Summary
Her presenterer vi homogen tid løst bånd (HTRF) som en effektiv metode for rask påvisning av insulin skilles ut fra celler.
Abstract
Oppdagelsen av insulinsekresjon er viktig for Klargjørende mekanismer av regulert sekresjon så vel som i studier av stoffskiftet. Selv om mange insulin analyser har eksistert i flere tiår, har det nylige advent homogen tid-løst han selvmord resonans energi overføring (HTRF) teknologi betydelig forenklet disse målingene. Dette er en rask, kostnadseffektiv, reproduserbare og robust optisk analysen basert på antistoffer konjugert til lyse fluorophores med langvarig utslipp som muliggjør tid-løst han selvmord resonans energi overføring. Videre er HTRF insulin gjenkjenning mottakelig for utvikling av høy gjennomstrømming screening analyser. Her bruker vi HTRF for å oppdage insulinsekresjon i INS-1E celler, en rotte insulinoma-avledet cellen linje. Dette tillater oss å beregne basale nivåer av insulin og deres endringer i respons til glukose stimulering. Dessuten, bruker vi dette insulin oppdagelsen system for å bekrefte dopamin rolle som en negativ regulator på glukose-stimulert insulinsekresjon (GSIS). På en lignende måte, andre dopamin D2-like reseptor agonister, quinpirole og bromocriptine, redusere GSIS i en konsentrasjon-avhengige måte. Våre resultater markere nytten av HTRF insulin analysen formatet fastsette rollen til mange narkotika i GSIS og deres farmakologiske profiler.
Introduction
Regulering av energi metabolism er finjustert med en større anabole hormon, insulin. Insulin syntetiseres og utgitt av bukspyttkjertelen beta-cellene som svar på økt ekstracellulære blodsukkeret. Utgitt insulin utløser opptaket av glukose av insulin-sensitive vev1,2. Fysiologisk, er dette knyttet til høyden av glukose konsentrasjon etter et måltid, etterfulgt av utskillelsen av insulin til å regulere glukose opptak. Forstyrrelser i glukose homeostase føre til metabolsk impairments i insulinresistens og til slutt i utbruddet av type 2 diabetes2,3,4.
Selv om insulinsekresjon har blitt grundig undersøkt, fortsatt dens forskrifter mekanismer dårlig forstått. Et kritisk område etterforskning har vært identifikasjon av romanen modulatorer på insulinsekresjon av beta-cellene5,6,7,8. Disse studiene krever en bedre forståelse av kopling forholdet mellom glukose stimulering og insulinsekresjon. Derfor er nøyaktig overvåke og kvantifisere nivåene av glukose-stimulert insulinsekresjon (GSIS) viktig. Hittil har imidlertid ble bare et begrenset antall metoder tillates kvantifisering av GSIS bruker insulin sekresjon linjer og/eller bukspyttkjertelen holmer. En er radioimmunoassay (RIA), som benytter radioisotop-merket insulin og antistoffer. De viktigste begrensningene av denne tilnærmingen inkluderer sikkerhetsforholdene håndtering og deponering av radioaktivt materiale. I tillegg er denne metoden arbeidskrevende, med flere lange vask og inkubasjon skritt. Enzym knyttet immunosorbent analysen (ELISA) er en annen dyrt og arbeidskrevende tilnærming som benytter antistoffer for insulin gjenkjenning. Variasjon i antistoff slektskap og effektiviteten av gjenkjenne insulin er begrensende faktorer av denne metoden og kan påvirke reproduserbarhet resultatene. ELISA verken RIA ble utformet for høy gjennomstrømming eksperimenter. AlphaScreen er en homogen analysen brukes til å oppdage og måle nivåer på insulinsekresjon. AlphaScreen teknologi er basert på konvertering av ambient oksygen i en spent oksygen singlet tilstand som kan reagere med chemiluminescent arter, som resulterer i generering av chemiluminescence. Analysen er homogen, elimineres mange av punktene vask forbundet med RIA og ELISA. Ustabilitet i signalet på grunn av reaksjonen er imidlertid en begrensende faktor som påvirker presentasjon av analysen. (TR-KNIPETANGSMANØVER, utviklet av Heyduk og kolleger9, er en annen homogen tilnærming til insulin mål basert på binding av to separate antistoffer mot ulike epitopes på insulin molekylet. Antistoffer er hver kjemisk knyttet til dobbel strandet DNA med kort komplementære enkelt strandet DNA overheng. Binding av antistoffer for insulin samler dem og fører til en double-strandet DNA tosidig. Hver antistoff er også forbundet med en respektive donor eller acceptor fluorophore og foreningen av DNA duplex samler disse fluorophores til å generere han selvmord resonans energioverføring (bånd). Én potensielle begrensning av TR-KNIPETANGSMANØVER, men hviler med båndet selv. Manglende evne til å raskt forsvinne bakgrunn fluorescens under bånd reaksjonen fører til relativt høye nivåer av bakgrunnen fluorescens og et svakt signal til støyforhold i analysen. Derfor eksisterer behov fortsatt for en pålitelig, solid og kostnadseffektiv analysen for kvantifisering GSIS på en høy gjennomstrømming måte.
Nylige fremskritt innen biofysikk har kulminerte i utviklingen av en homogen tid-løst fluorescens energi resonans overføring (HTRF) basert analysen. Spesielt mens energi overføring i kan analysen beskrives som bånd-basert, mer presist, HTRF er avhengig av luminescence energi resonans overføring (LRET)10 som er ikke-strålingen overføring av energi mellom giver og acceptor arter11,12,13. Denne forskjellen er viktig siden tidspunktet for en fluorescens eller slukke basert bånd samhandling er mye annerledes enn det er for LRET, selv om de samme typene gating kan brukes for bånd og LRET. Videre bruk av sjeldne jord transisjonsmetall cryptate forbindelser som bilderørskjermer eller terbium cryptate i HTRF produserer lange fluorescens halveringstid12,14. Dette tilbyr unike fordelen av innføringen av en tidsforsinkelse (µsec) mellom donor eksitasjon og måling av utslipp fra acceptor (dvs. tid-løst analysen). Denne forsinkelsen gir tilstrekkelig tid til bakgrunnen fluorescens å spre før måling av acceptor utslipp fluorescens. Følgelig, readout er gratis ikke-spesifikk fluorescens og dermed høy signal-til-støy forholdet er oppnådd (figur 1). Videre eliminerer homogen natur HTRF behovet for vask skritt å vaskes ubundet arter, gjøre analysen mye raskere enn ELISA eller RIA-baserte metoder.
Figur 1: skjematisk av mekanismen for HTRF insulin gjenkjenning. To selvstendig generert monoklonale antistoffer spesielt gjenkjenner og binder til insulin på forskjellige områder. Disse antistoffene er konjugert bilderørskjermer cryptate donor eller XL665 acceptor. Magnetisering av donor på 337 nm resultater på utslipp på 620 nm. Resulterende energi overføringen fører XL665 til å slippe ut på en lengre bølgelengde, 665 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Her gir vi en detaljert protokoll for å bruke et HTRF tilnærming til å bestemme nivåer av GSIS fra INS-1E celler, en veletablert insulin-sekresjon beta-celle-avledet rotte insulinoma celle linje15. Denne analysen kan i tillegg brukes til å identifisere farmakologiske profilen av molekylære regulatorer på insulinsekresjon. Vi bruker denne HTRF-baserte insulin analysen for å undersøke dopamin D2-like reseptor regulering av GSIS. Økende studier har vist at de nevrotransmitter dopamin er en viktig regulator av GSIS8,16,17,18,19,20, 21 , 22. dopamin påvirker GSIS i en negativ autocrine/paracrine måte via handlinger på dopamin D2-like reseptorer (D2, D3, D4 reseptorer) uttrykt på overflaten av beta bukspyttkjertelen celler8 , 16 , 19. bruker denne analysen, vi bekrefte dopamins rolle som en negativ regulator av GSIS og vise at dopamin D2-like reseptor agonister bromocriptine og quinpirole også redusere GSIS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. INS-1E celler: vedlikehold og Plating
- Opprettholde INS-1E celler i en fuktet 37 ˚C/5% CO2 inkubator og kultivert med RPMI 1640 medium supplert med 5% (v/v) inaktivert fosterets bovin serum, 2 mM L-glutamin, 10 mM HEPES, 1 mM natrium pyruvate, 100 U/mL Penicillin/Streptomycin løsning, 50 µM β-mercaptoethanol. Kultur celler i 10 mL komplett RPMI 1640 medium (per plate), før de når 80-90% samløpet, når de kan trypsinized og passaged eller brukes for insulin sekresjon analysen.
- Dag 1: Sug opp media og vask celler når med 5 mL forvarmes PBS. Legg til 0,5 mL av trypsin (0.025%) utvannet 1:1 i 0,5 mL PBS trypsinize cellene og ruge i 3-4 min på 37 grader. Deaktivere trypsin ved å legge 9 mL komplett medier og overføringen celler slik sentrifuge 15 mL av pipettering.
- Pellets celler med sentrifugering og å suspendere celle pellet i ca 5 mL frisk medier.
- Ta 10 µL re suspendert cellene og bland med 10 µL Trypan blå viktig fargestoff etter celle levedyktighet. Telle levende og døde celler i 10 µL av denne blandingen med en hemocytometer. Levedyktighet nivå bør være over 90%. Fortynne re suspendert cellene i frisk medier til 1 million celler per mL.
- Frø 0,5 mL INS-1E celler per brønn i en poly-L-Lysine pre-belagt 24-vel plate, på en tetthet på 500.000 celler/godt.
- Dag 2: Fjerne media 18-24 h etter plating og legge til 500 µL/vel fersk RPMI 1640 medier. Inkuber celler for en annen 24 h at cellene å komme helt fra tidligere passaging trinn. Denne ekstra tiden tillater cellene å spre på vev kultur plate.
2. insulin sekresjon analysen (3. dag)
- Forberede KRB buffer: 132.2 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 5 mM NaHCO3, 0,5 mM NaH2PO4, 0,5 mM MgCl2, 1,5 mM CaCl2og 0,001 g/mL bovin serum albumin (BSA), pH 7.4.
- Sug opp medier fra celler og vask to ganger med forvarmes PBS.
- For glukose sult trinn, kan du legge til 450 µL/vel KRB (som inneholder BSA) uten glukose 1t på 37 ˚C/5% CO2.
- Under glukose sult trinn, forberede føljetong fortynninger av medikament i KRB inneholder 200 mM glukose (10 x konsentrasjon).
- Forberede stoffet på 10 x siste konsentrasjonen i KRB supplert med 200 mM glukose (også 10 x den endelige analyse glukose konsentrasjonen). Hvis stoffet lager (pluss de ekstra 10 x glukose) er DMSO kontroller i DMSO prosent holdes konsistent hele analysen (ideelt siste prosent mindre enn 0,1% DMSO).
- Dopamin og quinpirole behandlinger, bruke en endelige analysen narkotika konsentrasjon rekke 100 µM 100 pM (fra høyeste til laveste konsentrasjon), med det siste datapunktet dose svaret inneholder ingen stoffet. For bromocriptine, bruker du en endelige analysen konsentrasjon rekke 10 µM til 10 pM, med det siste datapunktet dose svaret blir rusfrie kontrollen.
- Etter glukose sult, legge til narkotika føljetong fortynninger analysen til å produsere en dose-respons.
- Legge til 50 µL/godt av hver serielle fortynning tilsvarende brønnene (totalt analysen volum 500 µL).
- For glukose stimulering trinn, ruge celler med de respektive narkotika føljetong fortynninger (i nærvær av 20 mM glukose) i 90 minutter på 37 ˚C/5% CO2. Inkluderer et sett av kontroll: (1) stimulering med 20 mM glukose alene i fravær av noen ekstra stoff og (2) celler som verken stimulert med narkotika eller glukose (som gir en basal rate av sekret).
- Etter stimulering trinn, forsiktig fjerne supernatants (bruk direkte eller butikken på 4 grader).
Merk: En ekstra 5 min milde sentrifugering trinn (600 x g, 1 min) kan presenteres på dette punktet for å fjerne eventuelle gjenværende celler i analysen supernatants.
3. HTRF å måle insulinsekresjon
- Fortynne analysen supernatants 1:10 i KRB (uten BSA), fortrinnsvis i klart 96-brønns plater.
- Forberede insulin standardkurven HTRF insulin analysen (tabell 1).
| Standard lagerløsning 500 ng/ml | Seriell fortynninger | Arbeider [insulin] ng/ml |
| STD 7 | 30 µl lager + 140 µl KRB | 150 |
| STD 6 | 30 µl STD 7 + 45 µl KRB | 60 |
| STD 5 | 30 µl STD 6 + 45 µl KRB | 24 |
| STD 4 | 30 µl STD 5 + 45 µl KRB | 9.6 |
| STD 3 | 30 µl STD 4 + 45 µl KRB | 3.84 |
| STD 2 | 30 µl STD 3 + 45 µl KRB | 1,54 |
| STD 1 | 30 µl STD 2 + 45 µl KRB | 0,61 |
| STD 0 | 45 µl KRB | 0 |
| Merk: STD lager er 500 ng/ml | ||
Tabell 1. Seriell fortynninger å insulin standardkurven.
- Legge til standardkurve prøver og utvannet analysen supernatants HTRF platen. Måling av utskilles insulin av HTRF kan utføres i en 96-brønnen eller en 384-vel plate format, husk at analysen lydstyrken må justeres igjen. Bruk 10 µL/godt eksempel i 96-brønnen hvite halv-området plater eller 5 µL/godt i en 384-vel hvite lavt volum, runde-bunn plate (se Tabell for materiale).
- Forberede antistoff blande gjenkjenning buffer (se Tabell for materiale) i 1:2 giver (cryptate) / acceptor (XL-665) forholdet.
Merk: Ytterligere spesifikke detaljer om HTRF analysen er tilgjengelige fra produsenten. - Legge til antistoff blanding analysen på 30 µL/godt (for en 96 godt-plate analysen format) eller 15 µL/vel (for et 384-vel plate analysen format).
- Seal platen og ruge ved romtemperatur.
- Lese platen etter 2 h, 4 h eller overnatting inkubasjon med antistoffer plate leseren og den aktuelle HTRF fiberoptiske modulen (337 665 620 nm) (se Tabell av materialer og produsentens instruksjoner). Angi integrering start på 60 µs og integrering tiden 400 µs. Bruk 200 blinker per brønn.
Merk: Disse parametrene var basert på bruk av vår bestemt leser. Avlesning på 620 nm og 665 nm kan variere mellom forskjellige instrumenter. Dette er en av grunnene vi foreslår at du bruker 665/620 forholdet. Ved beregning av dette forholdet, noen potensielle forskjeller fra leseren leser blir normalisert og gir konsistente verdier uavhengig av instrumentet brukes til å måle HTRF.
4. dataanalyse og normalisering
- Beregne insulin konsentrasjonen av mikrotiterbrønnene via ekstrapolering av ratiometric fluorescens målinger (665 nm/620 nm) til en andre ordre kvadratisk polynomer (figur 2).
Figur 2 : Insulin standardkurve. Menneskelige insulin lager av kjente konsentrasjoner ble brukt til å generere insulin standardkurven. De resulterende HTRF prosenter (665 nm / 620 nm) var plottet mot insulin konsentrasjoner. Dataene ble beste tilpasning til en andre ordre kvadratisk polynomer (R2 = 0.99996). Dette er en representant standardkurve. Feilfelt = SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Med ekstrapolert dataene som ng/mL av insulin utskilles, normalisere (insulin utskilles som svar på økende ligand konsentrasjoner) til gjennomsnittsverdien av de % maksimal insulin sekresjon mikrotiterbrønnene (20 mM glukose alene tilstand).
- Bruke kurve passer (R2) fra ett enkelt eksperiment for å beregne intraplate variasjon. I eksperimentet, avledet R2 enkeltverdiene fra intra eksperimentelle duplikater, slik at beregningen standardfeilen for gjennomsnittet for kurven.
- For å bestemme interplate varianten, bruke data fra minst tre individuelle eksperimenter for å beregne standard feil av gjsnitt for R2 verdien av kollektive kurven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi validert analysen vår insulin-HTRF ved å generere en insulin standardkurve benytter renset menneskelige insulin standarder for forhåndsdefinerte (figur 2). Generasjon av standardkurve tillatt oss å ekstrapolere ratiometric fluorescens målinger og dermed avgjøre utskilles insulin nivåer svar medikamentelle behandlinger (figur 2). Intraplate variasjoner for montering kurve var minimal (R2 = 0.99996 ± 5.0 x 10-5) som var interplate variant (R2 = 0.947 ± 5.5 x 10-5, n = 3 plater).
Vi bestemt neste den basale nivået av insulinsekresjon fra INS-1E celler. Bruker en seeding tetthet 5 x 105 celler per brønn i 24-vel plate format, fant vi at celler utskilles 54.53 ± 2.2 ng/mL av insulin i fravær av glukose over en varighet på 90 min inkubasjon i en statisk bad. Tillegg av 20 mM glukose å stimulere GSIS resulterte i en betydelig forbedring i GSIS (112.4 ± 5.2 ng/mL insulin; p < 0,0001) (Figur 3).
Figur 3 : Estimering av basale versus stimulert insulinsekresjon. INS-1E celler ble behandlet i fraværet eller tilstedeværelsen av høy glukose (20 mM) stimulering for 90 min. En dobling i insulin sekresjon nivåer ble oppdaget svar på høy glukose stimulering i forhold til de unstimulated cellene (basale sekresjon tilstand; *** p < 0.0001, tosidig kort t-test). N = 5; alle analyser ble utført i triplicates. Feilfelt = SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Undersøke rollen av dopaminergic D2-like reseptor stimulering i GSIS i INS-1E cellen systemet, vi ruges celler i nærvær av D2-like reseptor Agonistiske legemidler (dopamin, quinpirole og bromocriptine) under 90-min stimulering periode med 20 mM glukose (Figur 4).
Figur 4 : HTRF påvisning av dopamin D2 -like reseptor Agonistiske hemming av GSIS. INS-1E celler ble behandlet med økende konsentrasjoner av dopamin D2-like reseptor agonister for 90 min i nærvær av høy glukose (20 mM, 37 grader). (A) dopamin hemmet GSIS med en IC50= 1,78 ± 3.9 µM (R2 = 0.4355). (B) Bromocriptine var mer potent enn dopamin å redusere GSIS (IC50 = 13.9 ± 2.4 nM, R2 = 0.7501). (C) Quinpiroles styrke var lik dopamin (IC50 = 3.3 ± 3 µM, R2 = 0.3617). Alle data var beste tilpasning til en tre-parameteren passer sigmoidal kurve. ' 0 mM glukose ' punkt angir basale insulinsekresjon av INS-1E cellene i fravær av høy glukose (20 mM) stimulering. N > 3; alle analyser ble utført i triplicates på forskjellige eksperimentelle dager. Feilfelt = SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Effekt og styrken på disse Agonistiske legemidler ble bestemt av grafiske insulin sekresjon kurvene. Vi fant at i fravær av stimulering med høy glukose, INS-1E cellene fortsatte å skille ut insulin, men til en markant lavere grad (angitt med betingelsen 0 mM), forenlig med tidligere rapporter15. Resultatene viste at dopamin, den endogene Agonistiske D2-like reseptorer, hemmet GSIS på en måte som concertation-avhengige (DA KI50 = 1,78 ± 3.9 µM; Figur 4A). I kontrast, bromocriptine, et medikament godkjent for å behandle type 2 diabetes23,24, var betydelig mer potent enn dopamin produsere GSIS hemming (IC50 = 13.9 ± 2.4 nM; Figur 4B). Til slutt, selv om mindre effektiv enn bromocriptine, quinpirole utstilt lignende styrke til dopamin i GSIS hemming (IC50 = 3.3 ± 3 µM; Figur 4C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HTRF insulin analysen beskrevet her tilbyr en rask, effektiv system for å måle insulinsekresjon fra en kultivert cellen-basert system. Blant sine viktigste fordeler tilbyr denne analysen en lav bakgrunn tapsfrie høy signal-til-støy-forhold. I tillegg har vi bekreftet at HTRF signalet er stabil over lengre tid (> 24 h)7. Siden insulin-bindende monoklonale antistoffer nå bindende metning etter tillegg til analysen, kan likevel kinetics antistoff bindingen påvirkes ved romtemperatur eller variasjoner i utskilles nivåer av insulin. Derfor leser vi analysen platen på flere tidspunkt (2t 4 h og overnatting) å nøyaktig identifisere når antistoffer har nådd full metning og HTRF er mest robuste7. Vi har også nylig vist insulin antistoffer ikke betydelig cross-react med proinsulin eller c-peptid, antyder at analysen er ganske spesifikk for eldre insulin7.
Et viktig skritt i optimalisering av analysen involvert etablere et bredt dynamisk område på insulinsekresjon. Dette dynamisk område er definert som forskjellen i oppdaget insulin under basale (unstimulated) versus stimulert insulinsekresjon. Finner vi at en innledende kort glukose sult trinn (0 mM glukose, 1 h) foregående høy glukose stimulering utvider dynamikkområdet ved grunning INS-1E cellene å skille ut flere insulin under GSIS. I tidligere arbeid, vi viste analysens dynamisk område fra 0,17 ng/mL (grense for påvisning) så høye som ~ 110 ng/mL insulin med et signal / støyforhold 10.027. Dessuten er mengden utskilles insulin avhengig av første celle nummer belagt per brønn. Vi fremme optimert analysen av standardisering av passaging og håndtering av INS-1E cellene. Opprettholde konsistens i passaging tidsplan og kontaktflate i en bestemt plate (f.eks 10 cm retter) er avgjørende for å få konsekvent utskilles insulin nivåer.
Blant mulige kilder til analysen som variasjon bobler i analysen løsninger som forstyrrer HTRF avlesning. En viktig kilde til disse boblene er tilstedeværelsen av bovin serum albumin (BSA) i ulike KRB-baserte analysen løsninger. Hvis du vil feilsøke dette potensielle problemet, redusere eller eliminere selv BSA betydelig minimerer bobler i løsningen og derfor forbedrer HTRF signal pålitelighet. Dette er spesielt viktig når insulin standardkurve og narkotika fortynninger. Cellen passasje nummer-avhengige forskjeller i basale insulinsekresjon er en annen kilde til potensielle analysen variasjoner (data ikke vist). Dette er i tråd med tidligere arbeid av Merglen og kolleger som foreslo også at optimal insulinsekresjon ligger mellom INS-1E cellen passasje tallene ~ 60-10015. For å minimere mulig variasjon i insulinsekresjon knyttet til celle passasje nummer, anbefaler vi derfor begrense sekresjon analyser til denne veldefinerte passasje celleområdet.
Den største begrensningen til cellebasert insulin sekresjon analysen er variasjon av basale utskillelsen innebygd INS-1E cellene. Dette kan være relatert til de voksende insulin sekresjon cellene utenfor fysiologiske sammenheng med bukspyttkjertelen Holme. Faktisk skiller de andre celletyper i Holmen inkludert alfa og deltaet celler rekke faktorer som modulere basal og stimulert insulinsekresjon fra beta celler i en lokal, paracrine måte25. Fravær av disse andre Holme celletyper kan forstyrre stramt reguleringen av insulinsekresjon, fører til større variasjon enn ellers observert fysiologisk. En annen potensiell begrensning er relativt liten lineær rekke analysen, siden insulin utskilles i respons på 20 mM glukose var nesten mette i noen tilfeller. Resultatet i ufortynnet celle supernatants, kan effekten av insulin secretagogues på stimulert insulinsekresjon være utenfor den lineære delen av kalibreringskurven. Dette er imidlertid obviated fortynne insulin inneholder nedbryting tilstrekkelig å tillate insulin å falle i den lineære rekke kalibreringskurven.
Vi validert analysen vår ved å vise at agonism av dopamin D2-like reseptorer via dopamin, bromocriptine og quinpirole behandlinger hemmet GSIS på konsentrasjon-avhengige måte. Disse dataene tillatt oss å bestemme Farmakologiske egenskaper av disse stoffene (dvs. IC50 og effekt) i deres effekter på GSIS. Resultatene er konsistente med en voksende mengde bevis som tyder på en viktig rolle for dopamin og dopaminergic signalering utenfor sentrale nervesystemet20,21,22,26, 27. Spesielt våre funn viser at dopamin D2-reseptor Agonistiske bromocriptine potently hemmer GSIS, men ble nylig godkjent av FDA for å behandle type 2 diabetes24, reiser viktige spørsmål: Hvordan kan dette stoffet godbit type 2 Diabetes (T2D) hvis det senker insulinsekresjon, minst akutt? En mulig forklaring kan være relatert til bromocriptine's evne til å pådra "beta-celle resten." Ifølge denne hypotesen, siden en av kardinal funksjonene i T2D er en total oversecretion av insulin, som til slutt kan bidra til beta-celle feil28. Videre foreslår vi insulin oversecretion under T2D kan også forverre insulinresistens av avtagende insulinfølsomhet organer inkludert skjelettlidelser muskler, lever og fettvev. Dermed kan blokkere eller svekke GSIS resultere i gradvis resensitization av disse mål vev, noe som gjør dem mer mottakelig for insulin og dermed forbedre insulinfølsomhet. Å ha en analysen system mottakelig for høy gjennomstrømming screening åpner døren til fremtidig arbeid både dissekere de intracellulær signalveier medierte av dopamin D2-like reseptorer i bukspyttkjertelen beta-cellene som er ansvarlig for paracrine / autocrine GSIS hemming også som å ytterligere belyse mekanismer som stoffer som bromocriptine kan forbedre symptomer på diabetes.
Utviklingen av et cellebasert insulin sekresjon analysen som utnytter HTRF teknologi for insulinsekresjon og representerer en betydelig fordel i rask og effektiv deteksjon av insulin på betydelig redusert pris relativ og/eller større sikkerhet i forhold til eldre insulin oppdagelsen analyser avhengig RIA og ELISA tilnærminger. Faktisk ELISA og RIA insulin analyser er sammenlignbare følsom og bestemte HTRF insulin analysen, eliminerer homogen natur deteksjon, mange ekstra vask skritt i disse andre analysen systemer7. Videre gir den relative stabiliteten av HTRF en annen viktig fordel for pålitelig insulin måling.
Til sammen har HTRF har insulin sekresjon analysen evnen til å raskt forskjellsbehandle Farmakologiske egenskaper for flere narkotika i forbindelse med cellular insulinsekresjon. Dessuten, denne analysen relativt brukervennlighet og robust signal gjør det mottakelig for høy gjennomstrømming screening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi takker Nicolas Pierre (Cisbio bioassay) for nyttige råd og Dr. Pierre Maechler (Universitetet i Geneve) for generøst gir INS-1E celler. Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra Department of Defense (grant PR141292 til Z.F.), og John F. og Nancy A. Emmerling Fund of Pittsburgh stiftelsen (til Z.F.).
Acknowledgments
Forfatterne ikke avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well white half area plate | Greiner Bio-One | 82050-042 | |
| 384-well white low-volume, round-bottom plate | Corning | 15100157 | |
| Insulin High Range Kit | Cisbio Bioassays | 62IN1PEH | 10,000 test HTRF-based insulin assay kit |
| PHERAstar FSX plate reader | BMG Labtech | FSX | Plate reader adapted for HTRF-based assay readings |
| Plate sealers | Fisher Scientific | DY992 | To seal plate while antibodies incubate |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| RPMI Medium 1640 (1x) | Gibco | 11875-093 | [+] L-glutamine |
| Trypsin 0.05% | Corning | 25-052-CI | 0.53 mM EDTA, (-) sodium bicarbonate |
| DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline) | Corning | 21-031-CV | Without calcium and magnesium |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| HEPES | Gibco | 156-30-080 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| Penicillin/Streptomycin solution 100x | Corning | 30-002 CT | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M1348 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Dopamine hydrochloride | Sigma | 8502 | |
| Bromocriptine mesylate | Tocris | 427 | |
| (-)-Quinpirole hydrochloride | Tocris | 1061 | |
| Bovine Serum Albumin | Calbiochem | 12659 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4832 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma | 276855 |
References
- Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. Critical nodes in signalling pathways: Insights into insulin action. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (2), 85-96 (2006).
- Vetere, A., Choudhary, A., Burns, S. M., Wagner, B. K. Targeting the pancreatic beta-cell to treat diabetes. Nat Rev Drug Discov. 13 (4), 278-289 (2014).
- Despres, J. P., Lemieux, I. Abdominal obesity and metabolic syndrome. Nature. 444 (7121), 881-887 (2006).
- Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).
- Barg, S. Mechanisms of exocytosis in insulin-secreting B-cells and glucagon-secreting A-cells. Pharmacol Toxicol. 92 (1), 3-13 (2003).
- Braun, M., Ramracheya, R., Rorsman, P. Autocrine regulation of insulin secretion. Diabetes Obes Metab. 14 Suppl 3, 143-151 (2012).
- Farino, Z. J., et al. Development of a rapid insulin assay by homogenous time-resolved fluorescence. PLoS One. 11 (2), e0148684 (2016).
- Simpson, N., et al. Dopamine-mediated autocrine inhibitory circuit regulating human insulin secretion in vitro. Mol Endocrinol. 26 (10), 1757-1772 (2012).
- Heyduk, E., Moxley, M. M., Salvatori, A., Corbett, J. A., Heyduk, T. Homogeneous insulin and C-Peptide sensors for rapid assessment of insulin and C-peptide secretion by the islets. Diabetes. 59 (10), 2360-2365 (2010).
- Heyduk, T. Measuring protein conformational changes by FRET/LRET. Curr Opin Biotechnol. 13 (4), 292-296 (2002).
- Degorce, F. HTRF((R)): Pioneering technology for high-throughput screening. Expert Opin Drug Discov. 1 (7), 753-764 (2006).
- Degorce, F., et al. HTRF: A technology tailored for drug discovery - a review of theoretical aspects and recent applications. Curr Chem Genomics. 3, 22-32 (2009).
- Mathis, G. HTRF(R) Technology. J Biomol Screen. 4 (6), 309-314 (1999).
- Daijo, J. E., Sportsman, J. R. A time-resolved fluorescence immunoassay for insulin in rodent plasma. J Pharm Biomed Anal. 19 (3-4), 335-342 (1999).
- Merglen, A., et al. Glucose sensitivity and metabolism-secretion coupling studied during two-year continuous culture in INS-1E insulinoma cells. Endocrinology. 145 (2), 667-678 (2004).
- Ustione, A., Piston, D. W. Dopamine synthesis and D3 receptor activation in pancreatic beta-cells regulates insulin secretion and intracellular [Ca(2+)] oscillations. Mol Endocrinol. 26 (11), 1928-1940 (2012).
- Ustione, A., Piston, D. W. A simple introduction to multiphoton microscopy. J Microsc. 243 (3), 221-226 (2011).
- Ustione, A., Piston, D. W., Harris, P. E. Minireview: Dopaminergic regulation of insulin secretion from the pancreatic islet. Mol Endocrinol. 27 (8), 1198-1207 (2013).
- Rubi, B., et al. Dopamine D2-like receptors are expressed in pancreatic beta cells and mediate inhibition of insulin secretion. J Biol Chem. 280 (44), 36824-36832 (2005).
- Garcia-Tornadu, I., et al. Disruption of the dopamine d2 receptor impairs insulin secretion and causes glucose intolerance. Endocrinology. 151 (4), 1441-1450 (2010).
- Garcia-Tornadu, I., et al. New insights into the endocrine and metabolic roles of dopamine D2 receptors gained from the Drd2 mouse. Neuroendocrinology. 92 (4), 207-214 (2010).
- Lopez Vicchi, F., et al. Dopaminergic drugs in type 2 diabetes and glucose homeostasis. Pharmacol Res. 109, 74-80 (2016).
- Kalra, S., Kalra, B., Agrawal, N., Kumar, S. Dopamine: The forgotten felon in type 2 diabetes. Recent Pat Endocr Metab Immune Drug Discov. 5 (1), 61-65 (2011).
- Mahajan, R. Bromocriptine mesylate: FDA-approved novel treatment for type-2 diabetes. Indian J Pharmacol. 41 (4), 197-198 (2009).
- Caicedo, A. Paracrine and autocrine interactions in the human islet: more than meets the eye. Semin Cell Dev Biol. 24 (1), 11-21 (2013).
- Ballon, J. S., Pajvani, U., Freyberg, Z., Leibel, R. L., Lieberman, J. A. Molecular pathophysiology of metabolic effects of antipsychotic medications. Trends Endocrinol Metab. , (2014).
- Freyberg, Z., Aslanoglou, D., Shah, R., Ballon, J. S. Intrinsic and antipsychotic drug-induced metabolic dysfunction in schizophrenia. Front Neurosci. 11, 432 (2017).
- de Leeuw van Weenen, E. J., et al. The dopamine receptor D2 agonist bromocriptine inhibits glucose-stimulated insulin secretion by direct activation of the alpha2-adrenergic receptors in beta cells. Biochem Pharmacol. 79 (12), 1827-1836 (2010).
