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Neuroscience

Isolation de Immunomagnetic rapide et spécifique de souris primaire Oligodendrocytes

Published: May 21, 2018 doi: 10.3791/57543
Automatic Translation
1, 2, 2
1Program in Molecular and Cellular Biology, State University of New York Downstate Medical Center, 2Department of Neurology and Rehabilitation, University of Illinois at Chicago

Summary

Nous décrivons l’isolement immunomagnetic des oligodendrocytes principal de la souris, qui permet d’isoler des cellules in vitro culture rapide et spécifique.

Abstract

L’isolement efficace et robuste et la culture des oligodendrocytes primaires (MCO) est un outil précieux pour l’étude in vitro de l’élaboration des oligodendrocytes ainsi que la biologie des maladies comme la sclérose en plaques démyélinisantes et Maladie de Pelizaeus-Merzbacher-like (PMLD). Ici, nous présentons un simple et méthode de sélection efficace pour l’isolation immunomagnetic de stade trois O4+ cellules preoligodendrocytes de petits souris néonatales. Comme OL immature constituent plus de 80 % de la matière blanche de cerveau de rongeurs à jour après la naissance 7 (P7) cette méthode d’isolement assure non seulement le cellulaire à haut rendement, mais aussi l’isolement spécifique du BSL déjà engagé envers la lignée oligodendrogliale, diminuant la possibilité d’isoler les cellules contaminantes telles que les astrocytes et les autres cellules du cerveau de souris. Cette méthode est une modification des techniques rapportées antérieurement et assure une pureté préparation oligodendrocyte au-dessus de 80 % en environ 4 h.

Introduction

Oligodendrocytes (OLs) sont les cellules myélinisantes du système nerveux central (SNC)1. L’isolement et la culture des oligodendrocytes primaires dans un environnement fortement réglementé est un outil précieux pour l’étude in vitro de l’élaboration des oligodendrocytes ainsi que la biologie des maladies telles que la sclérose2 démyélinisantes . Cela nécessite un oligodendrocyte efficace et robuste d’isolement et de la culture la méthode3. Dans cette étude, nous avons profité de l’expression d’un marqueur de surface de cellule oligodendrocyte distinctif pour mettre en œuvre une technique d’isolation modifiée qui est rapide et précis.

Quatre étapes distinctes de la maturation des oligodendrocytes ont été identifiés, chacun caractérisé par l’expression des marqueurs de surface de cellules distinctes pour chaque stade de développement (Figure 1). Ces marqueurs de surface cellulaire peuvent être reconnus par des anticorps spécifiques4,5et peuvent être utilisés pour isoler les langues officielles à des étapes spécifiques. Dans un premier temps, cellules de précurseurs d’oligodendrocytes (OPCs) ont la capacité à proliférer, de migrer et de façon explicite de facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF-Rα) de récepteur6, ganglioside A2B5, protéoglycane NG27,8 , polysialic acide-neural cell adhesion molécule9 et gras-acid-binding protein 7 (FABP7)10. OPCs ont une morphologie bipolaire avec peu de processus abrégé émanant des pôles opposés du corps cellulaire, qui est caractéristique des précurseurs neuronaux de cellules11.

Figure 1
Figure 1 : Expression de marqueurs de surface cellulaire lors du développement d’oligodendrocyte souris. Opération survie cellulaire marqueurs de surface tels que A2B5, GalC (O1), NG2, O4 et PDGF-Rα peuvent servir à isoler spécifiquement les oligodendrocytes au stade de développement spécifique en utilisant des anticorps spécifiques.   Veuillez cliquer ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Dans un deuxième temps, OPCs donnent lieu à la preoligodendrocytes et exprimer à la membrane cellulaire non seulement des marqueurs OPC, mais aussi le Sulfoglycosphingolipides (un galactolipide sulfatée) reconnu par le O4 anticorps12,13et la protéine de GPR1714, qui persiste jusqu’au stade d’oligodendrocytes immatures (OL). À ce stade, preoligodendrocytes étendre les processus abrégés multipolaires. Preoligodendrocytes sont l’étape majeure d’OL à jour après la naissance 2 (P2) dans la substance blanche cérébrale de rat et de souris avec une population mineure d’immatures OLs15.

Au cours de la troisième phase, OLs immatures continuent à exprimer O4, perdre l’expression des marqueurs A2B5 et NG2 et commencent à exprimer les galactocérébrosides C16. À ce stade, opération Survie au Soudan se sont engagés à la lignée oligodendrocyte et deviennent des cellules post-mitotiques avec des branches bien ramifiées17,18. À cette époque les premières cellules MBP+ on observe15,19,20,21et OL immature constituent plus de 80 % de la matière blanche rongeur à P7. Par conséquent, isolement des langues officielles à P7 pourrait garantir cellulaire à haut rendement.

Dans la finale et quatrième étape du développement de l’OL, OLs matures expriment myélinisantes protéines (la protéine basique de la myéline (MBP), protéine protéolipidique (PLP), glycoprotéine myéline associée (MAG) et la myéline oligodendrocyte glycoprotéine (MOG)22,23 ,24,25,26. À ce stade, OLs matures s’étendent les membranes ce compact de forme Envellopants gaines autour des axones et peuvent myéliniser. Cela coïncide avec l’observation que, dans le cerveau de rat et de souris, les cellules MBP+ deviennent plus en plus abondantes à P1419,20,21.

Depuis le premier isolement des oligodendrocytes par fifi et ses collègues en 196727, plusieurs méthodes pour l’isolement des langues officielles de la CNS du rongeur ont été appliquées, y compris immunopanning28,29,30, cellule activée par fluorescence triant (FACS) exploitant cell surface spécifique antigènes28,31, centrifugation en gradient différentiel32,33,34,35 et secouant méthode fondée sur l’adhésion différentielle des différents CNS glia36,37. Cependant, les méthodes existantes de la culture ont des limites, notamment en termes de pureté, de rendement et de temps requis pour exécuter les procédures38. Par conséquent, des méthodes d’isolation plus efficaces pour les oligodendrocytes sont nécessaires.

Dans cet article, nous présentons un simple et méthode de sélection efficace pour l’isolation immunomagnetic de stade trois O4+ cellules preoligodendrocytes de petits souris néonatales. Cette méthode est une modification des techniques signalées par Emery et al. 39 et Dincman et al. 40 et assure une oligodendrocyte préparation une pureté supérieure à 80 % en environ 4 h.

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Protocol

Les souris utilisées dans cette étude ont été pris en charge conformément aux directives de la numéro de protocole de SUNY Downstate Medical Center Division du laboratoire Animal Resources (DLAR) 15-10492.

Remarque : Les oligodendrocytes primaires ont été isolées de néonatale (P5-P7 sauvage C57Bl/6N) souris. À ce stade, OLs immatures constituent plus de 80 % de la matière blanche rongeur assurant un rendement cellulaire élevé. Tous les tampons et les compositions de réactif sont disponibles à la fin de la Table des matières.

1. préparation de lamelles couvre-objet

NOTE : Poly-D-lysine (PDL) / laminin enduit lamelles doivent être préparés avant l’isolement de l’OL.

  1. Lieu #1 allemand lamelles couvre-objet en verre dans un tube conique de 50 mL et ajouter 35 mL de 70 % EtOH à les nettoyer.
  2. Fermer le tube, placez-le dans un mélangeur oscillant et incuber à température ambiante pendant au moins 30 min, tout en poussant doucement. Lamelles couvre-objet peut être incubées pendant la nuit.
  3. Jeter l’EtOH 70 %.
  4. Laver les lamelles 3 fois avec de l’eau désionisée, retirez l’eau chaque fois à l’aspiration intra-utérine.
  5. Ajouter 30-35 mL de PDL 50 µg/mL pour les lamelles dans le tube de 50 mL, assez pour couvrir les lamelles couvre-objet.
  6. Placer le tube de 50 mL contenant les lamelles couvre-objet sur une table de mixage oscillant et incuber à température ambiante pendant au moins 30 min tout en berçant doucement.
  7. Laver les lamelles 3 fois avec de l’eau désionisée, élimination de l’eau chaque fois à l’aspiration intra-utérine.
  8. Transférer les lamelles dans 60 mm plats de Pétri contenant de l’eau désionisée.
  9. Utilisez une pointe de pipette P200 pour disposer les lamelles comme une couche qui recouvre toute la surface de la boîte de Pétri.
  10. Soigneusement, enlever l’eau de la vaisselle à l’aspiration intra-utérine.
  11. Enlever l’excès d’eau autour les lamelles et les laisser sécher pendant la nuit avec le couvercle ouvert et sous ultraviolets dans le capot.
    Remarque : Lamelles de verre PDL enduit peuvent être stockés à 4 ° C dans des plats de Pétri stérile jusqu'à trois mois.
  12. Placer les lamelles en plaques 24 puits, un par puits, à l’aide de pinces fines.
  13. Déplacez les lamelles vers le centre du bien faire que les bords ne touchent pas la paroi du puits.
  14. Ajouter 100 µL de 10 µg/mL laminine dilué dans B27NBMA (voir la Table des matières) à partir du centre de chaque lamelle et se déplaçant de façon circulaire vers les bords pour couvrir toute la région.
    Remarque : Puisque laminine participe au maintien de l’OL et favorise la différenciation en MCO mature, c’est un important facteur de survie OL pour in vitro culture41,42,43,44.
  15. Incuber la plaque dans un incubateur à 37 ° C à 5 % de CO2 pendant au moins 1 h ou jusqu'à ce que le BSL est prêt pour le placage.

2. souris cerveau Cortex Dissociation

  1. Sacrifier postnatale 5-7 jours vieux C57Bl/6N souriceaux par décapitation rapide avec des ciseaux préalablement nettoyés dans l’éthanol à 70 %.
    NOTE : cortex cérébraux de 5-6 petits de souris néonatales ont été utilisés pour chaque préparation. En moyenne, un cerveau de souris donne 1-1. 5 x 106 langues officielles.
  2. Couper la peau du cuir chevelu, le long de la ligne médiane avec des petits ciseaux de dissection et rétracter pour exposer le crâne.
  3. Couper le crâne soigneusement le long de la ligne médiane à partir de l’ouverture à l’arrière du crâne vers la zone frontale, tirant vers le haut avec les ciseaux pour éviter d’endommager le cerveau. Puis, à l’aide de l’ouverture à l’arrière du crâne coupé vers chaque orbite le long de la base du crâne.
  4. Utiliser des pinces fines doucement taquiner le cortex du mésencéphale et les transférer dans un plat de vitroplants de 60 mm contenant 7 mL de B27NBMA. Répétez les étapes 2.2 à 2.4 pour chaque cerveau, mettre en commun les cortex disséqués.
  5. Le cortex de transfert à une autre boite de culture de tissus de 60 mm contenant 5 mL de tampon de dissociation (B27NBMA, 20-30 U/mL papaïne et 2 500 U DNase I).
  6. Couper en dés le cortex en petits morceaux d’environ 1 mm3 à l’aide d’une lame de bistouri #15 et incuber pendant 20 min dans un 37 ° C, 5 % CO2 incubateur.
  7. Ajouter 1 mL de sérum bovin croissance (BGS) pour arrêter la réaction enzymatique.
  8. Transfert du cortex ainsi que les médias de dissociation d’un tube conique de 15 mL à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL.
  9. Doucement commencer à dissocier le tissu cérébral par pipetage lentement vers le haut et vers le bas de 6 à 8 fois à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL, à l’aide de soin de réduire les bulles.
  10. Laisser les morceaux de tissus pour se contenter de 2-3 min et transférer le surnageant dans un nouveau tube.
  11. Ajouter 3 mL de B27NBMA contenant 10 % BGS/2500 U DNase I le tissu-pellet.
  12. Utiliser une pipette sérologique de 5 mL de dissocier doucement le tissu cérébral lors de pipetage de haut en bas 6 - 8 fois. Veillez à réduire au minimum les bulles.
  13. Laisser les morceaux de tissu se contenter de 2-3 min.
  14. Transférer le surnageant dans un nouveau tube. Ajouter 3 mL de B27NBMA contenant 10 % BGS/DNase I le tissu-pellet.
  15. Doucement dissocier le tissu cérébral en utilisant un embout de pipette P1000, tout en pipettant également le mélange des médias et le tissu cérébral de haut en bas. Répétez les étapes 2.13 et 2.14 suivant jusqu'à ce qu’aucun gros morceaux de tissu ou jusqu’au B27NBMA contenant 10 % BGS/DNase I est épuisé, selon la première éventualité. Veillez à réduire au minimum les bulles.
  16. Suspension cellulaire de piscine avec des surnageants précédentes.
  17. Crépine de cellule place 70 µm dans un tube de 50 mL. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL, passer doucement la suspension de cellules regroupées sur la crépine de cellule de 70 µm.
  18. Lavez le tamis de la cellule en ajoutant 1 mL de B27NBMA contenant 10 % BGS/DNase I.
  19. Jeter la crépine de la cellule. Porter le volume à 30 mL avec B27NBMA contenant 10 % BGS/DNase I.
  20. Transférer la suspension cellulaire à deux tubes coniques 15 mL. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 10 min à 200 x g.
  21. Retirez le surnageant sans quitter les cellules exposées à l’air. Le surnageant sera nuageux à cause de débris cellulaires. Ajouter 3 mL de B27NBMA contenant 10 % BGS au culot.
  22. Soigneusement se dissocient le culot cellulaire à l’aide d’une pipette P1000. Compléter le volume à 15 mL par B27NBMA contenant 10 % BGS.
  23. Passer un frais 40 µm cellule/filtre de la suspension cellulaire.
  24. Lavez le tamis de la cellule en ajoutant 1mL de B27NBMA contenant 10 % BGS. Jeter la crépine de la cellule.
  25. Compléter le volume à 30 mL par B27NBMA contenant 10 % BGS.
  26. Transférer la suspension cellulaire à tubes coniques de 2 x 15 mL. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 10 min à 200 x g.
  27. Enlever la plupart de surnageant sans quitter les cellules exposées à l’air. Remettre en suspension les granules cellulaires dans 5 mL de cellule magnétique froid de glace tri tampon (MCS).

3. détermination du nombre de cellules et de la viabilité

  1. Diluer 100 µL de la suspension cellulaire avec 400 µL de Solution de bleu de Trypan dans un tube de microtubes de 1,5 mL pour réaliser une dilution de 1 / 5 à 0,4 % (p/v).
  2. Centrer une lamelle couvre-objet sur un hémocytomètre chambre et remplir les deux chambres avec 10 µL de la dilution de la cellule à l’aide d’une pipette de P10 et d’éviter de surcharger. La solution passera sous le couvercle en verre par capillarité.
  3. Placez l’hémocytomètre sur la platine du microscope et ajuster le foyer à l’aide d’un grossissement de 40 X.
    Remarque : Les globules sont enregistrées en utilisant un compteur à main dans chacun des cinq carrés (quatre coins et un centre). Uniquement les cellules non viables absorbent le colorant et apparaissent en bleus, tandis que direct et cellules saines apparaissent ronds et réfractive et n’absorbent pas le colorant de couleur bleue, permettant de déterminer le nombre de cellules viables et totales par millilitre.

4. isolement de O4+ Oligodendrocytes

  1. Centrifuger la suspension cellulaire à 200 x g pendant 10 min.
  2. Soigneusement, éliminer le surnageant à l’aide d’aspiration intra-utérine, éviter l’exposition des cellules à l’air.
  3. Resuspendre le culot dans 90 µL de tampon MCS par 1 x 107 cellules total, suivie de l’addition de 10 µL d’anti-O4 perles par 1 x 107 cellules.
  4. Mélanger la suspension cellulaire et des perles en doucement effleurer le tube conique de 15 mL avec le doigt 4 - 5 fois.
  5. Incuber le mélange pendant 15 min à 4 ° C, effleurant le tube conique de 15 mL avec le doigt 4-5 timesevery 5 min.
  6. Laver le mélange en ajoutant doucement 2 mL de tampon MCS par 1 x 107 cellules au tube. Centrifuger le mélange à 200 x g pendant 10 min.
  7. Jeter le surnageant soigneusement à l’aide d’aspiration intra-utérine, éviter l’exposition des cellules à l’air. Resuspendre le culot dans 500 µL de tampon MCS pour chaque 1 x 107 éléments.
  8. Fixer un séparateur magnétique sur un stand de séparateur magnétique. Fixer une colonne de sélection sur le séparateur magnétique et placez une passoire de cellule de 40 µm sur le dessus de la colonne. Placer deux 15 mL ou un tube conique de 50 mL sous la colonne de séparation pour recueillir l’écoulement à travers.
  9. Rincez d’abord la colonne 40 µm cellulaire crépine et séparation avec 3 mL de tampon MCS et laissez la mémoire tampon par le biais de la colonne sans laisser sécher.
  10. Ajouter le mélange de perles et de la suspension cellulaire à la crépine de la cellule et dans la colonne de la sélection.
  11. Lavez le tamis de cellule 40 µm avec 1 mL de tampon MCS.
  12. Jeter la crépine de la cellule et laisser le mélange des cellules, des perles et des tampons traversent la colonne sans laisser sécher.
  13. Laver la colonne de séparation 3 fois avec 3 mL de tampon MCS et 1 fois avec les médias de prolifération OL.
  14. Retirer la colonne de séparation du séparateur magnétique, placez-le rapidement dans un tube conique de 15 mL et immédiatement ajouter 5 mL de médias de prolifération OL.
  15. Placez un plongeur sur le dessus de la colonne et fermement pousser pour débusquer les cellules marquées dans le tube conique de 15 mL.
  16. Déposer 100 µL de la suspension cellulaire pour déterminer le nombre de cellules et de la viabilité en utilisant le bleu Trypan et hémocytomètre comme indiqué à l’article 3.
    Remarque : La viabilité des cellules au-dessus de 80 % est considérée comme acceptable de procéder avec la culture des langues officielles, mais plus de 90 % de la viabilité est optimale.

5. électrodéposition de O4 isolé+ Oligodendrocytes

  1. Diluer la suspension cellulaire au désir d’électrodéposition densité (5 x 105 cellules par lamelle) en utilisant les médias de prolifération OL.
    NOTE : OL, densité de semis est très important, donc la densité cellulaire appropriée doit être confirmée en utilisant un microscope de culture de tissus avant de procéder. Ensemencement de densité inférieure à 10 000 cellules/lamelles couvre-objet peut conduire à la survie des cellules pauvres. Densité à 10 000 à 25 000, OL d’électrodéposition différenciation morphologique est lent45. Nous plaque OLs avec une densité de semis d’au moins 50 000 cellules/lamelles couvre-objet pour assurer la survie des cellules.
  2. Déplacer les plaques 24 puits contenant des lamelles couvre-objet recouvert de laminine, de l’incubateur à la hotte de la culture de tissus.
  3. Retirez chaque lamelle de laminine et remplacez-le par 100 µL de la suspension de l’OL.
  4. Incuber les OLs dans un incubateur 37 °C/5% CO2 pour un maximum de 45 min pour favoriser l’adhérence OL pour les lamelles couvre-objet.
  5. Après l’incubation, retirer les plaques 24 puits de l’incubateur. Inonder chaque puits de la plaque 24 puits avec 500 µL de médias de prolifération OL.
  6. Replacez le BSL dans l’incubateur de2 °C/5% CO 37 pour 24h supplémentaire.
  7. 24 h après le placage d’OLs, retirez les supports de prolifération et remplacer par des médias de différenciation OL pour induire la différenciation.
  8. Replacez l’OLs dans l’incubateur et ne l’enlevez pas jusqu'à ce que les cellules sont prêtes pour la fixation.
    NOTE : Variations de pH sont préjudiciables pour les langues officielles et réduire la viabilité des cellules, donc retrait inutile des cultures langues officielles de l’incubateur doit être évité.

6. immunofluorescence souillant

  1. Pour la détection des cellules des marqueurs de surface (NG2, O1 et O4) Retirez le support des puits.
  2. Ajouter 250 µL de surnageants d’hybridome de souris contenant des anticorps primaires contre O1 (non dilué)13 et O4 (non dilué)13 et lapin polyclonaux contre NG2 (1 : 150 dilué dans B27NBMA).
    Remarque : Si des anticorps anti-O1 et anti-O4 commercialement disponibles doivent être utilisées, il est conseillé d’utiliser des dilutions suggérées par le fabricant.
  3. Incuber les cellules avec l’anticorps primaire maximale dans une étuve à2 °C/5% CO 37 45 min.
  4. Laver deux fois avec 0,05 % de Tween-20/1 X PBS. Fixer les cellules avec du paraformaldéhyde 4 % (4 % PFA) pendant 10 min à température ambiante.
  5. Laver trois fois de 5 min chacun, avec 0,05 % de Tween-20/1 X PBS.
  6. Diluer le conjugué Alexa 488 chèvre anti-souris IgM ou anticorps secondaire IgG anti-lapin (1 : 400) dans B27NBMA.
  7. Retirez les 0,05 % Tween-20/1 X PBS les lamelles couvre-objet. Incuber les cellules avec un anticorps secondaire pendant 1 h à température ambiante dans l’obscurité.
  8. Laver trois fois de 5 min chacun, avec 0,05 % de Tween-20/1 X PBS.
  9. Pour la double coloration pour la détection des marqueurs internes (GFAP), enlever les 0,05 % Tween-20/1 X PBS et bloc/permeabilize des cellules avec le tampon de bloc/perméabilisation pendant 15 min à température ambiante. Dans le cas contraire, passez à l’étape 6.17.
  10. Retirer le tampon de bloc/perméabilisation et ajouter 250 µL poulet anti-GFAP (1/100) dilué dans un tampon bloc/perméabilisation.
  11. Incuber les cellules avec anti-GFAP pendant 1 h à température ambiante. Laver trois fois de 5 min chacun, avec 0,05 % de Tween-20/1 X PBS.
  12. Diluer le conjugué Alexa 594 chèvre anti-poulet IgG anticorps secondaire (1 : 400) dans B27NBMA.
  13. Retirez les 0,05 % Tween-20/1 X PBS les lamelles couvre-objet. Incuber les cellules avec un anticorps secondaire pendant 1 h à température ambiante dans l’obscurité.
  14. Laver trois fois de 5 min chacun, avec 0,05 % de Tween-20/1 X PBS.
  15. Contre-coloration avec 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et monter les cellules avec antifade montage média contenant DAPI.
  16. Laissez les lamelles guérir du jour au lendemain dans l’obscurité à température ambiante.
  17. Images de cellules colorées avec un microscope à épifluorescence.
    Remarque : Dans le présent protocole, les cellules ont été imagées grossissement de 40 X à l’aide d’un temps d’exposition uniforme.

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Representative Results

Le but de cette étude était d’établir une méthode d’isolation améliorée pour O4+ oligodendrocytes souris primaire nécessitant la moins possible manipulation des cellules cibles. L’ensemble de la procédure de l’euthanasie des petits au bordé des cellules en lamelles prend environ 4 h et les données présentées ici représentent trois expériences indépendantes. Après dissociation tissulaire, une moyenne de 4,3 ± 0,46 x 107 cellules ont été isolées pour chaque étude indépendante, avec une viabilité de 91 % ± 5,6 %. Après isolement d’immunomagnétique à l’aide d’anti-O4 marqué microbilles magnétiques une moyenne de 6,9 ± 0,38 x 106 langues officielles ont été obtenues (1-1. 5 x 106 par souris) qui est de 16,2 % ± 1,6 % des cellules totales initialement dissociées ; la viabilité a été 96,3 % ± 3,5 %.

Figure 2
Figure 2 : Immunomagnetically isolé OLs marqueurs express immatures à 1DIV. (A) MCO sous microscope à contraste de phase Voir la morphologie bi - et tri-polaire. BSL express NG2 (B), O4 (C) et O1 (D). Très peu d’astrocytes étaient présents à 1DIV (C, rouge), échelle graphique = 50 µm. données ont été recueillies auprès de 3 expériences indépendantes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Pour examiner le phénotype antigénique des cellules immunomagnetically isolé, immunofluorescence souillant était effectué 24h (1DIV) et 72 h (3DIV) après les cellules de placage. À 1DIV, la cellule semble être bi - ou tripolaire sous le microscope à contraste de phase (Figure 2 a-B), une caractéristique de la caractéristique du stade précoce prolifèrent OLs (OPCs et ou preoligodendrocytes). 66,1 ± 8,4 % de ces cellules ont été marqués au NG2 (Figure 2 b), et 58 % ± 9,4 % des cellules étaient marqués au O4 (Figure 2). O1 (GalC)-étiquetage, un marqueur des cellules plus matures dans la lignée de l’oligodendrocyte, était beaucoup moins fréquent (7,4 % ± 6,0 %, Figure 2D). Ce profil de marqueur indique que la majorité des cellules à ce stade est des oligodendrocytes pre avec petits pourcentages immatures ou matures oligos et éventuellement quelques cellules progénitrices oligodendrocytes (OPCs). Astrocytes, comme en témoigne la GFAP coloration, comprenant la 0.57 ± 1,0 % (Figure 2). Ces résultats suggèrent que les oligodendrocytes isolées avec la technique modifiée sont hautement purifiés et la majorité montrent le modèle d’expression d’un marqueur typique d’oligodendrocytes immatures.

Figure 3
Figure 3 : Expression des marqueurs OLs matures 3DIV. OLs (A) phase microscope à contraste de voir la morphologie plus complexe. À 3DIV, expression du NG2 (B) diminue considérablement, tandis que O4 (C) et O1 augmentation (D). Les astrocytes peu sont visibles à 3DIVC, rouge, échelle graphique = 50 µm. données ont été recueillies auprès de 3 expériences indépendantes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

À 3DIV, morphologie de l’oligodendrocyte apparaît plus complexe que les cellules à 1DIV (Figure 3 a). À ce moment, la fréquence des cellules positives pour le marqueur précoce de l’oligodendrocyte NG2 était beaucoup plus faible par rapport à 1DIV. cellules marqués au NG2 composé 31,2 ± 17,1 % (contre 66,1 ± 8,4 % à 1DIV, t-test p < 0,0001, Figure 3 b, Figure 4 a). Bien que ne pas analysé ici, l’intensité moyenne de coloration dans les cellules jugés positifs pour NG2 était réduite à 3DIV comparée à 1DIV. La plupart des cellules (81,9 % ± 4.884 %, Figure 3) a montré O4-étiquetage, qui était supérieur à 1DIV (58 % ± 9,4 %, t-test p < 0,0001, Figure 4 b). Par ailleurs, près de la moitié des cellules (47,2 % ± 16,4 %, Figure 3D) montrent une coloration pour O1 (GalC), un marqueur de la lignée d’oligodendrocyte plus mature, ce qui suggère que les cellules sont différencier à un phénotype plus mature. L’augmentation de O1+ cellules à 3DIV était également significative par rapport à 1DIV (7,4 % ± 6,0 %, t-test p < 0,0001, Figure 4). La présence d’astrocytes à ce temps point est resté extrêmement faible (0,8 % ± 1,5 %, Figure 3) et il n’était pas significativement différent par rapport à 1DIV (0,57 % ± 1,0 %, non significative (ns), Figure 4). Ces résultats indiquent que, au fil du temps, oligodendrocytes immunomagnetically isolé sont capables de se différencier in vitro en troisième phase de maturation avec très peu de contamination des autres types de cellules comme les astrocytes.

Figure 4
Figure 4 : Quantification de l’expression des marqueurs OL 1DIV et 3DIV (A-D). À 1DIV, 66 % des cellules étaient NG2+, 58 % des cellules étaient O4+, 7 % des cellules étaient O1+ et 0,5 % des cellules étaient GFAP+. À 3DIV, 31 % des cellules étaient NG2+, 81 % des cellules étaient O4+, 47 % des cellules étaient O1+ et 0,7 % des cellules étaient GFAP+. Valeurs moyennes ± SD sont présentés ici, *** indique p < 0,0001, ns = non significatif. Données ont été recueillies auprès de 3 expériences indépendantes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Dans cette communication, nous présentons une méthode pour l’isolation efficace des cultures d’oligodendrocytes immatures hautement purifié de la souris. Par rapport aux protocoles précédemment publiés39,40, cette méthode a donné un degré de pureté supérieur à un niveau bien inférieur des astrocytes GFAP-positive et un très faible pourcentage des autres cellules non caractérisée. Il est important de souligner que ce sont immatures OLs déjà investis dans la lignée d’oligodendrocyte. Ainsi, ces cellules ne serait pas utiles pour l’étude des phases précoces de la différenciation.

Une des modifications du protocole Dincman40 a été la suppression du facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF) de nos médias de prolifération. Il a été rapporté que in vitro, bFGF agissant comme un facteur mitogène empêche non seulement les OPCs de différenciation, mais diminue également le nombre de processus46,47. En outre, bFGF augmente la dédifférenciation des oligodendrocytes et prolifération dans les subcultures de cellules de la lignée oligodendrogliale 48. Par conséquent, il est plausible que le nombre réduit de O4+ cellules et un nombre accru de A2B5+ et NG2+ cellules observées dans l' étude de Dincman40 peuvent être due à l’effet de la protéine dans la culture.

Malgré l’utilisation de liaison O4 comme méthode pour isoler les cellules, seulement 59 % des cellules sont O4+ à 1DIV. Ces résultats sont qualitativement semblables à ceux de Dincman et ses collaborateurs40 qui a constaté qu’utilisez une liaison O4 pour l’isolation, un peu moins de 50 % des cellules étaient O4+ à 1DIV. Il a été démontré que PDGF retarde le développement post-mitotique par transitoirement rétablissement O4+GalC– progéniteurs à A2B5+O4– pre-progenitor-comme des cellules qui se différencient par la suite même dans la présence continue de PDGF 49. par conséquent, il est probable qu’au cours du processus de prolifération dans le premier jour in vitro certains OLs immatures peuvent éprouver un renversement de O4+NG2+ à O4–NG2+, alors qu’en restant engagé à la lignée des oligodendrocytes. Cette hypothèse est étayée par conclusion40 qui, immédiatement après l’isolement environ 80 % des cellules étaient O4 de Dincman+.

À 3DIV, ce protocole a produit une pureté OL un peu plus élevée que celui décrit par d’autres39,40 , bien que nous n’avons pas fait une comparaison entre leurs méthodes. Par rapport au protocole de Dincman et al. 40, la diminution du nombre de cellules GFAP-positive dans nos cultures pourrait être due au manque de FGF dans les médias de la prolifération. Le protocole de Emery et Dugas39 s’appuie sur le passage séquentiel des cellules par l’intermédiaire de Pétri ; astrocytes peuvent joindre facilement à la culture des plats50 et pourraient être reportées après chaque passage séquentiel des cellules pendant le protocole immunopanning. La méthode présentée ne risque pas d’introduire des astrocytes contaminantes dans notre fraction de purification.

Notre méthode modifiée est plus rapide par rapport aux deux autres prendre environ 4 h pour effectuer. Nous y parviendrons en éliminant les étapes superflues et réactifs constituées par les autres protocoles. Par exemple, par rapport à la Dincman protocole40, qui prend 5 à 6 h, nous avons omis les deux l’utilisation d’un kit pour la dissociation de tissu neural et l’incubation de la suspension cellulaire OL avec rat anti-souris IgM billes pour éliminer les cellules mortes. Au lieu de cela, nous avons effectué la dissociation du cerveau de souris cortex avec la papaïne et cellules mortes ont été retirés en effectuant centrifugations à vitesse réduite (200 x g).

Une modification majeure de l’émeri protocole39, qui prend environ 9 h, a été l’élimination de la sélection d’immunopanning et la suppression de l’exigence pour un direct O2/co2 cordage servant à équilibrer préalablement le tampon de la papaïne en tissu digestion. Au lieu de cela, nous avons utilisé la sélection immunomagnétique et direct d’incubation du mélange de cortex de cerveau de souris et de la papaïne tampon dans un incubateur à CO2 .

Bien que non directement testé dans cette étude, les microbilles anti-O4 permet également d’isoler les OLs de rat, tissu de cerveau de souris transgéniques et humaine. Cela met en évidence la polyvalence de la technique à utiliser plusieurs sources de tissus pour l’isolement de MCO avec le potentiel au profit des laboratoires de recherche intéressés à travailler avec OLs provenant de sources autres que les souris.

En conclusion, la méthode d’isolement mis à jour le CPVP décrite dans la présente étude propose une alternative rapide et spécifique pour obtenir des oligodendrocytes principal de la souris qui pourraient être appliquées dans les études de la myélinisation et maladie démyélinisante.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucune divulgation.

Acknowledgments

Cette étude a été financée par des subventions de la National Multiple Sclerosis Society (RG4591A1/2) et le National Institutes of Health (R03NS06740402). Les auteurs remercient Dr Ivan Hernandez et les membres de son laboratoire pour fournir des conseils, des équipements et des laboratoires.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10ml serological pipets Fisher Scientific 13-676-10J
10ml syringe Luer-Loc tip BD, Becton Dickinson 309604
15ml conical tubes Falcon 352097
24-well tissue culture plates Falcon 353935
40µm cell strainer Fisher Scientific 22368547
50ml conical tubes Falcon 352098
5ml serological pipets Fisher Scientific 13-676-10H
60mm tissue culture plates Falcon 353002
70µm cell strainer Fisher Scientific 22363548
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A11001
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgM (H+L) secondary antibody Invitrogen A21042
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgM (H+L) secondary antibody Invitrogen A11008
Alexa Fluor 594 goat anti-chicken IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A11042
Anti-O4 beads- Anti-O4MicroBeads Miltenyi Biotec 130-094-543
Apo-Transferrin human Sigma T1147
Autofil complete bottle top filter assembly, 0.22um filter, 250ml USA Scientific 6032-1101
Autofil complete bottle top filter assembly, 0.22um filter, 250ml USA Scientific 6032-1102
B27 Supplement Invitrogen 17504-044
Boric acid Sigma B7660
Bovine Growth Serum (BGS) GE Healthcare Life Sciences SH30541.03
BSA Fisher Scientific BP-1600-100
CNTF Peprotech 450-50
d-Biotin Sigma B4639
Desoxyribonuclease I (DNAse I) Worthington LS002007
EDTA Fisher Scientific S311
Epifluorescence microscope with an Olympus DP70 camera Olympus Bx51
Feather disposable scalpels Andwin Scientific EF7281C
Forskolin Sigma F6886
German glass coverslips, #1 thickness, 12mm diameter round NeuVitro GG-12-oz
GFAP antibody Aves GFAP
Glucose Fisher Scientific D16-1
GlutaMAX Invitrogen 35050-61
Insulin Invitrogen 12585-014
Magnetic separator stand - MACS multistand Miltenyi Biotec 130-042-303
Magnetic separator-MiniMACS separator Miltenyi Biotec 130-042-302
Millex PES 0.22µm filter unit Millipore SLG033RS
Mounting media- Prolong Gold with DAPI Thermo Fisher P36930
N-acetyl-cysteine (NAC) Sigma A8199
Natural mouse laminin Invitrogen 23017-015
Neurobasal Medium A Invitrogen 10888-022
Neurotrophin-3 (NT-3) Peprotech 450-03
NG2 antibody Millipore AB5320
Papain Worthington LS003126
PBS without Ca2+ and Mg2+ Sigma D5652
PDGF Peprotech 100-13A
Petri dishes Falcon 351029
Poly-D-Lysine Sigma P6407
Primocin Invivogen ant-pm-2
Progesterone Sigma P8783
Putrescine Sigma P5780
Selection column-LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401
Sodium Selenite Sigma S5261
Trace elements B Corning 25-000-CI
Triiodothyronine (T3) Sigma T6397
Triton-X Sigma T8787
Trypan Blue Solution Corning 25-900-CI
Tween 20 Sigma P1379
B27NBMA 487.75 mL Neurobasal Medium A; 10 mL B27 Supplement; 1 mL Primocin; 1.25 mL Glutamax; Filter sterilize and store at 4 °C until use.
B27NBMA + 10% BGS 27 mL B27NBMA; 3 mL Bovine growth serum
CNTF solution stock (10 µg/ml; 1000X) Order from Peprotech (450-50). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to Manufacturer’s instruction (may vary from lot to lot) in buffer (e.g. DPBS + 0.2% BSA). Store at -80 °C.
Working solution (10 µg/ml, 1000X)
1. Make on 0.2% BSA (Fisher scientific BP-1600-100) in DPBS solution and filter sterilize.
2. Dilute master stock aliquot to 10µg/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS.
3. Aliquot (20µl/tube) and snap freeze in liquid nitrogen.
4. Store aliquots at -80 °C.
d-Biotin stock solution (50 µg/ml; 5000X) Resuspend d-Biotin (Sigma-B4639) in double-distilled H2O at 50 µg/ml (e.g. 2.5 mg in 50 ml of ddH2O). Resuspension might take fair amount of agitation/vortexing, or mild warming briefly at 37°C. If the d-Biotin still will not solubilize, it is fine to make up a less concentrated (e.g. 10µg/ml), and to add a higher volume to the B27NBMA (1/1000), instead of 1/5000). Store at 4°C.
DNase I stock solution 1. Dissolve at 12,500 U Deoxyribonuclease I / ml in HBSS chilled on ice.
2. Filter sterilize on ice
3. Aliquot at 200 µl and freeze overnight at -20°C.
4. Store aliquots at -20 to -30°C.
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (w/o Ca2+ and Mg2+) Dissolve pouch in 1 Liter of water to yield 1 liter of medium at 9.6 grams of powder per liter of medium. Store at 2-8 °C.
Forskolin stock solution (4.2 mg/ml; 1000X) Add 1 ml of sterile DMSO to 50 mg Forskolin in bottle (Sigma-F6886) and pipette until resuspended. Transfer to a 15 ml centrifuge tube and add 11 ml of sterile DMSO to bring to 4.2 mg/ml. Aliquot (e.g. 20 µl) and store at -20°C.
Hank’s balanced salts (HBSS) (Sigma 1. Measure 900 ml of water (temperature 15-20 °C) in a cylinder and stir gently.
2. Add the power and stir until dissolved.
3. Rinse original package with a small amount of water to remove all traces of the powder.
4. Add to the solution in step 2.
5. Add 0.35 gr of sodium bicarbonate (7.5% w/v) for each liter of final volume.
6. Keep stirring until dissolved.
7. Adjust the pH of the buffer while stirring to 0.1-0.3 units below pH= 7.4 since it may rise during filtration. The use of 1N HCl or 1N NaOH is recommended to adjust the pH.
8. Add additional water to bring the final volume to 1L.
9. Sterilize by filtration using a membrane with a porosity of 0.22 microns.
10. Store at 2-8 °C.
Insulin stock solution (4000 µg/ml) Thaw the bottle and aliquot 25 µl per microcentrifuge tube and store at -20°C.
Laminin solution Slowly thaw laminin in the cold (2°C to 8°C) to avoid gel formation. Then, aliquot into polypropylene tubes. Store at 5° C to -20° C in aliquots (e.g. 20 µl) and do not freeze/thaw repeatedly. Laminin may be stored at these temperatures for up to six months.
Magnetic Cell Sorting (MCS) Buffer Prepare the solution containing phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.2, and 0.5% bovine serum albumin (BSA), 0.5 mM EDTA, 5µg/ml Insulin, 1 g/L Glucose. Sterilize and degas by filtration the buffer by passing it through a 0.22 µm Millex filter. Store the buffer at 4°C until use
N-Acetyl-L-cysteine (NAC) stock solution (5mg/ml; 1000X) Dissolve N-Acetyl-L-cysteine (Sigma-A8199) at 5 mg/ml in DMEM (e.g. 50 mg NAC in 10 ml B27NBMA). Filter sterilize and aliquot (e.g. 20 µl). Store at -20°C.
NT3 stock solution (1 µg/ml; 1000X) Master stock:
Order from Peprotech (450-03). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to manufacturer’s instructions (may vary from lot to lot), in buffer (e.g. DPBS + 0.2% BSA). Store at -80°C.

Working stock (1µg/ml; 1000X):
1. Make on 0.2% BSA in DPBS solution and filter sterilize.
2. Dilute master stock aliquot to 1 µg/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS.
3. Aliquot (e.g. 20µl/tube) and snap freeze in liquid nitrogen.
4. Store aliquots at -80°C.
PDGF stock solution (10 µg/ml; 1000X) Master stock:
Order from Peprotech (100-13A). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to manufacturer’s instructions (may vary from lot to lot) in buffer (e.g. DPBS) + 0.2% BSA). Store at -80°C.

Working stock (1µg/ml; 1000X):
1. Make on 0.2% BSA in DPBS solution and filter sterilize.
2. Dilute master stock aliquot to 1µg/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS.
3. Aliquot (e.g. 20µl/tube) and snap freeze in liquid nitrogen.
4. Store aliquots at -80°C.
Poly-D-lysine (1mg/ml; 100X) Resuspend poly-D-lysine, molecular weight 70-150 kD (Sigma P6407) at 0.5mg/ml in 0.15M boric acid pH 8.4 (e.g. 50mg in 50ml borate buffer). Filter sterilize and aliquot (e.g. 100µl/tube). Store at -20°C. Prior to use, dilute the 100X stock (1mg/ml) to 50 µg/ml in sterile water.
Oligodendrocyte proliferation media see Supplementary Table 1
Oligodendrocyte differentiation media see Supplementary Table 1
Sato supplement (100X) see Supplementary Table 1
References: the list of reagents and recipes were adopted from the protocols previously described by Emery et. al. 2013 (Emery, B. & Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868, doi:10.1101/pdb.prot073973, (2013)) and Dincman et. al. (Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S. & Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J Neurosci Methods. 209 (1), 219-226, doi:10.1016/j.jneumeth.2012.06.017, (2012))

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Isolation de Immunomagnetic rapide et spécifique de souris primaire Oligodendrocytes
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Flores-Obando, R. E., Freidin, M. M., Abrams, C. K. Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes. J. Vis. Exp. (135), e57543, doi:10.3791/57543 (2018).

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