Vi illustrere, hvordan til at udføre registrering og elektriske graduering af 4-aminopyridine-induceret epileptiform aktivitet i gnavere hjernen skiver ved hjælp af mikroelektrode arrays. En brugerdefineret indtaling kammer fastholder væv levedygtighed i hele længerevarende eksperimentelle sessioner. Live elektrode kortlægning og udvalg af stimulerende par udføres af en brugerdefineret anskuelighed brugergrænseflade.
FLE (TLE) er den mest almindelige delvis komplekse epileptiske syndrom og den mindst lydhøre over for medicin. Deep brain stimulation (DBS) er en lovende tilgang når farmakologisk behandling fejler eller Neurokirurgi anbefales ikke. Akut hjernen skiver koblet til mikroelektrode arrays (MMA) udgør et værdifuldt redskab til at studere neuronal netværk interaktioner og deres graduering ved elektrisk stimulation. I forhold til konventionelle ekstracellulære optagelse teknikker giver de de ekstra fordele ved et større antal observationsområder og kendte Inter elektrode afstand, som giver mulighed for at studere formering sti og hastighed af elektrofysiologiske signaler. Væv iltning kan dog stærkt nedsat under MEA optagelse, der kræver en høj perfusion sats, som kommer på bekostning af nedsat signal / støj-forhold og større svingninger i den eksperimentelle temperatur. Elektrisk stimulation yderligere understreger hjernevæv, hvilket gør det vanskeligt at forfølge langvarig optagelse/stimulation epoker. Endvidere skal elektriske graduering af hjerneaktivitet skive målrette specifikke strukturer/veje i hjernen skive, der kræver, at elektroden kortlægning nemt og hurtigt udføres live under eksperimentet. Her, vi illustrere hvor hen til præstere den optagelse og elektriske graduering af 4-aminopyridine (4AP)-induceret epileptiform aktivitet i gnavere hjernen skiver ved hjælp af planar multilaterale miljøaftaler. Vi viser, at hjernevæv fremstillet af mus udkonkurrerer rotte hjernevæv og er dermed bedre egnet til MEA eksperimenter. Denne protokol garanterer generation og opretholdelsen af en stabil epileptiform mønster, der trofast gengiver den elektrofysiologiske egenskaber observeret med konventionelle felt potentielle optagelse, fortsætter i flere timer, og outlasts vedvarende elektrisk stimulation til langvarig epoker. Væv levedygtighed i hele eksperimentet er opnået takket være brugen af en små-volumen brugerdefineret indtaling afdeling giver mulighed for laminar flow og hurtig løsning exchange selv ved lav (1 mL/min.) perfusion satserne. Hurtig MEA kortlægning for real-time overvågning og udvælgelse af stimulerende elektroder er udført af en brugerdefineret grafiske brugergrænseflade (GUI).
Epilepsi er en liv-truende progressiv lidelse forårsager ukontrollerede aktivitet af hjernen1; det bærer blandt de højeste byrde af sygdom og betydelig social stigmatisering2,3. TLE er den hyppigste syndrom (40%) og mest hyppigt (~ 30%) resistente over for anti-epileptisk medicin4. Mens kirurgisk ablation af det epileptogenic væv kan forbedre patientens tilstand, det er ikke muligt i alle patienter og kan ikke garantere en fuldstændig beslaglæggelse-frit liv5. Graduering af epileptiske limbiske netværk af elektriske DBS er en lovende tilgang når farmakologisk behandling eller Neurokirurgi ikke er egnede.
Gnaver hjernen skiver er et værdifuldt redskab til at studere hvordan neuronal netværk funktion i sundhed og sygdom6 ved hjælp af in vitro- Elektrofysiologi teknikker, som de bevare, i det mindste i en del, den oprindelige arkitektur og tilslutning af hjernen region(er) af interesse (ROI). Især vandrette kombineret hippocampus-entorhinal cortex (hippocampus-EF) skiver omfatter de væsentlige neuronal netværk involveret i TLE og er derfor rutinemæssigt ansat i in vitro- TLE forskning7.
Beslaglæggelse-lignende aktivitet kan være akut induceret i hjernen skiver ved at ændre den ioniske sammensætning af den kunstige cerebrospinalvæske (ACSF), såsom faldende magnesium samtidig øge kalium8,9,10, eller ved hjælp af farmakologiske manipulationer, som blokerer hæmmende GABAergic aktivitet (Se11 for en omfattende revision). Disse modeller er imidlertid baseret på ubalanceret ændring af excitation og hæmning; de tillader således ikke, at studere samspillet og samordnet bidrag af excitatoriske og hæmmende netværk til ictogenesis. Kontinuerlig perfusion af hjerne skiver med konvulsiv drug 4AP forbedrer både excitatoriske og hæmmende neurotransmission, således for at studere akut ictogenesis samtidig med synaptic aktivitet generelt intakt12.
MEAs tillade registrering af den elektriske aktivitet genereret af neuronal netværk fra et større antal observationsområder i forhold til konventionelle ekstracellulære felt potentielle optagelse, hvor rumlige begrænsninger begrænser antallet af elektroder, der kan være indkvarteret på hjernen skive overflade. Desuden MEA chips giver den ekstra fordel af kendte Inter elektrode afstanden, hvilket er meget nyttigt at spore formering og vurdere rejser hastigheden af indspillede signaler. Selvom oprindeligt udtænkt til optagelse fra kulturperler neuroner13,14, er multilaterale miljøaftaler nu også bruges til at karakterisere de elektrofysiologiske egenskaber af akut hjernen skiver fremstillet af gnavere15 og mennesker16. Således, i forbindelse med epilepsi forskning, MEAs repræsenterer et værdifuldt værktøj til at lokalisere neuronal netværk interaktioner kernen af ictogenesis16,17,18.
Dog bærer MEA optagelse i sagens natur tekniske udfordringer i at opnå eller fastholde en stabil epileptiform mønster hele lange (flere timer) eksperimentelle protokoller. Først, væv iltning kan ikke være tilstrækkeligt inden for de store og runde neddykket type optagelse afdeling19,20 typisk af kommercielt tilgængelige miljøaftaler, mens dårlig signal-støj-forholdet og temperatur ustabilitet kan påvirke kvaliteten af optagelsen når en høj perfusion sats (6-10 mL/min.) bruges til at forbedre ilttilførslen til hjernen Skive (Se for eksempel de tekniske bemærkninger på varme og perfusion udstyr21). Andet, tilbagevendende udledninger med høj frekvens komponenter, såsom epileptiform udledning, overholdes næppe, når du bruger neddykket type optagelse kamre19; Dette er især tilfældet, når den akutte epileptiform mønster er kemisk induceret og indebærer ephaptic mekanismer, som det er tilfældet for 4AP model22 (Se11 for en omfattende oversigt). For at overvinde disse begrænsninger, er blevet foreslået flere strategier af forskere. For eksempel, er øge perfusion sats19,20 samtidig reducere hjernen skive tykkelse (≤300 µM) og området17,18 afgørende faktorer for at opnå tilstrækkelig ilttilførslen til vævet. Derudover kan forbedrede hjernen skive levedygtighed også ske ved hjælp af perforeret multilaterale miljøaftaler (pMEAs), som giver mulighed for perfusing hjernevæv fra begge sider18.
Der henviser til, at de beskrevne tilgange har væsentligt forbedret mulighederne for MEA optagelse fra hjernen skiver, de er ikke blevet testet mod langvarig (flere timer) optagelse og elektrisk stimulation sessioner, de sidstnævnte repræsenterer en betydelig stress for hjernevæv. Langvarig indspilningerne kan være nødvendigt at undersøge udviklingen i tid til særlige epileptiform mønstre, der ikke ville være muligt at afsløre af kortvarige målinger. I forbindelse med DBS forskning, kan længerevarende eksperimentelle protokoller forpligtes til at vurdere og sammenligne effekten af flere stimulation paradigmer i det samme hjerne udsnit.
Når kun spontane elektriske aktivitet skal være registreret, kortlægning af elektroder med hensyn til Investeringsafkastet er normalt gøres a posteriori, dvs., under dataanalyse; undersøgelse af evoked svar eller elektriske Neuromodulationsbehandling paradigmer kræver i stedet, at stimulation leveres til specifikke ROI(s), dikterer behovet for hurtig og nem live elektrode kortlægning under eksperimentet.
Her viser vi en simpel forsøgsplan, der giver mulighed for induktion og vedligeholdelse af en stabil 4AP-induceret epileptiform mønster i voksen gnaver hjernen skiver. Den observerede aktivitet gengiver trofast de elektrofysiologiske egenskaber af denne model som karakteriseret ved hjælp af konventionelle ekstracellulære Elektrofysiologi teknikker. Det fortsætter i flere timer og outlasts vedvarende elektrisk stimulation for gentagne langvarig epoker. Afdelingerne bruges til at vedligeholde og Inkuber i hjernen skiver kan let samles ved hjælp af standard laboratorie forsyninger (figur 1A), der henviser til, at en brugerdefineret indtaling afdeling giver mulighed for optimal løsning valutakurs og laminar flow (figur 1B) kan indhentes fra kommercielle kilder eller ved hjælp af 3D udskrivning teknologi til en overkommelig pris. Hurtig kortlægning af ROI(s) for real-time overvågning og udvælgelse af stimulerende elektroder er muliggjort af en brugerdefineret brugervenlig GUI opkaldt mapMEA, frit tilgængelig på anmodning.
Figur 1: Custom udstyr anvendes til denne protokol. (A) bedriften kamre for nyttiggørelse, før opvarmning og præ-inkubation i 4AP samles ved hjælp af et bæger og en petriskål. Petriskålen bør være mindre i diameter end afbryder og holdes på plads ved hjælp af en sprøjte stemplet. Bunden af petriskålen er erstattet af en nylon mesh (fra bløde strømper) limet med Cyanocrylat på kanten af petriskålen. Ilt tilføres via en bøjet spinal nål (22 G), indsættes mellem væggene i petriskålen og bægerglasset. Bobler bør opstår fra siden af den bægerglas og aldrig nå nylon mesh til at undgå hjernen skive forskydning. Toppen af en petriskål kan bruges som låg til at undgå ACSF fordampning og vedligeholde iltmætning. (B) Custom optagelse kammer. i: inlet reservoir til at rumme den varme kanyle og referenceelektrode. ud: outlet reservoir til at rumme den suge nål. REC: optagelse kammer. (C) glas Pasteur pipette, kruset af brand-polering, bruges til at håndtere væv og justere dets position inden for optagelse kammer. (D) Custom skive hold-down anker. (E) slutmontage af optagelse kammer monteret på MEA chip. En hjerne skive hviler på bunden holdes på plads af ankeret. Den røde pil angiver PTFE slanger der dækker varme kanyle, mens den røde cirkel angiver referenceelektrode, en mættet KCl pellet oversvømmet af ACSF i fjorden reservoir. Den blå pil angiver suge nålen i outlet reservoir. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
MMA er et uvurderligt værktøj for neurofysiologi undersøgelser og har nået modenhed i de seneste år takket være årtiers udforskning og udvikling. I forhold til konventionelle felt potentielle optagelse tilbyde foran den store fordel af et højere antal observationspunkter og kendte Inter elektrode afstanden, som er afgørende for præcist lokalisere neuronal netværk interaktioner.
MEA optagelse teknik kan også være koblet til andre Elektrofysiologi tilgange, såsom patch-clamp optagelse15, at undersøge forholdet mellem enkelt neuron og neuronal netværksaktivitet. Desuden kan mulighed for at visualisere felt potentialer og multi-enhed aktivitet samtidig give værdifuld indsigt i sammenhængen mellem aktiviteten af små neuronal ensembler og kollektive neuronal netværk. Kombination med spænding-følsomme farvestoffer, calcium imaging og optogenetics29 giver udlede neurofysiologi fænomener ved hjælp af polyeder tilgange. Ud over farmakologiske undersøgelser, mulighed for at udføre både optagelse og stimulation med det samme system gør MEA optagelse teknik meget kraftfulde og alsidige: for eksempel, det er muligt at studere synaptisk plasticitet fænomener i den kernen i hukommelse dannelse30, ved hjælp af protokollerne Neuromodulationsbehandling præsenteres her, som er relevante for DBS til behandling af epilepsi og en bred vifte af hjernen lidelser. De seneste beviser MEA optagelse teknik kan være anvendt med succes til epileptiske menneskehjerne væv16 viser sin uvurderlig nytte i epilepsi forskning, både for at forstå de grundlæggende mekanismer, der ligger til grund for denne ødelæggende sygdom og finjustere DBS algoritmer for at rette op på det.
Imidlertid MEAs tvinge udøvelse af Elektrofysiologi eksperimenter under «begrænse» betingelserne for hjernen skiver, på grund af kravet om en neddykket optagelse kammer og nødvendigheden af at lade hjernen skær resten på den fast substrat hvor mikro-elektroder er integreret. Således, hjernevæv kan ikke modtage tilstrækkelig ilt levering, hvilket igen kan påvirke kvaliteten af optagelserne.
Protokollen beskrevet her tillader at pålideligt registrere og studere ictogenesis i gnavere limbiske netværk koblet til MEAs ved hjælp af akut in vitro-4AP model og at forfølge langvarig epoker af elektrisk stimulation, der kan give relevante oplysninger til evaluering DBS politikker.
Tidligere undersøgelser på elektriske Neuromodulationsbehandling af epileptiske limbiske netværk baseret på brugen af konventionelle felt potentielle optagelse har brugt enten mus eller rotte hjernen skiver med lignende resultater24,25; men brugen af rotte hjernevæv viste sig at være mere udfordrende, rimeligt på grund af de svagere connectivity i forhold til hjernevæv fra mus7. Med hensyn til MEA teknik er mus hjernen skiver bedst egnet i kraft af deres størrelse. Derudover er gives højere forekomst af ictal-lignende udledninger i mus versus rotte hjernevæv, det muligt at teste betydeligt mere hjerne skiver hele en eksperimenterende dag, hvilket igen gør dataindsamling hurtigere og mere effektiv, og kan reducere antallet af forsøgsdyr.
Betydning med hensyn til eksisterende metoder:
Ictal udledninger registreres ved hjælp af den brugerdefinerede kammer beskrevet her synes at være lignende i varighed og satsen for forekomst til dem, der observeres ved hjælp af konventionelle MEA ring kammeret og den samme MEA type (planar mikro-elektroder, jf. 17). Det skal dog understreges, at hjernen skive tykkelse skal reduceres betydeligt, når ved hjælp af konventionelle runde optagelse mødesalen sammen med en lav perfusion sats (1 mL/min), som kan hindre en vellykket udøvelse af Neuromodulationsbehandling eksperimenter skyldes dårlig forbindelse.
I denne protokol giver en lav-volumen brugerdefineret indtaling kammer inspireret af patch-clamp optagelse kammer design stabil og pålidelig laminar flow, der er afgørende for vellykket udøvelse af MEA optagelser; Det giver også øget hjerne skive tykkelse til 400 µm for at opnå en rimelig afvejning mellem væv levedygtighed og iboende connectivity. Det er faktisk anerkendt at laminar flow af optagelse løsning inden for sal er meget ønskeligt, om hjernen skive Elektrofysiologi, da det påvirkes ikke af temperatur, ilt, og pH forløb, der er observeret i cirkulære-flow runde optagelse kamre19,20,31 (som dem forsynet med kommercielt tilgængelige MEA). Sådan forløb indføre eksperimentelle bias og er også skadeligt for hjernen skive. Optagelse kamre i en relativt lille volumen (~1.5 mL) sammen med en høj perfusion sats (5-6 mL/min)16,31 mulighed for passende udveksling af perfusion medium (≥3 gange / min). Den brugerdefinerede salen kan være let fra kommercielle kilder til en overkommelig pris eller produceres internt ved hjælp af 3D udskrivning teknologi. Andre undersøgelser har rapporteret MEA optagelser fra 400 µm tykt menneskelige hjerne skiver16 ved hjælp af de konventionelle MEA ring kammer, samtidig med at holde ACSF volumen til 1 mL og håndhæve en høj perfusion sats (5-6 mL/min) ved hjælp af en simpel-larmen peristaltisk pumpe. Men forfatterne har anvendt en anden model af ictogenesis, dvs., de lave Mg2 +, som er sandsynligvis mindre påvirket end 4AP model af ephaptic mekanismer der indebærer betydelige stigninger i ekstracellulær koncentration, K+ 11 , 22. vi har fundet, at en høj perfusion ikke er ønskeligt i 4AP model, muligvis på grund af den hurtige vaskes ud af akkumulerede ekstracellulære K+, som muligvis skal forøges betydeligt i indspilning ACSF16. Faktisk syntes ictal begivenheder mere “chunked’ når ASCF perfusion hastighed blev forøget til 2-3 mL/min og hjernen skive blev oversvømmet af en tyk ACSF lag, der henviser til, at fuld-blæst udledninger udstiller robust tonisk-kloniske komponenter kunne genoprettes efter tilbagevenden til en lavere perfusion sats (1 mL/min) og en tyndere ACSF lag lige ved væv overflade niveau (data ikke vist). Brugerdefineret indtaling salen beskrevet i denne protokol giver mulighed for at udveksle perfusion medium 3 – 5 gange / min med en væskehastighed på 1 mL/min. Således er samlede ilttilførslen til hjernen skiver stærkt forbedret selv ved relativt lave perfusion satserne, samtidig stadig sikre en stabil temperatur og høj signal-støj-forhold. Vigtigst af alt, er det muligt at holde den ekstracellulære K+ koncentration til en fysiologisk værdi.
4AP model af ictogenesis kræver ikke nogen væsentlig ændring af ACSF Ioniske sammensætning, såsom sænkning Mg2 + eller stigende K+, og byder på den unikke fordel med både excitatoriske og hæmmende transmissioner intakt 12, et aspekt, som er yderst relevante i epilepsi forskning i lyset af den afgørende rolle af både glutamatergic og GABAergic netværk i epileptiform synkronisering (jf. 7). 4AP-ACSF anvendes i denne protokol indeholder en fysiologisk K+ koncentration (3,25 mM) og en lidt lavere Mg2 + koncentration end bedrift ACSF (1 mM versus 1,3 mM). Denne koncentration stadig henhører under de rapporterede fysiologiske værdier i Mg2 + koncentration i gnaver CSF og det anvendes i mange laboratorier (Se for eksempel17,18). Formålet med den beskrevne protokol, har vi fundet, at denne mindre nedgang er foretrukket til støtte for 4AP virkning.
I tidligere arbejde, er 4AP blevet anvendt til hjernen skive, når det var allerede placeret inde optagelse afdeling17,18. Medmindre eksperimentatoren skal observere tid latenstiden mellem programmet 4AP og udbrud af epileptiform mønstre, finder vi, at denne tilgang er temmelig tidskrævende og er ikke egnet til at forfølge langvarig optagelse og stimulation sessioner beskrevet i denne protokol. Præ-inkubation af hjernen skiver i 4AP ved 32 ° C giver mulighed for besparende meget eksperimenterende tid, da hjernen skiver kan blive forbehandlet i serien samtidig føre eksperimentet ved hjælp af andre væv sektioner.
Hjernen skiver langvarig levedygtighed kan være nyttigt at analysere netværksfunktioner på lang sigt. Deres bedre modstandskraft over for gentagne elektrisk stimulation er desuden af stor fordel hvis eksperimentatoren ønsker at sammenligne flere stimulation protokoller, som skal udføres i den samme hjerne skive for statistiske robusthed. I vores hænder, når du tester 3 stimulation protokoller, hver efterfulgt af en kontrol fase og efterfulgt af en genopretningsfasen, eksperimentet kan vare 3-5 h. I denne forbindelse er live MEA kortlægning afgørende for at aktivere den korrekte sti og undertrykke snarere end at favorisere ictogenesis via elektrisk stimulation. Vores brugervenlig GUI repræsenterer en hurtig, enkel og fleksibel værktøj til at kortlægge elektroderne på forskellige hjernestrukturer. I modsætning til kommerciel software er det muligt at tilføje brugerdefinerede MEA layouts selv med grundlæggende programmering færdigheder. Billeder kan erhverves i lysfelt; eventuelle generelle formål kamera, der har god opløsning og passer på et mikroskop er således velegnet. En inverteret mikroskop er afgørende for at visualisere microelectrodes position i forhold til hjerne-skive, da disse vil være skjult under vævet hvis bruger en opretstående mikroskop. Et stereo-mikroskop anbefales dog ud over typen omvendt hvis eksperimentatoren skal udføre kniv-nedskæringer for at forstyrre specifikke neuronal veje.
Endelig, en yderligere fordel af den foreslåede tilgang er den billige og forholdsvis let forsamling for de fleste af de nødvendige værktøjer, som brugerdefineret indtaling kammer og bedrift kamre, varmt bad og skive anker samt den unødig brug af et dyrt støjsvage peristaltisk pumpe.
Begrænsninger af teknikken:
MEA optagelse tillader ikke visualisere meget langsom bølger, dvs, DC forskydninger i signalet. Sådanne baseline omlaegninger kan hjælpe asymptotiske måling af ictal decharge varighed, og mest vigtigt, de er grundlæggende at studere kortikale sprede depression (et fænomen, der vedrører pludselig uventet død i epilepsi32 og deles mellem epilepsi og migræne33).
Med hensyn til elektriske Neuromodulationsbehandling tillader protokollen beskrevet her udfører flere stimulation sessioner uden at påvirke hjernen skive levedygtighed. Vi kunne med held udføre op til 3 stimulation sessioner af 20-45 min, svarende til hvad rapporteret i tidligere arbejde25. Selv om hjernen skiver kan sandsynligvis klare et højere antal stimulation sessioner eller længere stimulation protokoller, har vi ikke teste hjernen skiver i denne henseende. Vi anbefaler, at begrænse antallet af stimulation protokoller til 3 og undgå langvarig (≥60 min) stimulation sessioner, som væsentligt kan understrege hjernevæv vedligeholdes disse betingelser grænse, op til manglen inddrivelse ved stimulus udbetaling.
Kritiske trin i protokollen:
Flere kritiske faktorer kan hindre vellykket udøvelse af optagelse og graduering af epileptiform aktivitet i hjernen skiver koblet til MEA. Udover de gnavere arter anvendes og kvaliteten af hjernen skiver, perfusion rate under optagelse og dynamikken i ACSF flow (dvs., laminar versus cirkulære) inden for optagelse kammer, har vi fandt, at betingelserne for inddrivelse og langsigtede vedligeholdelse af hjernen skiver samt mode 4AP anvendelse er de mest kritiske trin.
Når du bruger en neddykket bedrift kammer er det afgørende at gemme hjernen skiver ved stuetemperatur til at bevare hjernens væv netværksaktivitet og favorisere induktion af ictal-lignende udtømning af 4AP ansøgning. I vores hænder forringet genopretning og vedligeholdelse ved 32 ° C hjernevæv inden for 3-4 h af udskæring.
Inkubation af hjernen skiver i 4AP-ACSF ved stuetemperatur og optagelse ved 32 ° C er imidlertid ikke ønskeligt. Vi har fundet mange vanskeligheder med at overholde robust tilbagevendende ictal udledninger i denne tilstand. Faktisk, lave temperaturer i området 20-24 ° C er blevet rapporteret til at dæmpe eller endog forhindre 4AP-induceret ictogenesis både in vitro34 og i vivo35. Således 4AP inkubation og optagelse temperaturer skal ligge inden for 30-34 ° C og skal følges. For at undgå at sætte hjernevæv under for meget stress på grund af den samtidige induktion af hyperexcitabilitet 4AP og den pludselige eksponering af hjernen skiver fra stuetemperatur til varme (32 ° C) 4AP-ACSF, er det afgørende at udføre en mellemliggende præ-opvarmning trin og lad skiverne er hjernen habituate på bedrift ACSF ved 32 ° C i 20-30 min. springe dette trin kan påvirke ictogenesis induktion af 4AP.
Et andet aspekt, der skal nævnes, er betydningen af D-glukose koncentration i ACSF efter udskæring. En 25 mM koncentration bevarer hjernen skiverne er bedre end 10 mM koncentrationen anvendes i mange laboratorier og det forbedrer også satsen for forekomst af ictal aktivitet, som er 2-fold hurtigere (dermed, gøre det lettere at føre en lang række eksperimentelle protokoller i flere hjernen skiver hver dag).
Endelig, nogle vigtige fine detaljer under den udskæring procedure skal nævnes. Først, lad ikke de intakte hjernen og hjernen skiver til at fryse i kolde skære ACSF. Nedkøling hjernen for < 2 min er nok givet den lille størrelse af musen hjernen. Væv sektioner skal overføres straks fra pufferkar til de føres bægre ved stuetemperatur. Skylning opskæring er ACSF meget vigtigt, ellers den høje saccharose vil gøre hjernen skiver stick til nylon mesh bedrift kammer. Du kan effektivt skyl væv, er det vigtigt at minimere opskæring ACSF indhold inden for overførsel pipette så ikke forurene bedrift ACSF overdrevent. 2-trins skylning aids i at minimere kontaminering. Efter afslutningen af proceduren for udskæring, skal væv sektioner overføres straks fra de føres bægre til bedriften kammer, hvor den bløde nylon mesh suspenderede halvvejs i bedriften ACSF tillader væv iltning på begge sider. Samme princip bør anvendes på alle stadier proceduren udskæring: hjernen skiver skal aldrig sidde i bunden af bægerglasset, bør de ikke være i kontakt med siderne af bedriften kamre, og de bør aldrig være i kontakt med hinanden eller overlapning.
Ændringer og fejlfinding:
ACSF sammensætning kan ændres efter den eksperimentatoren behov. For eksempel kan medicin tilføjes for at dissekere bidrag af specifikke neurotransmittere eller Ionkanaler til effektiviteten af elektriske Neuromodulationsbehandling. Derudover kan pyrodruesyre og ascorbinsyre (jf. tabel 2) udelades, selv om vi finder, at de udøver en kraftfuld neuroprotektive rolle. I tabel 3 rapport vi de mest almindelige problemer, der kan opstå i denne protokol og hvordan man kan håndtere dem.
Konklusioner:
MEA optagelse er uden tvivl en uvurderlig teknik til at løse interaktionerne af neuronal netværk i sundhed og sygdom. Ud over farmakologiske undersøgelser er det også muligt at evaluere elektriske Neuromodulationsbehandling protokoller, der er relevante for DBS anvendes til epilepsi og andre neurologiske lidelser. I denne protokol, har vi vist, at det er muligt at gengive typisk periodiske stimulation eksperimenter med lignende resultater til dem, der opnås med konventionelle ekstracellulære felt potentielle optagelse og eksterne stimulere elektroder. Den øgede tilgængelighed af kommercielle brugervenligt udstyr og avancerede software-værktøjer gøre MEA optagelse teknik også velegnet til lukkede kredsløb stimulation eksperimenter, at yde ad hoc- stimulation til hjernevæv og undersøge bidrag af feedbackmekanismer til neuronal netværk svar.
The authors have nothing to disclose.
G.P. er en Marie Skłodowska-Curie Fellow finansieret af EU MSCA-IF-2014 projektet Re.B.Us, G.A. n.660689, under programmet rammer H2020. GUI mapMEA er frit tilgængelig på anmodning til forfatter ilaria.colombi@iit.it.
Poly-D-Lysine | Sigma-Adrich | P7886 | Needed for MEA coating |
NaCl | Sigma-Adrich | S9888 | Chemical |
KCl | Sigma-Adrich | P9541 | Chemical |
KH2PO4 | Sigma-Adrich | 795488 | Chemical |
CaCl2*2 H2O | Sigma-Adrich | C3306 | Chemical |
D-Glucose | Sigma-Adrich | RDD016 | Chemical |
NaHCO3 | Sigma-Adrich | S5761 | Chemical |
MgCl2*6 H2O | Sigma-Adrich | M2670 | Chemical |
MgSO4*6 H2O | Sigma-Adrich | M5921 | Chemical |
Sucrose | Sigma-Adrich | RDD023 | Chemical |
Pyruvic Acid, 98% | Sigma-Adrich | 107360 | Chemical |
4-aminopyridine | Sigma-Adrich | A78403 | Convulsant drug |
STG-2004 | Multichannel System | STG4004-1.6mA | 4-channel stimulus generator with voltage (±8 V) and current output (±1.6 mA) |
MEA1060 | Multichannel System | N/A | MEA amplifier |
planar MEA | Multichannel System | 60MEA500/30iR-Ti w/o ring | Must be without ring to allow using the custom recordingchamber |
McRack | Multichannel System | Recording software | |
McStimulus II | Multichannel System | STG4004 control software | |
TC02 | Multichannel System | TC02 | 2-channel thermostat |
PH01 | Multichannel System | PH01 | Heating perfusion canula |
MPH | Multichannel System | MPH | Magnetic holder for PH01 and suction needle |
Elastostil E43 | Wacker | E43 | Elastomeric sealant used to mount the custom recording chamber onto the MEA |
MEA Custom Chamber | Crisel Instrument | SKE-chamber MEA | Custom recording chamber |
Ag/AgCl electrode, pellet, 1.0 mm | Crisel Instrument | 64-1309 | Reference electrode for the custom recording chamber |
Tergazyme | Sigma-Adrich | Z273287-1EA | Enzymatic cleaner |
MATLAB | The Mathworks | Programming environment for electrodemapping | |
VT1000S | Leica Biosystems | VT1000S | Vibratome |
Warner Instruments | 64-1309 | Ag-AgCl Electrode Pellet 1.0 mm (E205). Reference electrode. |