Summary
4 aminopyridine uyarılan epileptiform aktivite kayıt ve elektrik modülasyon elektrot dizileri kullanma kemirgen beyin dilimler halinde gerçekleştirme göstermektedir. Özel kayıt odası doku canlılığı uzun süreli deneysel oturumları boyunca korur. Elektrot eşleme yaşamak ve uyarıcı çiftlerinin seçimi özel bir grafik kullanıcı arabirimi tarafından yapılmaktadır.
Abstract
Temporal lob epilepsi (TLE) en yaygın kısmi karmaşık epileptik sendromu ve ilaçlar için az duyarlı olduğunu. Farmakolojik tedavi kesildiğinde veya Nöroşirürji tavsiye edilmez derin beyin stimülasyonu (DBS) gelecek vaat eden bir yaklaşımdır. Akut beyin dilimleri elektrot dizilerin (ölçü) birleştiğinde nöronal ağ etkileşimleri ve onların modülasyon tarafından elektriksel stimülasyon eğitim için değerli bir araç temsil eder. Geleneksel ekstraselüler kayıt teknikleri ile karşılaştırıldığında, daha fazla sayıda gözlem noktaları ve bilinen bir elektrot arası mesafe, Elektrofizyolojik hızını ve yayılma yolunu eğitim izin ekledi avantajları sağladıkları sinyalleri. Ancak, kayıt, düşük sinyal-gürültü oranı ve deneysel sıcaklık daha yüksek titreşimler pahasına gelir yüksek perfüzyon hızı gerektiren MEA sırasında doku oksijenasyonu büyük ölçüde bozulmuş olabilir. Elektriksel stimülasyon daha da uzun süreli kayıt/stimülasyon dönemini takip zorlaştırır beyin dokusu vurguluyor. Ayrıca, belirli yapıları/yollar elektrot eşleme kolayca ve hızlı bir şekilde canlı deneme sırasında gerçekleştirilmesini gerektiren beyin dilim içinde hedeflemek beyin dilim faaliyet elektrik modülasyon ihtiyacı var. Burada, 4-aminopyridine (4AP) kayıt ve elektrik modülasyon gerçekleştirmek nasıl göstermek-kemirgen beyin dilimleri kullanarak düzlemsel Guinan epileptiform aktivite indüklenen. Biz fare elde edilen beyin dokusu sıçan beyin dokusu daha iyi performans ve böylece daha iyi MEA deneyleri için uygun gösteriyor. Bu iletişim kuralı oluşturma ve sadakatle geleneksel alan potansiyel kaydı ile gözlenen Elektrofizyolojik özellikleri üretir, birkaç saat boyunca devam ederse ve outlasts bir istikrarlı epileptiform desen bakımından sürekli garanti eder elektriksel stimülasyon uzun dönemler için. Doku canlılığı deneme boyunca laminar akış ve hızlı çözüm alışverişi bile, düşük (1 mL/dk) için perfüzyon oranları izin veren bir küçük hacimli özel kayıt odası kullanımı sayesinde elde edilir. Hızlı MEA eşleme gerçek zamanlı izleme ve seçim uyarıcı elektrot için özel grafik kullanıcı arabirim (GUI) tarafından gerçekleştirilir.
Introduction
Epilepsi kontrolsüz beyin1yol hayati, ilerleyici bir hastalıktır; hastalık ve önemli sosyal stigma2,3en yüksek yükünü arasında taşır. TLE olduğunu en sık Sendromu (% 40) ve en sık (~ % 30) anti-epileptik ilaçlar4dayanıklı. Epileptogenic dokusunun cerrahi ablasyon hastanın durumu iyileştirmek iken, tüm hastalarda mümkün değildir ve tamamen nöbet özgür hayat5garanti değil. Farmakolojik tedavi veya Nöroşirürji olmadığın zaman uygun modülasyon tarafından elektrik DBS epileptik limbik ağların gelecek vaat eden bir yaklaşımdır.
Onlar, en azından bölümü, özgün mimarisi ve beyin bağlantısı içinde korumak sağlık ve hastalık6 nasıl nöronal ağlar işlevinde vitro Elektrofizyoloji teknikleri sayesinde eğitim için değerli bir araç kemirgen beyin dilimleri şunlardır faiz (ROI) Region(s). Özellikle, yatay kombine hippocampus entorhinal korteks (Hipokampus-EC) dilimleri temel nöronal ağlar TLE içinde yer alan oluşturan ve bu nedenle düzenli olarak vitro TLE araştırma7' istihdam edilmektedir.
Nöbet benzeri aktivite akut indüklenen beyin dilimler halinde yapay serebrospinal potasyum8,9,10, artırırken magnezyum azalan gibi sıvı (ACSF), iyonik bileşimi değiştirerek veya inhibitör GABAergic aktivite engellemesi gibi farmakolojik manipülasyon yoluyla (11 kapsamlı bir inceleme için bkz.). Ancak, bu modeller üzerinde uyarma ve inhibisyon değişiklik dengesiz temel alır; Böylece, bunlar etkileşim ve uyumlu ictogenesis eksitatör ve inhibitör ağlarına katkısını izin vermez. Beyin dilim konvülsanların uyuşturucu 4AP ile sürekli perfüzyon geliştirir böylece sinirsel aktivite genel olarak sağlam tutarken akut ictogenesis çalışmaya izin eksitatör ve inhibitör neurotransmission12.
Bana gözlem noktaları nerede mekansal kısıtlamalar olabilir elektrotlar sınırlamak geleneksel hücre dışı alan potansiyel kaydı ile karşılaştırıldığında daha fazla sayıda gelen nöronal networks tarafından üretilen elektriksel aktivite kayıt izin beyin dilim yüzeyde ağırladı. Ayrıca, MEA fiş avantajı izleme yayma için çok yararlı olan bilinen arası elektrot mesafe teklif ve kaydedilen sinyalleri seyahat hızı değerlendirmek. Her ne kadar başlangıçta kültürlü nöronlar13,14kayıt için tasarlanmış, bana şimdi de kemirgen insan ve15 16elde edilen akut beyin dilimleri Elektrofizyolojik özellikleri tanımlamak için kullanılır. Böylece, epilepsi araştırma bağlamında, özünde nöronal ağlar etkileşimlerin ictogenesis16,17,18kesin olarak belirlemek için değerli bir araç beni temsil eder.
Ancak, MEA kayıt doğal olarak elde etmek veya uzun (birkaç saat) deneysel protokoller boyunca istikrarlı epileptiform desen Bakımı teknik zorluklar taşır. İlk olarak, doku oksijenasyonu olmayabilir büyük içinde yeterli ve yoksul sinyal-gürültü oranı ve sıcaklık istikrarsızlık etkileyebilir iken batık tipi kayıt odası19,20 piyasada bulunan Guinan, tipik yuvarlak yüksek perfüzyon oranı zaman (6-10 mL/dak) kayıt kalitesini (örneğin teknik Isıtma ve perfüzyon ekipman21tarihinde bkz: Notlar) oksijen beyin dilim için geliştirmek için kullanılır. İkinci, tekrarlayan deşarj gibi epileptiform deşarj, yüksek frekans bileşenleri featuring zor batık tipi kayıt odaları19kullanırken gözlenir; Akut epileptiform desen kimyasal olarak indüklenen ve ephaptic mekanizmaları, içerir bu 4AP model22 için olduğu gibi özellikle durum böyle (11 kapsamlı bir genel bakış için bkz:). Bu sınırlamaları aşmak için çeşitli stratejiler araştırmacılar tarafından önerilmiştir. Örneğin, beyin dilim kalınlığı (≤300 µM) ve alan17,18 azaltırken perfüzyon oranı19,20 artan dokulara yeterli oksijen kaynağı elde etmek çok önemli faktörlerdir. Ayrıca, gelişmiş beyin dilim canlılığı da her iki taraf18beyin dokusundan Ventriküler sağlayan delikli bana (pMEAs), kullanarak yapılabilir.
Açıklanan yaklaşımları önemli ölçüde beyin dilimleri kaydından MEA fizibilite düzeldi ise, onlar karşı (birkaç saat) uzun süreli sınanmamıştır ikinci önemli bir temsil eden kayıt ve elektrik stimülasyon oturumları beyin dokusu için stres. Uzun süreli kayıt oturumları meydana çıkarmak mümkün olmazdı epileptiform desen özellikleri zaman içinde evrim çalışmaya tarafından kısa vadeli ölçümleri gerekebilir. DBS araştırma bağlamında, uzun süreli deneysel protokoller değerlendirmek ve aynı beyin dilim içinde birkaç stimülasyon paradigmalar etkileri karşılaştırmak için gerekli olabilir.
Genellikle sadece spontan elektriksel aktivitenin kaydedilmesi, yatırım Getirisi açısından elektrot eşleme gerektiğinde sonsal, Yani, veri çözümlemesi sırasında yapılır; Bunun yerine, çalışma uyarılmış yanıtların veya elektrik neuromodulation paradigmaların hızlı ve kolay canlı elektrot eşleme deney sırasında ihtiyaç dikte Uyarım belirli ROI(s) için teslim edilmesini gerektirir.
Burada, indüksiyon ve yetişkin kemirgen beyin dilimleri istikrarlı 4AP uyarılan epileptiform desende için sağlar basit bir deneysel protokol göstermektedir. Gözlenen etkinliğin sadakatle bu modelin Elektrofizyolojik özellikleri geleneksel ekstraselüler Elektrofizyoloji yöntemlerle karakterize olarak ürer. Birkaç saat boyunca devam ederse ve sürekli elektrik stimülasyonu için tekrarlanan uzun süreli dönemini outlasts. En uygun çözüm döviz kuru ve laminar akış (şekil 1B) için izin veren bir özel kayıt odası olabilir Oysa eskiden korumak ve beyin dilimleri kuluçkaya chambers kolayca standart laboratuvar malzemeleri (şekil 1A), kullanarak monte edilebilir ticari kaynaklardan elde veya uygun bir fiyata 3D baskı teknolojisi kullanarak. Hızlı eşleme için gerçek zamanlı izleme ve uyarıcı elektrotlar seçimi için ROI(s), mapMEA, serbestçe elde edilebilir üzerinde rica adlı özel bir kullanıcı dostu GUI mümkün olmaktadır.
Şekil 1: özel cihazları için bu protokolü. (A) salonları kurtarma, önceden ısınma ve 4AP ön kuluçka için bir ölçek ve Petri kabına kullanarak monte edilir holding. Petri kabına kırıcı çapı küçük olmalıdır ve yerde şırınga lavabo pompası aracılığıyla düzenlenmektedir. Petri kabına alt Petri kabına kenarında üzerine cyanoacrylate ile yapıştırılmış bir naylon kafes (yumuşak çoraplar) ile değiştirilir. Oksijen bükülmüş spinal iğne (22 G), Petri kabına duvarlar ve kabı arasında eklenen üzerinden sağlanır. Kabarcıklar kabı ve asla ulaşmak beyin dilim deplasman önlemek için naylon mesh kısmından çıkan. Petri kabına üst kapak ACSF buharlaşma önlemek ve oksijen doygunluğu korumak için kullanılabilir. (B) özel kayıt odası. In: Isıtma kanül ve referans elektrot için giriş haznesi. Çıkış: çıkış rezervuar emme iğne karşılamak için. Rec: kayıt odası. (C) cam Pasteur pipet, yangın parlatma tarafından kıvrılmış kullanılan doku ve kayıt odası içinde konumunu ayarlamak için. (D) özel dilim hold-down çapa. Kayıt odası (E) son montaj MEA çip monte edilmiş. Yerde çapa tarafından düzenlenen alt üzerine bir beyin dilim aittir. Kırmızı daire referans elektrot, ACSF giriş Ivanhoe tarafından batık bir doymuş KCl Pelet gösterir, ancak kırmızı ok Isıtma kanül kapsayan PTFE boru gösterir. Mavi ok çıkış rezervuar emme iğneyi belirtir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Protocol
Tüm yöntem tanımlamak burada EU Direktifi 2010/63/EC sayılı hayvan refahı ile uyumlu Sağlık (yetkilendirme i. 860/2015-PR) İtalyanca Bakanlıkça onaylanmış olması.
1. MEA/özel odası derleme hazırlanması
Not: 2 gün önce deneme başlayın. Bana bir yüzük olmadan kullanın ( Malzeme tabloyabakın).
-
MEA temiz (süresi: 35-40 dk).
- Bir enzimatik temizleyici toz sıcak distile su geçiyoruz. Sıcak temizleme solüsyonu MEA yüzeyine fırça sonra temizleme solüsyonu en az 3 h için sıcak içine MEA emmek.
- MEA distile su ile iyice durulayın ve kuru bir hav bırakmayan no-sıfırdan doku kullanarak.
-
MEA kayıt odası ile bir araya (süresi: 10 dakika + geceleme).
- Eşit soğuk poliüretan mastik kayıt odası alt yüzeyine yayılmış. Hava kabarcığı yok olduğundan emin olun.
- Kayıt odası MEA cımbız yardımıyla üzerine monte ve hafif basınç uygulayın. Herhangi bir kabarcıklar iseniz, hafifçe odası bir daire içinde tüm kabarcıklar kayboldu kadar parmak ile hafif basınç uygularken hareket ettirin. Bir dolgu macunu katman kayıt odasının dış sınırlarındaki sonuna kadar yayıldı.
Not: kritik! Dolgu macunu MEA kişilerle kapatmayın. - MEA/odası derleme içinde 15 cm Petri kabına yerleştirin. Yer 5 mL Petri kabına veya 10 mL kabı MEA yakın distile su ile dolu. Nemli bir ortam sağlamak için her şeyi kapsar. Bir gecede tedavi oda sıcaklığında izin.
Not: Protokol burada duraklatılmış.
-
Hidrofilik yapmak için MEA kat (süresi: 5-10 dk + geceleme).
- MEA 15 cm Petri kabına yerleştirin. Poli-D-lizin 50 µL MEA kayıt alanının üzerine dökün. Petri kabına kapatın, film mühürleme ile kapatın ve gecede 4 ° C'de depolayın
- MEA iyice distile su kullanarak durulayın ve distile suda MEA 4 ° C'de depolayın.
Not: Protokol burada duraklatılmış. Kaplı bana saklanan ve çeşitli deneyler için yeniden kullanılabilir. Düzenli olarak temizlik ve bana yeniden kaplama doku enkaz kaldırma ve sinyal-gürültü oranı artırmaya yardımcı olur.
2. hisse senedi çözümleri hazırlanması
Not: 1 gün önce deney başlamak (süresi: ~ 2 h). Hisse senedi çözümleri hızlandırmak deneysel gün deneme yardımcı olur. Onlar önceden hazırlanmış ve depolanır. Bkz. Tablo 1 konsantrasyon faktörü ve kompozisyon için. Tablo 2 ' ye son çözümleri bileşimi için başvurun.
- Kimyasallar, oda sıcaklığında distile suda çözülür. Bir filtre şişe hisse senedi çözümlerle filtre (Filtre Çapı: 0,22 µm).
- Mağaza 4 ° C'de (maksimum saklama süresi tavsiye için bkz. Tablo 1).
Not: Protokol burada duraklatılmış.
3. Agar hazırlanması
Not: 1 gün önce deney başlamak (süresi: ~ 1 h).
- 250 mL distile su 500 mL kabı dökün ve 350 rpm'de karıştırmaya başlayın. Agar 5 g ekleyin ve tamamen eriyene kadar bekleyin.
- Çözüm 250-300 ° C'de ısı Çözüm ~ 200 mL % 2,5 w/v agar çözüm getirebilecek kadar buharlaşır su ver.
Not: Sıcaklık su köpüren olmadan buharlaşır için yüksek olmalıdır. - Cm-yüksek duvarlar üzerine bir 200 mL plastik kare kutu ~1.5 agar solüsyonu dökün ve katı hale gelinceye kadar oda sıcaklığında soğumasını bekleyin.
- Kutu örtmek ve 4 ° C'de saklayın Agar blok birkaç hafta için iyidir.
Not: Protokol burada duraklatılmış.
4. dondurulmuş uçak hazırlanması
Not: 1 gün önce deneme başlayın.
- Bir düz dipli paslanmaz çelik kase 0,5 - 1 cm azına kadar distile su ile doldurun.
- -20 ° C'de gecede saklayın.
5. ACSF kesme nöroprotektif hazırlanması
Not: 1 gün önce deney ya da aynı gün deneme başlatmak (bkz: Tablo 1 ve Tablo 2) (süresi: 30 dk).
- 200 mL distile su bir 500 mL ölçek dökün ve bir manyetik karıştırıcı 350 rpm ile karıştırarak başlayın.
- 50 mL stok B ve C stokunun 50 mL ekleyin (bkz. Tablo 1).
- 3 mM Pirüvik asit, 208 mM Sükroz, 10 mM D-glukoz ve 1 mM L-askorbik asit ekleyin.
Not: Pirüvik asit gerçek hacmiyle yoğunluk ve saflık bağlıdır ve toplu iş iş işlemle değişiklik gösterebilir. Her zaman yeni bir toplu iş açarken gerekli birim hesaplayın. - Film mühürleme ile kapak ve izin için 30 dakika karıştırın.
- Çözüm için 500 mL volumetric flask aktarmak ve şişeye doldurmak için distile su ekleyin.
- Volumetric flask film mühürleme ile mühür ve 3 - çözüm eşit temizlenene kadar 5 kez yavaşça tersine çevirin.
- Kesme ACSF kapaklı bir cam şişe içine aktarın.
- Kesme ACSF 20-30 dk-80 ° C'de veya 4 ° C'de gecede 4 ° c kadar soğutmak için saklamak
Not: bir gecede soğutma tercih edilirse protokol burada duraklatılmış. Aksi takdirde kesme ACSF soğutma adım 6 sürdürmeye kullanılan için zaman gerekli.
6. Holding hazırlanması ACSF
Not: çözüm taze deneme günü hazırlamak (süresi: 5-10 dk). Holding ACSF ACSF kesme Dilimleme işlemi sırasında gelen beyin dilimleri durulama için kullanılır (bkz. Adım 8.16) beyin dilim uzun vadeli depolama ve öncesi ısınma. Beyin dilimleri durulama için ACSF Holding'in 100 mL yeterlidir. Bu protokol için kullanılan tutan ve öncesi ısınma odaları özel yapım ve hacmi 300 mL ve 100 mL, sırasıyla içeren (bkz. şekil 1A). Bu ayar, ACSF Holding'in 500 mL yeterli olur. Ticari kaynaklardan alınan Chambers durumda hazırlanacak ACSF holding genel miktarını buna göre ayarlanması gereken başka bir bölüm içerebilir.
- 200 mL distile su içinde 500 mL volumetric flask dökün.
- 50 mL stok A, B stokunun 50 mL, M stokunun 6.5 mL ve 1 mM L-askorbik asit ekleyin. Yavaşça L-askorbik asit tamamen eriyene kadar dönen hareketleri kullanarak kışkırtmak.
- Distile su son hacim ulaşmak, film mühürleme ile volumetric flask mühür için ekleyin ve 3 - çözüm eşit temizlenene kadar 5 kez yavaşça tersine çevirin. Tablo 2 ' ye holding ACSF kompozisyon için başvurun.
7. deneysel banklar hazırlanması
Not: Bu 15 dk artı sıcak banyo istikrarlı bir sıcaklık elde etmek için 30 dk gerektirir.
-
Kayıt tezgah
- Sıcak banyo başlatmak, 32 ° C-ayarlayın ve kendi ısısını korumak için yeterli.
Not: Bu protokol için kullanılan sıcak banyo özel bir sert plastik kutu ve istenilen sıcaklıkta önceden belirlenen bir akvaryum termostat kullanarak olabilir. Sürekli istenilen sıcaklık ~ 30 dk Oda sıcaklığından itibaren ulaşmış olabilir. Öncesi ısınma ve kuluçka chambers plastik kutusunun altında oturup beri su seviyesi odaları yüzen üzerinden devam böylece termostat karşılamak için yeterli olmalıdır. - Holding ve (bkz. şekil 1A) öncesi ısınma odaları montajı ve holding ACSF onları içine dökün. Holding odası oda sıcaklığında tutmak ve öncesi Isınma odası sıcak banyo içine yerleştirin. % 95'i O2/5% CO2 gaz karışımı çözümlerle köpüren başlatıp herhangi bir kapana kısılmış kabarcıklar ters bir Pasteur pipet kullanarak kaldırabilirsiniz. Kapalı tutun.
- Sıcak banyo başlatmak, 32 ° C-ayarlayın ve kendi ısısını korumak için yeterli.
-
Dilimleme tezgah ve vibratome
- Cyanoacrylate tutkal kullanarak örnek disk bir küçük agar bloğunu Merkezi üzerine tutkal.
- 250 mL kabı buz kovası koymak ve ACSF içine kesme dökün.
- İki 100 mL kadehler alın ve her içine ACSF Holding'in 50 mL dökün. Oda sıcaklığında kadehler bırakın. Durulama kadehler bunlar.
- Bir % 95 O2/5% CO2 gaz karışımı çözümlerle köpüren başlatın.
- Arabellek tepsi vibratome üzerine monte ve kırılmış buz ile surround. Dilimleme işlemi sırasında soğuk sıcaklıklarda korumada yardımcı olmak için ezilmiş buz üzerinde bazı etanol dökün. Dökme etanol sonra gerektiğinde daha fazla buz ekleyin.
Not: 2 ° C sıcaklık en uygunudur. - Arabellek tepsi içinde bubbler yerleştirin sonra montaj ve vibratome bıçak blok monte.
Not: bıçak izni ~ 10 ° açıyla monte edilir emin olun. - 2/3 distile su ile doldurun ve birim için bir 500 mL ölçek ezilmiş buz koy.
- Dondurucudan donmuş yersiniz, Dilimleme bankta ters yerleştirin ve kağıt havlu ve filtre kağıdı disk ile kapağı.
-
Anestezi tezgah
- Küçük bir kase buz dolu bir tepsisine yerleştirin ve ACSF içinde kesme dökün. % 95'i O2/5% CO2 gaz karışımı ile köpüren başlatın.
8. beyin dilim hazırlık ve bakım
Not: Bu protokolü kullanır (4 - 6 hafta-yaşlı) Yetişkin erkek CD1 fareler, ama diğer suşların (örneğin, c57/bl617,18) kullanılabilir. Biz de daha sonra aynı yaşta erkek Sprague-Dawley sıçanlarından emir elde edilen beyin dilimler tarafından vermiştir bu konuda fare beyin dilimleri kullanarak elde edilen deneysel çıkış karşılaştırın. CA3 odaklı hızlı interictal benzeri aktivite Hipokampus uygun ölçülü ve parahipokampal cortices olarak yaymak değil kısmen bağlı beyin dilimleri hazırlanması için aşağıdaki adımlar bakın 23' te açıklanan. Hippocampus-korteks kopukluk Hipokampus-EC beyin dilim hazırlık kullanarak elektrik modülasyon çalışmaları sürdürmeye önceden gerekli olduğunu. Vibratome kullanılan Malzemeler tablomodeli anlamına gelir. Diğer modeller farklı bir yordam gerekebilir.
- İsoflurane kullanarak kemirgen anestezi % 5'bir carbogen gaz karışımı bir anestezi indüksiyon odası 2 L/dk'na teslim.
- Derin anestezi altında (yanıt-e doğru ayak ve pençeleri yok refleksleri tutam), 1 dk.23olduğu gibi standart prosedürleri takip içinde beyin ayıklamak. Beyin dengelenmiş buz gibi kesme ACSF içeren küçük kaseye koyun ve 90-120 s için chill izin.
Not: çok uzun süre soğuk beyin izin vermeyin, aksi takdirde donabilir. - Arabellek tepsi içine buz gibi kesme ACSF dökün. Filtre kağıdı üzerine yaymak kesme ACSF donmuş kase yerleştirilir. Beyin filtre kağıdı üzerine yerleştirin ve beyincik kaldırarak ve ön direğe düz kesme gerekli beyin doku blok yalıtır.
- Bükülmüş bir spatula yardımı ile kesilmiş ön yüzü agar blok ve oksipital kutup vibratome bıçak karşı karşıya bakacak şekilde örnek disk üzerine beynin yan dorsal tutkal. Cyanoacrylate tutkal ince bir tabaka kullanın. Örnek disk hemen arabellek tepsisine yerleştirin ve güvenli.
- Vibratome bıçak doku agar blok kadar tüm yol üzerinde hareket böylece parça aralığını ayarlayın. Beyin dokusu bloklu bıçak seviyesine ulaşmak için numune disk yüksekliğini ayarla.
- Hipokampüs açıkça görünene kadar doku bölümleri atmak (genellikle ~ 900 µm). Sonra bir dilim kalınlığı 400 µm ayarlayın ve doku bölümleri korumak için dilimleme başlatın. Her beyin bölümü için iki hemisferlerin bölünmüş ve iki beyin dilim elde etmek için gereksiz doku trim. Arabellek tepsi sırasında sonraki bölümlerde artan olarak, arabellek tepsi lodgment buzlu distile su ile doldurun (bkz. adım 7.2.7).
- Yavaşça beyin dilimler halinde ilk yıkama kabı transfer Pasteur pipet boş ve beyin dilimler için ikinci yıkama kabı transfer ters bir Pasteur pipet kullanın. Sonra beyin dilimleri holding odanın içine aktarmak ve onlara en az 60 dk için yeniden elde etmek.
Not: Genellikle 6-8 beyin dilimleri genel elde etmek mümkündür. Protokol burada duraklatılmış.
9. 4-AP (4AP-ACSF) içeren ACSF hazırlanması
Not: Bu hazırlığı için 10 dk artı ısınma 20 dk gerektirir. Dikkat! Konvülsanların bir ilaç 4-AP ve zehirli. Eldiven ile idare ve dökülmesini önlemek.
- 200 mL distile su içinde 500 mL volumetric flask dökün.
- 50 mL stok A, B stokunun 50 mL, stok M 5 mL ve 1 mM L-askorbik asit ekleyin. Yavaşça L-askorbik asit tamamen eriyene kadar dönen hareketleri kullanarak kışkırtmak.
- 4AP stok 500 µL ekleyin.
- Distile su son hacim ulaşmak, film mühürleme ile volumetric flask mühür için ekleyin ve çözüm eşit temizlenene kadar yavaşça o 3 - 5 kez tersine çevirin.
- 4AP incubating Odası (bkz. şekil 1A) Montaj ve 4AP-ACSF ~ 80 mL içine dökün. Odası kapak, sıcak banyo aktarmak ve % 95'i O2/5% CO2 gaz karışımı ile köpüren başlatın. Herhangi bir kapana kısılmış kabarcıklar ters bir Pasteur pipet kullanarak kaldırın. Kapalı tutun.
- 4AP-ACSF sıcaklık 30-32 ° C (~ 20 dk) tamamlanana kadar bekleyin.
Not: beyin dilimleri hala kurtaracaksanız protokol burada duraklatılmış.
10. öncesi ısınma ve dilimler halinde 4AP kuluçka (süre: 90 dk)
- Öncesi ısınma ACSF ile 4AP-ACSF sıcaklık 30-32 ° c olduğundan emin olun
- Ters bir cam Pasteur pipet kullanın 1 beyin dilim öncesi ısınma odasına transfer ve 25-30 dk için doku dinlensin. O zaman beyin dilim 4AP-ACSF incubating odasına aktarmak ve için 60 dk rahat bırak.
11. MEA Set-up hazırlanması
Not: 15 dk önce kayıt başlatma.
- 4AP-ACSF kalan hacmi 500 mL Erlenmeyer şişesi aktarın.
- MEA amplifikatör üstünde bir rafta Erlenmeyer şişeye koyun ve boru çözüm sürekli 60 mL şırınga beslemek için izin vermek için kullanın. Erlenmeyer şişesi ve yerçekimi beslenen oranı 1 mL/dk izin vermek belgili tanımlık tenkıye yüksekliğini ayarlayın.
Not: Boru iç çapı (ID) doğru yüksekliği bağlıdır. 5/32 inç kimliği tüp için 30 cm yeterli vardır. - 4AP ACSF Erlenmeyer şişesi ve bir % 95 O2/5% CO2 gaz karışımı şırınga köpüren başlatın.
- Oraya kadar içine bir ölçek perfüzyon boru aracılığıyla izin 4AP ACSF akış içindeki hiçbir hava bir; o zaman çözüm akışı!
- Isıtma elemanı MEA üssünde termostat için bağlayın. Amplifikatör Merkez güvenli ve kuru MEA çip MEA amplifikatör içinde yer. 4AP-ACSF giriş ve kayıt odasının dış rezervuar aktarmak için bir plastik Pasteur pipet kullanın.
- Isıtma kanül bir manyetik tutucu için güvenli ve ucu kayıt odası giriş liman içinde yer; Manyetik tutucu MEA Amplifikatör Merkez manyetik şeridinde ekleyin; perfüzyon tüp kanül için bağlamak; kanül termostat için bağlayın.
Not: Isıtma kanül eğimli politetrafloroetilin (PTFE) boru giriş bağlantı noktası kayıt odası ulaşmak ve gürültü kanül metalik malzeme nedeniyle en aza indirmek için tarafından örtülmelidir. Giriş haznesi yeterince 4AP-ACSF ile dolduğunda, perfüzyon sistemi düşen Damlalar görünür olmaması gerekir. - Emme iğne rezervuar yerleştirin ve emme iğne ACSF batış tarafından negatif basınç olduğunu doğrulayın; sürekli düşük frekanslı emme gürültü için kontrol edin.
Not: Sadece beyin dilim yüzeyi üzerinde akmaya 4AP ACSF izin emme iğne yerleştirilmelidir. Vakum bir çizgi veya bir düşük gürültü vakum pompası kullanılabilir. - Debisi 1 mL/dk izin ve Ventriküler başlatmak için akım regülatörü ayarlayın.
Not: Yerçekimi beslenen perfüzyon Peristaltik pompalar tarafından kaynaklanabilir gürültü ortadan kaldırır; Peristaltik pompalar tercih edilen iseniz, düşük gürültü modelleri zorunludur. - 4AP-ACSF kanül akan bir kez üzerinde termostat açmak. 37 ° C Isıtma kanül MEA Bankası 32 ° c 32-34 ° C sıcaklık kayıt odası içinde elde etmek için ayarlayın.
Not: dikkat! Asla ısı kanül çözüm o ya da o olmadan geri dönüşümsüz zarar görmüş olabilir. Kanül için iç sıcaklık ofset değerini ayarla uç Isıtma kanül ve kayıt odası içinde fiili değeri arasındaki hesap kayıt sıcaklık (örneğin, 32-34 ° C) daha yüksek sıcaklık ayarlayın. Akış hızı, ortam sıcaklığı ve kayıt hacmi tüm etkisi kayıt çözüm sıcaklığını odası. Adım 11,9 rapor ayarları açıklanan protokol ve ekipman için optimize edilmiştir. Her zaman bir termokupl kullanarak gerçek kayıt sıcaklığını kontrol edin ve ayarları gerektiği şekilde değiştirin. MEA Bankası beyin dilim ısınmayı önlemek için 34 ° c ısı değil. - Kayıt odası giriş Reservoir dış referans elektrot bir yer.
Not: her ne kadar bana fiş bir dahili referans elektrot ile donatılmıştır, bu özel kayıt odası tarafından kapsamındadır. Böylece, bir dış başvuru elektrot kullanılması gerekir. Doymuş KCl Pelet en pratik olduğu için klorlama gerek kalmadan kullanıma hazırdır.
12. MEA canlı eşleştirme
- Bir kez 4AP-ACSF düzeyi ve kayıt sıcaklık istenilen, dönüş olarak perfüzyon ve geçici olarak onları durdurmak için kapalı konuma emme kesme muslukları bağları.
- Hızlı bir şekilde bir beyin dilim ters bir cam Pasteur pipet kullanarak MEA kayıt odası üzerine aktarın. Gerekli bir yangın cilalı kıvrılmış Pasteur pipet (şekil 1 c) veya yumuşak bir kompakt küçük fırça kullanarak olarak MEA kayıt alanı konumu ayarlayın. Hold-down çapa (şekil 1 d) beyin dilim yerleştirin. Perfüzyon ve emme kendi kesme muslukları açık konuma açarak yeniden başlatın.
Not: kritik! Dilimi aktarılması gerektiğini ve perfüzyon yeniden içinde 60 s veya doku ölür. Dilim hold-down çapa beyin dilim yüzeysel gerginlik farklılıkları nedeniyle beyin dilim üzerinde çapa yerleştirerek süre hareket etmesini engellemek için 4AP-ACSF tutulmalıdır. MEA üzerine beyin dilim güvenli çapa paslanmaz çelik tel ve naylon iplik (şekil 1 d) kullanarak özel yapım olabilir veya ticari kaynaklardan alınan. Son deneysel set-up MEA çip ile amplifikatör'ın kafasına bağlı şekil 1E gösterir: kayıt odası içinde MEA yonga üzerinde dinlenme bir beyin dilim tarafından özel çapa basılı tutulduğu. Emme iğne (mavi ok) çıkış rezervuar yerleştirilir, ancak referans elektrot (kırmızı daire) ve Isıtma kanül (kırmızı ok) kapsayan boru PTFE giriş depo, konumlandırılmış.
- Hızlı bir şekilde bir beyin dilim ters bir cam Pasteur pipet kullanarak MEA kayıt odası üzerine aktarın. Gerekli bir yangın cilalı kıvrılmış Pasteur pipet (şekil 1 c) veya yumuşak bir kompakt küçük fırça kullanarak olarak MEA kayıt alanı konumu ayarlayın. Hold-down çapa (şekil 1 d) beyin dilim yerleştirin. Perfüzyon ve emme kendi kesme muslukları açık konuma açarak yeniden başlatın.
- Bir ters mikroskop sahnede monte edilmiş bir kamera ile beyin dilim bir resmini çek.
- Komut dosyası mapMEA elektrotlar eşlemek için GUI başlatmak için bilgisayar yazılımı çalıştırın.
Not: Özel yapım belgili tanımlık bilgisayar yazılımı beyin dilim belirli yapılara için karşılık gelen elektrotlar seçmesini sağlar. Bu adımı doğru yolu etkinleştirmek ve ictal etkinlik elektriksel stimülasyon kullanarak bastırmak çok önemlidir.
İncir 2: GUI için yaşamak MEA elektrot eşleme. (A)MEA üzerinde konumlandırılmış kombine Hipokampus-EC dilim şematik gösterimi. Cornu ammonis 3 (CA3), enthorinal korteks (EC), perirhinal korteks (PC), bu iletişim kuralı için kullanılan varsayılan yapıları vardır ve subiculum (SUB). Referans elektrot bir üçgen işareti olarak kapsamlıdır. Noktalı çizgiler içinde çevrili elektrotlar doğrultma görüntü için XY koordinatları temsil. (B) ekran yakalama GUI canlı MEA eşleme sırasında. Akış şeması yakalama soldaki takip için adım adım yordam gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
- Beyin dilim resim yüklemek için Gözat düğmesini tıklatın. Referans elektrot MEA (şekil 2A, üçgen mark) sol yarım tarafında üst satırda görüntülendiğinden emin olun. Etkinleştirmek işaretçi düğmesini tıklatın ve sonra üst ve alt elektrotlar görüntü düzleme ve elektrot eşleme için XY koordinatları işaret dizinin en soldaki satır seçin.
- Dilim türü aþaðý açýlan menüsünden Yatayseçin. Yapıları varsayılan onay kutusunu işaretleyin.
Not: Yeni yapıları girin düğmesini seçerek yapıları özelleştirmek kullanılabilir. Yatay beyin dilim için varsayılan yapıları şekil 2Atasvir edilir. - Beyin dilim resmin altındaki numaralı butonları kullanarak, yatırım Getirisi için karşılık gelen elektrotlar seçin ve onları (şekil 2B); atamak için yapıları panelinde karşılık gelen basma düğmesi'ı tıklatın Her yatırım Getirisi için bu adımı yineleyin.
- Kaydet düğmesine basın: yazılım seçili elektrotlar ve ROIs bildirdiği bir tabloyu içeren #EXP_LabelledElectrodes adında bir sonuç klasör oluşturur.
13. kayıt ve elektrik modülasyon Epileptiform aktivite
- 5-10 dk önce kayıt için kayıt odası içinde stabilize etmek için beyin dilim izin.
- Uyarıcı birimi en az 10 dk önce kendi kendine kalibrasyon ve stabilization stimülasyon iletişim kuralını etkinleştirin. Uyarıcı kontrol yazılımı başlatmak ve uyarıcı ve MEA amplifikatör doğru uyarıcı kontrol yazılımı ana panelindeki yeşil bir LED gösterildiği gibi bağlı olduğunuzdan emin olun. Lütfen özel aletler ve yazılım Malzemeler tablo bkz. ek ayrıntılar için kılavuzlarına bakın.
- İki kutuplu yapılandırma stimülasyon ayarlayın. Komut dosyası mapMEA ile (bkz. Bölüm 12) eşlenen olanlar arasında piramit hücre katmanı ile temas elektrot çiftleri CA1/proksimal subiculum (24,25bkz.) seçin. Bir tel seçilen elektrotlar biri negatif tak uyarıcı ve diğer elektrot aynı uyarıcı kanalını olumlu fiş bağlanmak için kullanın. Başka bir tel yere in Stimülatörü amplifikatör toprağa bağlamak için kullanın.
- Kayıt yazılımıyla başlayın. Veri almak için kayıt yazılımı ana bölmedeki PLAY düğmesine basın. Kayıt en az 4 ictal deşarj.
Not: 2 kHz örnekleme sıklığı sabit disk alanı kullanımını en aza indirerek alan potansiyelleri ile adil kararlılık elde sağlar. 5-dak kayıt dosyası ~ 80 MB alır. Daha yüksek örnekleme frekansları-ebilmek var olmak gerekli, örneğin, kayıt uyarıcı eserler veya çoklu birim faaliyet. Alan potansiyelleri sadece izlemeye, çoklu birim faaliyet kesmek için 300 Hz'de canlı bir alçak geçiren Filtre kullanın. - Uyarıcı yoğunluğunu belirlemek.
- Uyarıcı kontrol yazılımı ana panoyu 100 µs/faz darbe süresi geçerli kare bifazik pozitif-negatif tasarlamak için kullanın.
Not: dikkat! Doğru akım stimülasyon ekipman zarar görmesini önlemek için dengeli şarj nabzı gerektirir. - En iyi uyarıcı yoğunluğunu belirlemek için hızlı bir giriş/çıkış (g/ç) testi çalıştırın. Adımda 13.5.1 0.2 Hz veya daha düşük, 5 arası nabız aralığı ekleme tarafından tasarlanmış stimülasyon darbe teslim s veya uyarıcı kontrol yazılımı uygun şeklinde daha uzun. 100 µA/faz bir ilk darbe genlik darbe genlik sekmesine ve stimülasyon güvenilir parahipokampal cortices interictal benzeri olaylarda uyandırmak kadar 50-100 µA adımları her duruşmada artırmak (tarafından görüntülenmiştir sinyalleri kontrol kayıt yazılımı).
- Uyarıcı kontrol yazılımı ana panoyu 100 µs/faz darbe süresi geçerli kare bifazik pozitif-negatif tasarlamak için kullanın.
- Limbik ictogenesis elektrik modülasyon
- Program ilgi stimülasyon Protokolü sunmak için uyarıcı birim. I/O test sırasında tespit uyarıcı genlik kullanın.
Not: Uyarılmış yanıtların başarısızlık oranı ≤20% olmalıdır. - Stimülasyon durur sonra ağ kurtarma öncesi uyarıcı koşul için en az 4 ictal deşarj (aynı derecede içinde adım 13,4) kaydederek doğrulayın.
Representative Results
6 x 10 düzen ve 500 µm elektrot aralığı düzlemsel ölçü olan beyin dilim bütünüyle boyunca onların kayıt alana yayılan bu yana burada, açıklanan deneysel protokol için ideal kayıt cihazı (şekil 3A, ayrıca17bakınız). Delikli bana (pMEAs) doku oksijenasyonu geliştirmek için tercih olsa kendi kayıt alanı çok küçük (~ 2 mm çapında). Bu, Hipokampus ve parahipokampal cortices tarafından üretilen elektrik sinyalleri eş zamanlı görselleştirme izin vermez (veri gösterilmemiştir;18' e bakın).
Gözlenen 4AP uyarılan epileptiform desen (şekil 3A) sadakatle ne genellikle geleneksel alan potansiyel kaydı kullanarak bu vitro modelde gözlenen ve etkinlik7, üç tür oluşur üretir 26: (ı) ictal benzeri olaylar (şekil 3B, ok uçları) vardır sağlam uzun süreli (> 20 s, aralığı: 20-60 s) nöbet aktivitesi tonik ve klonik bileşenleri (şekil 3 c); electrographic özelliklerini benzeyen olaylar Onlar her 3-5 dk içinde parahipokampal cortices oluşturulan ve Hipokampal oluşumu dentat gyrus (3D şekil, ok); aracılığıyla yeniden girin (II) yavaş interictal benzeri deşarj (şekil 3B, EC izleme, siyah bar; genişletilmiş içinde şekil 3E) kısa (< 1 s) ubiquitously Hipokampus-EC beyin dilim hazırlık içinde ictal olaylar arasında oluşturulan nüfus olayları ve yavaş bir hızda (aralığı 10-30 s); meydana (III) hızlıinterictal benzeri deşarj (şekil 3B, CA3 izleme, siyah bar; şekil 3Eiçinde genişletilmiş) yinelenen kısa vardır (< 1 s) tarafından Hipokampal Altalan CA3; oluşturulan nüfus olayları Schaffer de¤erler korunur interictal olaylar hızlı CA3 tahrik Hipokampal döngü yaymak ve uygulamak bir anti-ictogenic etkisi24 (veri) gösterilmez; ictal etkinliği önlemek için Özet açıklanan protokol amacıyla CA3 çıktı (bkz. şekil 3B, E) bozulur. Bu ölçü kullanarak kaydedilen hızlı CA3 tahrik interictal etkinlik daha yavaş bir hızda oluşur dikkat edilmesi gereken (~ 0.4 Hz) ne cam Pipetler ile kayıt geleneksel alan potansiyeli kullanarak görülmektedir daha (~ 1 Hz, aralığı: 0.5 - 2.0 Hz, veri gösterilmez).
Belirli nöronal yolları27 hazırlık24' te dahil bölgeleri arasında iç bağlantısı ile birlikte aktivasyonu kemirgen beyin dilimleri içinde elektrik neuromodulation, başarılı sonucunu bağlıdır. Yetişkin erkek Sprague-Dawley sıçanlarından emir elde dilimleri test ettik ve sıçan beyin dilimleri boyut, kalınlık ve iç bağlantı arasında en iyi ticaret-off teklif yerine CD1 fareler ve biz o fare bulduk. İlk olarak, kendi küçük boyutu sayesinde Onlar piyasada bulunan ölçü küçük kayıt alanı daha iyi uyum (şekil 4A, sol: fare, doğru: fare); İkinci olarak, onlar daha esnek MEA (bkz. giriş) kayıt için içsel dezavantajlı durumu için: her ne kadar ictal benzeri deşarj bu iki doku (şekil 4B) tarafından oluşturulan benzer süresi vardır ()Şekil 4 c sol), olay onların hızı önemli ölçüde fare beyin dilimler halinde kısadır (n = 10 dilim türler; 2 kuyruklu unpaired t-Testi, p < 0,001; Şekil 4 c sağ). İkinci hız-beyin dilimleri daha fazla sayıda tek bir deneysel gün boyunca test edinerek deneysel protokoller up sağlar: Bu temsilci sonuç kümesi için iki tür beyin dilimleri benzer bir dizi test edebilir (fare: n = 58; fare: n 52 =), ama fare sayısı (n = 18) 2'ye katlanmış fareler sayısından daha küçük oldu (n = 42).
Ayrıca, fare beyin dilimleri ile yoğun bağlantı sunmak için görünür ve bu nedenle sürekli elektrik neuromodulation (şekil 4 d) daha iyi tepki olasılığı daha yüksektir. Böylece, ictogenesis bu vitro modelde, canlılık için elektriksel stimülasyon ictal aktivite kontrol amaçlı sıçan beyin dokusu için fare için önemli ölçüde daha büyük olmasıdır. Bu açıdan da stimülasyon deneyler bile birkaç sürekli stimülasyon protokol ()şekil 4Etakip zaman fareyle sıçan beyin dilimleri karşı gerçekleştirilen önemli ölçüde daha yüksek başarı oranını tarafından yansıtılır). Aslında, fare beyin dokusu daha iyi test edilmiş deneysel zaman çerçevesinde-4 h (şekil 4F) olarak daha yüksek sağkalım oranı tarafından önerilen sürekli elektrik stimülasyonu dayanacak şekilde görünüyor. Böylece, daha küçük boyutu ile birlikte iç bağlantı daha iyi korunması fare beyin dilimleri MEA parahipokampal Hipokampal ağ etkileşimleri eğitim amaçlı kayıt yapmak ve değerlendirmek için en iyi aday elektrik yapar TLE için uygun olan neuromodulation iletişim kuralları.
Periyodik CA1/subiculum teslim pacing limbik ictogenesis ' deki 4AP tedavi Hipokampus-EC dilim hazırlık24,25,27, 1 Hz olarak en etkili frekans27ile kontrol etmek için bilinir. Bu nedenle de (örneğin bkz:25) etkinlik ve verimliliğini diğer neuromodulation ilkeleri değerlendirmek için olumlu bir denetim olarak yararlıdır. Yukarıda belirtildiği gibi elektrik darbeleri MEA (Yani, harici bir uyarıcı elektrot, gerek kalmadan) aracılığıyla doğrudan teslim nüfus yanıt kemirgen beyin dokusunda uyandırmak (Ayrıca bkz:28). Yeterli koruma nöronal ağ bağlantısı beyin dilim içinde beyin dilimin üstüne MEA ve uyarıcı elektrot çiftleri uygun seçimi doğru konumlandırma izin takip elektrik neuromodulation deneyleri etkili bir şekilde kontrol ictogenesis. Şekil 5A' gösterildiği gibi kurallı 1 Hz düzlemsel bana bir kayıt olarak ve elektrik stimülasyon etkisini boyunca görüntülenmeyecektir yararı ile uyarıcı bir aygıt olarak iletişim kuralı'nı pacing periyodik çoğaltmak mümkündür beyin dokusu bölümü eşit aralıklı gözlem noktaları geleneksel alan potansiyel kaydı ile karşılaştırıldığında daha yüksek bir sayı ile. Şekil 5B gösterir n için elde edilen sonuçları miktar toplam saat (Toplam ictal etkinlik süresi/gözlem zaman25) stimülasyon sırasında ele geçirmek önemli bir azalma gösteren 9 beyin dilimleri = (bir yol-ANOVA, F(df): 6.84(2), p < korumalı 0,01, Fisher'ın LSD testi, post hoc ). Sonuçları dış uyarıcı elektrotlar24,25için edebiyat ile uyumludur.
Zaman içinde gözlem zaman ele geçirmek toplam ictal olaylar arasındaki süreyi bağlıdır ve ayrıca stimülasyon protokolü en az süresi belirler hesaplamak için güvenle neuromodulation etkilerini değerlendirmek için gerekli. Kayıt en az 4 ictal deşarj (ve bu nedenle en az 3 aralıkları ictal olaylar arasındaki) toplanan örnekleri ve gerekli toplama zamanı arasında iyi bir denge olduğunu bulmak. Denetim (Yani, hiçbir uyarı), gözlem zaman ilk ölçülen ictal olayın başlangıcı ve sona erdirilmesi sonuncusu arasında gecikme durumdadır. Pertürbasyon sistemdeki tanıtıldı süre boyunca meydana gelen olayları ölçmek için ölçüm amacı bu yana neuromodulation sırasında uyarıcı Protokolü süre gözlem zaman eşittir. Bilgi işlem ve saat yerine süresi ve aralığı ictal olayların ele geçirmek toplam karşılaştırma türü II hata önlemek için en uygun parametresidir. Aslında, ictal etkinlik tam bastırılması ile birlikte, sadece bir ictal olay çeşitli etkinlikler aksine elektriksel stimülasyon sırasında oluşturulan denetim durumda gözlenen olanağı da sağlar. Olaylar arasındaki süreyi ölçmek mümkün değil ise, bu durumda, bir Tahmincisi stimülasyon etkinliğinin olarak ictal süre ölçme neuromodulation (Yani, ictal etkinlik Redüksiyon), gerçek sonucunu temsil etmiyor.
Genel olarak, sonuçları burada sunulan fare beyin dilimler için ölçü birleştiğinde epilepsi araştırma ve DBS alan epilepsi tedavisi için ilerlemek ilgili güvenilir neuromodulation çalışmalar gerçekleştirmek için değerli araçlar olduğunu gösteriyor. Ayrıca, burada açıklanan protokol beyin dilim canlılığı artırır ve, örneğin, farklı elektriksel stimülasyon etkileri karşılaştırmak üzere gerekli olabilecek birkaç saat (şekil 6), deneysel oturumları takip sağlar paradigmalar.
Şekil 3 : Tipik 4AP uyarılan epileptiform desen ile düzlemsel ölçü birimi görselleştirildiği (A)fare beyin bir düzlemsel 6 x 10 MEA üzerinde konumlandırılmış dilim (elektrot aralığı: 500 µm) ve yan yana MEA kayıt ile görselleştirildiği 4AP uyarılan epileptiform desen genel bakış. Kılavuzdaki her kareye karşılık gelen yeri beyin dilim içinde kaydedilen etkinliği barındırır. Kesik mavi çizgilerle elektrot satır daha fazla netlik için başvurun. Kayıt elektrot sayısı her bir kare sol üst köşesinde mavi tanımlanır. Kare çarpı işareti gri referans elektrot temsil eder. (B) temsilcisi izleme kesimi EC ve CA3 desen daha hızlı bir zaman ölçeğinde görüntülenir. Ok uçları ictal olaylar gösterir. EC izlemesinde yavaş geçtiği için teşekkür ederiz mümkündür interictal deşarj (CA3 alt alan tipik sürekli fastinterictal desen (siyah bar) oluşturur, ancak siyah bar),. (C) ictal bir akıntı tipik Tonik-klonik desen gösterilen kayıt genişletti. (D) hızlı ölçekli görselleştirme EC (kırmızı) ve CA3 (siyah) izleme kesimleri için karşılık gelen ön-ictal-için-ictal geçiş işaretli (b) kırmızı çubukla. Ok ictal deşarj başlangıcından gösterir. Üst üste izleri ictal olay EC içinde kaynaklanan ve daha sonra CA3 alt alan yayar vurgulayın. (E) siyah çubuklar (b) işaretli interictal dönem genişletilmiş görünümü vurgular arasında yavaş bağlantı eksikliği ve fastinterictal modelleri sırasıyla EC (kırmızı) ve CA3 (siyah), tarafından üretilen. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Fare beyin dilimleri teklif sıçan beyin dilimleri daha yüksek bir deneysel çıktı. (A)beyin dilim bir fare (solda) ve eşleşen yaştan bir fare (sağda). Sıçan beyin dilim kadar MEA kayıt alanından daha büyüktür ve elektrik faaliyetine tam olarak görüntülenir. (B) fare ve sıçan korteks enthorinal (EC) tarafından oluşturulan Nükseden ictal etkinliğini doğrudan görsel karşılaştırma. (C) Fare ve sıçan beyin dilimleri benzer süresinin ictal deşarj oluşturur, ancak bu olaylar arasındaki süreyi neredeyse logosuna 2 kat içinde sıçan beyin dokudur. * p < 0,05. Beyin dilimleri elektriksel stimülasyon deneyler için geçerli logosuna 2 kat daha yüksek bir verim ictogenesis kontrol amaçlı (sıçanlar, fareler karşılaştırıldığındaD) sunuyoruz. Subiculum elektrik stimülasyon nüfus parahipokampal cortices sadece 20 58 (% 34) sıçan beyin dilimleri, 33 52 (% 63) karşı fare beyin dilimleri içinde yanıt-e doğru anımsatmak (Chi2: 9.22; p = 0,002). p < 0,05. (E) uygun dilimleri arasında ictal aktivite kontrol başarı oranı logosuna 2 kat sıçan beyin dilimleri karşı fare ile (fare: 33 beyin dilimleri, %60 20: fare: 6 20 beyin dilimleri, % 30; Chi2: 4,67; p = 0,03). p < 0,05. (F) fare beyin dilimleri dayanabilir sürekli elektrik stimülasyon (gri gölgeli alanlarda) uzun süreli dönemini tekrar. Sıçan beyin doku canlılık 3 h. önemli ölçüde düşer ise uyarıcı çekilmesi fare beyin dokusu epileptiform desenin tam kurtarma sergileyen Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : Bir beyin dilimleri kullanarak ictogenesis elektrik modülasyon temsilcisi deney birleştiğinde ölçü birimi için (A)kayıtları 4AP kaynaklı ictal faaliyete EC ve PC Denetim koşulu (hiçbir stimülasyon), (s) 1 Hz pacing periyodik sırasında (uyarıcı artifakı kısaltılır) ve uyarıcı çekilmesi üzerine kurtarma sırasında. (B) s 1 Hz değerinde etkisi zaman ele geçirmek toplam miktar. p < 0,05. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6 : İctal faaliyet 4AP kaynaklı temsilcisi uzun süreli kayıt. (A)izleme kesimleri yordamı Dilimleme beyin sonra kaydedilen 8 h ve 4AP uygulamasının aşağıdaki 2 h. (B) geniş kesimleri (bir) show uzun süreli gözlem zaman dul boyunca oluşturulan ictal faaliyet tutarlılığını harfler bir, bve c panelinde tanımlanan kutulu ictal deşarj karşılık gelen izleme. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Stok A | Kimyasal | Molekül ağırlığı | Konsantrasyonu (mM) |
| NaCl | 58.44 | 1150 | |
| Solvent: distile su | KCl | 74.55 | 20 |
| Konsantre: 10 x | KH2PO4 | 136.1 | 12,5 |
| Depolama Sıcaklığı: 4 ° C | CaCl2* 2 H2O | 147.02 | 20 |
| Maksimum saklama süresi: 1 wk | D-glikoz | 180.2 | 250 |
| Not: bir 50 mm membran filtre kullanarak filtre uygulama | |||
| Stok B | Kimyasal | Molekül ağırlığı | Konsantrasyonu (mM) |
| NaHCO3 | 84.01 | 260 | |
| Solvent: distile su | |||
| Konsantre: 10 x | |||
| Depolama Sıcaklığı: 4 ° C | |||
| Maksimum saklama süresi: 1 wk | |||
| Not: bir 50 mm membran filtre kullanarak filtre uygulama | |||
| Hisse senedi C | Kimyasal | Molekül ağırlığı | Konsantrasyonu (mM) |
| KCl | 74.55 | 20 | |
| Solvent: distile su | KH2PO4 | 136.1 | 12,5 |
| Konsantre: 10 x | MgCl2* 6 H2O | 203.3 | 50 |
| Depolama Sıcaklığı: 4 ° C | MgSO4* 6 H2O | 246.47 | 20 |
| Maksimum saklama süresi: 2 hafta | CaCl2* 2 H2O | 147.02 | 5 |
| Not: bir 50 mm membran filtre kullanarak filtre uygulama | |||
| Hisse senedi M | Kimyasal | Molekül ağırlığı | Konsantrasyonu (mM) |
| MgSO4* 6 H2O | 246.47 | 100 | |
| Solvent: distile su | |||
| Konsantre: 100 x | |||
| Depolama Sıcaklığı: 4 ° C | |||
| Maksimum saklama süresi: 4 wks | |||
| 4AP hisse senedi | Kimyasal | Molekül ağırlığı | Konsantrasyonu (mM) |
| 4-aminopyridine | 94.11 | 250 | |
| Solvent: distile su | |||
| Konsantre: 1000 x | |||
| Depolama Sıcaklığı: 4 ° C | |||
| Maksimum saklama süresi: 2 hafta | |||
| Not: 2-3 dk ya da stirr için 30-60 dk için girdap | |||
| Not: dikkat! 4-AP toksik ve cinvulsant olduğunu. Yayma veya dökülmesini önlemek ve eldiven kullanın. | |||
Tablo 1: Hisse senedi çözümleri.
| ACSF HOLDING | KAYIT ACSF | KESME ACSF | |||||
| Kimyasal | C [mM] | Kimyasal | C [mM] | Kimyasal | C [mM] | ||
| NaCl | 115 | NaCl | 115 | Sükroz | 208 | ||
| KCl | 2 | KCl | 2 | KCl | 2 | ||
| KH2PO4 | 1,25 | KH2PO4 | 1,25 | KH2PO4 | 1,25 | ||
| MgSO4 | 1.3 | MgSO4 | 1 | MgCl2 | 5 | ||
| CaCl2 | 2 | CaCl2 | 2 | MgSO4 | 2 | ||
| D-glikoz | 25 | D-glikoz | 25 | CaCl2 | 0,5 | ||
| NaHCO3 | 26 | NaHCO3 | 26 | D-glikoz | 10 | ||
| L-askorbik asit | 1 | L-askorbik asit | 1 | NaHCO3 | 26 | ||
| L-askorbik asit | 1 | ||||||
| pH | 7.4 | pH | 7.4 | Pirüvik asit | 3 | ||
| Osmolalite | 300 mOsm/Kg | Osmolalite | 300 mOsm/Kg | ||||
| pH | 7.4 | ||||||
| Osmolalite | 300 mOsm/Kg | ||||||
Tablo 2: Çözümleri kompozisyon.
| Sorun giderme | |||||
| SORUNU | KARŞI ÖNLEMLER | ||||
| 'Yığını' ictal deşarj bak | Perfüzyon oranı azaltmak ve/veya ACSF birimin beyin dilim üzerinde emme iğne pozisyon ayarlayarak daha düşük. | ||||
| İctal aktivite | Hızlı interictal olaylar CA3 tahrik korteks için yaymak değil (1) doğrulayın. Bir küçük neşter bıçak (örneğin, n.10) kullanın veya eğer Schaffer de¤erler sever için bir iğne olabilir ama dilim hold-down çapa naylon konuları kesmemeye dikkat. Stereo veya dik mikroskop en uygun ise ters mikroskop bu görevi çok zor yapar. | ||||
| (2) dilim canlılığı kontrol: güçlü elektriksel stimülasyon ictal aktivite tetikleyebilir mi? 4AP uygulama yaklaşık 2 saat kadar bekleyin, sonra ictal etkinlik meydana gelmez beyin dilim değiştirin. | |||||
| Beyin dilim hold-down çapa yerleştirirken taşır | (1) yavaşça dilim çapa kaldırmak ve beyin dilim yeniden konumlandırmak. | ||||
| (2) dilim çapa eşit olarak 4AP-ACSF ıslak olduğunu denetleyin. | |||||
| (3) 4AP-ACSF beyin dilim yapışma MEA için iyilik için kayıt odası kaldırın. | |||||
| (4) dilim hold-down çapa konumunu değiştirin. | |||||
| Transfer sonra beyin dilim MEA yonga üzerinde yüzen | (1) hafifçe Pasteur pipet ile aşırı ACSF Aspire edin. | ||||
| (2) MEA çip yeniden kaplanmış olması gerekebilir. | |||||
| Elektriksel stimülasyon ağ yanıt temin etmez | Uyarıcı yoğunluk artmak, elektrot çiftleri değiştirin. | ||||
| Elektriksel stimülasyon proksimal ama değil distal kortikal alanlarda nüfus yanıt-e doğru çıkarmak | Zavallı bağlantısının kesilmiş olması veya çok düşük uyarıcı yoğunluğu nedeniyle ikely konudur. Elektriksel stimülasyon bazı kortikal alanlarda sadece etkisiz ya da etkili olabilir. Bu beyin dilim değiştirmek için tavsiye edilir. | ||||
| Sinyal gürültü | (1) referans elektrot kontrol edin: gürültülü temel zaman zaman neden olabilir tarafından giriş baraj gölünün dolgu eksik değil tamamen derin ACSF referans elektrotlar yapar böyle. | ||||
| (2) genel topraklama donanımları kontrol edin. | |||||
| (3) ayarlama emme iğne pozisyonu sabit, yumuşak emme sesi duymak için. Zemin emme iğne. | |||||
| (4) MEA dış kişiler bir pamuklu çubukla kullanarak etanol ile temizleyin. | |||||
| (5) MEA çip hasar olabilir: MEA çip değiştirmek ve eserler ve sinyal-gürültü oranı kontrol edin. | |||||
Tablo 3: sorun giderme.
Discussion
Guinan nörofizyoloji araştırmalar için çok değerli bir araçtır ve olgunluk onlarca yıllık araştırma ve geliştirme sayesinde son yıllarda ulaştı. Geleneksel alan potansiyel kaydı ile karşılaştırıldığında, bana doğru nöronal ağ etkileşimleri kesin olarak belirlemek çok önemli gözlem noktaları ve bilinen arası elektrot mesafe, daha yüksek bir sayı en büyük avantajı sunar.
MEA kayıt tekniği de tek nöron ve nöronal ağ etkinliği arasındaki ilişkiyi araştırmak için yama-kelepçe kayıt15gibi diğer Elektrofizyoloji yaklaşımlara birleştiğinde olabilir. Ayrıca, alan potansiyelleri ve çoklu birim faaliyet aynı anda görüntülenmesi olanağı değerli küçük nöronal topluluklar etkinliklerini ve toplu nöronal ağlar arasındaki korelasyon kazandırabileceğini. Voltaj duyarlı boyalar, kalsiyum görüntüleme ve optogenetics29 ile birlikte yüzlü yaklaşımları kullanarak nörofizyoloji olayları çıkarım sağlar. Farmakolojik çalışmalar yanı sıra, kayıt ve stimülasyon aynı sistem ile gerçekleştirme imkanı MEA kayıt tekniği çok güçlü ve çok yönlü yapar: Örneğin, sinaptik plastisite olayları incelemek mümkündür epilepsi ve çok çeşitli beyin bozukluklarının tedavisi için DBS ilgili çekirdek bellek oluşumu30burada anlatılan neuromodulation protokolleri kullanarak. Epilepsi araştırma, altta yatan bu yıkıcı hastalık temel mekanizmaları anlamak için her ikisi de çok değerli onun usefulness MEA kayıt tekniği başarıyla insan epileptik beyin doku16 için uygulanabilir son kanıtı gösterir ve bunu iyileştirmek için DBS algoritmaları ince ayar yapmak için.
Ancak, beni takip Elektrofizyoloji deneyler, bir batık kayıt odasının gereksinimi ve beyin icar gerekliliği nedeniyle beyin dilimleri için 'limit' koşullarda gücü geri kalanı üzerinde katı substrat dilim nereye mikro elektrot entegre edilmiştir. Böylece, beyin dokusu sırayla kayıtları kalitesini etkileyebilir yeterli oksijen kaynağı alamayabilir.
Burada açıklanan iletişim kuralı güvenilir bir şekilde kayıt ve ictogenesis akut tüp bebek 4AP modelini kullanarak Guinan birleştiğinde kemirgen limbik ağlarında çalışma ve değerlendirme için ilgili bilgi sağlayan uzun süreli dönemini elektrik stimülasyon, devam etmek izin verir DBS politikaları.
Önceki çalışmalarda epileptik limbik ağların geleneksel alan potansiyel kaydı kullan seçeneğine göre elektrik neuromodulation üzerinde fare ya da sıçan beyin dilimleri ile benzer sonuçlar24,25kullandık; ama sıçan beyin doku kullanımı daha, makul fareler7' den elde edilen beyin dokusu ile karşılaştırıldığında daha zayıf bağlantısı nedeniyle zor oldu. MEA tekniği ile ilgili olarak, fare beyin dilimler onların daha küçük boyutu sayesinde en uygun olur. Ayrıca, ictal benzeri deşarj oluşumunu daha yüksek oranda sıçan beyin dokusu ile Mouse göz önüne alındığında, bu önemli ölçüde daha fazla beyin dilimleri sırayla veri toplama daha hızlı ve daha verimli yapar, bir deneysel gün boyunca test etmek ve olabilir mümkündür kullanılan hayvan sayısını azaltın.
Önemi ile ilgili mevcut yöntemler:
Burada açıklanan özel odası kullanarak kaydedilen ictal deşarj süresi ve bu geleneksel MEA halka odası ve aynı MEA türünü (düzlemsel mikro-elektrotlar, bkz. 17) kullanarak gözlenen gerçekleşme oranı benzer görünüyor. Ancak, ne zaman nedeniyle geleneksel yuvarlak kayıt odası neuromodulation başarılı peşinde engelleyebilir düşük perfüzyon oranı (1 mL/dk), birlikte kullanarak deneyler beyin dilim kalınlığı önemli ölçüde azaltılmalıdır vurguladı gerekir kötü bağlantı için.
Bu protokol için bir düşük hacimli özel kayıt odası tarafından yama-kelepçe kayıt odası tasarım ilham için MEA kayıtların peşinde başarılı önemlidir istikrarlı ve güvenilir laminar akış sağlar; Ayrıca doku canlılığı ve iç bağlantı arasında adil bir denge elde etmek için beyin dilim kalınlığı 400 µm için artan sağlar. Bu gerçekten de tanınır odası kayıt çözümünüzde o laminar akış sıcaklık, oksijen, etkilenmez ve daire-akışında gözlenen pH degradeler yuvarlak kayıt beri beyin dilim Elektrofizyoloji için son derece arzu edilir Chambers'ı19,20,31 (ticari olarak mevcut MEA ile sağlanan olanlar gibi). Böyle degradeler deneysel önyargı tanıtmak ve aynı zamanda beyin dilim için zararlıdır. Nispeten küçük hacimli (~1.5 mL) ile birlikte bir yüksek perfüzyon oranı (5-6 mL/dk)16,31 kayıt odaları perfüzyon orta yeterli alışverişi için izin (≥3 kez / dk). Özel odası-ebilmek var olmak kolayca uygun bir fiyata ticari kaynaklardan elde edilen veya şirket içinde 3D baskı teknolojisi kullanılarak üretilen. Diğer çalışmalar MEA kayıtları konvansiyonel MEA halka odası ACSF birim için 1 mL tutmak ve bir yüksek perfüzyon oranı (5-6 mL/dk) zorlamayı kullanarak 400 µm kalınlığında insan beyni dilimleri16 düşük gürültü Peristaltik pompa yardımı ile bildirdin. Ancak, yazarlar daha az önemli artışlar ekstraselüler K+ konsantrasyon içeren ephaptic mekanizmaları daha 4AP modeli etkisinde olası olan ictogenesis, Yani, düşük Mg2 +, farklı bir model kullanmış 11 , 22. bir yüksek perfüzyon oranı 4AP modelinde, büyük olasılıkla kayıt ACSF16önemli ölçüde artırılması gerekebilir birikmiş ekstraselüler K+, hızlı yıkama nedeniyle arzu değil bulduk. Oysa tam gelişmiş deşarj sağlam Tonik-klonik bileşenleri sergilenmesi döndüğünde geri aslında, ictal olaylar ASCF perfüzyon hız 2-3 mL/dk için yükseltilmiştir ve beyin dilim kalın bir ACSF tabaka tarafından batık daha 'yığın halinde' ortaya çıktı Katman doku yüzey (veri gösterilmez) sağda daha düşük bir perfüzyon oranı (1 mL/dak) ve ince bir ACSF. Bu protokol için açıklanan özel kayıt odası perfüzyon orta 3 - 5 kez alışverişi sağlar / dk 1 mL/dk akış hızında. Böylece, genel oksijen beyin dilimlere şiddetle hala istikrarlı bir sıcaklık ve yüksek sinyal gürültü oranı kayıt garanti ederken bile nispeten düşük perfüzyon oranlarda artırıldı. En önemlisi, fizyolojik bir değere ekstraselüler K+ konsantrasyonu tutmak mümkündür.
İctogenesis 4AP model ACSF iyonik kompozisyon, düşürücü Mg2 + veya artan K+, gibi herhangi bir önemli değişiklik gerektirmez ve eksitatör ve inhibitör yayınlar olduğu gibi tutmak benzersiz avantajı sunuyor 12, glutamatergic ve GABAergic epileptiform eşitleme (bkz. 7) ağlarında çok önemli rolü ışığında epilepsi araştırma son derece alakalı bir yönü. Bu protokol için kullanılan 4AP ACSF fizyolojik bir K+ konsantrasyonu (3.25 mM) ve biraz daha düşük bir Mg2 + konsantrasyon holding ACSF (1.3 mM karşı 1 mM) daha içerir. Bu konsantrasyon hala Mg2 + konsantrasyonunun kemirgen CSF bildirilen fizyolojik değerleri içinde düşer ve (örneğin bkz:17,18) birçok laboratuvarlarda kullanılır. Açıklanan Protokolü amaç için bulduk Bu hafif düşüş etkisini 4AP yardım etmek için tercih edilmektedir.
Ne zaman zaten içinde kayıt odası17,18yerleştirildi önceki çalışmalarda, 4AP beyin dilime uygulanmıştır. Deneyci 4AP uygulama ve epileptiform desenleri başlangıcı arasındaki zaman gecikme süresi gözlemlemek gereken sürece, biz bu yaklaşım oldukça zaman alıcı ve uzun süreli kayıt ve stimülasyon oturumları takip etmek uygun değil bulmak Bu protokol için nitelendirdi. Beyin dilimler halinde 4AP 32 ° c ön kuluçka beyin dilimleri diğer doku bölümlerde kullanarak deneme takip serisi önceden tedavi olabilir bu yana çok deneysel zaman, tutumlu sağlar.
Beyin dilimleri uzun süreli canlılığı ağ özellikleri vadede analiz etmek yararlı olabilir. Ayrıca, tekrarlanan elektrik stimülasyonu için onların Gelişmiş esneklik büyük avantajı ise deneyci aynı beyin dilim istatistiksel sağlamlık için gerçekleştirilmesi gereken birkaç stimulasyon protokolleri karşılaştırmak istiyor. Bizim ellerde 3 stimulasyon protokolleri sınarken, her bir denetim aşaması öncesinde ve bir kurtarma aşaması gelir, deney 3-5 h sürebilir. Bu bağlamda, canlı MEA eşleme doğru yolu etkinleştirmek ve bastırmak yerine ictogenesis elektriksel stimülasyon ile iyilik için önemlidir. Bizim kullanıcı dostu GUI elektrotlar farklı beyin yapıları eşlemek için hızlı, basit ve esnek bir araç temsil eder. Ticari yazılım aksine, özel MEA düzenler bile temel programlama becerileri ile eklemek mümkündür. Görüntüleri parlak alanında elde edilebilir; Böylece, iyi bir çözünürlük ve bir mikroskobunun uyan herhangi bir genel amaçlı kamera uygundur. Ters bir mikroskop ondan beri bunlar doku altında dik bir mikroskop kullanarak gizlenmiş olabilir microelectrodes konumuna göreli olarak beyin dilim görselleştirmek için esastır. Ancak, bir stereo mikroskop ters türünün yanı sıra deneyci belirli nöronal yolları bozmaya bıçak-keser gerçekleştirmek için gereksinim duyduğu önerilir.
Son olarak, önerilen yaklaşım daha fazla avantajı özel kayıt odası ve holding Odaları, sıcak banyo ve dilim çapa yanı sıra bir pahalı gereksiz kullanımı gibi gerekli araçlarının çoğu ucuz ve nispeten kolay montaj olduğunu düşük gürültü Peristaltik pompa.
Teknik sınırlamaları:
MEA kayda çok yavaş dalgalar, Yanigörselleştirme izin vermiyor, DC sinyal kaydırır. Bu tür temel deplasmanlar asimptotik ictal deşarj süresi ölçümü yardımcı olabilir ve en önemlisi, onlar kortikal yayılan depresyon (epilepsi32 ani beklenmedik ölümü ile ilgilidir ve paylaşılan bir fenomen incelemek için temel epilepsi ve Migren33arasında).
Elektrik neuromodulation ile ilgili olarak, burada açıklanan protokol beyin dilim canlılığı etkilemeden birçok stimülasyon oturumu performans sağlar. İlâ 3 stimülasyon seans 20-45 dk, önceki çalışma25' ne rapor edilir benzer başarılı bir şekilde gerçekleştirebilir. Beyin dilimleri muhtemelen daha yüksek sayıda stimülasyon oturumları veya daha uzun stimulasyon protokolleri dayanmak rağmen biz beyin dilimleri bu konuda did değil sınav. Stimülasyon Protokolü 3 sayısını sınırlayacak ve Önleme kurtarma uyarıcı çekilmesi üzerine eksikliği kadar bu sınır koşullar altında tutulan beyin dokusunun önemli ölçüde stres (≥60 min) stimülasyon oturumları uzun süreli tavsiye ediyoruz.
Protokol içindeki kritik adımlar:
Çeşitli kritik faktörler kayıt başarılı peşinde ve modülasyon MEA için birleştiğinde beyin dilimleri epileptiform aktivite engelleyebilir. Yanı sıra kullanılan kemirgen türler ve beyin dilimleri, kayıt sırasında perfüzyon oranı kalitesini ve ACSF akış dinamikleri (i.e., Laminer daire karşı) kayıt odası içinde bu kurtarma şartları bulduk ve beyin dilimleri uzun vadeli bakım yanı sıra 4AP uygulama modu en önemli adım vardır.
Bir batık holding odası kullanırken beyin dilimleri beyin doku ağ etkinliğini korumak ve ictal benzeri deşarj indüksiyon 4AP uygulama tarafından lehine oda sıcaklığında saklamak çok önemlidir. Bizim ellerimizde kurtarma ve bakım 32 ° C'de 3-4 h Dilimleme içinde beyin dokusu bozulmuştur.
Kuluçka beynin dilim içinde 4AP-ACSF, oda sıcaklığında ve kayıt 32 ° c olduğunu, ancak, arzu değil. Bu durumda sağlam Nükseden ictal deşarj gözlemleyerek birçok zorlukları bulduk. Gerçekten de, 20-24 ° C aralığında düşük sıcaklıklarda nemlendirin veya bile her iki içinde vitro34 ve in vivo354AP kaynaklı ictogenesis önlemek için rapor edilmiştir. Böylece, 4AP kuluçka ve kayıt sıcaklıklar 30-34 ° C içinde kalan gerekir ve uyumlu olması gerekir. Hyperexcitability aynı anda indüksiyon nedeniyle çok fazla stres altında beyin dokusu 4AP ve beyin dilimleri ani maruz kalma tarafından Oda sıcaklığından sıcak (32 ° C) 4AP-ACSF için koyarak önlemek için bir ara ısınma önceden gerçekleştirmek için esastır adım ve 20-30 dk. bu adımı atlamak için 32 ° C'de holding ACSF de beyin dilimleri alıştırmak izin ictogenesis indüksiyon 4AP tarafından etkileyebilir.
Belirtilmesi gereken bir başka yönü Dilimleme sonra ACSF D-glikoz konsantrasyonu önemlidir. 25 mM konsantrasyon beyin dilimleri birçok laboratuvarlarda kullanılan 10 mM konsantrasyonu daha iyi korur ve ayrıca ictal faaliyetle logosuna 2 kat daha hızlıdır, oluşumunu oranını artırır (böylece, deneysel uzun bir dizi takip kolaylaştırır iletişim kuralları'nda birkaç beyin dilimleri her gün).
Son olarak, bazı önemli ince detaylar Dilimleme işlemi sırasında söylenmesi gerekir. İlk olarak, izin vermez sağlam beyin ve ACSF kesme soğukta donarak beyin dilimleri. Beyin için soğutma < 2 dk yeterli fare beyni küçük boyutlarını düşünürsek. Doku bölümler hemen oda sıcaklığında durulama Şişeler için arabellek tepsiden aktarılmalıdır. Kesme durulama ACSF aksi halde yüksek Sükroz konsantrasyon dilimleri holding odası naylon mesh sopa beyin yapacak çok önemlidir. Etkili bir şekilde doku durulama için holding ACSF aşırı kontamine değil böylece transfer pipet kesme ACSF içeriği en aza indirmek önemlidir. 2 aşamalı durulama kirlenme minimize yardımcı olur. Dilimleme işlemi tamamlandıktan sonra doku bölümler hemen durulama kadehler nerede yumuşak naylon mesh askıya yarı-şekilde ACSF doku oksijenasyonu her iki tarafta sağlar holding holding odasına aktarılmalıdır. Aynı prensip Dilimleme prosedürü izleyerek tüm aşamalarında uygulanması gereken: beyin dilimleri kabı dibinde oturup hiç, holding chambers kenarlarına temas olmaması gerekir ve onlar asla birbirlerine temas halinde olmalıdır ne de üst üste.
Değişiklikler ve sorun giderme:
ACSF kompozisyon deneyci'nın ihtiyaçlarına göre değiştirilebilir. Örneğin, uyuşturucu belirli nörotransmitter veya iyon kanalları için elektrik neuromodulation etkinliğini incelemek için eklenebilir. Her ne kadar biz bir güçlü nöroprotektif rol sarfetmek bulmak Ayrıca, Pirüvik ve askorbik asit (bkz. Tablo 2), atlanabilir. Bu iletişim kuralı ve nasıl onlarla başa çıkmak karşılaşılan en yaygın sorunların Tablo 3 ' te rapor.
Sonuç:
MEA kayıt hiç şüphesiz sağlık ve hastalığında nöronal ağların etkileşimleri yönelik olarak çok değerli bir tekniktir. Farmakolojik çalışmalar yanı sıra, epilepsi ve diğer nörolojik bozukluklar uygulanan DBS alakalı elektrik neuromodulation protokolleri değerlendirmek mümkündür. Bu protokol için biz bu geleneksel hücre dışı alan potansiyel kaydı ile elde edilen benzer sonuçlar ile tipik periyodik stimülasyon deneyler çoğaltmak mümkün ve dış elektrotlar uyarıcı olduğunu göstermiştir. Artan durumu ticari kullanıcı dostu ekipman ve gelişmiş yazılım araçları yapmak MEA kayıt tekniği geçici stimülasyon beyin dokusu ve için sağlamak için kapalı çevrim stimülasyon deneyler için de uygundur geri bildirim mekanizmaları için nöronal ağ yanıt katkısını araştırmak.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
G.P. bir Marie Skłodowska-Curie Avrupa Birliği MSCA-Eğer-2014 proje Re.B.Us, H2020 çerçeve programı kapsamında G.A. n.660689 tarafından finanse edilen biri. GUI mapMEA serbestçe ilaria.colombi@iit.it yazar için istek üzerine mevcuttur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Adrich | P7886 | Needed for MEA coating |
| NaCl | Sigma-Adrich | S9888 | Chemical |
| KCl | Sigma-Adrich | P9541 | Chemical |
| KH2PO4 | Sigma-Adrich | 795488 | Chemical |
| CaCl2*2 H2O | Sigma-Adrich | C3306 | Chemical |
| D-Glucose | Sigma-Adrich | RDD016 | Chemical |
| NaHCO3 | Sigma-Adrich | S5761 | Chemical |
| MgCl2*6 H2O | Sigma-Adrich | M2670 | Chemical |
| MgSO4*6 H2O | Sigma-Adrich | M5921 | Chemical |
| Sucrose | Sigma-Adrich | RDD023 | Chemical |
| Pyruvic Acid, 98% | Sigma-Adrich | 107360 | Chemical |
| 4-aminopyridine | Sigma-Adrich | A78403 | Convulsant drug |
| STG-2004 | Multichannel System | STG4004-1.6mA | 4-channel stimulus generator with voltage (±8 V) and current output (±1.6 mA) |
| MEA1060 | Multichannel System | N/A | MEA amplifier |
| planar MEA | Multichannel System | 60MEA500/30iR-Ti w/o ring | Must be without ring to allow using the custom recordingchamber |
| McRack | Multichannel System | Recording software | |
| McStimulus II | Multichannel System | STG4004 control software | |
| TC02 | Multichannel System | TC02 | 2-channel thermostat |
| PH01 | Multichannel System | PH01 | Heating perfusion canula |
| MPH | Multichannel System | MPH | Magnetic holder for PH01 and suction needle |
| Elastostil E43 | Wacker | E43 | Elastomeric sealant used to mount the custom recording chamber onto the MEA |
| MEA Custom Chamber | Crisel Instrument | SKE-chamber MEA | Custom recording chamber |
| Ag/AgCl electrode, pellet, 1.0 mm | Crisel Instrument | 64-1309 | Reference electrode for the custom recording chamber |
| Tergazyme | Sigma-Adrich | Z273287-1EA | Enzymatic cleaner |
| MATLAB | The Mathworks | Programming environment for electrodemapping | |
| VT1000S | Leica Biosystems | VT1000S | Vibratome |
| Warner Instruments | 64-1309 | Ag-AgCl Electrode Pellet 1.0 mm (E205). Reference electrode. |
References
- Fisher, R. S., et al. Operational classification of seizure types by the International League Against Epilepsy: Position Paper of the ILAE Commission for Classification and Terminology. Epilepsia. 58 (4), 522-530 (2017).
- WHO. Epilepsy Facts Sheet. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs999/en/ (2017).
- Fiest, K. M., Birbeck, G. L., Jacoby, A., Jette, N. Stigma in epilepsy. Curr Neurol Neurosci Rep. 14 (5), 444 (2014).
- Brodie, M. J., Barry, S. J., Bamagous, G. A., Norrie, J. D., Kwan, P. Patterns of treatment response in newly diagnosed epilepsy. Neurology. 78 (20), 1548-1554 (2012).
- Tanriverdi, T., Poulin, N., Olivier, A. Life 12 years after temporal lobe epilepsy surgery: a long-term, prospective clinical study. Seizure. 17 (4), 339-349 (2008).
- Dingledine, R. Brain slices. , Plenum Press. (1984).
- Avoli, M., et al. Network and pharmacological mechanisms leading to epileptiform synchronization in the limbic system in vitro. Prog Neurobiol. 68 (3), 167-207 (2002).
- Rutecki, P. A., Lebeda, F. J., Johnston, D. Epileptiform activity induced by changes in extracellular potassium in hippocampus. J Neurophysiol. 54 (5), 1363-1374 (1985).
- Mody, I., Lambert, J. D., Heinemann, U. Low extracellular magnesium induces epileptiform activity and spreading depression in rat hippocampal slices. J Neurophysiol. 57 (3), 869-888 (1987).
- Huberfeld, G., et al. Glutamatergic pre-ictal discharges emerge at the transition to seizure in human epilepsy. Nat Neurosci. 14 (5), 627-634 (2011).
- Pitkanen, A. Models of seizures and epilepsy. , (2017).
- Rutecki, P. A., Lebeda, F. J., Johnston, D. 4-Aminopyridine produces epileptiform activity in hippocampus and enhances synaptic excitation and inhibition. J Neurophysiol. 57 (6), 1911-1924 (1987).
- Gross, G. W., Rieske, E., Kreutzberg, G. W., Meyer, A. A new fixed-array multi-microelectrode system designed for long-term monitoring of extracellular single unit neuronal activity in vitro. Neurosci Lett. 6 (2-3), 101-105 (1977).
- Pine, J. Recording action potentials from cultured neurons with extracellular microcircuit electrodes. J Neurosci Methods. 2 (1), 19-31 (1980).
- Reinartz, S., Biro, I., Gal, A., Giugliano, M., Marom, S. Synaptic dynamics contribute to long-term single neuron response fluctuations. Front Neural Circuits. 8, 71 (2014).
- Dossi, E., Blauwblomme, T., Nabbout, R., Huberfeld, G., Rouach, N. Multi-electrode array recordings of human epileptic postoperative cortical tissue. J Vis Exp. (92), (2014).
- Boido, D., et al. Cortico-hippocampal hyperexcitability in synapsin I/II/III knockout mice: age-dependency and response to the antiepileptic drug levetiracetam. Neuroscience. 171 (1), 268-283 (2010).
- Gonzalez-Sulser, A., et al. The 4-aminopyridine in vitro epilepsy model analyzed with a perforated multi-electrode array. Neuropharmacology. 60 (7-8), 1142-1153 (2011).
- Hajos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. Eur J Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).
- Ivanov, A., Zilberter, Y. Critical state of energy metabolism in brain slices: the principal role of oxygen delivery and energy substrates in shaping neuronal activity. Front Neuroenergetics. 3, 9 (2011).
- MultichannelSystems. Manual PH01. , Available from: https://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/PH01_Manual.pdf (2018).
- Zhang, M., et al. Propagation of epileptiform activity can be independent of synaptic transmission, gap junctions, or diffusion and is consistent with electrical field transmission. J Neurosci. 34 (4), 1409-1419 (2014).
- Panuccio, G., et al. In vitro ictogenesis and parahippocampal networks in a rodent model of temporal lobe epilepsy. Neurobiol Dis. 39 (3), 372-380 (2010).
- Barbarosie, M., Avoli, M. CA3-driven hippocampal-entorhinal loop controls rather than sustains in vitro limbic seizures. J Neurosci. 17 (23), 9308-9314 (1997).
- Panuccio, G., Guez, A., Vincent, R., Avoli, M., Pineau, J. Adaptive control of epileptiform excitability in an in vitro model of limbic seizures. Exp Neurol. 241, 179-183 (2013).
- Benini, R., Avoli, M. Rat subicular networks gate hippocampal output activity in an in vitro model of limbic seizures. J Physiol. 566 (Pt 3), 885-900 (2005).
- D'Arcangelo, G., Panuccio, G., Tancredi, V., Avoli, M. Repetitive low-frequency stimulation reduces epileptiform synchronization in limbic neuronal networks. Neurobiol Dis. 19 (1-2), 119-128 (2005).
- Steidl, E. M., Neveu, E., Bertrand, D., Buisson, B. The adult rat hippocampal slice revisited with multi-electrode arrays. Brain Res. 1096 (1), 70-84 (2006).
- Pulizzi, R., et al. Brief wide-field photostimuli evoke and modulate oscillatory reverberating activity in cortical networks. Sci Rep. 6, 24701 (2016).
- Liu, M. G., Chen, X. F., He, T., Li, Z., Chen, J. Use of multi-electrode array recordings in studies of network synaptic plasticity in both time and space. Neuroscience Bulletin. 28 (4), 409-422 (2012).
- Maier, N., Morris, G., Johenning, F. W., Schmitz, D. An approach for reliably investigating hippocampal sharp wave-ripples in vitro. PLoS One. 4 (9), e6925 (2009).
- Aiba, I., Noebels, J. L. Spreading depolarization in the brainstem mediates sudden cardiorespiratory arrest in mouse SUDEP models. Sci Transl Med. 7 (282), 282ra246 (2015).
- MA, R., et al. Jasper's Basic Mechanisms of the Epilepsies . Avoli, M., Noebels, J. L., Rogawski, M. A., et al. , 4th, National Center for Biotechnology Information (US). Bethesda (MD). (2012).
- Motamedi, G. K., et al. Termination of epileptiform activity by cooling in rat hippocampal slice epilepsy models. Epilepsy Res. 70 (2-3), 200-210 (2006).
- Yang, X. F., Duffy, D. W., Morley, R. E., Rothman, S. M. Neocortical seizure termination by focal cooling: temperature dependence and automated seizure detection. Epilepsia. 43 (3), 240-245 (2002).
