Summary
Aqui, apresentamos homogênea tempo resolvido FRET (HTRF) como um método eficiente para detecção rápida de insulina secretada de células.
Abstract
A detecção de secreção de insulina é fundamental para elucidar os mecanismos de secreção regulamentado, bem como em estudos de metabolismo. Apesar de inúmeros ensaios de insulina já existem há décadas, o recente advento da tecnologia de Förster ressonância energia de transferência (HTRF) de tempo-resolvido homogênea simplificou significativamente estas medições. Isto é um ensaio óptico rápido, econômico, reprodutível e robusto depende dos anticorpos conjugados a brilhante fluorophores com emissão de longa duração, que facilita o tempo-resolvido Förster ressonância transferir energia. Além disso, a detecção de insulina HTRF é favorável para o desenvolvimento de ensaios de rastreio com throughput alto. Aqui usamos o HTRF para detectar a secreção de insulina em células INS-1E, uma linha de celular insulinoma-derivado de rato. Isso nos permite estimar os níveis basais de insulina e suas mudanças em resposta à estimulação de glicose. Além disso, nós usamos este sistema de deteção de insulina para confirmar o papel da dopamina como um regulador negativo da secreção de insulina glicose-estimulada (GSIS). De forma semelhante, outros de dopamina D2-como agonistas dos receptores, quinpirole e bromocriptina, reduzem GSIS de forma concentração-dependente. Nossos resultados destacam o utilitário do formato HTRF insulina ensaio para determinar o papel de numerosas drogas em GSIS e seus perfis farmacológicos.
Introduction
A regulação do metabolismo energético é aperfeiçoá-lo por um importante hormônio anabólico, a insulina. Insulina é sintetizada e liberada por células-beta do pâncreas em resposta aos níveis de glicose extracelular aumentado. A insulina liberada provoca a absorção de glicose pelos tecidos sensíveis à insulina1,2. Fisiologicamente, isto está ligado à elevação da concentração de glicose após uma refeição, seguida de secreção de insulina para regular a absorção de glicose. Perturbações na homeostase de glicose levam a deficiências metabólicas, culminando na resistência à insulina e, finalmente, no início da43,2,do diabetes tipo 2.
Embora a secreção de insulina tem sido extensivamente estudada, seus mecanismos regulatórios permanecem mal compreendidos. Uma área crítica de investigação tem sido a identificação de novos moduladores de secreção de insulina em células beta5,6,7,8. Estes estudos requerem uma melhor compreensão da relação de acoplamento entre a estimulação de glicose e a secreção de insulina. Portanto, a capacidade de precisão de monitorar e quantificar os níveis de secreção de insulina glicose-estimulada (GSIS) tem sido essencial. Até à data, no entanto, apenas um número limitado de métodos estava disponível para permitir a quantificação de GSIS usando linhas de células secretoras de insulina e/ou de ilhotas pancreáticas. Um é o radioimunoensaio (RIA), que utiliza anticorpos e insulina radioisótopo-tag. As principais limitações desta abordagem incluem questões de segurança devido à manipulação e eliminação de materiais radioactivos. Além disso, este método é trabalhoso, envolvendo múltiplos lavagem longa e etapas de incubação. Ensaio imunoenzimático (ELISA) é outra abordagem dispendiosa e trabalhosa que utiliza anticorpos para a deteção de insulina. Variação em afinidades de anticorpo e da eficiência de reconhecer a insulina estão limitando fatores desse método e pode afetar a reprodutibilidade dos resultados. ELISA, nem RIA foi projetado para experimentos de alta produtividade. AlphaScreen é um ensaio homogêneo usado para detectar e medir os níveis de secreção de insulina. AlphaScreen tecnologia baseia-se na conversão de oxigênio ambiente em um estado singlete oxigênio excitado que pode reagir com espécies quimioluminescente, resultando na geração de quimioluminescência. Porque o ensaio é homogêneo, muitas das etapas lavagem associadas a RIA e ELISA são eliminadas. No entanto, a instabilidade do sinal devido à natureza da reação é um fator limitante que possam afectar a leitura do ensaio. (TR-pinça, desenvolvido pela Heyduk e colegas9, é outra abordagem homogénea para medição de insulina com base na ligação de dois anticorpos separados para diferentes epitopos na molécula de insulina. Os anticorpos são cada DNA encalhado quimicamente ligado à dupla com curto complementares único encalhado DNA saliências. Ligação dos anticorpos à insulina reúne-os e leva a um duplex de DNA encalhado dobro. Cada anticorpo também está associado com um fluoróforo dador ou aceitador respectivo, e a associação do duplex de DNA reúne estes fluorophores para gerar a transferência de energia de ressonância de Förster (FRET). Uma limitação potencial de TR-pinça, baseia-se no entanto, com o traste em si. A incapacidade de dissipar rapidamente fluorescência de fundo durante a reação de FRET pode levar a níveis relativamente elevados de fluorescência de fundo e um baixo sinal à relação de ruído dentro do ensaio. Portanto, ainda existe uma necessidade para um ensaio confiável, robusto e econômico para quantificar GSIS em uma maneira de alta produtividade.
Avanços recentes em Biofísica culminaram no desenvolvimento de um ensaio de transferência (HTRF) com base de ressonância de energia homogênea fluorescência tempo-resolvido. Especificamente, enquanto a energia de transferência dentro o ensaio pode ser descrito como baseado no traste, mais precisamente, HTRF depende da luminescência energia ressonância transferência (LRET)10 que é non-radiative transferência de energia entre o doador e o aceptor espécie de11,12,13. Esta distinção é importante, desde o momento de uma fluorescência ou têmpera interação com base de FRET é muito diferente do que é para LRET, embora os mesmos tipos de retenção podem ser usados para FRET e LRET. Além disso, o uso de terras raras lantanídeos cryptate compostos tais como o európio ou térbio cryptate em HTRF produz fluorescência longa meia-vida de12,14. Isto oferece a vantagem exclusiva da introdução de um atraso de tempo (microssegundos por) entre a excitação do doador e a medição das emissões do aceitador (isto é, tempo-resolvido do ensaio). Este atraso do tempo permite tempo suficiente para que a fluorescência de fundo a dissipar-se antes da medição de fluorescência de emissão aceitador. Consequentemente, a leitura é livre de fluorescência não-específica e assim, uma alta relação sinal-ruído é alcançada (Figura 1). Além disso, a natureza homogênea de HTRF elimina a necessidade de etapas de lavagem para lavar a espécie desacoplada, fazendo o ensaio muito mais rápido do que os métodos baseados em RIA ou ELISA.
Figura 1: esquemático do mecanismo para a deteção de insulina HTRF. Dois anticorpos monoclonais independentemente gerados especificamente reconhece e vincule a insulina em locais separados. Estes anticorpos são conjugados para o doador de cryptate de európio ou o aceitador de XL665. Excitação do doador em 337 resultados de nm em emissão a 620 nm. A transferência de energia resultante faz com que XL665 emitir um comprimento de onda mais longos, 665 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para usar uma abordagem baseada em HTRF para determinar os níveis de GSIS de células INS-1E, uma bem estabelecida insulina secretoras derivado de células beta rato insulinoma célula linha15. Além disso, este ensaio pode ser utilizado para identificar o perfil farmacológico de reguladores moleculares da secreção de insulina. Aplicamos este ensaio de insulina com base em HTRF para examinar a dopamina D2-como o Regulamento do receptor de GSIS. Cada vez mais estudos têm revelado que o neurotransmissor dopamina é um importante regulador do GSIS8,16,17,18,19,20, 21 , 22. dopamina afeta GSIS de maneira autócrina/parácrina negativa através de ações sobre a dopamina D2-como os receptores (D2, D3, receptores de4 D) expressados na superfície de células pancreáticas beta8 , 16 , 19. usando este ensaio, confirmar o papel da dopamina como um regulador negativo de GSIS e demonstrar que a dopamina D2-como receptor agonistas bromocriptina e quinpirole também reduzem GSIS.
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Protocol
1. INS-1E células: manutenção e chapeamento
- Manter células INS-1E numa incubadora de2 ˚C/5% CO 37 umidificado e culta com meio RPMI 1640 suplementado com 5% (v/v) inactivadas pelo calor fetal soro bovino, 2 mM L-glutamina, 10 mM HEPES, piruvato de sódio de 1 mM, 100 U/mL penicilina/estreptomicina solução de 50 µM de β-Mercaptoetanol. Cultura de células em meio RPMI 1640 completo de 10 mL (por placa), até atingirem a confluência de 80-90%, quando podem ser trypsinized e passadas ou usados para o ensaio de secreção de insulina.
- Dia 1: Aspirar a mídia e lavar as células uma vez com 5 mL de PBS pré-aquecido. Adicione 0,5 mL de tripsina (0.025%) diluído 1:1 em 0,5 mL de PBS trypsinize as células e incubar durante 3-4 minutos a 37 ˚ c. Desactive a tripsina adicionando mídia completa 9 mL e a transferência de células para um tubo de centrífuga de 15 mL por pipetagem.
- Células de pelotas por centrifugação e ressuspender o centrifugado em aproximadamente 5 mL fresco meios de comunicação.
- Pegue 10 µ l de células re-suspensas e misture com 10 µ l corante vital de Trypan azul para verificar a viabilidade celular. Contar as células vivas e mortas em 10 µ l desta mistura usando um hemocytometer. Nível de viabilidade deve ser acima de 90%. Dilua as células re-suspensas em mídia fresca para 1 milhão de células por mL.
- Células de INS-1E de 0,5 mL de semente por bem em um poli-L-Lysine pré-revestido placa de 24, com uma densidade de 500.000 células/poço.
- Dia 2: Remova a mídia 18-24h depois de chapeamento e adicionar 500 µ l/poço de mídia de RPMI 1640 fresco. Incube as células para outro 24h permitir que as células para se recuperar totalmente da etapa passaging prévia. Esse tempo adicional permite que as células a se espalhar na placa de cultura de tecidos.
2. insulina secreção ensaio (dia 3)
- Preparar o tampão KRB: 132,2 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 5mm NaHCO3, 0.5 mM NaH2PO4, 0.5 mM MgCl2, 1,5 mM CaCl2e 0,001 g/mL albumina de soro bovino (BSA), pH 7,4.
- Aspire os meios de comunicação de células e lave duas vezes com PBS pré-aquecido.
- Para a etapa de fome de glicose, adicione 450 µ l/poço KRB (contendo BSA) sem glicose para 1h 37 ˚C/5% CO2.
- Durante a etapa de fome de glicose, preparar diluições em série da droga (s) em KRB contendo 200 mM glicose (10 x concentração).
- Prepare a droga em 10 x a concentração final em KRB suplementado com glicose 200 mM (também 10 x a concentração final de glicose). Se o estoque de drogas (e mais o adicionado 10 x glicose) é em DMSO, certifique-se de percentual de DMSO é mantido consistente durante todo o ensaio (idealmente final percentual inferior a 0,1% DMSO).
- Para tratamentos de dopamina e quinpirole, usar um intervalo de concentração de drogas de ensaio final de 100 µM a 100 pM (do maior para menor concentração), com o último ponto da resposta dose não contendo nenhuma droga. Para bromocriptina, use um intervalo de concentração de ensaio final de 10 µM para 22:00, com o último ponto da resposta dose sendo o controle de drogas.
- Depois da fome de glicose, adicione diluições em série drogas para o ensaio para produzir uma resposta de dose.
- Adicione 50 µ l/poço de cada diluição serial nos poços correspondentes (ensaio total volume 500 µ l).
- Para a etapa de estimulação de glicose, incubar as células com as diluições de série respectivas drogas (na presença de glicose de 20 mM) durante 90 minutos a 37 ˚C/5% CO2. Incluem um conjunto de poços de controle: (1) estimulação com glicose 20mm sozinho na ausência de qualquer droga adicional e (2) células que nem são estimuladas com drogas nem glicose (que fornece uma taxa basal de secreção).
- Após a etapa de estimulação, remova com cuidado os sobrenadantes (uso diretamente ou loja no 4 ˚ c).
Nota: Um passo de centrifugação suave adicional 5 min (600 g de x, 1 min) pode ser introduzido neste momento para remover quaisquer células remanescentes nos sobrenadantes de ensaio.
3. HTRF a secreção de insulina medida
- Dilua o ensaio sobrenadantes 01:10 em KRB (sem BSA), de preferência em placas de 96 poços claros.
- Prepare a curva padrão de insulina para o ensaio de insulina HTRF (tabela 1).
| Solução-padrão estoque 500 ng/ml | Diluições em série | Trabalhando [insulina] ng/ml |
| STD 7 | 30 µ l estoque + 140 µ l KRB | 150 |
| STD 6 | 30 µ l STD 7 + 45 µ l KRB | 60 |
| STD 5 | 30 µ l STD 6 + 45 µ l KRB | 24 |
| STD 4 | 30 µ l STD 5 + 45 µ l KRB | 9.6 |
| DST 3 | 30 µ l STD 4 + 45 µ l KRB | 3,84 |
| STD 2 | 30 µ l STD 3 + 45 µ l KRB | 1,54 |
| STD 1 | 30 µ l STD 2 + 45 µ l KRB | 0,61 |
| STD 0 | µ l 45 KRB | 0 |
| Nota: Estoque STD é 500 ng/ml | ||
Tabela 1. Diluições em série para fazer a curva padrão de insulina.
- Adicione as amostras de curva padrão e os sobrenadantes de ensaio diluída para a placa HTRF. A medição de insulina secretada por HTRF pode efectuar-se em um poço-96 ou um formato de placa 384, mantendo em mente que o volume de ensaio deve ser re-ajustado. Uso 10 µ l/poço amostra em brancas 96 poços meia-área chapas ou 5 µ l/poço em uma placa de baixo volume, fundo redondo 384-poço branco (consulte Tabela de materiais).
- Preparar a mistura de anticorpo no buffer de deteção (ver Tabela de materiais) em um doador de 1:2 (cryptate) / relação do aceitador (XL-665).
Nota: Mais detalhes específicos sobre o ensaio HTRF estão disponíveis do fabricante. - Adicione a mistura de anticorpos para o ensaio em 30 µ l/poço (para um formato de 96-placa de ensaio) ou 15 µ l/poço (para um formato de ensaio de placa 384).
- Selar a placa e incubar à temperatura ambiente.
- Ler a placa depois de 2h, 4h, e/ou incubação durante a noite com anticorpos usando o leitor e o módulo de óptica de HTRF apropriado (337 665 620 nm) (ver Tabela de materiais e as instruções do fabricante). Definir o início da integração em 60 µs e o tempo de integração em 400 µs. uso 200 pisca por bem.
Nota: Estes parâmetros foram baseados na utilização de nosso leitor específico. A leitura a 620 nm e 665 nm pode variar entre diferentes instrumentos. Esta é uma das razões que sugerimos usar a relação de 665/620. No cálculo deste rácio, quaisquer diferenças de potencial de leitor para leitor vão ser normalizadas em fornecem valores consistentes independentemente do instrumento utilizado para medir a HTRF.
4. normalização e análise de dados
- Calcular as concentrações de insulina dos poços de ensaio através de extrapolação de ratiometric leituras de fluorescência (665 nm/620 nm) para uma segunda ordem polinomial curva quadrática (Figura 2).
Figura 2 : Curva padrão insulina. Estoque de insulina humana de concentrações conhecidas foi usado para gerar a curva padrão de insulina. Os rácios HTRF resultantes (665 nm / 620 nm) foram plotados contra as concentrações de insulina. Os dados foram o melhor ajuste para uma segunda curva polinomial quadrático de ordem (R2 = 0.99996). Esta é uma curva padrão representativa. Barras de erro = SEM. , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Com os dados extrapolados como ng/mL de insulina secretada, normalize (insulina secretada em resposta ao aumento da concentração de ligante) para o valor médio de poços de teste a % máxima de insulina secreção (condição sozinho de glicose 20 mM).
- Use o ajuste de curva (R2) de uma única experiência para calcular a variação de intraplate. Dentro do experimento, derivado dos valores individuais de2 R as duplicatas intra experimentais, permitindo o cálculo do erro padrão da média para a curva de ajuste.
- Para determinar a variação interplate, use os dados de pelo menos três experimentos individuais para calcular o erro padrão da média para o valor de2 R da curva coletiva.
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Representative Results
Nós validado o nosso ensaio HTRF de insulina, gerando uma curva padrão de insulina, usando insulina humana purificada padrões predefinidos concentrações (Figura 2). Geração da curva padrão nos permitiu extrapolar as leituras de fluorescência ratiometric e, portanto, para determinar os níveis de insulina secretada em resposta aos tratamentos de drogas (Figura 2). Intraplate variação para o encaixe de curva foi mínima (R2 = 0.99996 ± 5,0 x 10-5) como foi a variação interplate (R2 = 0.947 ± 5,5 x 10-5; n = 3 placas).
Em seguida determinamos os níveis basais de secreção de insulina das células INS-1E. Com uma densidade de semeadura de 5 x 105 células por bem em um formato de placa 24, encontramos que células secretada 54.53 ± 2,2 ng/mL de insulina na ausência de glicose em uma duração de incubação de 90 min em um banho de estática. Adição de glicose de 20 mM para estimular GSIS resultou em uma melhoria significativa em GSIS (insulina de 112,4 ± 5.2 ng/mL; p < 0,0001) (Figura 3).
Figura 3 : Estimativa de basal contra a secreção de insulina estimulada. INS-1E células foram tratadas na ausência ou presença de estimulação de alta glicose (20mm) para 90 min. Uma duplicação em níveis de secreção de insulina foi detectada em resposta à estimulação de alta glicose em relação as células unstimulated (condição de secreção basal; * * * p < 0.0001, bicaudal pareado t-teste). N = 5; todos os ensaios foram realizados em triplica. Barras de erro = SEM. , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Para investigar o papel dos dopaminérgicos D2-como a estimulação do receptor em GSIS dentro do nosso sistema de célula de INS-1E, estamos incubados células na presença de D2-como drogas de agonista do receptor (dopamina, quinpirole e bromocriptina) durante o 90 min período de estimulação com glicose de 20 mM (Figura 4).
Figura 4 : Deteção de HTRF de dopamina D2 -como a inibição de agonista do receptor de GSIS. INS-1E células foram tratadas com concentrações crescentes de dopamina D2-como agonistas dos receptores para 90 min na presença de glicose elevada (20 mM; 37 ˚ c). (A) dopamina inibida GSIS com um IC50= 1,78 ± 3,9 µM (R2 = 0.4355). (B) bromocriptina foi mais potente que a dopamina na redução GSIS (IC50 = 13,9 ± 2.4 nM, R2 = 0.7501). (C) a potência do Quinpirole era semelhante à dopamina (IC50 = 3,3 ± 3 µM, R2 = 0.3617). Todos os dados foram melhor ajuste para uma curva sigmoidal ajuste de três parâmetros. O ' 0 mM glicose ' ponto indica secreção basal de insulina pelas células INS-1E na ausência de estimulação de alta glicose (20 mM). N > 3; todos os ensaios foram realizados em triplica em dias separados experimentais. Barras de erro = SEM. , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A eficácia e a potência destas drogas agonista foi determinada pela representação gráfica das curvas de secreção de insulina. Descobrimos que na ausência de estimulação com alta glicose, as células de INS-1E continuadas a secretar insulina, embora em grau consideravelmente inferior (indicado pela condição 0 mM), consistente com anteriormente relata15. Nossos resultados demonstraram que dopamina, o agonista endógeno de D2-como receptores, inibido, GSIS em forma dependente de concertação (DA IC50 = 1,78 ± 3,9 µM; Figura 4A). Em contraste, bromocriptina, um medicamento aprovado para tratar a diabetes de tipo 223,24, foi marcadamente mais potente que a dopamina em produzir inibição GSIS (IC50 = 13,9 ± 2.4 nM; Figura 4B). Por último, embora menos eficaz do que a bromocriptina, quinpirole exibiu potência semelhante à dopamina na inibição GSIS (IC50 = 3,3 ± 3 µM; A Figura 4).
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Discussion
O ensaio de insulina HTRF descrito aqui oferece um sistema rápido e eficiente para medir a secreção de insulina de um sistema de baseados em células cultivada. Entre suas vantagens mais importantes, neste ensaio oferece um sinal baixo fundo devido a alta relação sinal-ruído. Além disso, confirmamos que o sinal HTRF é estável durante longos períodos de tempo (> 24 h)7. No entanto, desde que os anticorpos monoclonais de ligação de insulina rapidamente chegar a saturação de ligação após adição para o ensaio, cinética de ligação do anticorpo pode ser afetada pela temperatura ou variações segregados dos níveis de insulina. Portanto, podemos ler a placa de ensaio em vários pontos de tempo (2h, 4h e durante a noite) para identificar precisamente quando os anticorpos chegaram a saturação completa e sinal HTRF é mais robusto7. Também recentemente mostramos que os anticorpos de insulina não significativamente reagem de forma cruzada com proinsulina ou peptídeo-c, sugerindo que o ensaio é bastante específico para insulina madura7.
Um passo importante na otimização do ensaio envolvido estabelecer uma ampla gama dinâmica de secreção de insulina. Esta gama dinâmica é definida como a diferença detectada insulina durante basal (unstimulated) contra a secreção de insulina estimulada. Nós encontramos que um passo de fome inicial breve glicose (glicose 0 mM, 1 h) precedendo a estimulação de alta glicose se expande a gama dinâmica de escorva as células INS-1E a secretar mais insulina durante GSIS. Em trabalho anterior, mostramos a gama dinâmica do ensaio de 0,17 ng/mL (limite de detecção) para tão alta como insulina de ~ 110 ng/mL com um sinal à relação de ruído de 10,027. Além disso, a quantidade de insulina secretada é dependente de número de célula inicial banhado por bem. Nós aperfeiçoamos ainda mais o ensaio por padronizar a passagem e manipulação das células INS-1E. Manter consistência na passagem de horário e chapeamento em um tipo específico de placa (por exemplo, pratos de 10cm) é essencial para a obtenção de níveis de insulina secretada consistente.
Entre as possíveis fontes de ensaio variabilidade está borbulhando nas soluções de ensaio, que interfere com a leitura HTRF. Uma importante fonte dessas bolhas é a presença de albumina de soro bovino (BSA) nas várias soluções de ensaio KRB-baseado. Para solucionar esse problema potencial, reduzindo ou mesmo eliminando a BSA minimiza significativamente bolhas na solução e, portanto, melhora a confiabilidade do sinal HTRF. Isto é particularmente importante ao gerar a curva padrão de insulina e diluições de drogas. Célula passagem número dependente diferenças na secreção de insulina basal são outra fonte de variabilidade potencial de ensaio (dados não mostrados). Isto é consistente com trabalhos anteriores por Merglen e seus colegas que também sugeriram que a secreção de insulina ideal é encontrada entre número de passagem de células INS-1E ~ 60-10015. Portanto, para minimizar a possível variabilidade na secreção de insulina, relacionada ao número de passagem do celular, recomendamos limitar os ensaios de secreção para este intervalo de passagem de células bem definidos.
A principal limitação do ensaio de secreção de insulina baseado na célula é a variabilidade de secreção basal intrínseca às células INS-1E. Isto pode estar relacionado com as células secretoras de insulina crescentes fora do contexto fisiológico de ilhotas pancreáticas. Com efeito, os outros tipos de células dentro do Ilhéu, incluindo células alfa e delta secretam inúmeros fatores que podem modular a secreção de insulina basal e estimulada de células beta em um local, de forma parácrina25. A ausência desses outros tipos de células da ilhota pode perturbar o Regulamento apertado de secreção de insulina, levando a maior variabilidade do que caso contrário observado fisiologicamente. Outra limitação potencial é a escala linear relativamente pequena do ensaio, desde que a insulina secretada em resposta à glicose 20 mM foi quase saturando em alguns casos. Como resultado, os sobrenadantes de células não diluído, efeitos de secretagogues de insulina, na secreção de insulina estimulada seja fora da porção linear da curva de calibração. Isto é, no entanto, obviado diluindo o sobrenadante contendo insulina suficiente para permitir que a insulina cair na faixa linear da curva de calibração.
Nós validado o nosso ensaio, mostrando que a genealogia de dopamina D2-como receptores através de dopamina, bromocriptina e quinpirole tratamentos inibida GSIS de forma concentração-dependente. Estes dados nos permitiram determinar propriedades farmacológicas destas drogas (i.e., IC50 e eficácia) em termos de seus efeitos sobre GSIS. Nossos resultados são consistentes com um corpo crescente de evidências sugerindo um papel importante para dopamina e dopaminérgicos sinalização fora do sistema nervoso central20,21,22,26, 27. Notavelmente, nossos resultados mostram que a dopamina D2-receptor agonista bromocriptina potently inibe GSIS, ainda foi recentemente aprovada pelo FDA para tratar a diabetes de tipo 224, levanta a importante questão: como pode este tratamento drogas tipo 2 diabetes (T2D) se reduz a secreção de insulina, pelo menos aguda? Uma possível explicação pode estar relacionada a capacidade do bromocriptine de incorrer em "resto de células beta". De acordo com esta hipótese, desde que uma das características cardinais de T2D é um oversecretion total de insulina, que em última análise, podem contribuir para falha de célula beta28. Além disso, sugerimos que insulina oversecretion durante T2D também pode agravar a resistência à insulina por diminuir a sensibilidade à insulina dos órgãos, incluindo o músculo esquelético, fígado e tecido adiposo. Assim, bloqueando ou diminuindo GSIS pode resultar em resensitization gradual desses tecidos alvo, tornando-os mais sensíveis à insulina e, assim, melhorar a sensibilidade à insulina. Ter um sistema de ensaio passível de rastreio com throughput alto abre as portas para futuros trabalhos para ambos dissecar as vias de sinalização intracelulares mediadas pela dopamina D2-como os receptores nas células beta pancreáticas que são responsáveis por parácrina / inibição autócrina GSIS tão bem quanto mais elucidar os mecanismos pelos quais drogas como bromocriptina podem melhorar os sintomas do diabetes.
O desenvolvimento de um ensaio de secreção de insulina baseada em célula que tira proveito da tecnologia HTRF para a secreção de insulina e representa um avanço significativo para detecção rápida e eficiente de insulina no significativamente diminuída custo relativo e/ou maior segurança em relação ao mais velhos ensaios de deteção de insulina confiando na RIA e abordagens baseadas em ELISA. Com efeito, embora ensaios de ELISA e RIA insulina são comparàvel sensível e específico para o ensaio de insulina HTRF, a natureza homogênea da detecção, elimina várias etapas de lavagem adicionais presentes nesses outros ensaio de sistemas7. Além disso, a relativa estabilidade do sinal HTRF fornece outra vantagem chave para medição confiável de insulina.
Tomados em conjunto, a HTRF ensaio de secreção de insulina tem a capacidade de discriminar rapidamente entre as propriedades farmacológicas de múltiplas drogas no contexto da secreção de insulina celular. Além disso, relativamente fácil deste ensaio de usar e robusto sinal torná-lo favorável para seleção da elevado-produção.
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Disclosures
Agradecemos Nicolas Pierre (Cisbio bioensaios) para conselhos úteis e Dr. Pierre Maechler (Universidade de Genebra) generosamente, fornecendo células INS-1E. Este trabalho foi apoiado pelo financiamento do departamento de defesa (grant PR141292 a Z.F.) e John F. e Nancy A. Emmerling fundo da Fundação de Pittsburgh (a Z.F.).
Acknowledgments
Os autores não têm nada para divulgar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well white half area plate | Greiner Bio-One | 82050-042 | |
| 384-well white low-volume, round-bottom plate | Corning | 15100157 | |
| Insulin High Range Kit | Cisbio Bioassays | 62IN1PEH | 10,000 test HTRF-based insulin assay kit |
| PHERAstar FSX plate reader | BMG Labtech | FSX | Plate reader adapted for HTRF-based assay readings |
| Plate sealers | Fisher Scientific | DY992 | To seal plate while antibodies incubate |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| RPMI Medium 1640 (1x) | Gibco | 11875-093 | [+] L-glutamine |
| Trypsin 0.05% | Corning | 25-052-CI | 0.53 mM EDTA, (-) sodium bicarbonate |
| DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline) | Corning | 21-031-CV | Without calcium and magnesium |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| HEPES | Gibco | 156-30-080 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| Penicillin/Streptomycin solution 100x | Corning | 30-002 CT | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M1348 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Dopamine hydrochloride | Sigma | 8502 | |
| Bromocriptine mesylate | Tocris | 427 | |
| (-)-Quinpirole hydrochloride | Tocris | 1061 | |
| Bovine Serum Albumin | Calbiochem | 12659 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4832 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma | 276855 |
References
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