Summary
אנו מדגימים כיצד לבצע הקלטה וחשמליים מודולציה של פעילות אפילפטית 4-aminopyridine-induced פרוסות המוח מכרסמים באמצעות מערכי microelectrode. חדר הקלטה מותאמת אישית שומר על רקמות הכדאיות ברחבי מישיבות ניסיוני. חיים מיפוי אלקטרודה, מבחר זוגות מגרה מבוצעות על ידי ממשק משתמש גרפי מותאם אישית.
Abstract
אפילפסיה של האונה הרקתית (TLE) היא הנפוצה ביותר חלקית תסמונת אפילפטית מורכבים של תרופות קשוב לפחות. גירוי מוחי עמוק (DBS) היא גישה מבטיחה כאשר נכשלת טיפול תרופתי או כירורגי אינו מומלץ. פרוסות המוח חריפה מצמידים מערכים microelectrode (אותי) מייצגים כלי חשוב ללמוד הרשת העצבית אינטראקציות ו אפנון שלהם על ידי גירוי חשמלי. לעומת טכניקות הקלטה חוץ-תאית קונבנציונאלי, הם מספקים את היתרונות הוספה של מספר רב יותר של נקודות תצפית, מרחק בין אלקטרודה ידוע, אשר מאפשרים ללמוד את הפצת הנתיב ואת המהירות של אלקטרופיזיולוגיות אותות. עם זאת, רקמות חמצון עלול להיות לקוי במידה רבה במהלך MEA הקלטה, הדורש קצב גבוה זלוף, אשר מגיע על חשבון ירידה יחס אות לרעש, גבוה יותר תנודות הטמפרטורה ניסיוני. גירוי חשמלי נוסף מדגיש את רקמת המוח, ולכן קשה להתמיד שהשרתים הקלטה/גירוי ממושך. יתר על כן, חשמל מודולציה של פעילות מוחית פרוסה צריך למקד מבנים/מסלולים ספציפיים בתוך הפרוסה המוח, הדורש כי מיפוי אלקטרודה בקלות ובמהירות להתבצע חי במהלך הניסוי. כאן, אנחנו מדגימים כיצד לבצע את אפנון הקלטה וחשמליים של פמפרידין (4AP)-induced לפעילות אפילפטית פרוסות המוח מכרסמים באמצעות אותי מישוריים. אנו מראים כי רקמת המוח המתקבל עכברים outperforms חולדה רקמת המוח, ובכך מתאים יותר לניסויים MEA. פרוטוקול זה מבטיח הדור ואת התחזוקה של דפוס יציב אפילפטית בנאמנות מתרבה התכונות אלקטרופיזיולוגיות נצפתה עם הקלטה פוטנציאליים שדות קונבנציונלי, נמשכת כמה שעות, ולא outlasts מתמשכת גירוי חשמלי במשך תקופות ממושכות. רקמות הכדאיות לאורך כל הניסוי מושגת בזכות השימוש של חדר הקלטה מותאמת אישית בנפח מצומצם ומאפשר זרימה שכבתית וחילופי פתרון מהיר אפילו ב נמוך (1 mL/min) המחירים זלוף. מיפוי מהיר MEA עבור ניטור בזמן אמת ומבחר של אלקטרודות מגרה מתבצע על ידי ממשק מותאם אישית משתמש גרפי (GUI).
Introduction
אפילפסיה הוא סכנת חיים הפרעה פרוגרסיבית גרימת פעילות בלתי מבוקרת של המוח1; הוא נושא בין הנטל הגבוה ביותר של המחלה ו-2,סטיגמה חברתית משמעותית3. TLE היא התסמונת בתדירות הגבוהה ביותר (40%) ואת ביותר לעתים קרובות (~ 30%) עמידים בפני תרופות אנטי-אפילפטי4. בזמן ניתוח אבלציה של הרקמה epileptogenic ייתכן להפחיתם מצבו של החולה, הוא הוא לא ריאלי של כל החולים, אינו מבטיח לחיים לחלוטין ללא פרכוס5. אפנון של אפילפסיה הלימבי רשתות על ידי DBS חשמל היא גישה מבטיחה טיפול תרופתי או כירורגי אינם מתאימים.
פרוסות המוח מכרסמים הם כלי חשוב ללמוד איך רשתות תפקוד מחלה ובריאות6 על-ידי במבחנה טכניקות אלקטרופיזיולוגיה, כפי שהם לשמר, לפחות חלק, באדריכלות המקורי ואת קישוריות של המוח region(s) עניין (ROI). בפרט, ההיפוקמפוס משולב אופקי-entorhinal קליפת המוח (היפוקמפוס-EC) פרוסות מהווים את רשתות עצביים חיוני מעורב TLE, לכן מועסקות באופן שגרתי במבחנה TLE מחקר7.
הפציינט יכול להיות בחריפות המושרה פרוסות המוח על-ידי שינוי ההרכב יוניים של הנוזל מוחי שדרתי מלאכותי (כלנית חדד), כגון הפחתת מגנזיום תוך הגדלת אשלגן8,9,10, או באמצעות מניפולציות תרופתי, כגון חסימת מעכבות פעילות GABAergic (ראה11 עבור סקירה מקיפה). עם זאת, מודלים אלה מבוססים על משינוי לא מאוזן של עירור וניגוד; לפיכך, הם אינם מאפשרים ללמוד את האינטראקציה ואת התרומה מתואמת של רשתות סינאפסות כדי ictogenesis. זלוף רציפה של פרוסות המוח עם 4AP סמים convulsant משפר עצבית סינאפסות והן מעכבות, ובכך מאפשר ללמוד ictogenesis חריפה תוך שמירה בפעילות הסינפטית אוברול שלם12.
אותי לאפשר רישום הפעילות החשמלית שנוצרו על-ידי רשתות עצביים של מספר רב יותר של נקודות תצפית לעומת הקלטה פוטנציאליים שדות קונבנציונלי חוץ-תאית, איפה הגבלות המרחבי להגביל את מספר אלקטרודות זה יכול להיות לאכלס על פני השטח פרוסה של המוח. יתר על כן, MEA שבבי מציעים יתרון נוסף של המרחק בין אלקטרודה ידוע, אשר הוא מאוד שימושי כדי לאתר הפצת, להעריך את מהירות הנסיעה של אותות המוקלט. אמנם בתחילה נוצר עבור הקלטה של נוירונים בתרבית13,14, אותי עכשיו משמשים גם כדי לאפיין את התכונות אלקטרופיזיולוגיות של פרוסות המוח חריפה המתקבל מכרסמים15 ועוד בני16. לכן, בהקשר של מחקר אפילפסיה, אותי מייצגים כלי רב ערך לאתר האינטראקציות של רשתות עצביים הליבה של17,ictogenesis16,18.
עם זאת, MEA הקלטה מטבעו נושא האתגרים הטכניים קבלת או שמירה על דפוס אפילפטית יציבה לאורך כל הפרוטוקולים ניסיוני ארוך (מספר שעות). ראשית, חמצון הרקמות עשוי לא להיות נאותה בתוך הגדול, עגול שקוע-type הקלטה קאמרית19,20 אופייני לי זמינים מסחרית, ואילו יחס אות לרעש המסכן וחוסר יציבות טמפרטורה עלול להשפיע איכות ההקלטה כאשר קצב זלוף גבוהה (6-10 mL/min) משמש כדי לשפר את אספקת החמצן כדי הפרוסה המוח (ראה לדוגמה את הערות טכניות על ציוד חימום זלוף21). שנית, חוזרים ונשנים הפרשות הכוללים רכיבים בתדירות גבוהה, כגון הפרשות אפילפטית, בקושי שנצפו בעת שימוש שקוע-type הקלטה צ'יימברס19; זה המקרה בעיקר כאשר התבנית אפילפטית חריפה הנגרמת כימית והיא כוללת מנגנונים ephaptic, כמו המקרה מודל 4AP22 (ראה11 עבור סקירה מקיפה). כדי להתגבר על מגבלות אלה, מספר אסטרטגיות הוצעו על ידי חוקרים. למשל, להגדיל את קצב זלוף19,20 תוך הפחתת עובי הפרוסה המוח (≤300 מיקרומטר) ואזור17,18 הם גורמים חיוניים להשגת אספקת חמצן מספקת לרקמות. בנוסף, המוח משופרת פרוסה הכדאיות יכול להתבצע גם באמצעות מחורר לי (pMEAs), אשר מאפשרים פרפוזיה על רקמת המוח של שני הצדדים18.
ואילו הגישות שתואר השתפרו באופן משמעותי את הכדאיות של מאה הקלטה של פרוסות המוח, הם לא נבדקו נגד ממושך (מספר שעות) הפעלות גירוי הקלטה וחשמליים, האחרון ייצוג משמעותי לחץ על רקמת המוח. מאולפן ההקלטות ממושך ועשוי להידרש ללמוד את ההתפתחות בזמן של תכונות ספציפיות של דפוסי אפילפטית לא יהיה ניתן לחשוף ע י מדידות לטווח קצר. בהקשר של מחקר DBS, פרוטוקולים ניסיוני הממושך עשוי להידרש כדי להעריך ולהשוות את ההשפעות של מספר גירויים פרדיגמות בתוך הפרוסה המוח באותו.
כאשר רק ספונטנית פעילות חשמלית צריך להיות מוקלטת, מיפוי של האלקטרודות ביחס רועי נעשית בדרך-כלל posteriori, קרי, במהלך ניתוח נתונים; במקום זאת, המחקר עורר תגובות או של פרדיגמות neuromodulation חשמל מחייב כי גירוי ניתן להעביר ROI(s) ספציפיים, מכתיב את הצורך של מיפוי מהיר וקל אלקטרודה בשידור חי במהלך הניסוי.
כאן, אנו ממחישים פרוטוקול ניסוי פשוט המאפשר אינדוקציה ותחזוקה של דפוס יציב אפילפטית 4AP-induced פרוסות המוח מכרסמים למבוגרים. הפעילות שנצפה מוליד בנאמנות את התכונות אלקטרופיזיולוגיות של מודל זה כמו מאופיין בשיטות קונבנציונליות אלקטרופיזיולוגיה חוץ-תאית. זה נמשך כמה שעות, outlasts גירוי חשמלי מתמשכת במשך תקופות ממושכות חוזרות ונשנות. התאים נהגו לשמור על דגירה את פרוסות המוח יכול להיות בקלות מורכבים בעזרת ציוד מעבדה סטנדרטיים (איור 1 א'), ואילו חדר הקלטה מותאם אישית המאפשר פתרון אופטימלי החליפין, זרימה שכבתית (איור 1B) יכול ניתן לקבל ממקורות מסחריים או באמצעות טכנולוגיית הדפסת תלת-ממד במחיר סביר. מיפוי מהיר ROI(s) עבור ניטור בזמן אמת, את הבחירה של אלקטרודות מגרה התאפשר על ידי GUI ידידותי למשתמש המותאם אישית בשם mapMEA, באופן חופשי זמין על פי בקשה.
איור 1: ציוד מותאם אישית עבור פרוטוקול זה. (א) החזקת צ'יימברס השחזור, מראש ההתחממות של דגירה מראש ב- 4AP הם מורכבים באמצעות גביע צלחת פטרי. הפטרי אמור להיות קטן בקוטר יותר החשמל, מתקיים במקום בעזרת פומפה מזרק. בתחתית הפטרי מוחלף על ידי רשת ניילון (מתוך גרבי רך) מודבקים עם דבק מגע על שפת הפטרי. החמצן המסופקת באמצעות כפופות מחט השדרה (22 גרם), מוכנס בין קירות הפטרי את הספל. בועות צריך העולה מן הצד של הספל, אף פעם לא להגיע רשת ניילון כדי למנוע תזוזה פרוסה המוח. החלק העליון של צלחת פטרי יכול לשמש מכסה כדי למנוע אידוי חנה המבר ולשמור רווית חמצן. חדר הקלטה מותאמת אישית (B). ב: כניסת המאגר כדי להכיל את הצינורית חימום, האלקטרודה הפניה. .: עודפים המאגר כדי להכיל את המחט היניקה. rec: הקלטת קאמרית. פיפטה (C) זכוכית פסטר, מכורבלת על ידי שיוף אש, המשמש כדי להתמודד עם הרקמה ולהתאים את מיקומו בתוך תא הקלטה. מותאם אישית (D) פרוסה hold-down עוגן. (E) ההרכבה הסופית של התא הקלטה רכוב על גבי השבב MEA. פרוסה המוח נשענת על גבי התחתון שנערך במקום על ידי העוגן. החץ האדום מציין את הצנרור PTFE המכסים את הצינורית חימום, ואילו העיגול האדום מציין האלקטרודה הפניה, גלולה אשלגן כלורי רווי שקוע מאת כלנית חדד במאגר כניסת המים. החץ הכחול מציין את המחט היניקה במאגר המים לשקע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי משרד הבריאות (אישור (ש ע) 860/2015-PR) איטלקי תואם האיחוד האירופי הוראת 2010/63/EC על רווחת בעלי חיים.
1. הכנת מכלול קאמרית MEA/מותאם אישית
הערה: התחל 2 ימים לפני הניסוי. להשתמש MEA ללא טבעת (ראה טבלת חומרים).
-
לנקות את כר הדשא (משך: 35-40 דקות).
- התמוססות של אבקת הניקוי אנזימטי לתוך מים מזוקקים חמים. מברשת חמה ניקוי פתרון על גבי המשטח MEA ואז כר הדשא לטבול חמה ניקוי פתרון לפחות 3 שעות.
- שוטפים את כר הדשא ביסודיות עם מים מזוקקים ומייבשים אותו בעזרת טישו נטולת מוך לא-גירוד.
-
להרכיב את כר הדשא עם תא הקלטה (משך הזמן: 10 דקות + לילה).
- שווה להפיץ את איטום אלסטומריים על המשטח התחתון של תא הקלטה. ודא כי ישנם אין בועות.
- הר תא הקלטה על גבי כר הדשא בעזרת פינצטה והפעילו לחץ עדין. אם יש בועות, מעט להעביר התא במעגל תוך הפעלת לחץ עדין עם האצבעות עד כל הבועות נעלמו. מורחים שכבת איטום מסביב הגבול החיצוני של החדר הקלטה.
הערה: קריטי! מכסה MEA אנשי הקשר עם חומר האיטום. - הנח את מכלול MEA/קאמרית בתוך 15 ס מ פטרי. מקום 5 מ ל צלחת פטרי או 10 מ"ל גביע מלא מים מזוקקים ליד כר הדשא. מכסים הכל כדי לשמור על סביבה לחה. תן התרופה בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן.
-
מעיל כר הדשא כדי להפוך אותו הידרופיליות (משך: 5-10 דקות + לילה).
- למקם את כר הדשא 15 ס מ פטרי. יוצקים µL 50 של פולי-D-ליזין אל אזור הקלטה MEA. לסגור את צלחת פטרי, לאטום אותו עם סרט איטום ו לאחסן לילה ב 4 º C.
- לשטוף ביסודיות באמצעות מים מזוקקים כר הדשא ולאחסן כר הדשא ב 4 ° C במים מזוקקים.
הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן. אותי מצופה יאוחסן ויעבור ולהשתמש בהם שוב מספר ניסויים. באופן שגרתי ניקוי וציפוי מחדש כר הדשא מסייעת להסיר רקמות פסולת, לשפר את יחס אות לרעש.
2. הכנת מלאי פתרונות
הערה: הפעלת יום אחד לפני הניסוי (משך: ~ 2 h). פתרונות מניות עזרה במהירות הניסוי ביום ניסיוני. הם יכולים להיות מוכנים מראש ומאוחסנים. ראה טבלה 1 ריכוז גורם וקומפוזיציה. עיין בטבלה 2 עבור הרכב של פתרונות הסופי.
- להמיס את הכימיקלים במים מזוקקים בטמפרטורת החדר. לסנן את הפתרונות מניות עם בקבוק מסנן (קוטר פילטר: 0.22 מיקרומטר).
- חנות ב 4 ° C (ראה טבלה 1 עבור מומלץ זמן אחסון מרבי).
הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן.
3. הכנת אגר
הערה: הפעלת יום אחד לפני הניסוי (משך: ~ 1 h).
- שופכים 250 מ של מים מזוקקים לתוך גביע 500 מ"ל ולהתחיל זע ב 350 סל"ד. להוסיף 5 גר' אגר והמתן עד זה היא התפרקה לחלוטין.
- מחממים את הפתרון ב- 250-300 מעלות צלזיוס. תן למים להתאדות עד הפתרון הוא ~ 200 מל להניב פתרון אגר w/v 2.5%.
הערה: הטמפרטורה צריך להיות גבוה מספיק כדי לאפשר למים להתאדות ללא מבעבעים. - יוצקים הפתרון אגר על גבי קופסת פלסטיק 200 מ ל מרובע של ~1.5 ס מ בגובה קירות ולתת לו להתקרר בטמפרטורת החדר עד שיהפוך מוצק.
- לכסות את תיבת ואחסן אותו ב 4 º C. הבלוק אגר היא טובה למשך מספר שבועות.
הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן.
4. הכנה של המטוס קפוא
הערה: להתחיל יום אחד לפני הניסוי.
- למלא קערה נירוסטה שטוח התחתונה עם מים מזוקקים עד 0.5 - 1 ס מ מתחת לקצה.
- לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
5. הכנת Neuroprotective חיתוך כלנית חדד
הערה: הפעלת יום אחד לפני הניסוי או באותו היום של הניסוי (ראה טבלה 1 ו לטבלה 2) (משך: 30 דקות).
- יוצקים 200 מ של מים מזוקקים בתוך 500 מ"ל ולהתחיל לערבב שימוש של פגים-350 סל"ד.
- להוסיף 50 מ של מניות B ו- 50 מ של מניות C (ראה טבלה 1).
- להוסיף 3 מ מ פירובט, סוכרוז 208 מ מ, 10 מ מ D-גלוקוז ו חומצה אסקורבית L 1 מ"מ.
הערה: האחסון בפועל של פירובט תלוי צפיפות ואת טוהר והם עשויים להשתנות עם החבילה. תמיד לחשב את אמצעי האחסון הדרושים בעת פתיחת אוסף חדש. - לכסות עם איטום הסרט ולתת מערבבים למשך 30 דקות.
- להעביר את הפתרון סטריליות 500 מ"ל ולהוסיף מים מזוקקים כדי למלא את הבקבוק.
- חותם על סטריליות עם איטום הסרט, היפוך בעדינות 3 - 5 פעמים עד הפתרון ברור באופן שווה.
- העברת חיתוך כלנית חדד לתוך בקבוק זכוכית עם מכסה.
- לאחסן את חיתוך כלנית חדד ב-80 מעלות צלזיוס למשך 20-30 דקות או ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לקרר עד 4 ° C.
הערה: הפרוטוקול ניתן להשהות כאן אם בן לילה קירור היא עדיפה. אחרת הזמן הנדרש עבור קירור חיתוך חנה המבר עשוי לשמש כדי לרדוף אחרי שלב 6.
6. הכנת החזקת כלנית חדד
הערה: להכין הטרייה פתרון ביום של הניסוי (משך: 5-10 דקות). החזקת כלנית חדד ישמש כדי לשטוף את פרוסות המוח של חיתוך חנה המבר במהלך ההליך עם פרוסות (ראה שלב 8.16) עבור אחסון לטווח ארוך של פרוסה המוח ומחמם מראש. לשטוף את פרוסות המוח, 100 מ של מחזיק חנה המבר מספיקה. התאים מחזיקים ומחמם מראש בשימוש פרוטוקול זה בהזמנה אישית ומכילים נפח של 300 mL ו- 100 מל ', בהתאמה (.cf. איור 1 א'). עם הגדרה זו, 500 מ"ל של מחזיק חנה המבר מספיקה. צ'יימברס שהושג ממקורות מסחריים עשויים להכיל אמצעי אחסון שונה, שבו מקרה הסכום הכולל של מחזיק חנה המבר להיות מוכן צריך להיות מותאם בהתאם.
- יוצקים 200 מ ל מים מזוקקים סטריליות 500 מ"ל.
- להוסיף 50 מ של מניות A, 50 מ של מניות B, 6.5 מ של מניות מ' ו- 1 מ מ חומצה אסקורבית L. בעדינות להתסיס בתנועות סיבוב עד חומצה אסקורבית L היא התפרקה לחלוטין.
- להוסיף מים כדי להגיע את עוצמת הקול הסופי, חותם על סטריליות עם איטום הסרט מזוקקים, היפוך בעדינות 3 - 5 פעמים עד הפתרון ברור באופן שווה. עיין בטבלה 2 עבור החזקת הרכב חנה המבר.
7. הכנת הספסלים ניסיוני
הערה: פעולה זו דורשת 15 דקות, בתוספת 30 דקות כדי להשיג לטמפרטורה קבועה באמבט החמים.
-
ספסל הקלטה
- להתחיל באמבט החמים, לקבוע את 32 ° C, לכסות את זה כדי לשמור על הטמפרטורה שלו.
הערה: באמבט החמים בשימוש פרוטוקול זה ניתן בהזמנה אישית באמצעות קופסת פלסטיק קשיח עם תרמוסטט אקווריום שנקבע מראש בטמפרטורה הרצויה. ניתן להגיע לטמפרטורה הרצויה קבוע בדקות ~ 30 החל מבטמפרטורת החדר. מאז התאים מראש התחממות כדור הארץ, ומוכנסות יושב בתחתית תיבת פלסטיק, מפלס המים צריך להיות מספיק כדי לכסות את התרמוסטט כדי למנוע התאים צפים. - להרכיב על החזקתו ואת התאים מראש התחממות כדור הארץ (.cf. איור 1 א'), ויוצקים על החזקת חנה המבר לתוכם. להשאיר את תא המעצר בטמפרטורת החדר ולמקם את החדר מראש התחממות כדור הארץ בתוך באמבט החמים. להתחיל מבעבעים הפתרונות עם 95% או2/5% CO2 גז תערובת, להסיר את כל הבועות לכוד באמצעות פיפטה הפוכה של פסטר. שמור מקורה.
- להתחיל באמבט החמים, לקבוע את 32 ° C, לכסות את זה כדי לשמור על הטמפרטורה שלו.
-
ספסל עם פרוסות, vibratome
- הדבק בלוק קטן אגר אל המרכז של הדיסק הדגימה באמצעות דבק דבק מגע.
- מכניסים גביע 250 מ ל דלי קרח ויוצקים חיתוך חנה המבר לתוכו.
- לקחת שני בקבוקונים 100 מ ל ויוצקים 50 מ של מחזיק כלנית חדד לתוך כל. להשאיר את בקבוקונים בטמפרטורת החדר. אלה בקבוקונים השטיפה.
- התחל מבעבעים הפתרונות בתערובת 95% או2/5% CO2 גז.
- לטעון את המגש מאגר על גבי vibratome, להקיף אותו עם קרח כתוש. שופכים קצת אתנול בקרח כתוש כדי לסייע בשמירה על טמפרטורה במהלך ההליך עם פרוסות. לאחר שפיכת אתנול, להוסיף עוד קרח כנדרש.
הערה: לטמפרטורה של 2 ° C היא אופטימלית. - מקם את bubbler בתוך המגש מאגר, ואז להרכיב והר הרחוב להב vibratome.
הערה: ודא כי הלהב מותקן בזווית סיווג של ~ 10°. - לשים קרח כתוש בתוך 500 מ"ל כדי 2/3 של אמצעי אחסון, מילוי עם מים מזוקקים.
- קחי את הקערה קפוא מהמקפיא, למקם אותו הפוך על הספסל עם פרוסות, לכסות את זה עם מגבת נייר, נייר סינון דיסק.
-
ספסל הרדמה
- מניחים קערה קטנה מגש מלא קרח ויוצקים חיתוך חנה המבר בתוכו. התחל מבעבעים עם 95% או2/5% CO2 גז תערובת.
8. המוח פרוסה הכנה ותחזוקה
הערה: פרוטוקול זה עושה שימוש של מבוגר (4 - 6 שבועות בן) עכברים CD1 זכר, אבל זנים אחרים (למשל, c57/bl617,18) יכול לשמש. אנחנו גם בשלב מאוחר יותר להשוות את הפלט ניסיוני שהושג באמצעות העכבר מוח פרוסות עם הניב מאת פרוסות המוח המתקבל חולדות ספראג-Dawley גברים בני אותו גיל. השלבים הבאים מתייחסים הכנת פרוסות המוח מחובר חלקית בו פעילות דמוית-interictal מונחה CA3 מהיר מרוסנת בהיפוקמפוס תקין, אינו יכול להפיץ את cortices parahippocampal, כמו תיאר23. היפוקמפוס-קליפת ניתוק זה מהווה דרישה מוקדמת כדי לימודי אפנון חשמל באמצעות הכנת פרוסה המוח ההיפוקמפוס-EC. Vibratome היה מתייחס לדגם נמצאת טבלת חומרים. דגמים אחרים עשויים לדרוש הליך שונה.
- עזים ומתנגד למכרסמים באמצעות איזופלוריין 5% carbogen גז התערובת מועברת לתא אינדוקציה הרדמה ב 2 ל'/דקה.
- תחת הרדמה עמוקה (אין רפלקסים בתגובה הרגל, כפות רגליים לצבוט), לחלץ את המוח בתוך 1 דקות בעקבות הליכים סטנדרטיים כמו23. למקם את המוח בקערה קטנה המכילה חיתוך קרח equilibrated חנה המבר ואפשר להסתלבט s 90-120.
הערה: אל תתנו המוח מקררים למשך זמן רב מדי, אחרת זה עלול לקפוא. - יוצקים החיתוך כקרח חנה המבר במגש מאגר. התפשטות חיתוך כלנית חדד על גבי נייר הסינון להנחה על הקערה קפוא. מקם את המוח על גבי נייר הסינון, לבודד את הבלוק רקמת המוח נדרש על-ידי הסרת המוח הקטן וחיתוך הקוטב חזיתית ישר.
- בעזרת מרית כפופות, הדבק את הצד הגבי של המוח אל הדיסק הדגימה עם הצד לחתוך פרונטלית מול הרחוב אגר והמוט עורף מול הלהב vibratome. השתמש שכבה דקה של דבק מגע דבק. הכנס את הדיסק הדגימה המגש מאגר מיד ואבטח אותו.
- התאמת טווח אופטים כדי להזיז את הלהב vibratome לאורך כל הרקמה עד הרחוב אגר. להתאים את גובה הדיסק הדגימה כדי להגיע לרמה להב עם הרחוב רקמת המוח.
- ביטול הסעיפים רקמות עד ההיפוקמפוס נראה בבירור (בדרך כלל ~ 900 מיקרומטר). לאחר מכן, להגדיר את עובי הפרוסה של מיקרומטר 400 ולהתחיל לחתוך כדי לשמור את הסעיפים רקמות. עבור כל מקטע המוח לפצל את שתי ההמיספרות, לקצץ את הרקמה מיותרים כדי להשיג שתי פרוסות המוח. כפי המגש מאגר מועצמת במהלך בסעיפים הבאים, למלא את הגאוני מגש מאגר מים מזוקקים קר (ראה שלב 7.2.7).
- להשתמש על פיפטה פסטר הפוך כדי להעביר את פרוסות המוח במיכל השטיפה הראשונה, לרוקן את פיפטה פסטר ובעדינות להעביר את פרוסות המוח כשהספל השטיפה השנייה. לאחר מכן, להעביר את פרוסות המוח לתא המעצר ולתת להם לשחזר עבור פחות 60 דקות.
הערה: בדרך כלל זה אפשרי להשיג 6-8 פרוסות המוח הכללית. הפרוטוקול יכול להיות עצר כאן.
9. הכנת חנה המבר המכיל 4-AP (4AP-כלנית חדד)
הערה: פעולה זו דורשת 10 דקות הכנה, בתוספת 20 דקות של התחממות. זהירות! 4-AP היא תרופה convulsant והוא רעיל. להתמודד עם כפפות ולהימנע לשפוך.
- יוצקים 200 מ ל מים מזוקקים סטריליות 500 מ"ל.
- להוסיף 50 מ של מניות A, 50 מ של מניות B, 5 מ של מניות מ' ו- 1 מ מ חומצה אסקורבית L. בעדינות להתסיס בתנועות סיבוב עד לחומצה אסקורבית L היא התפרקה לחלוטין.
- להוסיף 500 µL של 4AP מניות.
- להוסיף מים כדי להגיע את עוצמת הקול הסופי, חותם על סטריליות עם איטום הסרט מזוקקים, בעדינות היפוך זה 3 - 5 פעמים עד הפתרון ברור באופן שווה.
- להרכיב את התא ומוכנסות 4AP (.cf. איור 1A) ויוצקים ~ 80 מ ל 4AP-חנה המבר לתוכו. לכסות את התא, להעביר אותו באמבט החמים, ולהתחיל מבעבעים עם תערובת דלק 95% O22 CO /5%. להסיר את כל הבועות לכוד באמצעות פיפטה הפוכה של פסטר. שמור מקורה.
- לחכות עד 4AP-חנה המבר הטמפרטורה היא 30-32 מעלות צלזיוס (~ 20 דקות).
הערה: הפרוטוקול עשוי להיות עצר כאן אם פרוסות המוח עדיין מחלים.
10. ההתחממות מראש, דגירה של פרוסות 4AP (משך זמן: 90 דקות)
- בדוק את חנה המבר מראש התחממות כדור הארץ, הטמפרטורה 4AP-חנה המבר 30-32 מעלות צלזיוס.
- השתמש של זכוכית הפוכה פיפטה פסטר להעביר 1 פרוסה המוח אל החדר מראש ההתחממות ולתת לשאר רקמות למשך 25-30 דקות. ואז להעביר את הפרוסה המוח אל החדר ומוכנסות 4AP-חנה המבר ולתת לו לנוח במשך 60 דקות.
11. הכנת הסידור MEA
הערה: מתחילים 15 דקות לפני הקלטה.
- העברת נפח הנותרים של 4AP-חנה המבר לתוך 500 מ ל Erlenmeyer את הבקבוק.
- הניחו את הבקבוק Erlenmeyer על מדף מעל המגבר MEA ולהשתמש אבובים כדי לאפשר את הפתרון להאכיל באופן רציף מזרק 60 מ. להתאים את הגובה את הבקבוקון Erlenmeyer ואת המזרק כדי לאפשר כוח המשיכה-fed בשיעור של 1 מ"ל לדקה.
הערה: בגובה הנכון תלויה הקוטר הפנימי אבובים (ID). עבור צינורות של מזהה 5/32 סנטימטרים, מספיקים 30 ס מ. - התחל מבעבעים את 4AP-כלנית חדד את הבקבוק Erlenmeyer, את המזרק עם 95% או2/5% CO2 גז תערובת.
- תן 4AP-חנה המבר הזרימה דרך הצנרת זלוף לתוך גביע עד היא ואין אוויר בתוך; אז תפסיק את זרימת פתרון.
- להתחבר גוף החימום בבסיס MEA התרמוסטט. מקם את השבב MEA יבש בתוך המגבר MEA ולאבטח את הראש במגבר. להשתמש על פיפטה פסטר פלסטיק כדי להעביר 4AP-כלנית חדד כניסת ואת מאגר החיצוני של החדר הקלטה.
- לאבטח את הצינורית חימום כדי מחזיק מגנטי ומקם את קצהו בתוך הנמל כניסת חדר הקלטה; לצרף את מחזיק מגנטי פס מגנטי על הראש במגבר MEA; להתחבר הצנרת זלוף הצינורית; לחבר את הצינורית התרמוסטט.
הערה: הצינורית חימום שאמור להיות מכוסה על ידי צינורות משופע טפלון (PTFE) כדי להגיע לחדר ההקלטה כניסת יציאת וכדי למזער את הרעש עקב החומר מתכתי של הצינורית. כאשר המאגר כניסת שלמאחה מלא 4AP-חנה המבר טיפות נופל מן המערכת זלוף לא צריך להיות גלוי. - למקם את המחט היניקה בתוך המאגר ולוודא שאין לחץ שלילי על ידי השוקע מחט שאיבה לתוך חנה המבר; בדוק אם יש רעש יניקה קבוע בתדר נמוך.
הערה: מחט שאיבה יוצבו כדי לאפשר את 4AP-חנה המבר לזרום מעל פני השטח פרוסה של המוח. קו ואקום או משאבת ואקום של רעש נמוך יכול לשמש. - הגדר את וסת זרימה כדי לאפשר קצב זרימה של 1 mL/min. ולהתחיל פרפוזיה.
הערה: כוח המשיכה-fed זלוף מבטלת את הרעש עלול להיגרם על ידי משאבות סחרור; אם משאבות סחרור עדיפים, מודלים רעש נמוכה הינם שדות חובה. - ברגע 4AP-כלנית חדד הוא זורם דרך הצינורית, הפעל את התרמוסטט. הגדר את הצינורית חימום 37 ° C ו הבסיס MEA עד 32 ° C כדי להשיג לטמפרטורה של 32-34 מעלות צלזיוס בתוך החדר הקלטה.
הערה: זהירות! אף פעם לא חום הצינורית ללא פתרון. או שזה בלתי הפיך שנפגמה. הגדר את הטמפרטורה של הצינורית גבוה יותר מאשר הטמפרטורה הקלטה (קרי, 32-34 מעלות צלזיוס) להביא בחשבון קיזוז טמפרטורה פנימי בין ערך ערכת ערך ממשי בקצה את הצינורית חימום ובתוך תא הקלטה. קצב הזרימה, טמפרטורת הסביבה והעוצמה של ההקלטה קאמרית כל השפעה הטמפרטורה של הפתרון הקלטה. ההגדרות דיווחו בשלב 11.9 הממוטבות את הפרוטוקול המתואר וציוד. תמיד לבדוק את הטמפרטורה בהקלטות באמצעות צמד תרמי והתאם את ההגדרות לפי הצורך. לא לחמם את הבסיס MEA מעל 34 ° C כדי למנוע התחממות יתר הפרוסה המוח. - מקום האלקטרודה הפניה חיצונית המאגר כניסת חדר ההקלטה.
הערה: למרות MEA שבבי הינם מצוידים עם אלקטרודה להפניה פנימית, זה מכוסה על ידי תא הקלטה מותאמת אישית. לכן, יש להשתמש אלקטרודה הפניה חיצונית. גלולה אשלגן כלורי רווי הוא המעשיים ביותר, שכן הוא מוכן לשימוש ללא צורך הכלרה.
12. לי לחיות מיפוי
- פעם אחת את רמת 4AP-חנה המבר ואת הטמפרטורה הקלטה התייצבו כמו התור המיוחל, את זלוף, את stopcocks היניקה למצב כבוי כדי לעצור אותם באופן זמני.
- במהירות העברה פרוסה אחת המוח אל תא MEA הקלטה באמצעות זכוכית הפוכה של פסטר פיפטה. התאם את מיקומו על האזור הקלטה MEA באמצעות הצורך של אש מלוטשים מסולסל פסטר פיפטה (איור 1C) או מברשת קטנה קומפקטית רכה. במקום העוגן hold-down (איור 1D) על הפרוסה המוח. הפעל מחדש את זלוף, היניקה על-ידי הפעלת stopcocks שלהם בחזרה למיקום.
הערה: קריטי! להעביר את הפרוסה, ויופעל זלוף בתוך 60 s או הרקמה עלולה למות. העוגן hold-down פרוסה יש לשמור במקום 4AP-חנה המבר כדי למנוע את הפרוסה המוח זז בעת הצבת נקודת העיגון על הפרוסה המוח עקב הבדלים שטחי מתח. עוגן כדי לאבטח את הפרוסה המוח אל כר הדשא יכול להיות בהזמנה אישית באמצעות פלדת אל-חלד חוט ניילון חוט (איור 1D) או שהושג ממקורות מסחריים. איור 1E מראה הגדרת ניסיוני הסופי עם השבב MEA מחובר לראש של המגבר: פרוסה המוח נח על השבב MEA בתוך תא הקלטה מוחזק על ידי העוגן מותאם אישית. האלקטרודה הפניה (עיגול אדום) ו PTFE אבובים המכסים את הצינורית חימום (חץ אדום) ממוקמות בתוך המאגר כניסת, ואילו המחט היניקה (חץ כחול) ממוקם בתוך המאגר עודפים.
- במהירות העברה פרוסה אחת המוח אל תא MEA הקלטה באמצעות זכוכית הפוכה של פסטר פיפטה. התאם את מיקומו על האזור הקלטה MEA באמצעות הצורך של אש מלוטשים מסולסל פסטר פיפטה (איור 1C) או מברשת קטנה קומפקטית רכה. במקום העוגן hold-down (איור 1D) על הפרוסה המוח. הפעל מחדש את זלוף, היניקה על-ידי הפעלת stopcocks שלהם בחזרה למיקום.
- צלם תמונה של הפרוסה המוח בעזרת מצלמה רכוב על במה מיקרוסקופ הפוכה.
- הפעל את התסריט mapMEA על תוכנת מחשב להתחיל GUI כדי למפות את האלקטרודות.
הערה: התוכנה בהזמנה אישית מאפשרת למשתמש לבחור האלקטרודות התואמים למבנים מסוימים של הפרוסה המוח. שלב זה חיוני להפעיל את השביל הנכון ולא לדכא התקפי. פעילות באמצעות גירוי חשמלי.
התאנה 2: GUI עבור live מיפוי אלקטרודה MEA. (א) ייצוג סכמטי של הפרוסה ההיפוקמפוס משולב-EC ממוקם על כר הדשא. המבנים ברירת המחדל המשמש עבור פרוטוקול זה הם cornu ammonis 3 (CA3), enthorinal בקליפת המוח (EC), perirhinal בקליפת המוח (PC), ו- subiculum (SUB). האלקטרודה הפניה schematized כסמן משולש. אלקטרודות כיתרו ב קווים מנוקדים מייצגים את קואורדינטות XY התמונה מיישר. לכידת מסך (B) של GUI במהלך המיפוי MEA בשידור חי. בתרשים זרימה בצד השמאל של לכידת מציין התהליך צעד אחר צעד כדי לעקוב אחר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
- לחץ על הלחצן ' עיון ' כדי לטעון את התמונה של הפרוסה המוח. ודא האלקטרודה הפניה מופיע בשורה העליונה של החצי-הצד השמאלי של כר הדשא (איור 2 א, סימן משולש). לחץ על לחצן הפעל מצביע ולאחר מכן בחר את האלקטרודות העליון והתחתון בשורה השמאלי של המערך כדי לסמן את קואורדינטות XY יישור תמונה ומיפוי אלקטרודה.
- בתפריט הנפתח סוג פרוסה בחר אופקי. סמן את תיבת הסימון ברירת מחדל מבנים .
הערה: זה ניתן להתאים אישית את המבנים על ידי בחירת לחצן הזן מבנים חדשים . המבנים ברירת המחדל עבור הפרוסה המוח אופקי מתוארת באיור2 א. - באמצעות את pushbuttons ממוספרות מתחת לתמונה פרוסה המוח, בחר האלקטרודות המתאים רועי ולחץ את pushbutton המתאים בחלונית מבנים כדי להקצות להם (איור 2B); חזור על שלב זה עבור כל רואי.
- לחץ על לחצן שמור : התוכנה יוצרת תיקיה תוצאה בשם #EXP_LabelledElectrodes המכיל טבלת דיווח את אלקטרודות שנבחרו ואת ROIs.
13. הקלטה וחשמליים מודולציה של פעילות אפילפטית
- לאפשר הפרוסה המוח לייצב בתוך תא הקלטה למשך 5-10 דקות לפני הקלטה.
- הפעל את הגירוי יחידה לפחות 10 דקות לפני פרוטוקול גירוי כדי לאפשר כיול עצמי וייצוב. להפעיל את תוכנת שליטה גירוי וודא כי ממריץ, MEA מגבר מחוברים כראוי כמצוין על-ידי נורית LED ירוקה שבלוח הראשי של תוכנת שליטה הגירוי. נא עיין במדריכים של הנגינה המסוימים והתוכנה לקבלת פרטים נוספים,. cf. טבלת חומרים.
- להגדיר את הגירוי בתצורה דו קוטבית. בחר אלקטרודה זוגות עם השכבה תא כפירמידה subiculum CA1/צינתור (cf.24,25) בקרב אלה ממופים עם התסריט mapMEA (.cf. סעיף 12). השתמש חוט כדי להתחבר לאחד האלקטרודות שנבחר התקע שלילי בין ממריץ את האלקטרודה אחרים התקע חיובית של הערוץ ממריץ אותו. השתמש חוט אחר להתחבר הקרקע של ממריץ הקרקע של המגבר.
- הפעל את תוכנת ההקלטה. לרכוש נתונים, לחץ על לחצן לשחק הלוח הראשי של תוכנת הצריבה. . פריקה שיא לפחות 4 התקפי.
הערה: תדר הדגימה של 2 קילו-הרץ מאפשר רכישת שדה פוטנציאל עם רזולוציה הוגן תוך מזעור השימוש בשטח דיסק. קובץ הקלטה 5-מין לוקח ~ 80 MB. תדרים דגימה גבוהים יותר יהיה צורך, למשל, גירוי שיא חפצים או פעילות יחידת מרובה. להתבונן שדה פוטנציאל בלבד, השתמש במסנן נמוך לעבור בשידור חי ב- 300 הרץ לחתוך את פעילות יחידת מרובה. - קבע את עוצמת הגירוי.
- בתוכנת שליטה של הגירוי, להשתמש בלוח הראשי עיצוב מרובע biphasic חיובי-שלילי הנוכחי הדופק משך זמן של 100 µs/שלב.
הערה: זהירות! זרם ישיר גירוי דורש דופק תשלום מאוזנת כדי למנוע נזק לציוד. - בדיקה מהירה קלט/פלט (i/O) כדי לזהות את עוצמת הגירוי הטוב ביותר. לספק את הדופק גירוי מתוכנן בשלב 13.5.1 הרץ 0.2 או נמוכה יותר על-ידי הוספת מרווח בין הדופק של 5 s או יותר בטופס המתאים של תוכנת שליטה הגירוי. בכרטיסיה הדופק משרעת הזן של משרעת הדופק הראשונית של µA 100/שלב ולהגדיל על-ידי 50-100 שלבים µA-בכל ניסוי עד גירוי אמין שעלול לעורר אירועים כמו interictal cortices parahippocampal (בדוק את האותות דמיינו ידי תוכנת הקלטה).
- בתוכנת שליטה של הגירוי, להשתמש בלוח הראשי עיצוב מרובע biphasic חיובי-שלילי הנוכחי הדופק משך זמן של 100 µs/שלב.
- אפנון חשמלי של ictogenesis הלימבי
- התוכנית היחידה גירוי להעביר פרוטוקול גירוי של עניין. השתמש את משרעת גירוי שזוהו במהלך הבדיקה קלט/פלט.
הערה: הכשלונות של עורר תגובות צריך להיות ≤20%. - לאחר גירוי מפסיק, לאמת רשת שחזור למצב גירוי מקדים על ידי הקלטה לפחות 4 התקפי. הפרשות (כמו שלב 13.4).
Representative Results
מישורי אותי עם פריסה ומרווח אלקטרודה מיקרומטר 500 6 x 10 הן התקן הקלטת אידיאלי עבור פרוטוקול הניסוי המתואר כאן, מאז משתרע על פני שטח ההקלטה שלהם לאורך הפרוסה המוח בשלמותו (איור 3 א, ראה גם17). למרות מחורר לי (pMEAs) עדיף לשפר את חמצון הרקמות, אזור ההקלטה שלהם הוא קטן מדי (~ 2 מ מ קוטר). זה אינו מאפשר את הפריט החזותי בו זמנית של אותות חשמליים שנוצרו על-ידי ההיפוקמפוס, את cortices parahippocampal (נתונים לא מוצג; ראה18).
התבנית אפילפטית 4AP-induced הנצפה (איור 3 א) מוליד בנאמנות מה בדרך כלל נצפית במודל זה במבחנה באמצעות הקלטה פוטנציאליים שדות קונבנציונלי, כוללת שלושה סוגים של פעילות7, 26: (אני) התקפי כמו אירועים (איור 3B, ראשי חץ) הם עמידים לאורך זמן (> 20 s, טווח: 20-60 s) אירועים הדומה התכונות electrographic של תפיסת פעילות עם טוניק ורכיבים clonic (איור 3C); הם שנוצר בתוך cortices parahippocampal כל 3-5 דקות והזן מחדש את היווצרות בהיפוקמפוס דרך הכישור משוננת (איור תלת-ממד, חץ); (ii) איטי interictal כמו הפרשות (איור 3B, מעקב EC, פס שחור; מורחבת ב איור 3E) קצרות (< 1 s) האוכלוסייה האירועים המתרחשים בין אירועי התקפי ubiquitously בתוך ההיפוקמפוס-EC המוח פרוסה ההכנה להתרחש ב איטי (s בטווח 10-30); (iii) מהרinterictal כמו הפרשות (איור 3B, CA3 לאתר, פס שחור; הורחב בשנת איור 3E) הן חוזרות הבריף (< 1 s) האוכלוסייה אירועים שנוצרו על-ידי שדה בהיפוקמפוס המשנה CA3; כאשר בהתקפה שפר נשמרים, מהר CA3 מונחה אירועים interictal להפיץ לאורך הכביש בהיפוקמפוס ולעשות מאמץ של אנטי-ictogenic אפקט24 (נתונים לא מוצג); כדי למנוע התקפי. פעילות תתעייף, לצורך הפרוטוקול המתואר, פלט CA3 משובשת (.cf. איור 3B, E). צריך לציין כי מהר CA3 מונחה הפעילות interictal נרשם באמצעות אותי מתרחשת בקצב נמוך יותר (~ הרץ 0.4) מאשר תצפית באמצעות שדות קונבנציונלי פוטנציאל הקלטה עם פיפטות זכוכית (~ 1 הרץ, טווח: 0.5 - הרץ 2.0, הנתונים לא מוצג).
התוצאה מוצלחת של neuromodulation חשמל פרוסות המוח מכרסמים תלוי ההפעלה של מסלולים עצביים מסוימים27 יחד עם קישוריות פנימית בין האזורים הכלולים הכנה24. בדקנו פרוסות המתקבל למבוגרים זכר ספראג-Dawley חולדות, עכברים CD1 ואנחנו מצאו את העכבר במקום פרוסות המוח עכברוש מציעים החלופה הטובה ביותר בין גודל, עובי וקישוריות מהותי. ראשית, בזכות גודלם הקטן יותר, הם מתאימים אזור קטן הקלטה של זמינים מסחרית אותי יותר (איור 4A, משמאל: עכברוש, נכון: העכבר); שנית, הם גמישים יותר לתנאי חסרון, כי הוא מהותי MEA הקלטה (.cf. מבוא): למרות התקפי כמו הפרשות שנוצר על ידי רקמות אלו שני (איור 4B) הם משך זמן דומה (4C באיור משמאל), שלהם קצב ההתרחשות הוא נמוך באופן משמעותי פרוסות המוח של העכבר (n = 10 פרוסות בכל המינים; 2-זנבי אינטראקצית מבחן t, p < 0.001; איור 4C ימין). האחרון מאפשר מהירות מופרזת-up הפרוטוקולים ניסיוני, מאפשר לבחון מספר רב יותר של פרוסות המוח במהלך יום אחד ניסיוני: עבור ערכת התוצאות נציג, אנו יכול לבדוק מספר דומה של פרוסות המוח של שני המינים (חולדה: n = 58; העכבר: n = 52), אך מספר עכברים (n = 18) היה קטן קיפול כפול מהמספר של חולדות (n = 42).
יתר על כן, פרוסות המוח העכבר מופיעים להציג עם חיבורי צפופה, ולכן הם נוטים יותר כדאי להגיב neuromodulation חשמל ממושכת (איור 4D). לכן, במודל זה במבחנה של ictogenesis, הכדאיות סטימולציה חשמלית במטרה לשלוט על פעילות התקפי. הוא גדול יותר באופן משמעותי בעכבר מאשר על רקמת המוח חולדה. היבט זה משתקפת גם שיעור ההצלחה גבוה משמעותית של גירוי ניסויים המבוצעת באמצעות העכבר לעומת פרוסות המוח חולדה גם בעת מימושה גירוי ממושך מספר פרוטוקולים (4E איור). למעשה, רקמת מוח העכבר מופיע לעמוד טוב יותר גירוי חשמלי ממושכת כפי שהוצע על ידי שיעור ההישרדות גבוהים בתוך שנבדקו ניסיוני-מסגרת הזמן של 4 שעות (איור 4F). לפיכך, גודל קטן יותר, שימור טובה יותר של קישוריות פנימית גורם פרוסות המוח העכבר המועמד הטוב ביותר לביצוע MEA הקלטה שמטרתה לימוד אינטראקציות רשת בהיפוקמפוס-parahippocampal וכן להעריך חשמל פרוטוקולים neuromodulation הרלוונטיים TLE.
תקופתיים צועד נשא את CA1/subiculum ידוע כדי לשלוט ictogenesis הלימבי ההיפוקמפוס-EC שטופלו 4AP פרוסה הכנה24,25,27, עם 1 הרץ כמו התדירות האפקטיבית ביותר27. לכן, זה גם שימושי כמו פקד חיובי כדי להעריך את היעילות ואת היעילות של מדיניות neuromodulation אחרים (ראה לדוגמה25). כפי שהוזכר לעיל, פולסים חשמליים מועברת ישירות דרך כר הדשא (קרי, ללא צורך אלקטרודה גירוי חיצוני) יכול לעורר תגובות האוכלוסייה ברקמת המוח מכרסמים (ראה גם28). שימור מספקת קישוריות הרשת העצבית בתוך הפרוסה המוח, מיקום מדויק של הפרוסה המוח עלו על כר הדשא, הבחירה המתאימה של זוגות אלקטרודה מגרה לאפשר רודף neuromodulation חשמל ניסויים זה שליטה יעילה על ictogenesis. כפי שמוצג באיור 5A, זה אפשרי לשחזר את הקנוני 1 הרץ תקופתיים צועד פרוטוקול באמצעות אותי מישורי בהשמעת הקלטה והן כהתקן מגרה, עם יתרון נוסף כי ההשפעה של גירוי חשמלי, ניתן לאבחן בכל רחבי מדור רקמת המוח עם מספר גבוה יותר של נקודות תצפית במרווחים לא פחות לעומת ההקלטה פוטנציאליים שדות קונבנציונלי. איור 5B מראה כימות של התוצאות המתקבלות עבור n = 9 פרוסות המוח, המציין ירידה משמעותית של סה כ התקף בזמן גירוי (פעילות התקפי הכוללת תצפית משך זמן25) (דרך אחת-ANOVA, F(df): 6.84(2), p < 0.01, LSD מבחן פישר פוסט הוק , מוגן). התוצאות הן בקנה אחד עם הספרות עבור חיצוני מגרה אלקטרודות24,25.
לחישוב סה כ תפיסת הזמן, הזמן תצפית תלוי מרווח הזמן בין אירועים התקפי, והיא גם קובעת את משך הזמן המינימלי של פרוטוקול גירוי נדרש להעריך את ההשפעות של neuromodulation בביטחון. אנו מוצאים כי הקלטת הפרשות התקפי. לפחות 4 (, ומכאן לפחות 3 מרווחי זמן בין אירועי התקפי) הוא פשרה טובה בין הדוגמאות שנאספו והזמן הנדרש אוסף. בתנאי בקרה (קרי, ללא גירוי), הפעם התצפית היא השהיה בין תחילת האירוע הראשון התקפי נמדד הסיום של האחרון. במהלך neuromodulation, הפעם תצפית שווה משך פרוטוקול גירוי, שכן מטרת המדידה היא לכמת את התופעה המתרחשת לאורך כל הזמן ההפרעות שקיימת במערכת. מחשוב, השוואת הסכום הכולל תפיסת זמן יותר מאשר משך ומרווח של אירועי התקפי. הוא הפרמטר המתאים ביותר כדי להימנע מסוג II שגיאה. למעשה, יחד עם דיכוי מוחלט של פעילות התקפי, אפשרי גם רק אחד אירוע התקפי. נוצר במהלך גירוי חשמלי לעומת מספר האירועים שנצפתה התנאי שליטה. במקרה זה, ואילו מדידה את מרווח הזמן בין אירועים אינה אפשרית, מדידת משך התקפי. כמו משערך של גירוי יעילות אינו מייצג את התוצאה בפועל של neuromodulation (כלומר, צמצום פעילות התקפי).
בסך הכל, התוצאות המובאות כאן מציינים כי פרוסות המוח העכבר בשילוב מרעה הם כלי רב ערך למחקר אפילפסיה, לבצע מחקרים אמינים neuromodulation הרלוונטיים להתקדם בתחום DBS עבור הטיפול באפילפסיה. בנוסף, פרוטוקול המתוארים כאן משפר את הכדאיות פרוסה במוח ומאפשר רודף הפעלות ניסיוני למשך מספר שעות (איור 6), אשר עשויים להידרש, לדוגמה, על מנת להשוות את ההשפעות של גירוי חשמלי שונה פרדיגמות.
איור 3 : דפוס אופייני 4AP-induced אפילפטית דמיינו MEAs. מישורי (א) העכבר מוח פרוסה על מאה 6 x 10 מישורי (מרווח אלקטרודה: 500 מיקרומטר), side-by-side סקירה של התבנית 4AP-induced אפילפטית מדמיין עם הקלטה MEA. כל ריבוע ברשת להכיל את הפעילות הוקלט ב המיקום המתאים בתוך הפרוסה המוח. קווים כחולים מקווקווים להפנות השורות אלקטרודה יותר בבהירות. המספר אלקטרודה הקלטה מזוהה בצבע כחול בפינה השמאלית העליונה של כל ריבוע. האפור חצה מרובע מייצג האלקטרודה הפניה. (B) נציג מעקב מקטעים של דפוסי EC ו CA3 דמיינו בקנה מידה-זמן מהיר יותר. ראשי חצים מצביעות על אירועי התקפי. ב- EC האיתור זה אפשרי להעריך את המופע של איטי interictal הפרשות (שחור בר), ואילו שדה CA3 המשנה יוצר התבנית טיפוסי fastinterictal מתמשכת (פס שחור). (ג) הרחיבה הקלטה השחרור התקפי. מציג את התבנית טוניק-clonic טיפוסי. (ד) מהיר-סולם חזותי של המעבר טרום-ictal-כדי-התקפי. המתאים EC (אדום) ו- CA3 (שחור) מעקב מקטעי המסומן באמצעות העמודה האדומה (ב'). החץ מצביע על הופעת התקפי. השחרור. העקבות-גבי להדגיש כי האירוע התקפי. מקורו ב- EC, לאחר מכן הורשה שדה CA3 המשנה. (E) התצוגה מורחב של התקופות interictal המסומנים בפסי שחור (ב') מדגיש את חוסר מתאם בין איטי ואת דפוסי fastinterictal שנוצר על ידי הנציבות האירופית (אדום) ו CA3 (שחור), בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : פרוסות המוח העכבר מציעים של פלט ניסויית גבוהה יותר מאשר פרוסות המוח עכברוש. (א) המוח פורסים חולדה (משמאל), עכבר (מימין) הגילאים בהתאמה. הפרוסה המוח עכברוש הוא הרבה יותר גדול מאשר באזור MEA הקלטה, פעילותה חשמל, לא ניתן לאבחן באופן מלא. (B) השוואה חזותית ישירה של פעילות התקפי חוזרים ונשנים שנוצר על ידי עכבר, חולדה enthorinal קליפת המוח (EC). (ג) פרוסות המוח של עכבר עכבר ליצור הפרשות התקפי. משך זמן דומה, אך מרווח הזמן בין אירועים אלה הוא כמעט 2-fold חולדה בתוך רקמת המוח. * p < 0.05. ההצעה (D) בהשוואה חולדות, עכברים תשואה גבוהה יותר 2-fold של פרוסות המוח קיימא עבור ניסויים גירוי חשמלי מכוון שליטה ictogenesis. גירוי חשמלי של subiculum יכולה לעורר תגובות האוכלוסייה ב- cortices parahippocampal ב- 20 היחידה של 58 (34%) עכברים המוח פרוסות, לעומת 33 של 52 (63%) העכבר פרוסות המוח (צ'י2: 9.22; p = 0.002). p < 0.05. (E) בין פרוסות קיימא, שיעור ההצלחה בשליטה פעילות התקפי. הוא 2-fold עם העכבר לעומת פרוסות המוח של עכברוש (העכבר:-20 פרוסות המוח 33, 60%: עכברוש: 6 מתוך 20 פרוסות המוח, 30%; צ'י2: 4.67; p = 0.03). p < 0.05. העכבר (F) פרוסות המוח יכול לעמוד חזר על תקופות ממושכות של גירוי חשמלי מתמשכת (אזורים מוצלים גריי). על גירוי נסיגה, רקמת מוח העכבר תערוכות החלמה מלאה של התבנית אפילפטית, ואילו החולדה במוח רקמות הכדאיות נופל באופן דרמטי ב ה 3 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : ניסוי נציג של אפנון חשמלי של ictogenesis המוח בפרוסות מצמידים MEAs. (א) הקלטות של 4AP-induced התקפי. פעילות EC ו PC במהלך בקרת התנאי (אין גירוי), תקופתיים צועד (PP) ב 1 הרץ (גירוי החפץ הוא נחתך), ובמהלך השחזור על גירוי נסיגה. (B) כימות השפעת PP ב 1 הרץ על הסכום הכולל תפיסת הזמן. p < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6 : נציג הקלטה לטווח ארוך של פעילות התקפי הנוצרות על-ידי 4AP. (א) מעקב מקטעים מוקלטים 8 שעות לאחר המוח עם פרוסות הליך ו- h 2 הבאים של יישום 4AP. (B) מורחב לאתר מקטעים התואם הפרשות התקפי. מסגרת המזוהה על-ידי האותיות , bו- c בלוח (א) הצג העקביות של פעילות התקפי שנוצר לאורך הזמן-האלמנה התבוננות ממושכת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| מניות A | כימית | משקל מולקולרי | ריכוז (מ מ) |
| NaCl | 58.44 | 1150 | |
| הממס: מים מזוקקים | אשלגן כלורי | 74.55 | 20 |
| רכז: 10 x | 2פו ח'4 | 136.1 | 12.5 |
| טמפרטורת אחסון: 4 ° C | CaCl2* 2 H2O | 147.02 | 20 |
| זמן אחסון מרבי: 1 wk | D-גלוקוז | 180.2 | 250 |
| הערה: סינון באמצעות מסנן ממברנה 50 מ מ | |||
| מניות B | כימית | משקל מולקולרי | ריכוז (מ מ) |
| NaHCO3 | 84.01 | 260 | |
| הממס: מים מזוקקים | |||
| רכז: 10 x | |||
| טמפרטורת אחסון: 4 ° C | |||
| זמן אחסון מרבי: 1 wk | |||
| הערה: סינון באמצעות מסנן ממברנה 50 מ מ | |||
| מניות C | כימית | משקל מולקולרי | ריכוז (מ מ) |
| אשלגן כלורי | 74.55 | 20 | |
| הממס: מים מזוקקים | 2פו ח'4 | 136.1 | 12.5 |
| רכז: 10 x | MgCl2* 6-אייץ '-2O | 203.3 | 50 |
| טמפרטורת אחסון: 4 ° C | MgSO4* 6-אייץ '-2O | 246.47 | 20 |
| זמן אחסון מרבי: בשבועיים | CaCl2* 2 H2O | 147.02 | 5 |
| הערה: סינון באמצעות מסנן ממברנה 50 מ מ | |||
| מניות M | כימית | משקל מולקולרי | ריכוז (מ מ) |
| MgSO4* 6-אייץ '-2O | 246.47 | 100 | |
| הממס: מים מזוקקים | |||
| רכז: 100 x | |||
| טמפרטורת אחסון: 4 ° C | |||
| זמן אחסון מרבי: 4 wks | |||
| 4AP מניות | כימית | משקל מולקולרי | ריכוז (מ מ) |
| פמפרידין | 94.11 | 250 | |
| הממס: מים מזוקקים | |||
| רכז: 1000 x | |||
| טמפרטורת אחסון: 4 ° C | |||
| זמן אחסון מרבי: בשבועיים | |||
| הערה: מערבולת של 2-3 דקות או stirr למשך 30-60 דקות | |||
| הערה: זהירות! 4-AP היא toxic cinvulsant. שימוש בכפפות ולהימנע מתפשט או לשפוך. | |||
טבלה 1: מלאי פתרונות.
| מחזיק כלנית חדד | הקלטה כלנית חדד | חיתוך כלנית חדד | |||||
| כימית | ג [מ מ] | כימית | ג [מ מ] | כימית | ג [מ מ] | ||
| NaCl | 115 | NaCl | 115 | סוכרוז | 208 | ||
| אשלגן כלורי | 2 | אשלגן כלורי | 2 | אשלגן כלורי | 2 | ||
| ח'2PO4 | 1.25 | ח'2PO4 | 1.25 | ח'2PO4 | 1.25 | ||
| MgSO4 | 1.3 | MgSO4 | 1 | MgCl2 | 5 | ||
| CaCl2 | 2 | CaCl2 | 2 | MgSO4 | 2 | ||
| D-גלוקוז | 25 | D-גלוקוז | 25 | CaCl2 | 0.5 | ||
| NaHCO3 | 26 | NaHCO3 | 26 | D-גלוקוז | 10 | ||
| חומצה אסקורבית L | 1 | חומצה אסקורבית L | 1 | NaHCO3 | 26 | ||
| חומצה אסקורבית L | 1 | ||||||
| ה-pH | 7.4 | ה-pH | 7.4 | פירובט | 3 | ||
| Osmolality | mOsm 300/ק"ג | Osmolality | mOsm 300/ק"ג | ||||
| ה-pH | 7.4 | ||||||
| Osmolality | mOsm 300/ק"ג | ||||||
טבלה 2: פתרונות הרכב.
| פתרון בעיות | |||||
| בעיה | אמצעי-נגד | ||||
| הפרשות התקפי. להיראות 'מקוטע' | להקטין את קצב זלוף ו/או להנמיך את עוצמת הקול של חנה המבר מעל הפרוסה המוח על-ידי התאמת המיקום מחט שאיבה. | ||||
| אין פעילות התקפי. | (1) ודא CA3 מונחה אירועים מהר interictal הופצה אל קליפת המוח. להשתמש בלהב אזמל קטן (למשל, n.10) או מחט לנתק את בהתקפה שפר אם צריך להיות, אבל להיזהר לא לחתוך את חוטי ניילון העוגן hold-down פרוסה. סטריאו - או של מיקרוסקופ זקוף הם המתאימים ביותר, ואילו המיקרוסקופ ההפוכה הופכת משימה זו קשה מאוד. | ||||
| (2) לבדוק את הכדאיות פרוסה: גירוי חשמלי חזק. יוכל להפעיל פעילות התקפי? לחכות עד כ 2 h של יישום 4AP ולאחר מכן לשנות את המוח פרוסה אם פעילות התקפי לא התרחשה. | |||||
| הפרוסה המוח זז בעת הצבת העוגן hold-down | (1) בעדינות להסיר את העוגן פרוסה ולמקם את הפרוסה המוח. | ||||
| (2) בדוק העוגן פרוסה אחיד רטוב של 4AP-כלנית חדד. | |||||
| (3) להסיר את 4AP-חנה המבר מן החדר הקלטה לטובת הדבקה פרוסה המוח על כר הדשא. | |||||
| (4) למקם מחדש את העוגן hold-down פרוסה. | |||||
| הפרוסה המוח צף על השבב MEA לאחר שהועבר | (1) בעדינות האחות חנה המבר עודף עם פיפטה פסטר. | ||||
| (2) לי השבב ייתכן שתצטרך להיות מצופה מחדש. | |||||
| גירוי חשמלי לא זכה רשת תגובות | להגביר את עוצמת הגירוי, לשנות אלקטרודה זוגות. | ||||
| גירוי חשמלי יכול להפיק תגובות האוכלוסייה באזורים קורטיקליים proximal אבל לא דיסטלי | הבעיה היא ikely עקב קישוריות עניים או עוצמת הגירוי נמוך מדי. גירוי חשמלי עשוי להיות לא יעיל או יעיל באיזורים קורטיקליים מסוימים בלבד. מומלץ לשנות את המוח פרוסה. | ||||
| האות רועש | (1) לבדוק את האלקטרודה הפניה: בסיסית רועש יכולה לעיתים להיגרם המילוי לא שלם של המאגר כניסת כך האלקטרודות הפניה אינה לא לגמרי לעומק חנה המבר. | ||||
| (2) עיין של הארקה הכוללת של ציוד. | |||||
| (3) התאמת המיקום מחט שאיבה על מנת לשמוע צליל יניקה קבועה, רך. פרוק את המחט היניקה. | |||||
| (4) לנקות אנשי הקשר החיצוניים MEA עם אתנול באמצעות מקלון צמר גפן. | |||||
| (5) לי השבב פגום: לשנות את השבב MEA ולבדוק את יחס אות לרעש והאיורים. | |||||
טבלה 3: פתרון בעיות.
Discussion
הגיעו לבגרות בשנים האחרונות הודות עשורים של מחקר ופיתוח, הינם כלי רב ערך עבור חקירות נוירופיזיולוגיה אותי. לעומת הקלטה פוטנציאליים שדות קונבנציונלי, מציעים לי היתרון הגדול של מספר גבוה יותר של נקודות תצפית, המרחק בין אלקטרודה ידוע, אשר מכריעים לאתר במדויק את הרשת העצבית אינטראקציות.
גם יכול להיות מצמידים את טכניקת הקלטה MEA גישות אחרות אלקטרופיזיולוגיה, כגון תיקון-קלאמפ הקלטה15, כדי לחקור את הקשר בין תא עצב אחד ופעילות הרשת העצבית. יתר על כן, האפשרות להצגה חזותית שדה פוטנציאל ופעילות יחידת מרובות בו-זמנית של יכול לספק תובנות יקרות הקשר בין הפעילות של הרכבים עצביים קטן לבין רשתות עצביים קולקטיבית. השילוב עם צבעי מתח רגיש, הדמיית סידן optogenetics29 מאפשר מסיקים נוירופיזיולוגיה התופעות בעזרת גישות לכל מקרה. בנוסף מחקרים, הופך האפשרות של ביצוע הקלטה וגם גירוי עם אותה מערכת הטכניקה הקלטה MEA חזק מאוד תכליתי: לדוגמה, זה אפשרי ללמוד את תופעת הפלסטיות הסינפטית- הליבה של זיכרון צורה30, באמצעות פרוטוקולים neuromodulation המובאים כאן, רלבנטיות DBS לטיפול אפילפסיה ועוד מגוון רחב של הפרעות מוח. ההוכחה האחרונה כי ניתן להחיל בהצלחה טכניקת הקלטה MEA על רקמת המוח האנושי אפילפסיה16 מדגים תועלתו לא בפז במחקר אפילפסיה, שניהם כדי להבין את המנגנונים הבסיסיים המחלה ההרסנית הזאת ולדייק DBS אלגוריתמים דהוא זה.
עם זאת, לי כוח המרדף אלקטרופיזיולוגיה ניסויים בתנאים 'הגבל' עבור פרוסות המוח, עקב הדרישה של חדר הקלטה המשוקע ולצורך לתת למוח לחתוך את השאר על מצע מוצק איפה המיקרו-האלקטרודות משולבים. לפיכך, רקמת המוח לא מקבלות אספקת חמצן נאותה, אשר בתורו עלול להשפיע על איכות ההקלטות.
הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר להקליט באופן אמין וללמוד ictogenesis ברשתות הלימבי מכרסמים, מצמידים מרעה באמצעות מודל חריפה 4AP במבחנה כדי לרדוף אחרי תקופות ממושכות של גירוי חשמלי, המספקות מידע רלוונטי על הערכה הפוליסות DBS.
מחקרים קודמים על חשמל neuromodulation מרשתות הלימבי אפילפטי, בהתבסס על השימוש של הקלטה פוטנציאליים שדות קונבנציונלי השתמשו פרוסות המוח או עכבר או חולדה עם24,דומה תוצאות25; אבל השימוש של רקמת המוח עכברוש הוכיח יותר מאתגר, באופן סביר עקב קישוריות חלש יותר לעומת רקמת המוח המתקבל עכברים7. לגבי הטכניקה MEA, פרוסות המוח העכבר הם המתאימים ביותר בשל גודלם הקטן יותר. יתר על כן, בהינתן שיעור גבוה יותר של מופע של הפרשות כמו התקפי. עכבר לעומת רקמת המוח החולדה, זה אפשרי לבדוק פרוסות המוח יותר באופן משמעותי במהלך יום אחד ניסיוני, אשר בתורו גורם איסוף נתונים יעילה ומהירה, יכול להפחית את מספר בעלי החיים שבהם משתמשים.
משמעות לגבי שיטות קיימות:
הפרשות התקפי. הוקלט באמצעות תא מותאם אישית המתוארים כאן מופיעים דומים ב משך וקצב של התרחשות לאלה שנמדדו באמצעות תא טבעת MEA קונבנציונלי ו- MEA מאותו סוג (מיקרו-אלקטרודות מישורי, cf. 17). עם זאת, זה צריך להדגיש כי עובי הפרוסה המוח חייב להיות משמעותית בעת שימוש לחדר ההקלטה עגול קונבנציונאלי יחד עם שיעור נמוך זלוף (1 מ"ל לדקה), אשר עלול להפריע המרדף מוצלחת של neuromodulation ניסויים עקב כדי קישוריות המסכן.
פרוטוקול זה, חדר הקלטה מותאמת אישית בנפח נמוך בהשראת תיקון-קלאמפ הקלטה קאמרית עיצוב מספקת זרימה שכבתית אמינה ויציבה, זה חיוני עבור המרדף מוצלחת של הקלטות MEA; זה גם מאפשר להגדיל את עובי הפרוסה המוח מיקרומטר 400 על מנת להשיג פשרה הוגנת בין רקמות הכדאיות וקישוריות מהותי. הוא אכן מוכר זה זרימה שכבתית של הפתרון הקלטה בתוך התא הוא רצוי מאוד עבור המוח פרוסה אלקטרופיזיולוגיה, כיוון זה אינו מושפע טמפרטורה, חמצן, מעברי pH הם נצפו circular זרימה סביב הקלטת צ'יימברס19,20,31 (כמו אלה סיפק לי זמינים מסחרית). מעברי צבע כזה גורם להטיה ניסיוני, פוגמים גם לחתוך המוח. הקלטה לשכות נפח קטן יחסית (~1.5 מ"ל) יחד עם16,קצב (5-6 mL/min) זלוף גבוה31 לאפשר לחילופי נאותה של המדיום זלוף (≥ 3 פעמים / min). החדר מותאם אישית יכול להיות בקלות שהושג ממקורות מסחריים במחיר סביר או יוצרו בחברה באמצעות טכנולוגיית הדפסת תלת-ממד. מחקרים אחרים דיווחו לי הקלטות מ 400 המוח האנושי מיקרומטר בעובי פרוסות16 באמצעות תא טבעת MEA קונבנציונאלי, תוך שמירה על אמצעי האחסון כלנית חדד מ ל 1 ואכיפת שיעור זלוף גבוהה (5-6 mL/min) בעזרת משאבה סחרור רעש נמוכה. עם זאת, המחברים השתמשו דגם אחר של ictogenesis, כלומר, את נמוכה מ ג2 +, אשר סביר שפחות מושפע מאשר הדגם 4AP ephaptic מנגנונים מעורבים עליות משמעותיות בריכוז K+ חוץ-תאית 11 , 22. מצאנו כי שיעור גבוה זלוף אינה רצויה במודל 4AP, כנראה עקב בכביסה מהר החוצה של K חוץ-תאית שהצטברו+, אשר ייתכן צריך להיות גדל באופן משמעותי בהקלטה כלנית חדד16. למעשה, אירועי התקפי. הופיע יותר 'מקוטע' כאשר מהירות זלוף ASCF הוגדל ל 2-3 mL/min הפרוסה המוח שקעה על ידי חנה המבר שכבה עבה, ואילו הפרשות במלוא מובן המילה מציג רכיבי טוניק-clonic חזקים יכול להיות משוחזר על החזרה קצב זלוף נמוך יותר (1 מ"ל לדקה), חנה המבר דק יותר של שכבה ממש על פני השטח רקמות (נתונים לא מוצג). תא הקלטה מותאמת אישית שמתואר פרוטוקול זה מאפשר להחלפת המדיום זלוף 3 - 5 פעמים / min בספיקה של 1 מ"ל לדקה. לפיכך, אספקת החמצן הכוללת לפרוסות המוח בחום משופרת אפילו במחירים זלוף נמוכה יחסית, תוך שמירה עדיין יציבה מקליט טמפרטורה, יחס אות לרעש גבוה. והכי חשוב, זה אפשרי לשמור על ריכוז K+ חוץ-תאית לערך פיזיולוגיים.
המודל 4AP של ictogenesis לא דורשת כל שינוי משמעותי של הרכב יוניים כלנית חדד, כגון Mg להורדת2 + או הגדלת K+, ומציע את היתרון הייחודי של שמירה על שידורי סינאפסות והן מעכבות ללא פגע 12, היבט זה מאוד רלוונטי במחקר אפילפסיה לאור תפקיד מכריע הן glutamatergic והן GABAergic רשתות בסנכרון אפילפטית (cf. 7). בשימוש פרוטוקול זה 4AP-חנה המבר מכיל ריכוז K+ פיזיולוגית (3.25 מ מ) מ ג2 + ריכוז נמוך במקצת מאשר החזקת כלנית חדד (1 מ"מ לעומת 1.3 מ'מ). ריכוז זה עדיין נופל בתוך הערכים פיזיולוגיים המדווחת של Mg2 + ריכוז למכרסמים CSF, זה משמש במעבדות רבות (ראה לדוגמה17,18). המטרה של הפרוטוקול המתואר, מצאנו כי זו ירידה קלה מועדף כדי לסייע האפקט של 4AP.
בעבודה הקודמת, 4AP הוחלה על הפרוסה המוח כאשר הוא הוצב כבר בתוך הקלטת קאמרית17,18. אלא אם כן הנסיין צריך להתבונן ההשהיה הזמן בין תחילת אפילפטית דפוסי היישום 4AP, נמצא כי גישה זו הוא במקום זמן רב ואינה מתאימה לרדוף את ההקלטה ממושך והפעלות גירוי תיאר ב פרוטוקול זה. קדם דגירה של פרוסות המוח 4AP ב 32 ° C מאפשר ממעט זמן הניסוי הרבה, מאז פרוסות המוח יכול להיות טרום שטופלו בסדרה תוך כדי לרדוף אחרי הניסוי באמצעות סעיפים אחרים רקמות.
הכדאיות ממושך של פרוסות המוח עשוי להיות שימושי לנתח תכונות רשת לטווח הארוך. יתר על כן, העמידות שלהם משופר החוזרות על עצמן גירוי חשמלי הוא יתרון גדול אם הנסיין רוצה להשוות בין מספר פרוטוקולים גירוי, אשר חייב להתבצע בתוך הפרוסה המוח זהה עבור חוסן סטטיסטי. בידיים שלנו, בעת בדיקת הפרוטוקולים גירוי 3, אחד ולפניהם שלב הבקרה, בעקבות שלב ההתאוששות, הניסוי יימשך 3-5 שעות. בהקשר זה, מיפוי MEA חיים חיונית על מנת להפעיל את השביל הנכון ועל העלם ולא טובה ictogenesis באמצעות גירוי חשמלי. GUI ידידותי למשתמש שלנו מייצג כלי מהיר, פשוט וגמיש כדי למפות את האלקטרודות של מבנים שונים במוח. בניגוד תוכנה מסחרית, זה אפשר להוסיף פריסות מותאמות אישית MEA אפילו עם ידע בתכנות בסיסי. ניתן לרכוש תמונות בשדה בהיר; לפיכך, כל מצלמה למטרה כללית יש רזולוציה טובה, מתאים מיקרוסקופ מתאימה. מיקרוסקופ הפוכה חיונית כדי להמחיש את המיקום microelectrodes ביחס הפרוסה המוח, שכן אלו מוסתרים מתחת לרקמת אם באמצעות מיקרוסקופ זקוף. עם זאת, סטריאו-המיקרוסקופ מומלץ בנוסף הסוג ההפוך אם הנסיין צריך לבצע סכין-חתכים לשבש מסלולים עצביים מסוימים.
לבסוף, יתרון נוסף של הגישה המוצעת היא מכלול זול וקל יחסית של רוב הכלים הנדרשים, כמו תא הקלטה מותאמת אישית של הצ'יימברס אחזקות, באמבט החמים העוגן פרוסה, וכן שימוש מיותר יקר משאבת סחרור רעש נמוכה.
מגבלות של הטכניקה:
הקלטה MEA אינו מאפשר להמחיש גלים איטיים מאוד, קרי, DC משמרות בתוך האות. Deflections בסיסית כזה עשוי לסייע מדידה אסימפטוטית של התקפי פריקה משך והוא, והכי חשוב, הם היסוד ללמוד דיכאון מתפשטת בקליפת המוח (תופעה מתייחס למוות פתאומי בלתי צפוי ב אפילפסיה32 משותפת בין אפילפסיה ומיגרנה33).
לגבי neuromodulation חשמל, הפרוטוקול המתואר כאן מאפשרת ביצוע מספר מפגשים גירוי מבלי להשפיע על המוח פרוסה הכדאיות. בהצלחה שיכולנו לבצע עד 3 מפגשים גירוי בני 20-45 דקות, דומה מה לדווח העבודה הקודמת25. למרות פרוסות המוח עשוי כנראה לעמוד מספר גבוה יותר של הפעלות גירוי או פרוטוקולים גירוי יותר זמן, אנחנו לא בדק פרוסות המוח בהקשר זה. אנו ממליצים על הגבלת מספר פרוטוקולים גירוי 3 והימנעות ממושכת הפעלות גירוי (≥60 דקות), אשר באופן משמעותי עלול להדגיש את רקמת המוח נשמר בתנאים אלה מגבלת ', עד חוסר התאוששות על גירוי נסיגה.
שלבים קריטיים בתוך הפרוטוקול:
מספר גורמים קריטיים עשויה לעכב המרדף מוצלחת של הקלטה, מודולציה של פעילות אפילפטית פרוסות המוח מצמידים MEA. מלבד המינים מכרסמים בשימוש, האיכות את פרוסות המוח, קצב זלוף במהלך ההקלטה ואת הדינמיקה של הזרם כלנית חדד (כלומר., למינריות לעומת מעגלי) בתוך התא הקלטה, אנחנו מצאו כי התנאים של התאוששות, תחזוקה לטווח הארוך של פרוסות המוח, כמו גם המצב של יישום 4AP הם הצעדים הקריטיים ביותר.
בעת שימוש בתא המעצר המשוקע זה הכרחי לאחסן את פרוסות המוח בטמפרטורת החדר כדי לשמר פעילות רשת של רקמת המוח וחסדך של אינדוקציה של הפרשות כמו התקפי. על-ידי יישום 4AP. בידיים שלנו, שחזור ותחזוקה -32 מעלות צלזיוס התדרדרה על רקמת המוח בתוך 3-4 h ששיספתי.
דגירה של המוח פרוסות ב- 4AP-חנה המבר בטמפרטורת החדר, הקלטה ב 32 ° C, אולם הוא לא רצוי. מצאנו בקשיים רבים התבוננות חזקים הפרשות התקפי חוזרים ונשנים במצב הזה. אכן, טמפרטורות נמוכות בטווח 20 – 24 ° C דווחו לצנן או אפילו למנוע ictogenesis 4AP-induced שני חוץ גופית בתוך34 ו ויוו35. לפיכך, הטמפרטורות הקלטה של דגירה 4AP חייב ליפול בתוך 30-34 ° C, חייב להיות מתאימים. כדי להימנע לשים על רקמת המוח תחת לחץ עקב אינדוקציה סימולטני של אי-שקט על פי 4AP, חשיפה פתאומית של פרוסות המוח של טמפרטורת החדר כדי 4AP חמים (32 ° C)-חנה המבר, זה הבסיס לביצוע של ביניים מראש התחממות כדור הארץ שלב ולתת שפרוסות המוח habituate במעצר כלנית חדד-32 מעלות צלזיוס במשך 20-30 דק. דילוג על שלב זה עלול להשפיע על אינדוקציה ictogenesis על ידי 4AP.
היבט נוסף צריך להיות מוזכר הוא החשיבות של D-גלוקוז ריכוז כלנית חדד לאחר חיתוך. ריכוז 25 מ מ משמרת את פרוסות המוח טוב יותר הריכוז 10 מ"מ בשימוש במעבדות רבים של גם משפר את שיעור ההתרחשות של פעילות התקפי, אשר 2-fold מהר יותר (לכן, ובכך להקל על לרדוף אחרי סדרה ארוכה של ניסויים פרוטוקולים המוח מספר פרוסות בכל יום).
לבסוף, כמה פרטים חשובים בסדר במהלך ההליך עם פרוסות צריך להיות מוזכר. ראשית, אל תאפשר המוח ללא פגע, את פרוסות המוח לקפוא בקור חיתוך כלנית חדד. מצמרר המוח עבור < 2 דקות מספיקה נוכח היקפה המצומצם של המוח העכבר. מקטעי רקמת צריך להעביר מיד ממגש מאגר בקבוקונים השטיפה בטמפרטורת החדר. שטיפה החיתוך כלנית חדד הוא מאוד חשוב שאחרת הריכוז סוכרוז גבוה יגרום המוח פרוסות לדבוק רשת ניילון של תא המעצר. לשטוף ביעילות את הרקמה, חשוב למזער את התכנים חנה המבר חיתוך פיפטה העברה כדי לא לזהם את החזקת חנה המבר יתר על המידה. 2-שלב השטיפה מסייעת למזער את הזיהום. עם סיומו של ההליך עם פרוסות, מקטעי רקמת יש להעביר מיד מ בקבוקונים השטיפה לתא המעצר, איפה הניילון רך mesh מושעה במחצית הדרך במעצר חנה המבר מאפשר חמצון הרקמות משני הצדדים. אותו עיקרון צריך להיות מיושם בכל שלבי ביצוע שלבי ההליך עם פרוסות: פרוסות המוח אף פעם לא צריכה לשבת בתחתית הספל, הם לא צריכים להיות בקשר עם צדי הצ'יימברס אחזקות, הם לא צריך להיות בקשר עם אחד את השני ולא חופפים.
שינויים, פתרון בעיות:
הרכב חנה המבר ניתן לשנות על פי הצרכים של הנסיין. לדוגמה, ניתן להוסיף תרופות לנתח את התרומה של נוירוטרנסמיטורים מסוימים או תעלות יונים על היעילות של neuromodulation חשמל. יתר על כן, pyruvic וחומצה אסקורבית (.cf. בטבלה 2) עשוי להיות מושמט, למרות שנמצא כי הם מפעילים תפקיד neuroprotective עוצמה. . מדווחים בטבלה 3 הבעיות הנפוצות ביותר שניתן נתקל ב פרוטוקול זה וכיצד להתמודד איתם.
מסקנות:
הקלטה MEA הוא ללא ספק טכניקה שלא יסולא בפז לפנות את האינטראקציות של רשתות עצביים על בריאות ומחלה. בנוסף מחקרים, זה גם אפשרי להעריך פרוטוקולים neuromodulation חשמל הרלוונטיים DBS חלה על אפילפסיה והפרעות נוירולוגיות אחרות. ב פרוטוקול זה, אנחנו הראו כי זה אפשר לשחזר את גירוי תקופתי טיפוסי ניסויים עם תוצאות דומות לאלו שהושגו עם הקלטה פוטנציאליים שדות קונבנציונלי חוץ-תאית וחיצוניים מגרה אלקטרודות. הזמינות הגוברת של ציוד מסחרי ידידותי למשתמש, כלי תוכנה מתקדמים להפוך את טכניקת הקלטה MEA מתאים גם לניסויים לולאה סגורה גירוי, גירוי אד הוק לרקמת המוח, וכדי לספק לחקור את התרומה של מנגנוני משוב תגובות הרשת העצבית.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
ג. פ הוא עמית הספרותמוזאון מארי במימון הפרויקט האיחוד האירופי MSCA-אם-2014 Re.B.Us, n.660689 לשכניו, במסגרת התוכנית מסגרת H2020. MapMEA GUI זמין באופן חופשי על פי בקשה לעריכת ilaria.colombi@iit.it.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Adrich | P7886 | Needed for MEA coating |
| NaCl | Sigma-Adrich | S9888 | Chemical |
| KCl | Sigma-Adrich | P9541 | Chemical |
| KH2PO4 | Sigma-Adrich | 795488 | Chemical |
| CaCl2*2 H2O | Sigma-Adrich | C3306 | Chemical |
| D-Glucose | Sigma-Adrich | RDD016 | Chemical |
| NaHCO3 | Sigma-Adrich | S5761 | Chemical |
| MgCl2*6 H2O | Sigma-Adrich | M2670 | Chemical |
| MgSO4*6 H2O | Sigma-Adrich | M5921 | Chemical |
| Sucrose | Sigma-Adrich | RDD023 | Chemical |
| Pyruvic Acid, 98% | Sigma-Adrich | 107360 | Chemical |
| 4-aminopyridine | Sigma-Adrich | A78403 | Convulsant drug |
| STG-2004 | Multichannel System | STG4004-1.6mA | 4-channel stimulus generator with voltage (±8 V) and current output (±1.6 mA) |
| MEA1060 | Multichannel System | N/A | MEA amplifier |
| planar MEA | Multichannel System | 60MEA500/30iR-Ti w/o ring | Must be without ring to allow using the custom recordingchamber |
| McRack | Multichannel System | Recording software | |
| McStimulus II | Multichannel System | STG4004 control software | |
| TC02 | Multichannel System | TC02 | 2-channel thermostat |
| PH01 | Multichannel System | PH01 | Heating perfusion canula |
| MPH | Multichannel System | MPH | Magnetic holder for PH01 and suction needle |
| Elastostil E43 | Wacker | E43 | Elastomeric sealant used to mount the custom recording chamber onto the MEA |
| MEA Custom Chamber | Crisel Instrument | SKE-chamber MEA | Custom recording chamber |
| Ag/AgCl electrode, pellet, 1.0 mm | Crisel Instrument | 64-1309 | Reference electrode for the custom recording chamber |
| Tergazyme | Sigma-Adrich | Z273287-1EA | Enzymatic cleaner |
| MATLAB | The Mathworks | Programming environment for electrodemapping | |
| VT1000S | Leica Biosystems | VT1000S | Vibratome |
| Warner Instruments | 64-1309 | Ag-AgCl Electrode Pellet 1.0 mm (E205). Reference electrode. |
References
- Fisher, R. S., et al. Operational classification of seizure types by the International League Against Epilepsy: Position Paper of the ILAE Commission for Classification and Terminology. Epilepsia. 58 (4), 522-530 (2017).
- WHO. Epilepsy Facts Sheet. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs999/en/ (2017).
- Fiest, K. M., Birbeck, G. L., Jacoby, A., Jette, N. Stigma in epilepsy. Curr Neurol Neurosci Rep. 14 (5), 444 (2014).
- Brodie, M. J., Barry, S. J., Bamagous, G. A., Norrie, J. D., Kwan, P. Patterns of treatment response in newly diagnosed epilepsy. Neurology. 78 (20), 1548-1554 (2012).
- Tanriverdi, T., Poulin, N., Olivier, A. Life 12 years after temporal lobe epilepsy surgery: a long-term, prospective clinical study. Seizure. 17 (4), 339-349 (2008).
- Dingledine, R. Brain slices. , Plenum Press. (1984).
- Avoli, M., et al. Network and pharmacological mechanisms leading to epileptiform synchronization in the limbic system in vitro. Prog Neurobiol. 68 (3), 167-207 (2002).
- Rutecki, P. A., Lebeda, F. J., Johnston, D. Epileptiform activity induced by changes in extracellular potassium in hippocampus. J Neurophysiol. 54 (5), 1363-1374 (1985).
- Mody, I., Lambert, J. D., Heinemann, U. Low extracellular magnesium induces epileptiform activity and spreading depression in rat hippocampal slices. J Neurophysiol. 57 (3), 869-888 (1987).
- Huberfeld, G., et al. Glutamatergic pre-ictal discharges emerge at the transition to seizure in human epilepsy. Nat Neurosci. 14 (5), 627-634 (2011).
- Pitkanen, A. Models of seizures and epilepsy. , (2017).
- Rutecki, P. A., Lebeda, F. J., Johnston, D. 4-Aminopyridine produces epileptiform activity in hippocampus and enhances synaptic excitation and inhibition. J Neurophysiol. 57 (6), 1911-1924 (1987).
- Gross, G. W., Rieske, E., Kreutzberg, G. W., Meyer, A. A new fixed-array multi-microelectrode system designed for long-term monitoring of extracellular single unit neuronal activity in vitro. Neurosci Lett. 6 (2-3), 101-105 (1977).
- Pine, J. Recording action potentials from cultured neurons with extracellular microcircuit electrodes. J Neurosci Methods. 2 (1), 19-31 (1980).
- Reinartz, S., Biro, I., Gal, A., Giugliano, M., Marom, S. Synaptic dynamics contribute to long-term single neuron response fluctuations. Front Neural Circuits. 8, 71 (2014).
- Dossi, E., Blauwblomme, T., Nabbout, R., Huberfeld, G., Rouach, N. Multi-electrode array recordings of human epileptic postoperative cortical tissue. J Vis Exp. (92), (2014).
- Boido, D., et al. Cortico-hippocampal hyperexcitability in synapsin I/II/III knockout mice: age-dependency and response to the antiepileptic drug levetiracetam. Neuroscience. 171 (1), 268-283 (2010).
- Gonzalez-Sulser, A., et al. The 4-aminopyridine in vitro epilepsy model analyzed with a perforated multi-electrode array. Neuropharmacology. 60 (7-8), 1142-1153 (2011).
- Hajos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. Eur J Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).
- Ivanov, A., Zilberter, Y. Critical state of energy metabolism in brain slices: the principal role of oxygen delivery and energy substrates in shaping neuronal activity. Front Neuroenergetics. 3, 9 (2011).
- MultichannelSystems. Manual PH01. , Available from: https://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/PH01_Manual.pdf (2018).
- Zhang, M., et al. Propagation of epileptiform activity can be independent of synaptic transmission, gap junctions, or diffusion and is consistent with electrical field transmission. J Neurosci. 34 (4), 1409-1419 (2014).
- Panuccio, G., et al. In vitro ictogenesis and parahippocampal networks in a rodent model of temporal lobe epilepsy. Neurobiol Dis. 39 (3), 372-380 (2010).
- Barbarosie, M., Avoli, M. CA3-driven hippocampal-entorhinal loop controls rather than sustains in vitro limbic seizures. J Neurosci. 17 (23), 9308-9314 (1997).
- Panuccio, G., Guez, A., Vincent, R., Avoli, M., Pineau, J. Adaptive control of epileptiform excitability in an in vitro model of limbic seizures. Exp Neurol. 241, 179-183 (2013).
- Benini, R., Avoli, M. Rat subicular networks gate hippocampal output activity in an in vitro model of limbic seizures. J Physiol. 566 (Pt 3), 885-900 (2005).
- D'Arcangelo, G., Panuccio, G., Tancredi, V., Avoli, M. Repetitive low-frequency stimulation reduces epileptiform synchronization in limbic neuronal networks. Neurobiol Dis. 19 (1-2), 119-128 (2005).
- Steidl, E. M., Neveu, E., Bertrand, D., Buisson, B. The adult rat hippocampal slice revisited with multi-electrode arrays. Brain Res. 1096 (1), 70-84 (2006).
- Pulizzi, R., et al. Brief wide-field photostimuli evoke and modulate oscillatory reverberating activity in cortical networks. Sci Rep. 6, 24701 (2016).
- Liu, M. G., Chen, X. F., He, T., Li, Z., Chen, J. Use of multi-electrode array recordings in studies of network synaptic plasticity in both time and space. Neuroscience Bulletin. 28 (4), 409-422 (2012).
- Maier, N., Morris, G., Johenning, F. W., Schmitz, D. An approach for reliably investigating hippocampal sharp wave-ripples in vitro. PLoS One. 4 (9), e6925 (2009).
- Aiba, I., Noebels, J. L. Spreading depolarization in the brainstem mediates sudden cardiorespiratory arrest in mouse SUDEP models. Sci Transl Med. 7 (282), 282ra246 (2015).
- MA, R., et al. Jasper's Basic Mechanisms of the Epilepsies . Avoli, M., Noebels, J. L., Rogawski, M. A., et al. , 4th, National Center for Biotechnology Information (US). Bethesda (MD). (2012).
- Motamedi, G. K., et al. Termination of epileptiform activity by cooling in rat hippocampal slice epilepsy models. Epilepsy Res. 70 (2-3), 200-210 (2006).
- Yang, X. F., Duffy, D. W., Morley, R. E., Rothman, S. M. Neocortical seizure termination by focal cooling: temperature dependence and automated seizure detection. Epilepsia. 43 (3), 240-245 (2002).
