции инсулина стимулировали. INS-1E клетки рассматривались в отсутствие или наличие высокой глюкозы (20 мм) стимуляции 90 мин. В два раза уровень секреции инсулина был обнаружен в ответ на стимуляцию высокой глюкозы относительно кератоз клетки (базальная секреция условие; *** p < 0.0001, двустороннее непарных t-тест). N = 5; Все анализы были проведены в triplicates. Планки погрешностей = SEM. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Для расследования роли дофаминергической D2-как стимуляция рецепторов в ССГС в рамках нашей системы клеток INS-1E, мы инкубировали клетки присутствии Д2-как рецептора агонистом наркотиков (дофамина, quinpirole и Бромокриптин) во время 90 мин. стимуляция период с глюкозы 20 мм (рис. 4).
Рисунок 4 : HTRF обнаружение допамина D2 -как рецептора агонистом ингибирование ССГС. INS-1E клетки относились с увеличением концентрации допамина D2-как рецепторов агонистов 90 мин в присутствии высоких глюкозы (20 мм; 37 градусов). (A) допамина тормозится ССГС IC50= 1,78 ± 3,9 мкм (R2 = 0.4355). (B) Бромокриптин был более мощным, чем допамина в сокращении ССГС (IC50 = 13,9 Нм ± 2,4, R2 = 0.7501). (C) Quinpirole в потенции был похож на допамин (IC50 = 3,3 ± 3 μm, R2 = 0.3617). Все данные были лучше всего подходят к нужным сигмоид кривой тремя параметрами. «0 мм глюкозы ' точка указывает на секрецию базального инсулина клетками INS-1E в отсутствие стимуляции высокой глюкозы (20 мм). N > 3; Все анализы были проведены в triplicates на отдельных экспериментальных дней. Планки погрешностей = SEM. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Эффективность и эффективность этих препаратов агонист определяется графиков кривых секреции инсулина. Мы обнаружили, что в отсутствие стимуляции с высоким глюкозы, клетки INS-1E, по-прежнему выделяют инсулин, хотя и заметно ниже степени (обозначается состояние 0 мм), в соответствии с ранее докладов15. Наши результаты показывают, что допамина, эндогенного агонист D2-как рецепторы, ингибирует ССГС образом зависящих от коалиции (да IC50 = 1,78 ± 3,9 мкм; На рисунке 4A). В отличие от, бромокриптин, наркотиков, утвержденных для лечения типа 2 диабет23,24, был заметно более мощным, чем допамина в производстве ССГС ингибирование (IC50 = 13,9 Нм ± 2,4; Рисунок 4B). И наконец хотя менее эффективными чем бромокриптин, quinpirole выставлены же потенции допамина в ССГС ингибирование (IC50 = 3,3 ± 3 μm; Рисунок 4 c).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Пробирного инсулин HTRF, описанные здесь предлагает быстрые, эффективные системы для измерения секреции инсулина от культурной системы, основанной на ячейку. Среди его наиболее важных преимуществ этот assay предлагает низкий фонового сигнала из-за высокое соотношение сигнал шум. Кроме того, мы подтвердили, что сигнал HTRF стабильным для длительных периодов времени (> 24 h)7. Тем не менее поскольку инсулин привязки моноклональные антитела быстро достичь привязки насыщения после добавления к assay, кинетика антитела связывая могут быть затронуты температуры окружающей среды или изменения в уровнях выделяется инсулина. Таким образом мы читаем пробирного пластины в нескольких точках времени (2 h, 4 h и ночевка) точно определить, когда антитела достигли полного насыщения и HTRF сигнала является наиболее надежной7. Мы также недавно показали, что инсулин антител не значительно cross-react с проинсулин или c пептида, предположить, что assay весьма специфична для зрелой инсулина7.
Важным шагом в процессе оптимизации анализа предусматривает создание широкого динамического диапазона секреции инсулина. Этот динамический диапазон определяется как разница в обнаруженных инсулина во время базальную (кератоз) против секреции инсулина стимулировали. Мы находим, что первоначальный краткий глюкозы голода шаг (0 мм глюкозой, 1Н) предыдущие высокие глюкоза стимуляции расширяет динамический диапазон, грунтовка INS-1E клетки выделяют больше инсулина в ССГС. В более ранних работ, мы показали пробирного динамический диапазон от 0,17 нг/мл (предел обнаружения) до уровня ~ 110 нг/мл инсулина с соотношение сигнал-шум 10.027. Кроме того количество выделяется инсулина зависит от количества первоначальных клеток покрытием за хорошо. Далее мы оптимизировали assay путем стандартизации пассированый и обработки INS-1E клеток. Для получения последовательной выделяется инсулин уровнях важно поддержание согласованности в пассированый расписание и покрытие в конкретных пластинчатого типа (например, 10 см блюда).
Среди потенциальных источников пробирного изменчивость кипит в Пробирной решения, которые мешают индикация HTRF. Важным источником этих пузырьков является наличие бычьим сывороточным альбумином (БСА) в различных растворах на основе KRB пробирного. Для устранения этой потенциальной проблемы, сокращение или даже ликвидацию BSA существенно минимизирует пузыри в решении и таким образом улучшает надежность сигнал HTRF. Это особенно важно при создании инсулина калибровочной кривой и разбавления наркотиков. Клетки проход номер зависимых различия в секреции базального инсулина являются еще одним источником потенциальных анализа изменчивости (данные не показаны). Это согласуется с предыдущей работы Merglen и его коллеги, которые также предложили секреции инсулина оптимального находится между INS-1E числа клеток проход15~ 60-100. Таким образом чтобы свести к минимуму возможные изменчивости в секреции инсулина, связанных с ячейки номер прохода, рекомендуется ограничить секрецию анализов в этот проход четко определенных ячеек.
Основным ограничением пробирного секрецию инсулина на основе ячеек является изменчивость базальной секреции, встроенные в INS-1E клетки. Это может быть связано с растущей секреции инсулина клетки вне физиологических контекста поджелудочной островок. Действительно другие типы клеток в Иле, включая альфа- и Дельта клетки секретируют многочисленные факторы, которые могут модулировать секреции базальную и стимулированную инсулина из бета-клеток в местных, паракринными образом25. Отсутствие этих других типов островковых клеток может нарушить туго регуляции секреции инсулина, приводит к большей изменчивости, чем в противном случае наблюдается физиологически. Еще одним потенциальным ограничением является относительно небольшой линейный диапазон assay, поскольку инсулина в ответ на 20 мм глюкозы почти насыщения в некоторых случаях. В результате в неразбавленном мобильные supernatants, эффекты инсулина secretagogues на секрецию инсулина стимулировали может быть из линейной части калибровочной кривой. Это однако, устраняют путем разбавления инсулин содержащих супернатант достаточно, чтобы позволить инсулина, чтобы попасть в диапазона линейной калибровочной кривой.
Мы проверить наши пробирного, показывая что агонизмом дофамина D2-как рецепторы через допамина, бромокриптин и quinpirole лечения препятствует ССГС в зависимости от концентрации. Эти данные позволили нам определить фармакологических свойств этих препаратов (то есть, IC50 и эффективность) с точки зрения их воздействия на ССГС. Наши результаты согласуются с растущее число доказательств того, важную роль для допамина и дофаминергической сигнализации за пределами центральной нервной системы в20,21,22,26, 27. В частности, наши выводы, показывая, что допамина D2-рецептора агонистом Бромокриптин мощно подавляет ССГС, еще недавно был одобрен FDA для лечения типа 2 диабет24, поднимает важный вопрос: как может этот препарат лечения типа 2 сахарный диабет (T2D), если он снижает секрецию инсулина, по крайней мере остро? Одно из возможных объяснений может быть связано с бромокриптин и способность нести «бета клеток отдых.» Согласно этой гипотезе так как одна из основных особенностей T2D общий излишнего выделения инсулина, что в конечном счете может способствовать бета клеток провал28. Кроме того, мы предлагаем что инсулин излишнего выделения во время T2D может также усугубить сопротивление инсулина путем снижения чувствительности к инсулину органов, включая скелетных мышцах, печени и жировой ткани. Таким образом блокирование или уменьшение ССГС может привести к постепенному resensitization этих тканях-мишенях, делая их более чутко реагировать на инсулин и повышая чувствительность инсулина. Имея систему пробирного поддаются высокопроизводительного скрининга открывает двери для будущей работы как вскрыть внутриклеточных сигнальных путей, посредничестве допамина D2-как рецепторы в поджелудочной бета-клеток, которые отвечают за паракринными / Аутокринный ССГС ингибирования также дальнейшего выяснения механизмов, в которых наркотики как Бромокриптин может улучшить симптомы диабета.
Разработка assay секрецию инсулина на основе ячеек, который использует HTRF технологии для секреции инсулина и представляет собой значительный шаг вперед в быстрое и эффективное обнаружение инсулина на значительно уменьшилась стоимость относительный или более безопасность по сравнению с старше анализов обнаружения инсулина, полагаясь на РИА и подходы на основе ELISA. Действительно хотя инсулина assays ELISA и РИА соответствующе чувствительных и специфические для assay инсулин HTRF, однородный характер обнаружения, устраняет многочисленные шаги дополнительной стирки, присутствующих в этих других7пробирного систем. Кроме того относительная стабильность HTRF сигнала обеспечивает другим ключевым преимуществом для измерения надежной инсулина.
Взятые вместе, HTRF пробирного секрецию инсулина имеет возможность быстро дискриминацию между фармакологических свойств нескольких препаратов в контексте секреции инсулина сотовой. Кроме того этот assay относительно простоты использования и надежный сигнал сделать поддаются для высокопроизводительного скрининга.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Мы благодарим Nicolas Пьер (Cisbio Bioassays) за полезные советы и доктор Пьер Maechler (Женевский университет) за щедро предоставленные INS-1E клетки. Эта работа была поддержана финансирование от министерства обороны (Грант PR141292 в з.ф.) и Нэнси а. Emmerling фонда Фонда Питтсбург (чтобы з.ф.) и Джон ф.
Acknowledgments
Авторы не имеют ничего сообщать.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well white half area plate | Greiner Bio-One | 82050-042 | |
| 384-well white low-volume, round-bottom plate | Corning | 15100157 | |
| Insulin High Range Kit | Cisbio Bioassays | 62IN1PEH | 10,000 test HTRF-based insulin assay kit |
| PHERAstar FSX plate reader | BMG Labtech | FSX | Plate reader adapted for HTRF-based assay readings |
| Plate sealers | Fisher Scientific | DY992 | To seal plate while antibodies incubate |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| RPMI Medium 1640 (1x) | Gibco | 11875-093 | [+] L-glutamine |
| Trypsin 0.05% | Corning | 25-052-CI | 0.53 mM EDTA, (-) sodium bicarbonate |
| DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline) | Corning | 21-031-CV | Without calcium and magnesium |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| HEPES | Gibco | 156-30-080 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| Penicillin/Streptomycin solution 100x | Corning | 30-002 CT | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M1348 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Dopamine hydrochloride | Sigma | 8502 | |
| Bromocriptine mesylate | Tocris | 427 | |
| (-)-Quinpirole hydrochloride | Tocris | 1061 | |
| Bovine Serum Albumin | Calbiochem | 12659 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4832 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma | 276855 |
References
- Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. Critical nodes in signalling pathways: Insights into insulin action. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (2), 85-96 (2006).
- Vetere, A., Choudhary, A., Burns, S. M., Wagner, B. K. Targeting the pancreatic beta-cell to treat diabetes. Nat Rev Drug Discov. 13 (4), 278-289 (2014).
- Despres, J. P., Lemieux, I. Abdominal obesity and metabolic syndrome. Nature. 444 (7121), 881-887 (2006).
- Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).
- Barg, S. Mechanisms of exocytosis in insulin-secreting B-cells and glucagon-secreting A-cells. Pharmacol Toxicol. 92 (1), 3-13 (2003).
- Braun, M., Ramracheya, R., Rorsman, P. Autocrine regulation of insulin secretion. Diabetes Obes Metab. 14 Suppl 3, 143-151 (2012).
- Farino, Z. J., et al. Development of a rapid insulin assay by homogenous time-resolved fluorescence. PLoS One. 11 (2), e0148684 (2016).
- Simpson, N., et al. Dopamine-mediated autocrine inhibitory circuit regulating human insulin secretion in vitro. Mol Endocrinol. 26 (10), 1757-1772 (2012).
- Heyduk, E., Moxley, M. M., Salvatori, A., Corbett, J. A., Heyduk, T. Homogeneous insulin and C-Peptide sensors for rapid assessment of insulin and C-peptide secretion by the islets. Diabetes. 59 (10), 2360-2365 (2010).
- Heyduk, T. Measuring protein conformational changes by FRET/LRET. Curr Opin Biotechnol. 13 (4), 292-296 (2002).
- Degorce, F. HTRF((R)): Pioneering technology for high-throughput screening. Expert Opin Drug Discov. 1 (7), 753-764 (2006).
- Degorce, F., et al. HTRF: A technology tailored for drug discovery - a review of theoretical aspects and recent applications. Curr Chem Genomics. 3, 22-32 (2009).
- Mathis, G. HTRF(R) Technology. J Biomol Screen. 4 (6), 309-314 (1999).
- Daijo, J. E., Sportsman, J. R. A time-resolved fluorescence immunoassay for insulin in rodent plasma. J Pharm Biomed Anal. 19 (3-4), 335-342 (1999).
- Merglen, A., et al. Glucose sensitivity and metabolism-secretion coupling studied during two-year continuous culture in INS-1E insulinoma cells. Endocrinology. 145 (2), 667-678 (2004).
- Ustione, A., Piston, D. W. Dopamine synthesis and D3 receptor activation in pancreatic beta-cells regulates insulin secretion and intracellular [Ca(2+)] oscillations. Mol Endocrinol. 26 (11), 1928-1940 (2012).
- Ustione, A., Piston, D. W. A simple introduction to multiphoton microscopy. J Microsc. 243 (3), 221-226 (2011).
- Ustione, A., Piston, D. W., Harris, P. E. Minireview: Dopaminergic regulation of insulin secretion from the pancreatic islet. Mol Endocrinol. 27 (8), 1198-1207 (2013).
- Rubi, B., et al. Dopamine D2-like receptors are expressed in pancreatic beta cells and mediate inhibition of insulin secretion. J Biol Chem. 280 (44), 36824-36832 (2005).
- Garcia-Tornadu, I., et al. Disruption of the dopamine d2 receptor impairs insulin secretion and causes glucose intolerance. Endocrinology. 151 (4), 1441-1450 (2010).
- Garcia-Tornadu, I., et al. New insights into the endocrine and metabolic roles of dopamine D2 receptors gained from the Drd2 mouse. Neuroendocrinology. 92 (4), 207-214 (2010).
- Lopez Vicchi, F., et al. Dopaminergic drugs in type 2 diabetes and glucose homeostasis. Pharmacol Res. 109, 74-80 (2016).
- Kalra, S., Kalra, B., Agrawal, N., Kumar, S. Dopamine: The forgotten felon in type 2 diabetes. Recent Pat Endocr Metab Immune Drug Discov. 5 (1), 61-65 (2011).
- Mahajan, R. Bromocriptine mesylate: FDA-approved novel treatment for type-2 diabetes. Indian J Pharmacol. 41 (4), 197-198 (2009).
- Caicedo, A. Paracrine and autocrine interactions in the human islet: more than meets the eye. Semin Cell Dev Biol. 24 (1), 11-21 (2013).
- Ballon, J. S., Pajvani, U., Freyberg, Z., Leibel, R. L., Lieberman, J. A. Molecular pathophysiology of metabolic effects of antipsychotic medications. Trends Endocrinol Metab. , (2014).
- Freyberg, Z., Aslanoglou, D., Shah, R., Ballon, J. S. Intrinsic and antipsychotic drug-induced metabolic dysfunction in schizophrenia. Front Neurosci. 11, 432 (2017).
- de Leeuw van Weenen, E. J., et al. The dopamine receptor D2 agonist bromocriptine inhibits glucose-stimulated insulin secretion by direct activation of the alpha2-adrenergic receptors in beta cells. Biochem Pharmacol. 79 (12), 1827-1836 (2010).
