Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Visualisering Motor Axon navigasjon og kvantifisering av Axon Arborization i Mouse embryoer bruker lys ark fluorescens mikroskopi

Published: May 11, 2018 doi: 10.3791/57546
Automatic Translation
*1,2, *2,3, 1,2
1Molecular and Cell Biology, Taiwan International Graduate Program, Academia Sinica and Graduate Institute of Life Sciences, National Defense Medical Center, 2Institute of Molecular Biology, Academia Sinica, 3Institute of Biotechnology, College of Bio-Resources and Agriculture, National Taiwan University
* These authors contributed equally

Summary

Her beskriver vi en protokoll for å visualisere motoriske nervecellen projeksjon og axon arborization i transgene Hb9::GFP mouse embryoer. Etter immunostaining for motor neurons brukte vi lys ark fluorescens mikroskopi til bildet embryo for påfølgende kvantitativ analyse. Denne protokollen gjelder andre Nevron navigasjon prosesser i sentralnervesystemet.

Abstract

Spinal motor neurons (MNs) utvide deres axons å kommunisere med sine innervating mål, og dermed kontroll bevegelse og komplekse oppgaver i virveldyr. Derfor er det avgjørende å avdekke molekylære mekanismer av hvordan motor axons Gå til arborize og innervate deres eksterne muskel mål under utvikling og degenerasjon. Selv om transgene Hb9::GFP musen linjer har lenge fungert å visualisere motoren axon baner under embryonale utviklingen, detaljerte beskrivelser av hele spekteret av axon terminal arborization fortsatt ufullstendig på grunn av mønsteret kompleksiteten og begrensninger av gjeldende optisk mikroskopi. Her beskriver vi en forbedret protokoll som kombinerer lys ark fluorescens mikroskopi (LSFM) og robust bildeanalyse kvalitativt og kvantitativt visualisere utvikle motorisk axons. Dette systemet kan lett vedtatt for å krysse genetisk mutanter eller MN sykdom modeller med Hb9::GFP linjer, avslørende romanen molekylære mekanismer som fører til motor axon navigasjon og arborization.

Introduction

Spinal MNs inngår i sentralnervesystemet men innervate eksterne muskler for å kontrollere bevegelsen. Utvikle ryggmargen, er MN progenitors (pMNs) opprettet etter signalene kommer fra notochord og tilstøtende somites. Alle differensiert etter mitotisk MNs genereres fra pMNs, til slutt gir opphav til en rekke MN subtyper langs rostrocaudal akse ryggmargen1,2. Spinal MNs er topografisk og anatomisk godt organisert. Deres morfologiske ordning samsvarer med plasseringen av deres respektive mål i periferien3. Ved å nå sine muskler mål, axons motta mobilnettet og eksogene nevrotropisk faktorer som overtale dem til å utvide og gren videre til musklene. Gir og forgrening defekter kan bidra til å danne nevromuskulær veikryss (NMJ). For eksempel glial-avledet nevrotropisk faktorer (GDNF)-indusert Pea3 er uunnværlig for axon arborization i kutan maximus (CM) og vannkalv dorsi (LD) muskler4,5. I tillegg viser DINE knockout mouse embryoer defekt arborization av phrenic nerver i mellomgulvet, forårsaker respirasjonssvikt og dødelighet umiddelbart etter fødselen6,7. Derfor er dette siste trinnet i MN modning (dvs., axonal projeksjon og forgrening) avgjørende for å sikre kommunikasjon mellom nerveceller og målcellene.

Du kan vise arborization mønstre, utfører forskere normalt AC confocal avbildning eller to-fotonet fluorescens * lys av appa-eller hele-mount8,9,10. Begge teknikkene mikroskopi generere akseptabel oppløsning og dyp gjennomtrenging. * To-fotonet fluorescens lys innebærer magnetisering av fluorophores ved samtidige absorpsjon av to nedre-energi fotoner11. Siden to-fotonet eksitasjon bruker nær infrarød stråling, bidrar redusert eksitasjon frekvensen til redusert spredning og bedre vev gjennomtrengning opptil 1 mm i vevet, dermed gir bildebehandling med større dybde. AC confocal mikroskopi fjerner ved filtre ut-av-fokus signaler og samler bare inn lys i fokalplanet12. Med denne tilnærmingen, kan bilder av prøver fra ulike fokal plan kombineres for å gir tredimensjonale (3D) bilder via en Z-stack-funksjonen. Likevel reduseres signalet intensitet som de fleste av lyset er blokkert og høy numeriske blenderåpninger obskure dybde-av-feltet. Enda viktigere, bidrar begge teknikkene til alvorlig photodamage og Phototoksisitet siden hele prøven mottar belysning selv når bare ett plan er avbildet på et gitt tidspunkt.

For å omgå disse svakhetene, har LSFM blitt en favoritt alternativ, med fordelene ved å være rask, lys-effektiv, og mindre fototoksisk13,14. I tillegg gir LSFM flere tenkelig. Denne tilnærmingen er spesielt egnet til visualisere motorisk axons og deres dispersing terminaler som de spre gjennom 3D plass. LSFM utkonkurrerer de andre to alternativene fordi prøver er montert på et stadium som tillater rotasjon rundt en akse og bevegelser langs x-, y- og z-aksene. Dette oppsettet ikke bare tillater for en minimal blokkerte visning av prøven, men også valg av en ønskelig belysning banen, en svakhet for to-fotonet og AC confocal mikroskopi, begge krever montering av eksempler på et flatt lysbilde. Derfor er LSFM det mest passende verktøyet for 3D-bildebehandling av axon arborization og for kvantifisering av motor nerve terminaler i mouse embryoer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle de levende dyr ble holdt i en bestemt patogen gratis (SPF) dyr anlegget, godkjent og overvåket av IACUC av Academia Sinica.

1. fiksering

  1. Samle embryo embryonale dag 12,5 (E12.5) og halshugge og eviscerate dem.
  2. Fikse embryoene individuelt i 24-vel plater med 1 mL/vel av nylagde 4% paraformaldehyde i 1 x fosfat buffer saltvann (PBS) over natten. Ruge på 4 ° C i en shaker.
  3. Vask de faste embryoene minst 3 x, hver for 5-10 min, med 1 mL 1 x PBS og ruge over natten ved 4 ° C i en shaker fjerne de gjenværende paraformaldehyde.

2. hele-mount Immunostaining

  1. Permeabilize hver embryoet i 1 mL av 0,5% PBS-Triton-X-100 (PBST) overnatting på 4 ° C i en shaker.
  2. Blokkere hvert utvalg med 1 mL av 10% FBS utarbeidet i 1 x PBS overnatting på 4 ° C i en shaker.
  3. Inkuber embryoet med 1 mL av anti-GFP primære antistoff (1:1, 000 fortynning i 10% FBS) ved 4 ° C i 72 h med konstant risting å intensivere GFP signalet av motor nerver.
  4. Den primære antistoff inkubasjon vaskes med 1 mL av 0,5% PBST i løpet av 1-2 dager på 4 ° C i en shaker, endre 0,5% PBST minst tre ganger.
  5. Bruke 1 mL av sekundær antistoff (1:1, 000 fortynning i 10% FBS) og ruge over natten i mørket på 4 ° C med konstant risting.
  6. Vask 3 x med 1 mL av 0,5% PBST på 4 ° C i en shaker i løpet av 2-3 dager. Hold prøver i 1 x PBS på 4 ° C til dagen før bildebehandling.
    Merk: Embryo kan være deles opp i mindre segmenter før clearing, avhengig av hvilken del av embryoene blir vist. Forelimbs beholdes i denne eksperimentelle (figur 1A).
  7. Inkuber embryoet i en kommersiell clearing reagens med en brytningsindeks av 1.49 nD i en 1,5 mL tube, beskyttet fra lys ved romtemperatur over natten, for å gjengi embryoet gjennomsiktig for bildebehandling.
    Merk: Mengden lysning reagensen er omtrent fem ganger prøven volumet.

3. LSFM (2-3 h)

  1. Eksempel oppsett
    1. Sette opp 5 X / 0,1 belysning optikk og 5 X / 0,16 oppdagelsen optikk. Samle prøven holderen og prøve kapillær (1,5 mm indre diameter, grønn) og plassere dem i mikroskopet.
      Merk: Se visningskroppen brukerhåndboken for detaljert oppsett prosedyrer.
    2. Monter embryoet som følger:
      1. Forberede P200 pipette spissen av skjære bort den øvre delen slik at den passer diameter av kapillær og fjerne den pekende delen (~ 3 mm) for eksempel vedlegget.
      2. Smelt avstumpet slutten pipette tips med liten flamme.
      3. Slukke flammene, og fest embryoet vertikalt på smeltet slutten.
      4. Passe den øvre delen av pipette spissen med prøven kapillær.
    3. Tillate kammer buffer til equilibrate med embryoet for 1 min å fjerne rusk eller bobler.
    4. Ved hjelp av tenkelig programvare, velg Finn kapillær fanen finne og justere x, y, z-aksene posisjon av prøven kapillær.
    5. Velg Finn eksempler og zoome til 0,6 X å fokusere på fosteret. Rotere embryoet for å sikre at den lange aksen fotografert lem justerer med lys banen til to lyskilder (figur 1B).
  2. Bildeopptak
    1. Kategorien oppkjøpet definere parameterne lys banen som gjenkjenning mål, laser blokkerer filter, strålen splitter, kameraer og lasere.
      Merk: GFP kanalen brukes i dette eksperimentet (eksitasjon bølgelengde: 488 nm; utslipp filter: BP 505 til 545 nm, strålen splitter: SPS LP 560).
    2. Merker du pivot skanning av for skygge reduksjon.
    3. Definere oppkjøpet innstillinger: bitdybde, 16 bit; zoome, 0,36-0,7 X; enkelt-side belysning (venstre/høyre) eller dobbeltsidig belysning.
    4. Velg Fortløpende og angi laser intensitet, eksponeringstid, laser makt og lys ark posisjon hente skarpere bilder.
      Merk: Laser makt holdes så lavt som mulig for å minimalisere photodamage.
    5. Trykk Stopp å avslutte bildeopptak.
  3. Flerdimensjonale oppkjøp
    1. Definere z-stakken ved å flytte Z for det første og siste bildet. Klikk Optimal du angir skive.
    2. Klikk Start eksperimentet å erverve valgte z-stakken.
    3. Når det er gjort, kan du lagre bildet i .czi format.
  4. Bildebehandling (valgfritt)
    1. Fortsett med dobbelt siden fusion under Behandling av Lightsheet kanalen hvis dobbeltsidig belysning. MultiView behandling er nødvendig hvis flere visninger er ervervet for å kombinere bilder fra flere vinkler.
    2. Opprette et 2D-bilde ved hjelp av data fra de høyeste intensitet pikslene langs projeksjon aksen under Maksimal intensitet projeksjon kanalen.
    3. Under Kopier kanal, klikker du del for å velge delsett av bilder fra det opprinnelige settet.

4. kvantifisering av Axon Arborization (30 Min for hver individuelle Nerve)

  1. Åpne bildefilen i tenkelig analyseprogramvare (standard bildet som inneholder XYZ dataene er åpnet i Overgå modus og som en gjengitt i 3D-visning).
  2. Justere bildefarge, lysstyrke og kontrast i vinduet Vise justering (Rediger | Vis Display justering) oppdage filamenter basert på lokale intensitet kontrast.
  3. Klikk på ikonet Legg til ny filamenter og velg Autopath (ingen loop) algoritmen i det miste-ned menyen.
  4. Velg området rundt (i dette tilfellet segmenting axon av interesse). Klikk neste når du er ferdig.
  5. Definerer Start frø poeng ved å tilordne største og tynneste diameter målingene, som kan måles med skive -modus.
  6. Tilordne et utgangspunkt i utkanten av regionen rundt. For å oppnå Manuell tillegging eller fjerning av utgangspunkt, først endre pekeren (Naviger | Velg) og deretter SKIFT + høyreklikk severdigheter.
  7. Velg Manuell terskler for frø poeng å sikre at alle synlige arborization er merket. Endre pekeren (Naviger | Velg) og deretter Skift + venstre severdigheter manuelt legge til eller fjerne frø poeng.
    Merk: Det er viktig å manuelt fjerne bakgrunnsstøy og signaler fra nærliggende nerver.
  8. Merk av for Fjern frø punkter rundt utgangspunkt.
  9. Sjekk Fjern frakoblet segmenter å tillate utelukkelse av poeng som er for langt unna, og som kan representere bakgrunnsstøy. Angi Maksimumslengde gapet i neste trinn for å definere den øvre grensen for eksklusjon.
  10. Justere terskelen for bakgrunnen subtraksjon, som bruker filtere Gaussian for å anslå bakgrunn intensiteten av hver voxel.
  11. Angi automatiske terskel for dendrite diameter ved hjelp av omtrentlig tverrsnitt område algoritmen.
  12. Hoppe over trinnene for beregning av ryggraden.
  13. Fullføre prosessen og velg ønsket stil og farge.
  14. Uncheck boksen volum i Egenskaper for å vise bare rekonstruert axons.
  15. Under kategorien statistikk , velger du detaljert. Bruke Filament. Dendrite Terminal poeng å kvantifisere motor nerve terminalene som en indikator på motor axon arborization.
    Merk: Statistisk merknader kan legges hvis ønskelig.
  16. Eksporter bildet av rekonstruert axon som en TIF-fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

LSFM gir detaljert 3D-visualisering av MN banen og axon arborization musen embryoer. Under lyse feltet vises vev helt gjennomsiktig etter å være nedsenket i kommersielle clearing reagensen. Ingen krymping eller hevelse av prøven ble oppdaget etter opptil en uke lagringsplass i clearing reagens før bildebehandling. Under fluorescens kanal, er motor neurons merket med transgenically uttrykt GFP (film 1). I noen tilfelle, er detaljer om axon strukturen kompromittert. Figur 2 representerer for eksempel lav kvalitet tenkelig. Flere faktorer kan hindre tenkelig kvalitet. For det første, utilstrekkelig permeabilization og vask trinnene kan føre til høye signal. Dernest fører lysspredning gjennom mangelfullt ryddet vev uskarpe bilder. Til slutt, suboptimal prøve posisjonering under bildeopptak kan øke lysspredning eller blokkere lys banen.

Å bilde axon arborization i større detalj og utføre kvantifisering forstørrelse kan justeres slik at alle fint arborized struktur blir avslørt (Movie 2). Bilder av enkelt - og dobbeltsidig belysning skal sammenlignes for å fastslå den optimale oppløsningen arborization mønster (Figur 3). Tenkelig analyseprogramvare kan deretter brukes til å rekonstruere axon arborization mønstre for individuelle forlemen nerver (Figur 4). Du definerer startpunktet og diameteren for frø punktet deteksjon, kan disse arborized strukturer semi-automatisk oppdages og beregnet mens bakgrunn signaler fjernes manuelt. Vi brukte feltet "Filament -. Dendrite Terminal Pts"funksjonen for å beregne totalt motor nerve terminalene på individuelle nerver som en indikator på motor axon arborization. I tillegg kan lengden for gren, gjennomsnittlig diameter og volum beregnes med "Filament - Dendrite lengde", "Filament - Dendrite mener Diameter" og "Filament - Dendrite Volume", henholdsvis.

Figure 1
Figur 1: grafisk illustrasjon av prøven oppsett. (A) under eksempel forberedelse, embryoer er først decapitated og eviscerated. Forelimbs er dissekert langs den stiplede linjen. (B) i eksemplet kammeret, prøver er posisjonert for å holde hele regionen rundt langs lys banen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Movie 1
Film 1: lys ark fluorescens mikroskopi av en stor synsfelt av øvre halvdel av et E12.5 transgene musen embryo (Hb9::GFP). Filmen viser tydelig motor nerver eller ryggmargen sine innervating mål. Det 3D image utlegg under 0.3 X forstørrelse med enkelt-side belysning og 30 ms eksponeringstid og senere behandles i video med analyseprogramvare. Skala linjen representerer 500 µm. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Figure 2
Figur 2: eksempel på en lavkvalitets med høye signal og uklare områder (blå piler). Uriktig trinnene under eksempel forberedelse og image oppkjøpet kan føre til nedsatt bildekvaliteten til svekker nøyaktigheten av alle etterfølgende kvantifisering av axon arborization. Skala bar i bildet representerer 200 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Movie 2
Movie 2: visualisering av E12.5 forlemen nerver under 488 nm eksitasjon med dobbeltsidig belysning på en forstørrelse på 0,6 X. Zoomet inn filmen kan klare og panoramautsikt visualisering av alle bra arborized strukturer på individuelle nerver. Skala linjen representerer 300 µm. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Figure 3
Figur 3: sammenligning mellom enkelt - og dobbeltsidig belysning. Både venstre og høyre illuminations vise detaljer om bestemte regioner bare (røde piler), mens en kombinert bilde fra dobbeltsidig illuminations gir et mer komplett bilde av arborization mønster. Imidlertid kan enkelt-side belysning oppnås på kortere tenkelig tid og noen ganger med bedre bildekvalitet. Dette er på grunn av at belysning baner fra begge sider ikke kan ligge helt på et enkelt fly, som resulterer i sløret under dobbeltsidig illuminations. Bilder vises som maksimale intensitet projeksjon. Skala linjen representerer 200 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: rekonstruert axon arborization av personlige forlemen nerver, fargekodet slik: suprascapularis (rød), aksillær (rosa), radial (blå), bakre brachialis cutaneous (lilla). Arborization kompleksitet ble beregnet av antall terminal end-meningene oppdaget bruker vår semi-automatisert metode. Autopath (ingen loop) algoritmen spor filamenter og oppdager frø poeng fra brukerdefinerte startpunkter. Skala bar i både bilder representerer 200 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Flere trinn i protokollen kan bli utsatt for endringer under visse omstendigheter. For eksempel varigheten av fiksering, avhenger av en alder av embryo, varierer fra 2 h til 1 eller flere dager med nylaget paraformaldehyde. Siden fiksering utføres før hele mount immunostaining, for antistoffer som protein crosslinking, kan metanol brukes som en alternativ etappe, den stabiliserende agent. For en høy signal-til-støy-forhold på flekker, er det nødvendig å optimalisere vaskemiddel konsentrasjonen (mellom 0,1-0,5%). Ekstra vask trinn før og etter antistoff inkubasjon kan også øke signal-til-støy-forhold. I tillegg er et vev-clearing skritt viktig å sikre at lys banen er avblokkert gjennom dype axonal anslag. For å forsterke vev åpenhet, er det viktig å sikre minimal innføring av PBS under inkubasjonen i kommersielle clearing agent, som clearing effekten tilbakeføres ved å fordype prøver buffer løsninger. Ellers anbefales en lysning reagens med en høyere brytningsindeks eller lengre clearing. I mellomtiden varierer parametere under bildeopptak mellom forskjellige prøver. Dobbeltsidig belysning og multivisning bildebehandling kan bildebehandling med større dybde-of-field og forbedrede detaljer. Men siden belysning fra forskjellige vinkler anskaffes samtidig, er enkelt-side belysning mer effektive for mindre prøver eller flytte prøver. En god bildekvalitet sikrer nøyaktighet for følgende kvantitative analyser.

Tidligere studier, inkludert de fra vår gruppe, har benyttet enten AC confocal imaging eller to-fotonet mikroskopi å observere motor axon navigasjon prosess eller arborization mønsteret i Hb9::GFP embryo10,15, 16 , 17. basert på vår erfaring, tror vi LSFM å være overlegen til disse to andre metoder siden: 1) Imaging tid er i stor grad redusert som LSFM gir mer rask og høyere kvalitet imaging, mens minimere photodamage og Phototoksisitet prøvene. Prøvene er opplyst fra siden med en tynn lys ark, og dermed skape en innebygd optisk paragraf14,18,19. Midten av lys arket konvergerer med fokalplanet av oppdagelsen system, som er ortogonale belysning aksen. Derfor ut-av-fokusere lys redusert, og bare fluorophores i fokalplanet er opplyst for hvert bilde, dvs.i stedet for hele prøven, og dermed redusere photobleaching20. 2) detaljer av arborization mønsteret er mye bedre illustrert som LSFM tillater multivisning bildebehandling. I stedet for prøven blir montert på et lysbilde, legges det slik at rotasjon rundt en akse er mulig, som er bevegelser langs x-, y- og z-dimensjonene. Bildene fra forskjellige plan og utsikt er å produsere mer isotropic 3D-bilder. LSFM har imidlertid en begrensning i forhold til AC confocal og to-fotonet tilnærminger i massiv filstørrelsen opprettet for hvert bilde. Disse fordeler og ulemper må veies når du bestemmer hvilke bildebehandling metode å bruke, men til slutt valget avhenger på hvilke mikroskopiske maskinvare/programvare er tilgjengelig på forespørsel.

Kort sagt, denne protokollen kombinerer hele-mount immunostaining, state-of-the-art lette ark 3D-bildebehandling, sammen med kvantifisering i analyseprogramvare. Vi tror denne protokollen ikke bare gir et nytt paradigme for å visualisere motoren axon navigasjon og baner i embryoer med kvantifisering av axon arborization kompleksitet, men kan også brukes til andre Nevron systemer (dvs., sensoriske neurons) med aktuelle transgene mus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

LSFM eksperimenter og dataanalyse ble utført delvis bruke de avanserte optiske mikroskoper divisjon av Instrument tjenesten i Academia Sinica og med hjelp av Ms. Shu-Chen Shen. Vi takker Ms. Sue-Ping Lee fra den Imaging Core anlegg av IMB for betydelig kundestøtte med Imaris bildeanalyser. IMB vitenskapelige engelsk redigering Core gjennomgått manuskriptet. Dette arbeidet er finansiert av Academia Sinica karriere Development Award (CDA-107-L05), mest (104-2311-B-001-030-MY3) og NHRI (NHRI-EX106-10315NC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hb9::GFP The Jackson labortory 005029 Collect embryos of embryonic day 12.5 (E12.5)
4% Paraformaldehyde (PFA) For 200ml: Add 20ml 10X PBS, 8g PFA in ddH2O. Adjust pH to 7.4 with NaOH (10N). Filter sterilize and store at -20 °C.
Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X) For 1L: Add 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 and top up with ddH2O. Autoclave and store at RT.
Triton X-100 Sigma X100-500ML
Fetal Bovine Serum ThermoFisher 26140079
Sheep polyclonal anti-GFP AbD Serotec 4745-1051 1:1000
Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep Invitrogen A-11015 1:1000
RapiClear 1.49 clearing reagent SunJin Lab RC149001
1.5ml micro tube Sarstedt 72.690.001
24 wells plate ThermoFisher 142475
5 SA Tweezer ideal-tek 3480641
Iris Scissors striaght sharp/sharp Aesculap BC110R
Microsurgery Scalpels, single use Aesculap BA365
Dissecting microscope Nikon SMZ800
Shaker TKS RS-01
Lightsheet Z.1 microscope Carl Zeiss Microscopy
Imaris 8.4.0 image analysis software Bitplane, Zurich, Switzerland
B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9::GFP mice) The Jackson Laboratory 005029

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Davis-Dusenbery, B. N., Williams, L. A., Klim, J. R., Eggan, K. How to make spinal motor neurons. Development. 141, 491-501 (2014).
  2. Stifani, N. Motor neurons and the generation of spinal motor neuron diversity. Front Cell Neurosci. 8, 293 (2014).
  3. Kania, A., Jessell, T. M. Topographic motor projections in the limb imposed by LIM homeodomain protein regulation of ephrin-A:EphA interactions. Neuron. 38, 581-596 (2003).
  4. Livet, J., et al. ETS gene Pea3 controls the central position and terminal arborization of specific motor neuron pools. Neuron. 35, 877-892 (2002).
  5. Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. Motor neuron diversity in development and disease. Annu Rev Neurosci. 33, 409-440 (2010).
  6. Matsumoto, S., Kiryu-Seo, S., Kiyama, H. Motor Nerve Arborization Requires Proteolytic Domain of Damage-Induced Neuronal Endopeptidase (DINE) during Development. J Neurosci. 36, 4744-4757 (2016).
  7. Nagata, K., et al. ECEL1 mutation implicates impaired axonal arborization of motor nerves in the pathogenesis of distal arthrogryposis. Acta Neuropathol. 132, 111-126 (2016).
  8. Catela, C., Shin, M. M., Lee, D. H., Liu, J. P., Dasen, J. S. Hox Proteins Coordinate Motor Neuron Differentiation and Connectivity Programs through Ret/Gfralpha Genes. Cell Rep. 14, 1901-1915 (2016).
  9. Bonanomi, D., et al. Ret is a multifunctional coreceptor that integrates diffusible- and contact-axon guidance signals. Cell. 148, 568-582 (2012).
  10. Tung, Y. T., et al. Mir-17 approximately 92 Governs Motor Neuron Subtype Survival by Mediating Nuclear PTEN. Cell Rep. 11, 1305-1318 (2015).
  11. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
  12. Jonkman, J., Brown, C. M. Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques. J Biomol Tech. 26, 54-65 (2015).
  13. Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nat Methods. 12, 30-34 (2015).
  14. Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J Histochem Cytochem. 59, 129-138 (2011).
  15. Hanley, O., et al. Parallel Pbx-Dependent Pathways Govern the Coalescence and Fate of Motor Columns. Neuron. 91, 1005-1020 (2016).
  16. De Marco Garcia, N. V., Jessell, T. M. Early motor neuron pool identity and muscle nerve trajectory defined by postmitotic restrictions in Nkx6.1 activity. Neuron. 57, 217-231 (2008).
  17. Li, C. J., et al. MicroRNA filters Hox temporal transcription noise to confer boundary formation in the spinal cord. Nat Commun. 8, 14685 (2017).
  18. Swoger, J., Pampaloni, F., Stelzer, E. H. Light-sheet-based fluorescence microscopy for three-dimensional imaging of biological samples. Cold Spring Harb Protoc. 2014, 1-8 (2014).
  19. Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 327-339 (2014).
  20. Reynaud, E. G., Tomancak, P. Meeting report: first light sheet based fluorescence microscopy workshop. Biotechnol J. 5, 798-804 (2010).

Tags

Nevrovitenskap problemet 135 Motor neuron axon navigasjon axon bane axon arborization lys ark mikroskopi ryggmargsskade IMARIS
Visualisering Motor Axon navigasjon og kvantifisering av Axon Arborization i Mouse embryoer bruker lys ark fluorescens mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liau, E. S., Yen, Y. P., Chen, J. A. … More

Liau, E. S., Yen, Y. P., Chen, J. A. Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (135), e57546, doi:10.3791/57546 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter