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Neuroscience

Rapido e specifico immunomagnetica isolamento degli oligodendrociti primario del Mouse

Published: May 21, 2018 doi: 10.3791/57543
Automatic Translation
1, 2, 2
1Program in Molecular and Cellular Biology, State University of New York Downstate Medical Center, 2Department of Neurology and Rehabilitation, University of Illinois at Chicago

Summary

Descriviamo l'isolamento immunomagnetica degli oligodendrociti primario del mouse, che permette l'isolamento rapido e specifico delle cellule per coltura in vitro .

Abstract

L'efficiente e robusto isolamento e coltura dei oligodendrocytes primario (OLs) è uno strumento prezioso per lo Studio in vitro di sviluppo di oligodendroglia, nonché la biologia di demyelinating malattie come la sclerosi multipla e Malattia di Pelizaeus-Merzbacher-simile (PMLD). Qui, presentiamo un semplice e metodo di selezione efficace per l'isolamento di immunomagnetica di fase tre O4+ cellule preoligodendrocytes da cuccioli di topi neonatali. Poiché immaturo OL costituiscono più dell'80% della materia bianca roditore-cervello postnatale giorno 7 (P7) questo metodo di isolamento non solo assicura un alto rendimento cellulare, ma anche l'isolamento specifico di OLs già commesso alla stirpe oligodendroglial, diminuendo il possibilità di isolare cellule contaminanti quali gli astrociti e altre cellule del cervello del mouse. Questo metodo è una modifica delle tecniche segnalato precedentemente e fornisce del oligodendrocyte preparazione purezza superiore al 80% in circa 4 h.

Introduction

Oligodendrociti (OLs) sono le cellule di mielinizzazione del sistema nervoso centrale (SNC)1. L'isolamento e la coltura degli oligodendrociti primari in un ambiente strettamente regolamentato è uno strumento prezioso per lo Studio in vitro di sviluppo di oligodendroglia, nonché la biologia di demyelinating malattie come la sclerosi multipla2 . Ciò richiede un'efficiente e robusto del oligodendrocyte isolamento e coltura metodo3. In questo studio, abbiamo approfittato dell'espressione di un indicatore della superficie delle cellule del oligodendrocyte distintivo per implementare una tecnica di isolamento modificate che è rapido e specifico.

Sono state identificate quattro distinte fasi di maturazione del oligodendrocyte, ognuna caratterizzata dall'espressione di marcatori di superficie cellulare distintivo per ogni stadio di sviluppo (Figura 1). Questi indicatori di superficie delle cellule possono essere riconosciuti da anticorpi specifici4,5e possono essere utilizzati per isolare OLs alle fasi specifiche. Nella prima fase, le cellule del precursore del oligodendrocyte (OPCs) hanno la capacità di proliferare, migrare e rapidi in particolare fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF-Rα) recettore6, ganglioside A2B5, proteoglicano NG27,8 , neuro-acido polisialico delle cellule adesione molecola9 e grassi-acido-legante proteina 7 (FABP7)10. Gli OPC hanno morfologia bipolare con alcuni processi brevi che emana dai poli opposti del corpo cellulare, che è caratteristico di cellule precursori neurali11.

Figure 1
Figura 1: espressione di marcatori di superficie delle cellule durante lo sviluppo del oligodendrocyte mouse. OLs cella marcatori di superficie come A2B5, GalC (O1), NG2, O4 e PDGF-Rα può essere utilizzato per isolare specificamente oligodendrociti in fase inerente allo sviluppo specifica utilizzando anticorpi specifici.   Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Nella seconda fase, OPCs danno luogo a preoligodendrocytes e rapidi alla membrana delle cellule non solo gli indicatori OPC, ma anche il sulfatide (un galattolipide solfonata) riconosciuto dal O4 anticorpo12,13e la proteina GPR1714, che persiste fino alla fase di oligodendrociti immaturi (OL). In questa fase, preoligodendrocytes estendere multipolari processi brevi. Preoligodendrocytes sono la grande fase OL al giorno postnatale 2 (P2) nella materia bianca cerebrale di ratto e topo con una popolazione secondaria di immaturi OLs15.

Durante la terza tappa, immaturi OLs continuano a esprimere O4, perdere espressione degli indicatori A2B5 e NG2 e cominciano ad esprimere Galattocerebrosidi C16. In questa fase, OLs sono impegnati alla stirpe oligodendroglial e diventare cellule post-mitotiche con rami lunghi ramificate17,18. Immaturo OL costituiscono più dell'80% della materia bianca del roditore in P7 e in questo momento si osservano le prime cellule MBP+ 15,19,20,21. Di conseguenza, isolamento di OLs presso P7 potrebbe garantire alto rendimento cellulare.

Nella fase finale e la quarta di sviluppo OL, OLs matura esprimono proteine myelinating (proteina basica della mielina (MBP), proteolipide (PLP), glicoproteina mielina associata (MAG) e myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG)22,23 ,24,25,26. In questa fase, OLs matura estendere membrane quello compatto di forma economale guaine intorno gli assoni e sono in grado di mielinare. Questo coincide con l'osservazione che nel cervello di ratto e topo, cellule MBP+ diventano sempre più abbondanti a P1419,20,21.

Poiché il primo isolamento del oligodendrocyte Fewster e colleghi nel 196727, sono stati implementati diversi metodi per l'isolamento di OLs da roditore SNC compreso immunopanning28,29,30, fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS) sfruttando delle cellule degli antigeni di superficie-specific28,31, differenziale mediante centrifugazione in gradiente32,33,34,35 e agitazione metodo basato sull'adesione differenziale di diverse CNS glia36,37. Tuttavia, i metodi di coltura esistenti hanno limitazioni, soprattutto in termini di purezza, rendimento e tempo necessario per eseguire la procedure38. Pertanto, i metodi più efficienti di isolamento per gli oligodendrociti sono necessari.

In questa carta, presentiamo un semplice e metodo di selezione efficace per l'isolamento di immunomagnetica di fase tre O4+ cellule preoligodendrocytes da cuccioli di topi neonatali. Questo metodo è una modificazione delle tecniche riportate da Emery et al. 39 e Dincman et al. 40 e fornisce una purezza di preparazione del oligodendrocyte superiore all'80% in circa 4 h.

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Protocol

I topi utilizzati in questo studio sono stati curati per secondo le indicazioni del numero di protocollo di SUNY Downstate Medical Center divisione del laboratorio animale risorse (DLAR) 15-10492.

Nota: Oligodendrocytes primario sono stati isolati da neonatale (P5-P7 selvaggio-tipo C57Bl/6N) topi. In questa fase, immaturi OLs costituiscono più dell'80% della materia bianca del roditore garantire alto rendimento cellulare. Tutti i buffer e composizioni di reagente sono disponibili alla fine della Tabella materiali.

1. preparazione vetrini coprioggetti

Nota: Poli-D-lisina (PDL) / vetrini coprioggetti laminin rivestito devono essere preparati prima dell'isolamento di OL.

  1. Posto n. 1 tedesco vetrini coprioggetto in vetro in una provetta conica da 50 mL e aggiungere 35 mL di 70% EtOH per pulirli.
  2. Tappare la provetta, metterlo in un mixer nutante e incubare a temperatura ambiente per almeno 30 min mentre delicatamente a dondolo. Le lamelle possono essere incubate durante la notte.
  3. Scartare il 70% EtOH.
  4. Lavare i vetrini coprioggetti 3 volte con acqua deionizzata, rimuovere l'acqua ogni volta con aspirazione a vuoto.
  5. Aggiungere 30-35 mL di PDL 50 µ g/mL a lamelle nel tubo da 50 mL, abbastanza per coprire i coprioggetti.
  6. Posizionare il tubo da 50 mL contenente lamelle su un mixer nutante e incubare a temperatura ambiente per almeno 30 min mentre a dondolo delicatamente.
  7. Lavare i vetrini coprioggetti 3 volte con acqua deionizzata, rimuovendo l'acqua ogni volta con aspirazione a vuoto.
  8. Trasferire i coprioggetti in 60 mm di Petri contenente acqua deionizzata.
  9. Utilizzare una punta di pipetta P200 per disporre i vetrini coprioggetti come uno strato che copre l'intera superficie del piatto Petri.
  10. Con attenzione, rimuovere l'acqua dai piatti con aspirazione a vuoto.
  11. Rimuovere l'eccesso di acqua intorno a lamelle e lasciarli asciugare durante la notte con il coperchio aperto e sotto UV luce nella cappa.
    Nota: PDL rivestito vetrini coprioggetti memorizzabili a 4 ° C in Petri sterili fino a tre mesi.
  12. Inserire i vetrini coprioggetti in piastre da 24 pozzetti, uno per bene, utilizzando una pinzetta.
  13. Spostare i coprioggetti al centro il Bene assicurandosi che i bordi non tocchino la parete del pozzo.
  14. Aggiungere 100 µ l di 10 µ g/mL laminin, diluito in B27NBMA (Vedi la Tabella materiali) iniziando al centro di ogni vetrino coprioggetto e lo spostamento in modo circolare verso i bordi per coprire tutta l'area.
    Nota: Poiché la laminina è coinvolto nella manutenzione di OL e promuove la differenziazione in OLs matura, è un importante fattore di sopravvivenza della OL per in vitro cultura41,42,43,44.
  15. Incubare la piastra in un incubatore a 37 ° C 5% CO2 per almeno 1 h o fino a quando la OLs sono pronti per la placcatura.

2. Mouse Brain Cortex dissociazione

  1. Sacrificare postnatali cuccioli di topo C57Bl/6N vecchi di 5-7 giorni per decapitazione veloce con forbici precedentemente pulite in etanolo al 70%.
    Nota: cortecce cerebrali da 5-6 cuccioli di topi neonatali sono stati utilizzati per ogni preparazione. In media, un cervello di topo produce 1-1.5 x 106 OLs.
  2. Tagliare la pelle del cuoio capelluto lungo la linea mediana con piccole forbici per dissezione e ritrarre per esporre il cranio.
  3. Tagliare il cranio con cura lungo la linea mediana a partire dall'apertura nella parte posteriore del cranio verso l'area frontale, sollevando con le forbici per evitare di danneggiare il cervello. Quindi, utilizzando l'apertura nella parte posteriore del cranio tagliare verso ogni zoccolo dell'occhio lungo la base del cranio.
  4. Utilizzare una pinzetta per delicatamente prendere in giro le cortecce dal mesencefalo e trasferirli su un piatto di coltura del tessuto 60 mm contenente 7 mL di B27NBMA. Ripetere i passaggi da 2.2 attraverso 2.4 per ogni cervello, pool le cortecce dissecate.
  5. Le cortecce di trasferimento a un nuovo piatto di coltura del tessuto 60 mm contenente 5 mL di tampone di dissociazione (B27NBMA, 20-30 U/mL papaina e 2.500 U dnasi io).
  6. Tagliare a dadini le cortecce in pezzetti di circa 1 mm3 utilizzando una lama per bisturi #15 e incubare per 20 minuti in un 37 ° C, 5% CO2 incubator.
  7. Aggiungere 1 mL di siero della crescita bovina (BGS) per fermare la reazione enzimatica.
  8. Trasferire le cortecce insieme con il supporto di dissociazione di un tubo conico di 15 mL utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL.
  9. Delicatamente comincia a dissociare il tessuto cerebrale pipettando lentamente su e giù 6 - 8 volte utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL, facendo attenzione a ridurre al minimo le bolle.
  10. Consentire i pezzi di tessuto di stabilirsi per 2-3 min e trasferire il surnatante in una nuova provetta.
  11. Aggiungere 3 mL di B27NBMA contenente 10% BGS/2500 U dnasi I per il tessuto a pellet.
  12. Utilizzare una pipetta sierologica di 5ml per dissociare delicatamente il tessuto cerebrale durante il pipettaggio su e giù 6 - 8 volte. Fare attenzione a ridurre al minimo le bolle.
  13. Consentire i pezzi di tessuto a stabilirsi per 2-3 min.
  14. Trasferire il surnatante in una nuova provetta. Aggiungere 3 mL di B27NBMA contenente 10% BGS/dnasi I per il tessuto a pellet.
  15. Delicatamente dissociare il tessuto cerebrale utilizzando una punta di pipetta P1000, mentre pipettaggio il mix dei media e del tessuto del cervello su e giù. Ripetere passaggi 2.13 e 2.14 fino a quando non rimangono grossi pezzi di tessuto o fino a quando B27NBMA contenente 10% BGS/dnasi I è esausto, si verifichi per primo. Fare attenzione a ridurre al minimo le bolle.
  16. Sospensione di cellule di piscina con surnatanti precedenti.
  17. Colino di cella posto 70 µm in un tubo da 50 mL. Utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL, passare la sospensione cellulare in pool delicatamente sopra il filtro di cella di 70 µm.
  18. Lavare il filtro cella aggiungendo 1 mL di B27NBMA contenente 10% BGS/dnasi I.
  19. Gettare il filtro cella. Portare il volume a 30 mL con B27NBMA contenente 10% BGS/dnasi I.
  20. Trasferire la sospensione cellulare a due provette coniche da 15 mL. Centrifugare la sospensione cellulare per 10 min a 200 x g.
  21. Rimuovere il surnatante senza lasciare le cellule esposte all'aria. Il surnatante sarà nuvoloso a causa di detriti cellulari. Aggiungere 3 mL di B27NBMA contenente 10% BGS al pellet.
  22. Attentamente e dissociare il pellet cellulare utilizzando una pipetta da P1000. Portare il volume a 15 mL con B27NBMA contenente 10% BGS.
  23. Passare la sospensione cellulare sopra un fresco filtro di cella 40 µm.
  24. Lavare il filtro cella aggiungendo 1mL di B27NBMA contenente 10% BGS. Gettare il filtro cella.
  25. Portare il volume a 30 mL con B27NBMA contenente 10% BGS.
  26. Trasferire la sospensione cellulare per provette coniche da 2 x 15 mL. Centrifugare la sospensione cellulare per 10 min a 200 x g.
  27. Rimuovere la maggior parte del surnatante senza lasciare le cellule esposte all'aria. Risospendere il pellet cellulare in 5 mL di ghiaccio freddo magnetico cella ordinamento buffer (MCS).

3. determinazione del conteggio delle cellule e vitalità

  1. Diluire 100 µ l di sospensione cellulare con 400 µ l di soluzione di blu di Trypan in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL per ottenere una diluizione di 1:5 in 0,4% (p/v).
  2. Centrare una copertura vetrata sopra un emocitometro camera e riempire le due camere con 10 µ l della diluizione delle cellule usando una pipetta P10 ed evitando di troppo-pieno. La soluzione passerà sotto il vetro di copertura per azione capillare.
  3. Posizionare l'emocitometro sul tavolino del microscopio e regolare la messa a fuoco utilizzando ingrandimento 40x.
    Nota: I conteggi delle cellule vengono registrati utilizzando un contatore portatile in ognuna delle cinque piazze (quattro angoli e un centro). Solo le cellule non vitali assorbono il colorante e appaiono blue, mentre dal vivo e le cellule sane appaiono rotondi e rifrangente e non assorbono la tintura di colore blu, permettendo per la determinazione del numero di cellule vitali e totale per millilitro.

4. isolamento di O4+ oligodendrociti

  1. Centrifugare la sospensione cellulare a 200 x g per 10 min.
  2. Attentamente e scartare il surnatante tramite aspirazione a vuoto, evitando l'esposizione delle cellule all'aria.
  3. Risospendere il pellet in 90 µ l di tampone MCS per 1 x 107 cellule totale seguita dall'aggiunta di 10 µ l di anti-O4 perline per 1 x 107 cellule.
  4. Mescolare la sospensione cellulare e le perle scorrendo delicatamente la provetta conica 15 mL con il dito 4 - 5 volte.
  5. Incubare il mix per 15 min a 4 ° C, sfogliando la provetta conica 15 mL con il dito 4-5 timesevery 5 min.
  6. Lavare il mix delicatamente aggiungere 2 mL di tampone MCS per 1 x 107 cellule al tubo. Centrifugare il mix a 200 x g per 10 min.
  7. Scartare il surnatante mediante accuratamente aspirazione a vuoto, evitando l'esposizione delle cellule all'aria. Risospendere il pellet cellulare in 500 µ l di tampone MCS per ogni 1 x 107 cellule.
  8. Posizionare un separatore magnetico su un separatore magnetico. Associare una colonna di selezione per il separatore magnetico e posizionare un colino di cella di 40 µm in cima alla colonna. Posizionare due 15 mL o una provetta conica da 50 mL sotto la colonna di separazione per raccogliere il flusso attraverso.
  9. Pre-risciacquo la colonna filtro e separazione della cella da 40 µm con 3 mL di tampone MCS e lasciare che il buffer attraversano la colonna senza lasciarlo asciugare.
  10. Aggiungere il mix di sospensione cellulare e perline al filtro delle cellule e nella colonna di selezione.
  11. Lavare il filtro di cella 40 µm con 1 mL di tampone MCS.
  12. Eliminare il filtro cella e lasciare che il mix di cellule, perline e buffer attraversano la colonna senza lasciarlo asciugare.
  13. Lavare la colonna di separazione 3 volte con 3 mL di tampone MCS e 1 volta con media di proliferazione di OL.
  14. Rimuovere la colonna di separazione dal separatore magnetico, in modo di metterlo in una provetta conica da 15 mL e immediatamente aggiungere 5 mL di terreno di proliferazione di OL.
  15. Posizionare uno stantuffo in cima alla colonna e saldamente push per scovare le cellule con etichettate nella provetta conica 15 mL.
  16. Rimuovere 100 µ l di sospensione cellulare per determinare il conteggio delle cellule e attuabilità utilizzando Trypan Blue ed emocitometro come indicato nella sezione 3.
    Nota: La vitalità cellulare oltre l'80% è considerata accettabile per procedere con la cultura di OLs, ma redditività superiore al 90% è ottimale.

5. placcatura di isolato O4+ oligodendrociti

  1. Diluire la sospensione di eritrociti al desiderio placcatura densità (5 x 105 cellule per vetrino coprioggetti) utilizzando OL proliferazione media.
    Nota: OL densità di semina è molto importante, quindi la densità di cella appropriata devono essere confermate usando un microscopio di coltura del tessuto prima di procedere. Semina di densità inferiore a 10.000 cellule/vetrini coprioggetti può portare a scarsa sopravvivenza. Placcatura di densità a 10.000 a 25.000, OL differenziazione morfologica è lento45. Abbiamo piastra OLs ad una densità di semina di almeno 50.000 cellule/coprivetrini per garantire la sopravvivenza delle cellule.
  2. Spostare le piastre 24 pozzetti contenenti lamelle rivestite con laminin da incubatore per la cappa di coltura del tessuto.
  3. Rimuovere laminin da ciascun vetrino coprioggetto e sostituirlo con 100 µ l della sospensione OL.
  4. Incubare OLs nell'incubatore 37 °C/5% CO2 per un massimo di 45 min per promuovere l'adesione OL a lamelle.
  5. Dopo l'incubazione, rimuovere le piastre a 24 pozzetti dall'incubatrice. Inondare ogni bene della piastra 24 pozzetti con 500 µ l di media di proliferazione di OL.
  6. Rimettere la OLs nell'incubatore 37 °C/5% CO2 per altre 24 h.
  7. 24 h dopo il placcaggio di OLs, rimuovere i supporti di proliferazione e sostituire con media di differenziazione di OL per indurre la differenziazione.
  8. Rimettere la OLs nell'incubatrice e non rimuovere fino a quando le cellule sono pronte per il fissaggio.
    Nota: Variazioni di pH sono dannosi per OLs e diminuiscono la vitalità cellulare, pertanto dovrebbe essere evitati inutili rimozione di OLs culture dall'incubatrice.

6. immunofluorescenza

  1. Per la rilevazione della cellula marcatori di superficie (NG2, O1 e O4) rimuovere il supporto dai pozzi.
  2. Aggiungere 250 µ l di surnatanti di ibridoma mouse contenente anticorpi primari contro O1 (non diluito)13 e O4 (non diluito)13 e coniglio policlonale contro NG2 (1: 150 diluito in B27NBMA).
    Nota: Se gli anticorpi anti-O1 e anti-O4 commercialmente disponibili devono essere utilizzati, si consiglia di utilizzare diluizioni suggeriti dal produttore.
  3. Incubare le cellule con l'anticorpo primario per 45 min massimo in incubatore a 37 °C/5% CO2 .
  4. Lavare due volte con 0.05% Tween-20/1 X PBS. Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% (4% PFA) per 10 min a temperatura ambiente.
  5. Lavare tre volte per 5 minuti ciascuno con 0.05% Tween-20/1 X PBS.
  6. Diluire anti-topo di capra Alexa 488-coniugato IgM o anticorpo secondario (1: 400) di anti-coniglio IgG in B27NBMA.
  7. Rimuovere il 0.05% Tween-20/1 X PBS da lamelle. Incubare le cellule con anticorpo secondario per 1 h a temperatura ambiente al buio.
  8. Lavare tre volte per 5 minuti ciascuno con 0.05% Tween-20/1 X PBS.
  9. Per la doppia colorazione per l'individuazione di indicatori interni (GFAP), rimuovere il 0.05% Tween-20/1 X PBS e blocco/permeabilize cellule con un tampone di blocco/permeabilizzazione per 15 min a temperatura ambiente. In caso contrario, procedere al passaggio 6.17.
  10. Rimuovere il tampone di blocco/permeabilizzazione e aggiungere 250 µ l pollo anti-GFAP (1: 100) diluito in un tampone di blocco/permeabilizzazione.
  11. Incubare le cellule con anti-GFAP per 1 h a temperatura ambiente. Lavare tre volte per 5 minuti ciascuno con 0.05% Tween-20/1 X PBS.
  12. Diluire l'anticorpo secondario da Alexa 594-coniugati anti-pollo IgG (1: 400) in B27NBMA.
  13. Rimuovere il 0.05% Tween-20/1 X PBS da lamelle. Incubare le cellule con anticorpo secondario per 1 h a temperatura ambiente al buio.
  14. Lavare tre volte per 5 minuti ciascuno con 0.05% Tween-20/1 X PBS.
  15. Colorante di contrasto con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e montare le cellule con montaggio supporti contenenti DAPI antifade.
  16. Lasciate che i coprioggetti curare una notte al buio a temperatura ambiente.
  17. L'immagine di cellule marcate con un microscopio a epifluorescenza.
    Nota: Nel presente protocollo, le cellule erano imaged a 40 ingrandimenti utilizzando un tempo di esposizione uniforme.

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Representative Results

Lo scopo di questo studio era di stabilire un metodo di isolamento migliorato per O4+ oligodendrociti primario del mouse che richiedono la manipolazione meno possibile delle cellule bersaglio. L'intera procedura dall'eutanasia dei cuccioli di placcatura delle celle di vetrini coprioggetti prende circa 4 h e i dati qui indicati rappresentano tre esperimenti indipendenti. Dopo dissociazione del tessuto, una media di 4,3 ± 0,46 x 107 cellule sono state isolate per ogni esperimento indipendente, con una redditività del 91% ± 5,6%. Dopo immunomagnetiche isolamento utilizzando anti-O4 etichetta microperle magnetiche una media di 6,9 ± 0,38 x 106 OLs sono stati ottenuti (1-1.5 x 106 per topo) che è di 16,2% ± 1,6% delle cellule totali inizialmente dissociata; attuabilità era 96,3% ± 3,5%.

Figure 2
Figura 2: Immunomagnetically isolate OLs marcatori express immaturi alle 1DIV. (A) OLs sotto microscopio a contrasto di fase Vedi morfologia bi - e tri-polare. OLs express NG2 (B), O4 (C) e O1 (D). Pochissimi gli astrociti erano presenti alla 1DIV (C, rosso), scala bar = 50 µm. i dati sono stati raccolti da 3 esperimenti indipendenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per esaminare il fenotipo antigenico delle cellule immunomagnetically isolate, colorazione di immunofluorescenza era effettuato 24 h (1DIV) e 72 h (3DIV) dopo il placcaggio delle cellule. Alla 1DIV, la cella è sembrato essere bi - o tripolare sotto il microscopio di contrasto di fase (Figura 2A-B), una caratteristica di caratteristica della fase iniziale proliferazione OLs (OPCs e o preoligodendrocytes). 66,1 ± 8,4% di queste cellule erano NG2-etichetta (Figura 2B) e 58% ± 9,4% delle cellule erano O4-etichetta (Figura 2). O1 (GalC)-etichettatura, un marcatore delle cellule più mature nel lignaggio del oligodendrocyte, era molto meno comune (± 7,4% 6,0%, Figura 2D). Questo profilo di marcatore suggerisce che la maggioranza delle cellule a questo punto è pre-oligodendrociti con piccole percentuali acerbo o maturo oligos e possibilmente alcune cellule del progenitor del oligodendrocyte (OPCs). Astrociti, come evidenziato da GFAP macchiatura, composto del 0,57 ± 1,0% (Figura 2). Questi dati suggeriscono che i oligodendrocytes isolati con la tecnica modificata sono altamente purificati e la maggior parte Mostra pattern di espressione per un marcatore tipico di oligodendrociti immaturi.

Figure 3
Figura 3: espressione di marcatori di OLs maturi a 3DIV. (A) OLs sotto fase microscopio a contrasto di mostrare più complessa morfologia. Alle 3DIV, espressione di NG2 (B) diminuisce drasticamente, mentre O4 (C) e O1 (D) aumento. Pochi gli astrociti sono visibili presso 3DIV (C, rosso), scala bar = 50 µm. i dati sono stati raccolti da 3 esperimenti indipendenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Alla 3DIV, morfologia del oligodendrocyte apparve più complessa rispetto alle celle al 1DIV (Figura 3A). A questo punto del tempo, la frequenza delle cellule positive per l'indicatore in anticipo del oligodendrocyte NG2 era molto più basso rispetto alla 1DIV. NG2-etichettati cellule comprende 31,2 ± 17,1% (contro il 66,1 ± 8,4% a 1DIV, t-test p < 0,0001, Figura 3B, Figura 4A). Anche se non analizzati qui, l'intensità media di macchiatura in cellule siano risultati positivi per NG2 è stato ridotto a 3DIV rispetto alla 1DIV. La maggior parte delle cellule (81,9% ± 4.884%, Figura 3) hanno mostrato O4-etichettatura, che era superiore alle 1DIV (58% ± 9,4%, t-test p < 0.0001, Figura 4B). Inoltre, quasi la metà delle cellule (47,2% ± 16,4%, Figura 3D) ha mostrato la macchiatura per O1 (GalC), un marcatore del lignaggio del oligodendrocyte più maturo, suggerendo che le cellule sono differenziando ad un fenotipo più maturo. L'aumento di O1+ cellule a 3DIV è stato anche significativo rispetto alla 1DIV (± 7,4% 6,0%, t-test p < 0.0001, Figura 4). La presenza di astrociti in questo tempo punto è rimasto estremamente bassa (0,8% ± 1,5%, Figura 3) e non era significativamente differente rispetto al 1DIV (0,57% ± 1,0%, non significativa (ns), Figura 4). Questi risultati indicano che, nel tempo, sono in grado di differenziare in vitro in terza fase di maturazione con molto poco contaminazione di altri tipi cellulari come gli astrociti oligodendrociti immunomagnetically isolate.

Figure 4
Figura 4: quantificazione dell'espressione di marcatori OL 1DIV e 3DIV (A-D). Alle 1DIV, il 66% delle cellule erano NG2+, il 58% delle cellule erano O4+, 7% delle cellule erano O1+ e 0,5% delle cellule erano GFAP+. 3DIV, 31% delle cellule erano NG2+, l'81% delle cellule erano O4+, 47% delle cellule sono stati O1+ e 0,7% delle cellule erano GFAP+. Valori di media ± SD sono presentati qui, * * * indica p < 0,0001, ns = non significativo. I dati sono stati raccolti da 3 esperimenti indipendenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

In questa comunicazione, presentiamo un metodo per l'isolamento efficiente delle culture del oligodendrocyte altamente purificata del mouse immaturo. Rispetto ai protocolli precedentemente pubblicati39,40, questo metodo ha reso una purezza più elevata con un livello molto più basso degli astrociti GFAP-positive e una percentuale molto bassa di altre cellule non caratterizzato. È importante sottolineare che questi sono immaturi OLs già commit alla stirpe oligodendroglial. Così, queste cellule non sarebbe utile per lo studio delle prime fasi di differenziazione.

Una delle modifiche dal protocollo Dincman40 era la rimozione del fattore di crescita di base del fibroblasto (bFGF) dal nostro supporto di proliferazione. È stato segnalato che in vitro, bFGF che agisce come un forte fattore mitogenico non solo inibisce OPCs da differenziazione, ma diminuisce anche il numero di processi46,47. Inoltre, bFGF aumenta del oligodendrocyte dedifferentiation e proliferazione in cellule secondarie del lignaggio oligodendroglial 48. Di conseguenza, è plausibile che il ridotto numero di O4+ cellule e aumento del numero di A2B5+ e NG2+ cellule osservate in Dincman Studio40 possono essere dovuto l'effetto di bFGF nella cultura.

Nonostante l'uso O4 associazione come metodo per isolare le cellule, solo il 59% delle cellule sono O4+ a 1DIV. Questi risultati sono qualitativamente simili a quelli di Dincman e colleghe40 che ha trovato che utilizza l'associazione O4 per isolamento, poco meno del 50% delle cellule erano O4+ a 1DIV. È stato dimostrato che PDGF ritarda lo sviluppo post-mitotico da transitoriamente ripristino O4+GalC– progenitori a A2B5+O4– pre-progenitor-come le cellule che successivamente si differenziano anche nella continua presenza di PDGF 49. Pertanto, è probabile che durante il processo di proliferazione nel primo giorno in vitro alcuni OLs immaturo può verificarsi un'inversione da O4+NG2+ a O4–NG2+, mentre rimanendo impegnati il casato di oligodendrociti. Questa ipotesi è sostenuta dal ritrovamento di Dincman40 che subito dopo l'isolamento circa l'80% delle cellule erano O4+.

A 3DIV, questo protocollo produce una purezza OL piuttosto più alta di quello descritto da altri39,40 , anche se non abbiamo fatto un confronto testa a testa con i loro metodi. Rispetto al protocollo di Dincman et al. 40, il più basso numero di cellule GFAP-positive nelle nostre culture potrebbe essere a causa della mancanza di FGF sui media di proliferazione. Il protocollo Emery e Dugas39 si basa sul passaggio sequenza delle cellule tramite piastre di coltura; astrocytes possono collegare facilmente alla cultura piatti50 e potrebbero essere trasportati dopo ogni passaggio sequenza delle cellule durante il protocollo di immunopanning. Il metodo proposto non rischia di introdurre contaminanti astrociti nella nostra frazione di purificazione.

Il nostro metodo modificato è più veloce rispetto agli altri due prendendo circa 4 h per eseguire. Raggiungiamo questo eliminando passaggi inutili e reagenti incorporati per gli altri protocolli. Ad esempio, rispetto ai Dincman protocollo40, che prende 5-6 h, abbiamo omesso sia l'uso di un kit per la dissociazione di tessuto neurale e l'incubazione della sospensione delle cellule OL con perline di IgM anti-topo ratto per rimuovere le cellule morte. Invece, abbiamo effettuato la dissociazione del cervello del mouse cortecce di papaina e cellule morte sono stati rimossi eseguendo centrifugazioni di bassa velocità (200 x g).

Un'importante modifica dalla Emery protocollo39, che dura circa 9 ore, è stata la rimozione della selezione immunopanning e la rimozione del requisito di un diretto O2Co2 linea utilizzato per pre-equilibrare il Buffer di papaina durante del tessuto digestione. Invece, abbiamo usato selezione immunomagnetica e incubazione diretta del mix di cortecce di cervello di topo e papaina buffer nell'incubatore CO2 .

Anche se non direttamente testati in questo studio, le microsfere di anti-O4 utilizzabile anche per isolare OLs da rat, tessuto cerebrale umano e transgenici del mouse. Questo mette in evidenza la versatilità della tecnica da utilizzare fonti multiple di tessuto per isolamento di OLs con il potenziale a beneficio di laboratori di ricerca interessati a lavorare con OLs da fonti diverse dal mouse.

In conclusione, il metodo di isolamento OPC modificato descritto in questo studio fornisce un'alternativa rapida e specifica per ottenere oligodendrociti primario del mouse che potrebbero essere applicati negli studi di mielinizzazione e malattie demielinizzanti.

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Disclosures

Gli autori non hanno alcuna informazioni integrative.

Acknowledgments

Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Multiple Sclerosis Society (RG4591A1/2) e il National Institutes of Health (R03NS06740402). Gli autori ringraziano il Dr. Ivan Hernandez e membri del suo laboratorio per fornire consulenza, attrezzature e lo spazio laboratorio.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10ml serological pipets Fisher Scientific 13-676-10J
10ml syringe Luer-Loc tip BD, Becton Dickinson 309604
15ml conical tubes Falcon 352097
24-well tissue culture plates Falcon 353935
40µm cell strainer Fisher Scientific 22368547
50ml conical tubes Falcon 352098
5ml serological pipets Fisher Scientific 13-676-10H
60mm tissue culture plates Falcon 353002
70µm cell strainer Fisher Scientific 22363548
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A11001
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgM (H+L) secondary antibody Invitrogen A21042
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgM (H+L) secondary antibody Invitrogen A11008
Alexa Fluor 594 goat anti-chicken IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A11042
Anti-O4 beads- Anti-O4MicroBeads Miltenyi Biotec 130-094-543
Apo-Transferrin human Sigma T1147
Autofil complete bottle top filter assembly, 0.22um filter, 250ml USA Scientific 6032-1101
Autofil complete bottle top filter assembly, 0.22um filter, 250ml USA Scientific 6032-1102
B27 Supplement Invitrogen 17504-044
Boric acid Sigma B7660
Bovine Growth Serum (BGS) GE Healthcare Life Sciences SH30541.03
BSA Fisher Scientific BP-1600-100
CNTF Peprotech 450-50
d-Biotin Sigma B4639
Desoxyribonuclease I (DNAse I) Worthington LS002007
EDTA Fisher Scientific S311
Epifluorescence microscope with an Olympus DP70 camera Olympus Bx51
Feather disposable scalpels Andwin Scientific EF7281C
Forskolin Sigma F6886
German glass coverslips, #1 thickness, 12mm diameter round NeuVitro GG-12-oz
GFAP antibody Aves GFAP
Glucose Fisher Scientific D16-1
GlutaMAX Invitrogen 35050-61
Insulin Invitrogen 12585-014
Magnetic separator stand - MACS multistand Miltenyi Biotec 130-042-303
Magnetic separator-MiniMACS separator Miltenyi Biotec 130-042-302
Millex PES 0.22µm filter unit Millipore SLG033RS
Mounting media- Prolong Gold with DAPI Thermo Fisher P36930
N-acetyl-cysteine (NAC) Sigma A8199
Natural mouse laminin Invitrogen 23017-015
Neurobasal Medium A Invitrogen 10888-022
Neurotrophin-3 (NT-3) Peprotech 450-03
NG2 antibody Millipore AB5320
Papain Worthington LS003126
PBS without Ca2+ and Mg2+ Sigma D5652
PDGF Peprotech 100-13A
Petri dishes Falcon 351029
Poly-D-Lysine Sigma P6407
Primocin Invivogen ant-pm-2
Progesterone Sigma P8783
Putrescine Sigma P5780
Selection column-LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401
Sodium Selenite Sigma S5261
Trace elements B Corning 25-000-CI
Triiodothyronine (T3) Sigma T6397
Triton-X Sigma T8787
Trypan Blue Solution Corning 25-900-CI
Tween 20 Sigma P1379
B27NBMA 487.75 mL Neurobasal Medium A; 10 mL B27 Supplement; 1 mL Primocin; 1.25 mL Glutamax; Filter sterilize and store at 4 °C until use.
B27NBMA + 10% BGS 27 mL B27NBMA; 3 mL Bovine growth serum
CNTF solution stock (10 µg/ml; 1000X) Order from Peprotech (450-50). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to Manufacturer’s instruction (may vary from lot to lot) in buffer (e.g. DPBS + 0.2% BSA). Store at -80 °C.
Working solution (10 µg/ml, 1000X)
1. Make on 0.2% BSA (Fisher scientific BP-1600-100) in DPBS solution and filter sterilize.
2. Dilute master stock aliquot to 10µg/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS.
3. Aliquot (20µl/tube) and snap freeze in liquid nitrogen.
4. Store aliquots at -80 °C.
d-Biotin stock solution (50 µg/ml; 5000X) Resuspend d-Biotin (Sigma-B4639) in double-distilled H2O at 50 µg/ml (e.g. 2.5 mg in 50 ml of ddH2O). Resuspension might take fair amount of agitation/vortexing, or mild warming briefly at 37°C. If the d-Biotin still will not solubilize, it is fine to make up a less concentrated (e.g. 10µg/ml), and to add a higher volume to the B27NBMA (1/1000), instead of 1/5000). Store at 4°C.
DNase I stock solution 1. Dissolve at 12,500 U Deoxyribonuclease I / ml in HBSS chilled on ice.
2. Filter sterilize on ice
3. Aliquot at 200 µl and freeze overnight at -20°C.
4. Store aliquots at -20 to -30°C.
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (w/o Ca2+ and Mg2+) Dissolve pouch in 1 Liter of water to yield 1 liter of medium at 9.6 grams of powder per liter of medium. Store at 2-8 °C.
Forskolin stock solution (4.2 mg/ml; 1000X) Add 1 ml of sterile DMSO to 50 mg Forskolin in bottle (Sigma-F6886) and pipette until resuspended. Transfer to a 15 ml centrifuge tube and add 11 ml of sterile DMSO to bring to 4.2 mg/ml. Aliquot (e.g. 20 µl) and store at -20°C.
Hank’s balanced salts (HBSS) (Sigma 1. Measure 900 ml of water (temperature 15-20 °C) in a cylinder and stir gently.
2. Add the power and stir until dissolved.
3. Rinse original package with a small amount of water to remove all traces of the powder.
4. Add to the solution in step 2.
5. Add 0.35 gr of sodium bicarbonate (7.5% w/v) for each liter of final volume.
6. Keep stirring until dissolved.
7. Adjust the pH of the buffer while stirring to 0.1-0.3 units below pH= 7.4 since it may rise during filtration. The use of 1N HCl or 1N NaOH is recommended to adjust the pH.
8. Add additional water to bring the final volume to 1L.
9. Sterilize by filtration using a membrane with a porosity of 0.22 microns.
10. Store at 2-8 °C.
Insulin stock solution (4000 µg/ml) Thaw the bottle and aliquot 25 µl per microcentrifuge tube and store at -20°C.
Laminin solution Slowly thaw laminin in the cold (2°C to 8°C) to avoid gel formation. Then, aliquot into polypropylene tubes. Store at 5° C to -20° C in aliquots (e.g. 20 µl) and do not freeze/thaw repeatedly. Laminin may be stored at these temperatures for up to six months.
Magnetic Cell Sorting (MCS) Buffer Prepare the solution containing phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.2, and 0.5% bovine serum albumin (BSA), 0.5 mM EDTA, 5µg/ml Insulin, 1 g/L Glucose. Sterilize and degas by filtration the buffer by passing it through a 0.22 µm Millex filter. Store the buffer at 4°C until use
N-Acetyl-L-cysteine (NAC) stock solution (5mg/ml; 1000X) Dissolve N-Acetyl-L-cysteine (Sigma-A8199) at 5 mg/ml in DMEM (e.g. 50 mg NAC in 10 ml B27NBMA). Filter sterilize and aliquot (e.g. 20 µl). Store at -20°C.
NT3 stock solution (1 µg/ml; 1000X) Master stock:
Order from Peprotech (450-03). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to manufacturer’s instructions (may vary from lot to lot), in buffer (e.g. DPBS + 0.2% BSA). Store at -80°C.

Working stock (1µg/ml; 1000X):
1. Make on 0.2% BSA in DPBS solution and filter sterilize.
2. Dilute master stock aliquot to 1 µg/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS.
3. Aliquot (e.g. 20µl/tube) and snap freeze in liquid nitrogen.
4. Store aliquots at -80°C.
PDGF stock solution (10 µg/ml; 1000X) Master stock:
Order from Peprotech (100-13A). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to manufacturer’s instructions (may vary from lot to lot) in buffer (e.g. DPBS) + 0.2% BSA). Store at -80°C.

Working stock (1µg/ml; 1000X):
1. Make on 0.2% BSA in DPBS solution and filter sterilize.
2. Dilute master stock aliquot to 1µg/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS.
3. Aliquot (e.g. 20µl/tube) and snap freeze in liquid nitrogen.
4. Store aliquots at -80°C.
Poly-D-lysine (1mg/ml; 100X) Resuspend poly-D-lysine, molecular weight 70-150 kD (Sigma P6407) at 0.5mg/ml in 0.15M boric acid pH 8.4 (e.g. 50mg in 50ml borate buffer). Filter sterilize and aliquot (e.g. 100µl/tube). Store at -20°C. Prior to use, dilute the 100X stock (1mg/ml) to 50 µg/ml in sterile water.
Oligodendrocyte proliferation media see Supplementary Table 1
Oligodendrocyte differentiation media see Supplementary Table 1
Sato supplement (100X) see Supplementary Table 1
References: the list of reagents and recipes were adopted from the protocols previously described by Emery et. al. 2013 (Emery, B. & Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868, doi:10.1101/pdb.prot073973, (2013)) and Dincman et. al. (Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S. & Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J Neurosci Methods. 209 (1), 219-226, doi:10.1016/j.jneumeth.2012.06.017, (2012))

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Flores-Obando, R. E., Freidin, M. M., Abrams, C. K. Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes. J. Vis. Exp. (135), e57543, doi:10.3791/57543 (2018).

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