Summary
Här presenterar vi homogen tid löst FRET (HTRF) som en effektiv metod för snabb upptäckt av insulin utsöndras från celler.
Abstract
Påvisande av insulinutsöndringen är kritisk för klarlägga mekanismer av reglerade sekretion samt som i studier av metabolism. Även om många insulin analyser har funnits i decennier, har nyligen tillkomsten av homogena tid-löst Förster resonans energi överföring (HTRF) teknik avsevärt förenklat dessa mätningar. Detta är en snabb, kostnadseffektiv, reproducerbar och robusta optiska analys beroende av antikroppar konjugerat med ljusa fluorophores med långvarig utsläpp som underlättar tid-löst Förster resonans energi överföring. HTRF insulin upptäckt är dessutom mottagliga för utveckling av high-throughput screening analyser. Här använder vi HTRF för att upptäcka insulinutsöndringen i INS-1E celler, en råtta insulinom-derived cellinje. Detta tillåter oss att uppskatta basala nivåer av insulin och deras förändringar som svar på glukos stimulering. Dessutom, använder vi detta system för upptäckt av insulin för att bekräfta rollen av dopamin som en negativ regulator av glukos-stimulerade insulinsekretionen (GSIS). På ett liknande sätt, andra dopamin D2-som-receptoragonister, quinpirole och bromokriptin, minska GSIS på ett koncentrationsberoende sätt. Våra resultat belysa nyttan av formatet HTRF insulin analys för att fastställa rollen av många läkemedel i GSIS och deras farmakologiska profiler.
Introduction
Regleringen av energimetabolism är finjusteras av en större anabola hormon, insulin. Insulin är syntetiserade och släpptes av betaceller som svar på ökad extracellulär glukosnivåer. Frisläppta insulinet utlöser upptaget av glukos med insulin-känsliga vävnader1,2. Fysiologiskt, detta är höjden av glukos koncentration efter en måltid, följt av utsöndringen av insulin för att reglera glukosupptag. Störningar i glukoshomeostasen leda till metabola försämringar kulminerade i insulinresistens och slutligen i uppkomsten av typ 2 diabetes2,3,4.
Även om insulinutsöndringen har studerats, fortfarande dess reglerande mekanismer dåligt förstådd. En kritisk undersökning varit identifiering av romanen modulatorer av insulinutsöndringen av beta-cellerna5,6,7,8. Dessa studier kräver en bättre förståelse för kopplingen förhållandet mellan glukos stimulering och insulinutsöndringen. Förmågan att noggrant övervaka och kvantifiera nivåerna av glukos-stimulerad insulinsekretion (GSIS) har därför varit avgörande. Hittills har dock var endast ett begränsat antal metoder tillgänglig för att möjliggöra kvantifiering av GSIS använder insulin-utsöndrar cellinjer eller Langerhanska. En är radioimmunoassay (RIA), som använder radioisotop-taggade insulin och antikroppar. De viktigaste begränsningarna med denna metod inkluderar säkerhetsfrågor på grund av hantering och bortskaffande av radioaktivt material. Dessutom, är denna metod arbetsintensiva, som involverar flera långa tvätt och inkubationsstegen. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) är en annan kostsamma och arbetsintensiva metod som använder antikroppar för insulin upptäckt. Variation i antikropp tillhörighet och effektivitet erkänner insulin är begränsande faktorer av denna metod och kan påverka reproducerbarheten för resultaten. Varken ELISA eller RIA har utformats för hög genomströmning experiment. AlphaScreen är en homogen analys används för att upptäcka och mäta nivåer av insulinsekretionen. AlphaScreen teknik är baserad på omvandling av omgivningens syre till en upphetsad syre singlet stat som kan reagera med Kemiluminiscens arter, vilket resulterar i generationen av chemiluminescence. Eftersom analysen är homogen, elimineras många av de tvätt stegen i samband med RIA och ELISA. Instabiliteten i signalen pågrund av reaktionen är dock en begränsande faktor som kan påverka avläsningen av analysen. ()TR-pincett, utvecklat av Heyduk och kollegor9, är en annan homogen syn på insulin mätning baserat på bindningen av två separata antikroppar mot olika epitoper på insulin-molekylen. Antikropparna är varje kemiskt kopplade till dubbel stranded DNA med korta kompletterande enda stranded DNA överhäng. Bindande antikroppar till insulin för dem samman och leder till en dubbel stranded DNA duplex. Varje antikropp är också förknippat med en respektive givare eller acceptor fluorophore och sammanslutningen av DNA duplex sammanför dessa fluorophores att generera Förster resonans energiöverföringen (bandet). En potentiell begränsning av TR-pincett, vilar dock bandet själv. Oförmåga att snabbt försvinna bakgrund fluorescens under bandet reaktionen kan leda till relativt höga nivåer av bakgrunden fluorescens och en låg signal-brus-förhållande inom analysen. Det finns därför fortfarande ett behov för en tillförlitlig, robust och kostnadseffektiv analys för att kvantifiera GSIS på ett sätt som hög genomströmning.
Senaste framstegen inom biofysik har utmynnat i utvecklingen av en homogen tid-löst fluorescens energi resonance överföring (HTRF) baserat analys. Specifikt, medan energin överföra inom kan analysen beskrivas som bandet-baserade, rättare HTRF bygger på luminiscens energi resonance överföring (LRET)10 som är icke-strålnings överföring av energi mellan givare och acceptor arter11,12,13. Denna distinktion är viktigt, eftersom tidpunkten för en fluorescens eller släcka baserade bandet interaktion är mycket annorlunda än det är för LRET, men samma typer av gating kan användas för bandet och LRET. Dessutom, användning av sällsynta jordartsmetaller lanthanide cryptate föreningar såsom europium eller terbium cryptate i HTRF producerar långa fluorescens halveringstider12,14. Detta ger den unika fördelen att införa en tidsfördröjning (µsec) mellan givare excitation och mätning av utsläpp från acceptorn (dvs tid-löst assay). Denna tidsfördröjning tillåter tillräckligt med tid för bakgrunden fluorescensen att skingra före mätning av acceptor utsläpp fluorescens. Utslaget är följaktligen gratis av icke-specifika fluorescens och således en hög signal-brus-förhållande uppnås (figur 1). Dessutom eliminerar homogena beskaffenhet HTRF behovet av tvätt steg att tvätta bort den obundna arter, vilket gör analysen mycket snabbare än ELISA eller RIA-baserade metoder.
Figur 1: Schematisk av mekanismen för HTRF insulin upptäckt. Två självständigt genererade monoklonala antikroppar specifikt känner igen och binder till insulin på separata platser. Dessa antikroppar är konjugerat med antingen europium cryptate givaren eller den XL665 acceptorn. Excitation av givaren på 337 nm resulterar i utsläpp på 620 nm. Den resulterande energiöverföringen orsakar XL665 att släppa ut en längre våglängd, 665 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Här, vi tillhandahålla ett detaljerat protokoll för att använda en strategi baserad på HTRF för att bestämma nivåerna av GSIS från INS-1E celler, en väletablerad insulin utsöndrar beta cell-derived råtta insulinom cell linje15. Denna analys kan dessutom användas för att identifiera molekylära regulatorer av insulinsekretionen farmakologiska profil. Vi tillämpar denna HTRF-baserade insulin analys för att undersöka dopamin D2-gillar receptor reglering av GSIS. Ökande studier har visat att signalsubstansen dopamin är en viktig regulator GSIS8,16,17,18,19,20, 21 , 22. dopamin påverkar GSIS negativt autokrin/parakrin via åtgärder på dopamin D2-liknande receptorer (D2, D3, D4 receptorer) uttrycks på ytan av beta bukspottkörtelns celler8 , 16 , 19. använda denna analys, vi bekräfta dopamins roll som en negativ regulator av GSIS och visa att den dopamin D2-som receptor agonister bromokriptin och quinpirole också minska GSIS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. INS-1E celler: underhåll och plätering
- Upprätthålla INS-1E celler i en fuktad 37 ˚C/5% CO2 inkubator och odlade med RPMI 1640 medium kompletteras med 5% (v/v) Värmeinaktiverade fetalt bovint serum, 2 mM L-glutamin, 10 mM HEPES, 1 mM natrium pyruvat, 100 U/mL Penicillin/Streptomycin lösning, 50 µM β-merkaptoetanol. Kultur celler i 10 mL komplett RPMI 1640 medium (per platta), tills de når 80-90% sammanflödet, när de kan trypsinized och anpassade eller användas för insulin sekretionen analysen.
- Dag 1: Aspirera media och tvätta cellerna en gång med 5 mL före värmde PBS. Tillsätt 0,5 mL av trypsin (0,025%) utspädd 1:1 i 0,5 mL PBS att trypsinize cellerna och Inkubera under 3-4 minuter vid 37 ° c. Avaktivera trypsin genom att lägga till 9 mL komplett media och överföring celler i en 15 mL centrifugrör genom pipettering.
- Pellet celler genom centrifugering och slamma cellpelleten i cirka 5 mL färsk media.
- Ta 10 µL av de åter suspenderade cellerna och blanda med 10 µL Trypan blå vitala färgämnet att kontrollera för cellernas viabilitet. Räkna levande och döda celler i 10 µL av denna blandning med hjälp av en hemocytometer. Livskraft-nivå bör vara över 90%. Späd de åter suspenderade cellerna i färska media till 1 miljon celler per mL.
- Utsäde 0,5 mL INS-1E celler per brunn i en poly-L-lysin belagd före 24-well plate, på en densitet på 500 000 celler per brunn.
- Dag 2: Ta bort media 18-24 h efter plätering och tillsätt 500 µL per brunn av färska RPMI 1640 media. Inkubera cellerna för en annan 24 h att låta cellerna återhämta sig helt från förhand passaging steg. Denna ytterligare tiden tillåter cellerna att sprida på vävnadsodling plattan.
2. insulin sekretionen Assay (dag 3)
- Förbereda KRB buffert: 132,2 mM NaCl, 3.6 mM KCl, 5 mM NaHCO3, 0,5 mM NaH2PO4, 0,5 mM MgCl2, 1,5 mM CaCl2och 0,001 g/mL bovint serumalbumin (BSA), pH 7,4.
- Sug ut media från celler och tvätta två gånger med pre värmde PBS.
- För glukos svält steg, lägga till 450 µL per brunn KRB (innehållande BSA) utan glukos för 1 h på 37 ˚C/5% CO2.
- Under glukos svält steg, förbereda seriespädningar av droger i KRB innehållande 200 mM glukos (10 x koncentration).
- Förbereda drog 10 x den slutliga koncentrationen i KRB kompletteras med 200 mM glukos (även 10 x slutliga analysen glukos koncentrationen). Om drogen beståndet (plus den extra 10 x glukos) är DMSO, kontrollera DMSO procentandel hålls konsekvent genom hela analysen (idealiskt slutliga andelen mindre än 0,1% DMSO).
- Dopamin och quinpirole behandlingar, Använd en slutlig analys drog koncentrationsintervall 100 µm till 100 pM (från högsta till lägsta koncentration), med den sista punkten i dos-respons som innehåller inget läkemedel. För bromokriptin, använder du en slutlig analys koncentrationsintervall 10 µm till 10 pM, med den sista punkten i dosrespons att vara drogfri-kontrollen.
- Efter glukos svält, lägga till drogen seriespädningar analysen att producera ett dos-respons.
- Tillsätt 50 µL per brunn av varje seriell utspädning till de motsvarande brunnarna (analysmetod total volym 500 µL).
- För glukos stimulering steg, inkubera cellerna med de respektive drog seriespädningar (i närvaro av 20 mM glukos) under 90 minuter vid 37 ˚C/5% CO2. Inkluderar en uppsättning kontrollbrunnar: (1) stimulering med 20 mM glukos ensam i avsaknad av ytterligare läkemedel och (2) celler som stimuleras varken med drogen eller glukos (som ger en basal hastighet av sekretion).
- Efter steget stimulering och ta försiktigt bort supernatanterna (Använd direkt eller förvaras vid 4 ° c).
Obs: Ett ytterligare 5 min skonsam centrifugering steg (600 x g, 1 min) kan införas på denna punkt för att ta bort eventuella resterande celler i assay supernatanterna.
3. HTRF till åtgärd insulinutsöndringen
- Späd assay supernatanterna 1:10 i KRB (utan BSA), helst i klara 96 brunnar.
- Förbereda insulin standardkurvan för HTRF insulin analysen (tabell 1).
| Stamstandardlösning 500 ng/ml | Seriespädningar | Arbetar [insulin] ng/ml |
| STD 7 | 30 µl lager + 140 µl KRB | 150 |
| STD 6 | 30 µl STD 7 + 45 µl KRB | 60 |
| STD 5 | 30 µl STD 6 + 45 µl KRB | 24 |
| STD 4 | 30 µl STD 5 + 45 µl KRB | 9,6 |
| STD 3 | 30 µl STD 4 + 45 µl KRB | 3,84 |
| STD 2 | 30 µl STD 3 + 45 µl KRB | 1,54 |
| STD 1 | 30 µl STD 2 + 45 µl KRB | 0,61 |
| STD 0 | 45 µl KRB | 0 |
| Obs: STD lager är 500 ng/ml | ||
Tabell 1. Seriespädningar att göra insulin standardkurvan.
- Lägga till standardkurvan proverna och utspädda assay supernatanterna HTRF plattan. Mätning av utsöndras insulin av HTRF kan utföras i antingen en 96-brunn eller plattan med 384 brunnar format, i åtanke som assay volymen måste justeras igen. Användning 10 µL per brunn prov i 96 brunnar vit halv-området plattor eller 5 µL per brunn i en 384-väl vit låg volym, runda-botten platta (se Tabell för material).
- Förbereda antikropp mix i upptäckt buffert (se Tabell för material) i en 1:2 givare (cryptate) / acceptor (XL-665) baserat.
Obs: Ytterligare specifika detaljer om HTRF analysen finns tillgängliga från tillverkaren. - Lägg till antikropp mix i analysen på 30 µL per brunn (för en 96 väl-plate assay format) eller 15 µL per brunn (för ett plattan med 384 brunnar assay format).
- Försegla plattan och odla i rumstemperatur.
- Läs plattan efter 2 h, 4 h eller natten inkubation med antikroppar med hjälp av plattan läsaren och lämplig HTRF fiberoptiska module (337 665 620 nm) (se Tabell för material - och tillverkarens anvisningar). Ställ in integration start på 60 µs och integration tiden 400 µs. Använd 200 blinkar per brunn.
Obs: Dessa parametrar var baserade på användning av vår särskilda läsare. Utslaget på 620 nm och 665 nm kan variera mellan olika instrument. Detta är en av de skäl som vi föreslår att du använder 665/620 förhållandet. Vid beräkningen av denna kvot, eventuella potentiella skillnader från läsare till läsare kommer att normaliseras och ger konsekventa värden oavsett det instrument som används för att mäta HTRF.
4. dataanalys och normalisering
- Beräkna insulin koncentrationerna av analysbrunnar via extrapolering av proportionerlig fluorescens mätningar (665 nm/620 nm) till en andra beställning kvadratiskt polynom kurva (figur 2).
Figur 2 : Insulin standardkurvan. Humaninsulin lager av kända koncentrationer användes för att generera insulin standardkurvan. De resulterande HTRF nyckeltal (665 nm / 620 nm) var plottas mot insulin koncentrationerna. Data var bästa passform till en andra beställning kvadratiskt polynom kurva (R2 = 0.99996). Detta är en representativ standardkurva. Felstaplar = SEM. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
- Med de extrapolerade uppgifterna som ng/mL av insulin utsöndras, normalisera (insulin utsöndras som svar på ökande ligand koncentrationer) till det genomsnittliga värdet av de % maximal insulin sekretionen analysbrunnar (20 mM glukos ensam tillstånd).
- Använda kurva passformen (R2) från en enda experiment för att beräkna den intraplate variationen. I experimentet, härrör de individuella R2 värdena från inom experimentell dubbletter, möjliggör en beräkning standardavvikelsen för medelvärdet för den kurva som passar.
- För att fastställa den interplate variationen, använda data från minst tre individuella experiment för att beräkna standardavvikelsen för medelvärdet för R2 värdet av kollektiva kurvan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi validerat våra insulin HTRF analys genom att generera en insulin standardkurvan med renat humaninsulin standarder av fördefinierade koncentrationer (figur 2). Generation av standardkurvan låtit oss att extrapolera proportionerlig fluorescens avläsningar och därmed avgöra utsöndrade insulinnivåerna i svar till läkemedelsbehandlingar (figur 2). Intraplate variation för kurva montering var minimal (R2 = 0.99996 ± 5,0 x 10-5) som var den interplate variationen (R2 = 0.947 ± 5,5 x 10-5, n = 3 plattor).
Vi har därefter pröva de basala nivåerna av insulinutsöndringen från INS-1E celler. Med en sådd densitet på 5 x 105 celler per brunn i ett 24-well platta format, upptäckte vi att celler utsöndras 54.53 ± 2,2 ng/mL av insulin i avsaknad av glukos över en varaktighet 90 min inkubering i en statisk bad. Tillägg av 20 mM glukos att stimulera GSIS resulterade i en betydande förbättring i GSIS (112,4 ± 5,2 ng/mL insulin; p < 0,0001) (figur 3).
Figur 3 : Uppskattning av basala kontra stimuleras insulinutsöndringen. INS-1E celler behandlades i frånvaron eller närvaron av hög glukos (20 mM) stimulering för 90 min. En fördubbling i sekretion insulinnivåer upptäcktes som svar på hög glukos stimulering i förhållande till de ostimulerade cellerna (basal sekretion skick; *** p < 0.0001, tvåsidiga oparat t-test). N = 5; alla analyser genomfördes i exemplar. Felstaplar = SEM. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Att undersöka betydelsen av dopaminerga D2-som receptorn stimulering i GSIS inom vårt INS-1E cellsystem, vi inkuberas celler i närvaro av D2-liknande receptoragonist droger (dopamin, quinpirole och bromokriptin) under den 90-min stimulering perioden med 20 mM glukos (figur 4).
Figur 4 : HTRF detektion av dopamin D2 -gillar receptoragonist hämning av GSIS. INS-1E celler behandlades med ökande koncentrationer av dopamin D2-gillar receptoragonister för 90 min i närvaro av hög glukos (20 mM; 37 ˚C). (A) dopamin inhiberad GSIS med en IC50= 1,78 ± 3.9 µM (R2 = 0.4355). (B) bromokriptin var mer potent än dopamin att minska GSIS (IC50 = 13,9 ± 2,4 nM, R2 = 0.7501). (C) liknade Quinpiroles potens dopamin (IC50 = 3,3 ± 3 µM, R2 = 0.3617). Alla data var bästa passform till en tre-parameter fit sigmoidal kurva. Den ' 0 mM glukos ' punkt visar basinsulin utsöndringen av INS-1E celler i avsaknad av hög glukos (20 mM) stimulering. N > 3; alla analyser genomfördes i exemplar på separata experimentella dagar. Felstaplar = SEM. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Effekt och styrka narkotikan agonist bestämdes av grafritande insulin sekretionen kurvorna. Vi fann att i avsaknad av stimulering med hög glukos, INS-1E cellerna fortsatte att utsöndra insulin, om än i betydligt lägre grad (indikeras av villkoret 0 mM), överensstämmer med tidigare rapporter15. Våra resultat visade att dopamin, en endogen agonist D2-liknande receptorer, inhiberad GSIS på ett sätt som samordning-beroende (DA IC50 = 1,78 ± 3.9 µM; Figur 4A). I kontrast, bromokriptin, en drog godkänd för att behandla typ 2 diabetes23,24, var betydligt mer potent än dopamin i producerar GSIS hämning (IC50 = 13,9 ± 2,4 nM. Figur 4B). Slutligen, dock mindre effektiv än bromokriptin, quinpirole uppvisade liknande potens att dopamin i GSIS hämning (IC50 = 3,3 ± 3 µM; Figur 4 c).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HTRF insulin analysen beskrivs här erbjuder en snabb, effektivt system för att mäta insulinutsöndringen från odlade cell-baserat system. Bland dess viktigaste fördelar erbjuder denna analys en låg bakgrund signal på grund av det höga signal-brus-förhållandet. Dessutom har vi bekräftat att HTRF signalen är stabil under en längre tid (> 24 h)7. Ändå, eftersom insulin bindande monoklonala antikropparna snabbt nå bindande mättnad efter tillägg till analysen, kineticsen av antikropp bindande kan påverkas av omgivningstemperaturen eller variationer i utsöndras insulin. Därför läser vi assay plattan vid flera tidpunkter (2 h 4 h och övernattning) att exakt identifiera när antikropparna har nått full mättnad och HTRF signalen är mest robusta7. Vi har också nyligen visat insulin antikropparna inte avsevärt korsreagerar med proinsulin eller c-peptid, tyder på att analysen är ganska specifik för mogna insulin7.
Ett viktigt steg i optimering av analysen inblandade om inrättande av ett brett dynamiskt omfång av insulinsekretionen. Denna dynamik definieras som skillnaden i upptäckta insulin under basala (ostimulerade) kontra stimuleras insulinutsöndringen. Finner vi att en inledande kort glukos svält steg (0 mM glukos, 1 h) före hög glukos stimulering expanderar det dynamiska omfånget av grundning INS-1E cellerna att utsöndra mer insulin under GSIS. I tidigare arbete, vi visade analysens dynamiskt omfång för att vara från 0,17 ng/mL (detektionsgräns) till så högt som ~ 110 ng/mL insulin med en signal-brusförhållandet 10,027. Dessutom, är mängden utsöndras insulin beroende av initial cell nummer pläterade per brunn. Vi optimerat ytterligare analysen genom att standardisera den passaging och hantering av INS-1E cellerna. Att upprätthålla konsekvens i passaging schema och plätering i en specifik plattan typ (t.ex. 10 cm rätter) är nödvändigt för att erhålla konsekvent utsöndras insulinnivåer.
Bland potentiella källor till assay bubblar variabilitet i assay lösningar som stör HTRF utläsningen. En viktig källa till dessa bubblor är förekomsten av bovint serumalbumin (BSA) i olika KRB-baserad analys-lösningarna. Felsök problemet potentiella, minska eller eliminera även BSA betydligt minimerar bubblor i lösningen och därför förbättrar HTRF signal tillförlitlighet. Detta är särskilt viktigt när du genererar de insulin standardkurva och drog utspädningar. Cell passage nummer-beroende skillnaderna i basal insulinfrisättning är en annan källa till potentiella assay variabilitet (inga data anges). Detta är förenligt med tidigare arbete av Merglen och kollegor som också föreslog att optimal insulinutsöndringen finns mellan INS-1E cell passage nummer ~ 60-10015. Vi rekommenderar därför för att minimera möjlig variation i insulinutsöndringen relaterade till passagen mobilnummer, begränsa sekretion analyser till denna väldefinierade cellområde passage.
Den primära begränsningen av cellbaserade insulin sekretionen analysen är variabilityen av basala sekretionen inneboende i INS-1E-celler. Detta kan relateras till de växande utsöndrar insulin cellerna utanför fysiologiska samband med bukspottskörteln Holmen. Faktiskt, de andra celltyper inom Holmen inklusive alfa och delta celler utsöndrar många faktorer som kan modulera basal som stimulerad insulinsekretion från beta-celler i en lokal, parakrin sätt25. Avsaknad av dessa andra islet celltyper kan störa snäva regleringen av insulinfrisättning, vilket leder till större variation än vad som annars sågs fysiologiskt. En annan potentiell begränsning är relativt små linjära spänna av analysen, eftersom insulin utsöndras som svar på 20 mM glukos nästan mättar i vissa fall. Som ett resultat i outspädd cell supernatanterna, kan effekter av insulinsekretionen på stimuleras insulinutsöndringen vara slut den linjära delen av kalibreringskurvan. Detta, emellertid, undanröjs genom att späda ut insulin-innehållande supernatanten tillräckligt för att tillåta insulinet att falla i det linjära området av kalibreringskurvan.
Vi validerat vår analys av visar att agonism av dopamin D2-liknande receptorer via dopamin, bromokriptin och quinpirole behandlingar hämmas GSIS i en koncentrationsberoende sätt. Dessa data tillät oss att bestämma farmakologiska egenskaperna hos dessa läkemedel (dvs. IC50 och effekt) när det gäller deras effekter på GSIS. Våra resultat är förenliga med en växande mängd bevis som tyder på en viktig roll för dopamin och dopaminerg signalering utanför den centrala nervsystem20,21,22,26, 27. Framför allt, våra fynd visar att dopamin D2-receptoragonist bromokriptin potent hämmar GSIS, ännu var nyligen godkändes av FDA för behandling av typ 2 diabetes24, väcker den viktiga frågan: Hur kan denna läkemedel behandla typ 2 diabetes (T2D) om det sänker insulinutsöndringen, åtminstone akut? En potentiell förklaring kan vara relaterade till bromokriptins kapacitet att ådra sig ”beta cellen vila”. Enligt denna hypotes, eftersom en av de huvudsakliga funktionerna av T2D är en övergripande överproducering av insulin, som i slutändan kan bidra till beta cellen misslyckande28. Dessutom föreslår vi att insulin överproducering under T2D kan också förvärra insulinresistens genom att minska insulinkänsligheten organ inklusive skelettmuskulaturen, lever och fettväv. Således, blockerar eller minskande GSIS kan leda till gradvisa resensitization av dessa vävnader, vilket gör dem mer lyhörd för insulin och därmed förbättra insulinkänsligheten. Att ha ett test system mottagliga för high-throughput screening öppnar dörren för framtida arbete både dissekera de intracellulära signalvägar medierade av dopamin D2-liknande receptorer i betaceller som ansvarar för parakrin / autokrin GSIS hämning samt att ytterligare klarlägga mekanismer genom vilka droger som bromokriptin kan förbättra symtomen av diabetes.
Utvecklingen av en cellbaserade insulin sekretionen analysmetod som tar fördel av HTRF teknik för insulinutsöndringen och utgör ett betydande framsteg i snabb och effektiv upptäckt av insulin vid betydligt minskat kostnaden relativ och/eller större säkerhet jämfört med äldre insulin upptäckt analyser förlitar sig på RIA och ELISA-baserade metoder. Faktiskt även ELISA och RIA insulin analyser är comparably känsligt och specifikt till HTRF insulin analysen, eliminerar homogena beskaffenhet upptäckt, många ytterligare tvätt steg i dessa andra test system7. Den relativa stabiliteten av HTRF signalen ger dessutom en annan viktig fördel för tillförlitlig insulin mätning.
Sammantaget HTRF har insulin sekretionen assay förmågan att snabbt diskriminera de farmakologiska egenskaperna hos flera droger inom ramen för cellulära insulinutsöndringen. Dessutom denna analys relativt enkel användning och robust signal gör den mottaglig för high-throughput screening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi tackar Nicolas Pierre (Cisbio Bioassays) för användbara råd och Dr. Pierre Maechler (universitetar av Geneva) för generöst ge INS-1E celler. Detta arbete stöds av finansiering från Department of Defense (grant PR141292 till Z.F.), och John F. och Nancy A. Emmerling Fund Pittsburgh Foundations (till Z.F.).
Acknowledgments
Författarna har något att avslöja.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well white half area plate | Greiner Bio-One | 82050-042 | |
| 384-well white low-volume, round-bottom plate | Corning | 15100157 | |
| Insulin High Range Kit | Cisbio Bioassays | 62IN1PEH | 10,000 test HTRF-based insulin assay kit |
| PHERAstar FSX plate reader | BMG Labtech | FSX | Plate reader adapted for HTRF-based assay readings |
| Plate sealers | Fisher Scientific | DY992 | To seal plate while antibodies incubate |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| RPMI Medium 1640 (1x) | Gibco | 11875-093 | [+] L-glutamine |
| Trypsin 0.05% | Corning | 25-052-CI | 0.53 mM EDTA, (-) sodium bicarbonate |
| DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline) | Corning | 21-031-CV | Without calcium and magnesium |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| HEPES | Gibco | 156-30-080 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| Penicillin/Streptomycin solution 100x | Corning | 30-002 CT | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M1348 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Dopamine hydrochloride | Sigma | 8502 | |
| Bromocriptine mesylate | Tocris | 427 | |
| (-)-Quinpirole hydrochloride | Tocris | 1061 | |
| Bovine Serum Albumin | Calbiochem | 12659 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4832 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma | 276855 |
References
- Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. Critical nodes in signalling pathways: Insights into insulin action. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (2), 85-96 (2006).
- Vetere, A., Choudhary, A., Burns, S. M., Wagner, B. K. Targeting the pancreatic beta-cell to treat diabetes. Nat Rev Drug Discov. 13 (4), 278-289 (2014).
- Despres, J. P., Lemieux, I. Abdominal obesity and metabolic syndrome. Nature. 444 (7121), 881-887 (2006).
- Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).
- Barg, S. Mechanisms of exocytosis in insulin-secreting B-cells and glucagon-secreting A-cells. Pharmacol Toxicol. 92 (1), 3-13 (2003).
- Braun, M., Ramracheya, R., Rorsman, P. Autocrine regulation of insulin secretion. Diabetes Obes Metab. 14 Suppl 3, 143-151 (2012).
- Farino, Z. J., et al. Development of a rapid insulin assay by homogenous time-resolved fluorescence. PLoS One. 11 (2), e0148684 (2016).
- Simpson, N., et al. Dopamine-mediated autocrine inhibitory circuit regulating human insulin secretion in vitro. Mol Endocrinol. 26 (10), 1757-1772 (2012).
- Heyduk, E., Moxley, M. M., Salvatori, A., Corbett, J. A., Heyduk, T. Homogeneous insulin and C-Peptide sensors for rapid assessment of insulin and C-peptide secretion by the islets. Diabetes. 59 (10), 2360-2365 (2010).
- Heyduk, T. Measuring protein conformational changes by FRET/LRET. Curr Opin Biotechnol. 13 (4), 292-296 (2002).
- Degorce, F. HTRF((R)): Pioneering technology for high-throughput screening. Expert Opin Drug Discov. 1 (7), 753-764 (2006).
- Degorce, F., et al. HTRF: A technology tailored for drug discovery - a review of theoretical aspects and recent applications. Curr Chem Genomics. 3, 22-32 (2009).
- Mathis, G. HTRF(R) Technology. J Biomol Screen. 4 (6), 309-314 (1999).
- Daijo, J. E., Sportsman, J. R. A time-resolved fluorescence immunoassay for insulin in rodent plasma. J Pharm Biomed Anal. 19 (3-4), 335-342 (1999).
- Merglen, A., et al. Glucose sensitivity and metabolism-secretion coupling studied during two-year continuous culture in INS-1E insulinoma cells. Endocrinology. 145 (2), 667-678 (2004).
- Ustione, A., Piston, D. W. Dopamine synthesis and D3 receptor activation in pancreatic beta-cells regulates insulin secretion and intracellular [Ca(2+)] oscillations. Mol Endocrinol. 26 (11), 1928-1940 (2012).
- Ustione, A., Piston, D. W. A simple introduction to multiphoton microscopy. J Microsc. 243 (3), 221-226 (2011).
- Ustione, A., Piston, D. W., Harris, P. E. Minireview: Dopaminergic regulation of insulin secretion from the pancreatic islet. Mol Endocrinol. 27 (8), 1198-1207 (2013).
- Rubi, B., et al. Dopamine D2-like receptors are expressed in pancreatic beta cells and mediate inhibition of insulin secretion. J Biol Chem. 280 (44), 36824-36832 (2005).
- Garcia-Tornadu, I., et al. Disruption of the dopamine d2 receptor impairs insulin secretion and causes glucose intolerance. Endocrinology. 151 (4), 1441-1450 (2010).
- Garcia-Tornadu, I., et al. New insights into the endocrine and metabolic roles of dopamine D2 receptors gained from the Drd2 mouse. Neuroendocrinology. 92 (4), 207-214 (2010).
- Lopez Vicchi, F., et al. Dopaminergic drugs in type 2 diabetes and glucose homeostasis. Pharmacol Res. 109, 74-80 (2016).
- Kalra, S., Kalra, B., Agrawal, N., Kumar, S. Dopamine: The forgotten felon in type 2 diabetes. Recent Pat Endocr Metab Immune Drug Discov. 5 (1), 61-65 (2011).
- Mahajan, R. Bromocriptine mesylate: FDA-approved novel treatment for type-2 diabetes. Indian J Pharmacol. 41 (4), 197-198 (2009).
- Caicedo, A. Paracrine and autocrine interactions in the human islet: more than meets the eye. Semin Cell Dev Biol. 24 (1), 11-21 (2013).
- Ballon, J. S., Pajvani, U., Freyberg, Z., Leibel, R. L., Lieberman, J. A. Molecular pathophysiology of metabolic effects of antipsychotic medications. Trends Endocrinol Metab. , (2014).
- Freyberg, Z., Aslanoglou, D., Shah, R., Ballon, J. S. Intrinsic and antipsychotic drug-induced metabolic dysfunction in schizophrenia. Front Neurosci. 11, 432 (2017).
- de Leeuw van Weenen, E. J., et al. The dopamine receptor D2 agonist bromocriptine inhibits glucose-stimulated insulin secretion by direct activation of the alpha2-adrenergic receptors in beta cells. Biochem Pharmacol. 79 (12), 1827-1836 (2010).
