Summary
כאן, אנו מציגים את פרוטוקול שימוש דרוזופילה נוירון חישה - דנדריטים arborization (da) נוירון פציעה דגם, אשר משלב ויוו לחיות הדמיה, שני הפוטונים לייזר axotomy/dendriotomy ואת הכלים גנטי לטוס עוצמה, פלטפורמה לסינון היזמים הפוטנציאליים, מעכבי של neuroregeneration.
Abstract
היכולת לצמיחה מחודשת של נוירונים פגום מושלת neuroregeneration ושחזור פונקציונלי אחרי טראומה מערכת העצבים. במהלך העשורים האחרונים, זוהו פנימי ולא חיצוני מעכבות גורמים שונים המעורבים ההגבלה של האקסון התחדשות. עם זאת, הסרת רמזים מעכבות אלה אינו מספיק מוצלח ההתחדשות, המצביע על קיומן של מכונות רגולטוריות נוספות. דרוזופילה melanogaster, זבוב הפירות, חולק גנים שנשמרת אבולוציונית, איתות המסלולים עם בעלי חוליות, כולל בני אדם. שילוב הכלים גנטי רב עוצמה של הזבובים עם שני הפוטונים לייזר axotomy/dendriotomy, נתאר כאן דרוזופילה נוירון חישה – דנדריטים arborization (da) נוירון פציעה דגם כפלטפורמה לסינון באופן שיטתי על הרומן התחדשות הרגולטורים. בקצרה, זו הפרדיגמה כולל a) הכנה של הזחלים, ב) הנגע אינדוקציה dendrite(s) או axon(s) באמצעות לייזר שני הפוטונים, ג) בשידור חי קונאפוקלית הדמיה לאחר פציעה ד) ניתוח ממצאים. המודל שלנו מאפשר פגיעה מאוד לשחזור של נוירונים שכותרתו יחיד, אקסונים ו דנדריטים של תתי סוגים עצביים מוגדרים היטב, הן ציוד היקפי והן במערכת העצבים המרכזית.
Introduction
חוסר היכולת של אקסונים להתחדש לאחר פציעה מערכת העצבים המרכזית (CNS), עלול להוביל נכות קבועה בחולים, גם משחק תפקיד גרעונות בלתי הפיך ניווניות מחלות1,2 ,3,4,5. הסביבה מערכת העצבים המרכזית, כמו גם יכולת גידול מהותי של נוירונים, קובע אם אקסונים מסוגלים להתחדש לאחר טראומה. גורמים חוץ-תאית וממקורות אוליגודנדרוציטים, astroglial, fibroblastic הוכחו לעכב צמיחה עצביים4,6,7,8, אבל חיסול של מולקולות אלה רק מאפשר מוגבלת הלבלוב5. התחדשות פנימית אותות יכול להשפיע על הצלחה משובי5,9 ומייצגים מטרות טיפוליות אפשריות, אך תהליכים אלה הם עדיין לא מוגדר היטב ברמה המולקולרית. העלאות עם מחלות גורם איתות או חיסול של בלמים אנדוגני, כגון פוספטאז Pten10, יכול לגרום התחדשות עצב בנסיבות מסוימות. שילובים של שיטות שונות נמצא יעיל באופן אינדיבידואלי מספקים גם רק ההתאוששות הכללית מוגבל עד כה11,12,13,14. לכן, אין צורך נואש כדי לזהות מסלולים נוספים לטיפול ממוקד. בנוסף אתחול של האקסון לצמיחה מחודשת, אם וכיצד אקסונים תיל מחדש אל המטרה הנכונה, הרפורמה סינפסה, ירידה לפרטים, ולהשיג שחזור פונקציונלי חשוב שאלות בלתי פתורות.
לסיכום, ההבנה הנוכחית של מכונות הכתבת התחדשות האקסון הוא עדיין מאד וכלליות. חלק מהבעיה היא הקושי הטכני של הלומדים האקסון התחדשות ביונקים בזמן אמת, גישה זה יקר, גוזלת זמן, ומאתגר עבור ניצוח מסכי גנטי בקנה מידה גדול. דרוזופילה melanogaster, מצד שני, הוכיחה להיות מערכת חזק לחקר שאלות ביולוגיות מורכבות. זבוב הפירות כבר אינסטרומנטלי הגדרת גנים והאיתות מסלולים זה נשמרים להפליא בבני אדם, היה מודל מוצלח לצורך המחקר של מחלות אנושיות, כמו מחלות ניווניות, דרך הכלים העצום גנטיקה מולקולרית זמין לתמרן ג'ין פונקציה15. בפרט, זבובי פירות, נחשבת כלי אידיאלי עבור גילוי גנים המעורבים פגיעה עצבית ו לצמיחה מחודשת15,16. פותחו מספר מודלים לטוס פגיעה עצבית, כולל ראש-מבוגר או עצב הגחון זחל כבל (VNC) לדקור עם מחטים, זחל VNC או עצב מעוך עם מלקחיים, נוירון זחל axotomy לייזר, הסרת נוירון קולטני ריח, פגיעה מוחית explants, פגיעה במערכת העצבים ההיקפית על ידי אגף פיצויי15,17,18,19,20,21,22,23. . Excitingly, זה התבצעה עבודה ניצול דרוזופילה פציעה מודלים המתקדמת ההבנה שלנו של המסלולים הסלולר ותעשיה בשימוש על ידי מערכת העצבים להגיב לפגיעה עצבית, אשר הוכחו להיות שמור ב יונקים24 ,25. שוב, זה מדגיש את התועלת של זה אורגניזם מודל עבור זיהוי מנגנוני תיקון עצבי הרומן.
המתוארים כאן הוא שני הפוטונים מבוססת לייזר דרוזופילה נוירון חישה זחל פציעה מודל. לייזר שני הפוטונים השימוש הראשון היה לחתוך אקסונים דג זברה ויוו 200326. באותה שנה, dendriotomy לייזר הראשונה בוצעה בשנת דרוזופילה באמצעות לייזר של חנקן פעמו27. זמן קצר לאחר מכן, מספר מעבדות C. elegans להשתמש לייזר הפמטו-שנייה כדי ליצור מודלים של האקסון התחדשות28. ב- 2007, וו ועמיתיו בהשוואה ודיווח על ההבדלים בין פציעות לייזר ב- C. elegans המושרה על ידי סוגים שונים של לייזרים29. בשנת 2010, האקסון חידוש לאחר לייזר axotomy הוצג לראשונה להופיע אצל דרוזופילה30. בהתבסס על ספרות זו פגיעה נרחב לייזר, פיתחנו מודל פגיעה עצבית לעוף באמצעות הלייזר שני הפוטונים, המאפשר אינדוקציה מדויק לפגיעה אתרי יישוב עם ההפרעות מינימלי של רקמות שכנות, מתן יחסית נקי מערכת ללמוד בשני המאפיינים פנימי ולא חיצוני של neuroregeneration עם רזולוציה תא בודד. באופן ספציפי, הקמנו קבוצת שיטות הפציעה arborization דנדריטים (da) החישה הניריונים, הן מערכת העצבים ההיקפית (מערכת העצבים ההיקפית) ואת מערכת העצבים המרכזית. ניתן לקבץ Da נוירונים ארבע כיתות נפרדות מאופיינת בעיקר המורכבות מסעף שלהם דנדריט: מחלקה אני הרביעי31. עבודתנו שפורסמו מראה כי דה נוירון התחדשות דומה מודלים בתרבית של פגיעה ברמת פנוטיפי ו מולקולרית: da נוירונים להציג מאפייני מחלקה של התחדשות מסוימת, עם מחלקה IV אבל לא כיתה אני או נוירונים da השלישי מפגין התחדשות ב מערכת העצבים ההיקפית; השיעור הרביעי da נוירון אקסונים להתחדש robustly בפריפריה, אבל פוטנציאל הרגנרציה שלהם מופחת באופן דרמטי מערכת העצבים המרכזית, ובכך דמוי שורש העזוב נוירונים גנגליון (DRG) ביונקים; שיפור הפעילות mTOR באמצעות Pten מחיקה או ביטוי Akt משפר האקסון התחדשות של הזבוב CNS19. ניצול מודל זה פגיעה, אנו להיות ביצוע מסכי גנטי, זיהו את האנזים עיבוד RNA rtca ב גורם מעכבות אבולוציונית שנשמרת האקסון ההתחדשות, קישור האקסון פציעת מתח סלולר והסבת RNA20 .
ב התבנית שהוצגו, הפגיעה הנגרמת באמצעות לייזר axotomy/dendriotomy של הזחל class IV או נוירונים da השלישי, הנקרא על-ידי ממ ק-CD4-tdGFP או 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, ריפו-Gal80, בהתאמה. הפגיעה מבוצעת 2nd כדי 3rd הזחלים לחלל כ 48-72 שעות לאחר הנחת (h AEL) ביצה. עבור מערכת העצבים ההיקפית axotomy הנגע מכוון למקטע של האקסון ~ 20-50 מיקרומטר, והגוף תא, CNS axotomy לאזור של ~ 20 מיקרומטר בקוטר בצומת commissure ב VNC, ולכל dendriotomy על נקודות סניף ראשי דנדריטים. באותו הנוירון זה עם תמונה 8-24 שעות לאחר פציעה (AI) כדי לאשר חיתוך מלאה, ובבית 48-72 h AI כדי להעריך את התחדשות. באמצעות הדמיה קונאפוקלית זמן לשגות, ניוון של התחדשות של אקסונים/דנדריטים בודדים שהיו פצועים ויוו ניתן לנטר לאורך זמן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת לוחות תרבות ובקבוקים
- הכנת מיץ ענבים פלטות אגר
- להוסיף 10 גרם של אבקת אגר, מיץ ענבים 200 mL, 192 mL ddH2O לתוך הספל במיקרוגל במשך כ 4-5 דקות, תוך ערבוב לסירוגין עד אגר היא התפרקה לחלוטין.
- בשכונה fume, לקרר את הפתרון כ 60 מעלות צלזיוס. הוספת אתנול 95% 4.2 מ ל ו- 4.0 מ ל חומצה אצטית. להתאים את הנפח הכולל של הפתרון עד 400 מ"ל עם ddH2O. לערבב היטב.
- על כל צלחת 35 מ מ, להוסיף בערך 2-3 מ"ל של הפתרון. ודא כ 120-150 לוחות עבור סכום כולל של 400 מ ל מיץ ענבים אגר פתרון.
- המתן 10 דקות לקרר את הצלחות, לחזק את הפתרון אגר. לארוז את מיץ ענבים פלטות אגר בתוך שקיות ziplock העצמית אטום ולאחסן ב 4 ° C לשימוש עתידי.
- הכנת דרוזופילה תרבות בקבוקים
- השתמש בלהב כדי 1.5 ס מ בצד אורך משולש חור בקיר אחד בלבד של הבקבוק תרבות דרוזופילה ולמלא את החור עם כדור בקוטר 2-2.5 ס מ של כותנה לאוורור.
- חבר את הבקבוק עם צלחת אגר מיץ ענבים בתוספת על 0.5 ס מ3 של שמרים הדבק.
2. אוסף של הזחלים דרוזופילה
- הגדרת חוצה של הזבוב הבוגר
- מקום 10 נקבות בתולה עם מבוגר זכר 5 טיסות יחד בבקבוק תרבות מחובר עם צלחת אגר מיץ ענבים.
- המקום תחתית הבקבוק עד 25° c, כך זבובים להטיל ביצים בצלחת אגר מיץ ענבים. לשנות את הצלחת עם שמרים הדבק לפחות פעם ביום. לתקופה אוסף 2-h, מה שמקנה קציר של הזחלים בשלב התפתחותי הומוגנית, להתחיל עם יותר מ- 20 בתול נקבות וזכרים 10 בשלב 2.1.1.
- תרבות הצלחת 25° c בצלוחית 60 מ מ עם ממחטה רטובה, לדוגמה, ספוג בתמיסה 0.5% חומצה propionic. לסדר את הרקמה כך זה אינו חוסם את זרימת החמצן.
הערה: הפתרון חומצה propionic משמש כדי לשמור על לחות בצלחת למנוע הצמיחה של עובש.
- קציר הזחלים בגיל מסוים
- השתמש זוג מלקחיים להעברת הזחלים של השלב הרצוי, לדוגמה, 2nd 3rd לחלל רימות-48-72 שעות לאחר הנחת (AEL), ביצה עד כדי צלחת אגר מיץ ענבים חדש ללא שמרים הדבק.
- הסר השמרים העור של הזחלים ולהודיע להם סריקה מסביב על הצלחת חדשה, כדי למנוע הפרעות אפשריות של שמרים עם לייזר axotomy ודימות. לחלופין, ניקוי יסודי הזחלים על ידי שטיפה אותם בתוך קערת PBS וייבוש בקצרה על פיסת נייר טישו.
3. שני הפוטונים פציעה והדמיה קונפוקלי
- מיקרוסקופ ההתקנה
הערה: לייזר קונפוקלי מיקרוסקופ סורק עם לייזר שני הפוטונים שימשו את הניסוי הזה, אך מערכות אחרות עם התקנה מקבילה גם יספיק. הלייזר שני הפוטונים (930 ננומטר) שימש להעברת פציעה, ללייזר (488 ננומטר) שימש עבור הדמיה קונאפוקלית של GFP.- בתחילת כל מפגש, הפעל את הלייזר שני הפוטונים ו/או את laser(s) קונאפוקלית ולאחר המיקרוסקופ. פתח את תוכנת הדמיה.
- עבור שני הפוטונים פציעה, להגדיר את הפרמטרים הבאים הדמיה GFP עם לייזר שני הפוטונים-930 nm (1,950 mW).
- בחר במצב סריקה קו. לפתוח את חריר עד הסוף. להגביר את עוצמת הלייזר ~ 20% (390 מגה-וואט).
- בחר 512 x 512 הסריקה מסגרת. השתמש מהירות סריקה מקסימלי (בדרך כלל עם הזמן להתעכב פיקסלים ב- 0.77 µs). ודא כי המספר הממוצע הוא 1, עומק סיביות ויש 8 סיביות.
- רווח קבוע ~ 750, ההיסט ל- 0.
- שמור את נסיוני שנקבע מראש P 2 GFP 930 אבלציה, מתן אפשרות עבור שימוש חוזר בעתיד ניסויים.
- עבור הדמיה קונאפוקלית, להגדיר את הפרמטרים הבאים הדמיה GFP עם לייזר ארגון-488 ננומטר:
- בחר את הכרטיסיה רכישה ולאחר מכן Z-מחסנית.
- תחת "לייזר", להפעיל את הכוח הלייזר ארגון 488 ננומטר.
- עבור ערוצים, בחר את הלייזר מ מ 488 ולאחר להגביר את עוצמת הלייזר ל 5-10%. לשימוש חריר, 1-2 ואווריריים היחידה (AU). להתאים את הרווח אל 650.
- רכישת מצב, בחר 1024 x 1024 הסריקה מסגרת, השתמש מהירות הסריקה המקסימלי, מספר ממוצע של 2, ואת עומק סיביות של 8 סיביות.
- שמור את נסיוני שנקבע מראש GFP הדמיה.
- הזחלים הרדמה ועם דיאתיל אתר הרכבה
- בשכונה fume, מניחים צלחת זכוכית 60 מ מ ב- 15 ס מ פלסטיק פטרי. מקפלים ומניחים פיסת נייר טישו בתחתית קערה מזכוכית, ואז מניחים צלחת אגר מיץ ענבים על הרקמה. להוסיף דיאתיל אתר לתוך קערה מזכוכית, לנקודה בה ממחטת נייר ספוגה יש שכבה של אתר נוזלי שנותרו בצלחת. לשמור על כל הזמן.
- הכנת שקופית מזכוכית עם טיפה אחת של halocarbon שמן 27 במרכז. להוסיף 4 כתמי גריז ואקום על ארבע הפינות של השקופית, כדי לתמוך מאוחר יותר את coverslip.
- להשתמש מלקחיים להרים זחל נקי ולמקם אותו על הצלחת אגר בצלחת זכוכית 60 מ מ. מכסים את הכלי זכוכית עם המכסה והמתן עד הזחל יפסיק לזוז. עבור מערכת העצבים ההיקפית פציעה/הדמיה, להוציא הזחל ברגע זנבו מפסיק בפקעת. עבור מערכת העצבים, המתן עד הזחל כולו הופך ללא תנועה, במיוחד את מקטעי ראש.
הערה: העיתוי של אתר חשיפה היא קריטית. ראה דיון. - בזהירות לאסוף את הזחל anesthetized והנח אותו ראש-זקוף לתוך טיפת שמן halocarbon בשקופית. הוסף את coverslip על גבי השקופית. השתמש לחץ עדין כדי ללחוץ על coverslip, עד שייגע הזחל (איור 1 א').
- להתאים המיקום של הזחל דוחפים בעדינות את coverslip לכיוון שמאלה או ימינה כדי לגלגל את הזחל, כך הנוירון/האקסון/פיתוח של עניין הוא בחלק העליון תוך הקרוב המיקרוסקופ.
- עבור מערכת העצבים ההיקפית פציעה, הר הצד הגבי זחל, כך tracheas שני גלויים. . אז גלגל הזחל ~ 30 מעלות שמאלה עבור ופצעו class III da נוירון אקסונים (איור 1B וג 1), 90 מעלות עבור ופצעו class IV דה נוירון אקסונים (איור 1B ו- 1E) או ~ 30 מעלות עבור ופצעו class IV דה נוירון דנדריטים ( איור 2A).
- עבור פגיעה CNS, מקם הזחל להיות בצד הגחוני לחלוטין למעלה (איור 3 א), כך האזור עניין הוא הקרוב ביותר עדשת המיקרוסקופ ב z-המישור.
- פגיעה על ידי שני הפוטונים לייזר
- מקם את השקופית עם הזחל מתחת למיקרוסקופ ואבטח אותו במקום עם המחזיק שקופיות על הבמה. שימוש 10 X (0.3 NA) המטרה למצוא הזחל.
- להוסיף טיפה 1 של שמן אובייקטיבית coverslip, לעבור 40 X (1.3 NA) המטרה והתאימו את המוקד.
- כדי לעבור למצב סריקה ולהשתמש פרוטוקול נסיוני P 2 GFP 930 אבלציה. ודא שחריר פתוח עד הסוף.
הערה: התצורה צריך להיות מותאם בהתבסס על מערכות נפרדות. - להפעיל את מצב Live כדי לאתר את האזור של הריבית (ROI), לכוונן את ההגדרות כדי להשיג איכות תמונה טובה עם הזום המתאים.
הערה: מטרתו של שלב זה היא למצוא הנוירון/האקסון/דנדריט לפצוע, במקום לקחת את התמונה באיכות הטובה ביותר. לכן, השתמש בהגדרות מזערית מספיקה כדי להמחיש את אזור המטרה, כדי למנוע חשיפת יתר או photobleaching. - לעצור את הסריקה Live , כך הלחצן חתוך יהפוך לזמין. תן את תמונת הסטילס לשמש מפת הדרכים. בחר בפונקציה חיתוך ולהתאים חלון הסריקה להתמקד המטרה להיפצע.
- להפחית את רועי לגודל של אתר פוטנציאליים של פציעה. לדוגמה, רק לכסות הרוחב של האקסון או דנדריט, כדי להבטיח את הדיוק של הפגיעה ולהפחית נזק לרקמות שכנות. אם רצונך בכך, תקריב על רועי לפני חיתוך, התרת פגיעה מדויקת יותר.
- פתח חלון חדש הדמיה. להפחית את מהירות סריקה ולהגדיל את עוצמת הלייזר. לקבוע את העלייה בעוצמת לייזר המבוסס על האות פלורסצנטיות רקמות שנסרקו במצב Live .
- בדרך כלל, להגדיר את עוצמת הלייזר שני הפוטונים החל מ- 25% על מערכת העצבים ההיקפית הפגיעה ו- 50-100% על הפגיעה VNC. מערכת העצבים ההיקפית האקסון להיפצע, להבטיח עוצמת הלייזר ~ 480 מגה-וואט, פיקסל להתעכב זמן הוא 8.19 μs. עבור הפגיעה האקסון VNC, ודא כי הזמן להתעכב לייזר בעוצמה, פיקסל הם בדרך כלל 965-1930 mW 8.19-32.77 μs, בהתאמה.
- הפעל סריקה רציף . השאר את הסמן מרחף מעל הלחצן רציף . להשגיח מקרוב על התמונה ולהפסיק את הסריקה ברגע נצפית עלייה דרסטית בזריחה.
הערה: המראה של ספייק פלורסצנטיות נובעת אוטומטית-זריחה הפציעה. - לעבור בחזרה למצב בשידור חי על-ידי שימוש חוזר להגדרות. למצוא את האזור של עניין זה רק סומן על-ידי התאמת את המוקד.
הערה: סימן טוב של פגיעה מוצלחת היא המראה של מכתש קטן, מבנה טבעתי או פסולת מקומי בכניסה לאתר פציעה. - לעבור הנוירון הבא וחזור מ שלב 3.3.5, לפגוע נוירונים מרובים ב- חיים בודד. או חזור על שלב 3.3.5 תוך בהדרגה בהגדלת הכוח ו/או הפחתת מהירות סריקה אם הפגיעה הראשונית הייתה מספיקה.
הערה: במקרה זה עוצמת הלייזר גם גבוה, אזור נזק גדול יהיה גלוי בתמונה סריקה בשידור חי לאחר פציעה. פגיעה מדי עלולה לגרום למותו של הזחל. - לשחזר הזחל על ידי הסרת את coverslip והעברת הזחל פצועים על צלחת חדשה עם שמרים הדבק בזהירות. לנטוש את מספר מערות בצלחת אגר עם מלקחיים; לחלופין, לבצע אי של אגר בצלחת במקום להשתמש צלחת מלאה, כדי לצמצם את האפשרות של הזחל זוחל מהצלחת.
- לשים את הצלחת בצלוחית 60 מ מ עם רקמת רטוב (ספוג עם 0.5% חומצה propionic פתרון) והתרבות בטמפרטורת החדר או 25 º C.
הערה: הזחל יישאר בשלב הזחל עבור יום נוסף בטמפרטורת החדר (22 מעלות צלזיוס) בהשוואה ל- 25° C.
- הדמיה קונאפוקלית לאחר פציעה
- תמונת הזחל פצוע בנקודות הזמן הרצויים על-ידי הכנת הזחל באמצעות ההליך באותה ההרדמה, הרכבה כמו 3.2 שלב, לאחר מכן הדמיה עם לייזר קונפוקלי.
הערה: תמונה הזחל 24 שעות לאחר פציעה (AI) כדי לאשר פציעה axonal דיפוזי וכן ב 48 שעות AI (class IV דה נוירונים) או 72 h AI (class III da נוירונים) כדי להעריך את התחדשות. - לאתר הזחל באמצעות המטרה X 10 ולאחר מכן לעבור 25 X (0.8 NA) המטרה. שימוש חוזר פרוטוקול נסיוני GFP הדמיה.
- לחץ על לחצן Live ולמצוא אותו נוירון נפגע בעבר.
- הגדר את העמדות Z הראשון והאחרון בחלון סריקה בשידור חי. לחץ על stop ולחץ על התחל להתנסות כדי לרכוש תמונה Z-מחסנית.
הערה: ודא כי נקודת נורמליזציה (נקודת משולבות של האקסון) נכלל בעת לכידת תמונות כך כימות של התחדשות אפשרית (איור 1D, 1F) – זה נדון בהמשך במקטע ניתוח הנתונים. - לעבור עיבוד תמונה, בחר את התמונה פשוט לקחת ולהפיק הקרנה העוצמה המקסימלית. שמור z-מחסנית ואת העוצמה המקסימלית הקרנת תמונות.
- תמונת הזחל פצוע בנקודות הזמן הרצויים על-ידי הכנת הזחל באמצעות ההליך באותה ההרדמה, הרכבה כמו 3.2 שלב, לאחר מכן הדמיה עם לייזר קונפוקלי.
4. ניתוח נתונים
- תהליך ולכמת תמונות באמצעות הדמיה תוכנה או ImageJ.
- כימות של האקסון התחדשות ב מערכת העצבים ההיקפית
- חישוב אחוזי התחדשות, המתייחס האחוזים של רגנרציה אקסונים בין כל האקסונים שהיו lesioned. ציון של האקסון כמו רגנרציה כל עוד זה מתחדש מעבר אתר הפציעה.
- מדד אורך התחדשות, אשר הגדלת אורך האקסון. אם לכימות עם ImageJ, השתמש בכלי קו מקוטע כדי לאתר את האקסון regenerated, והשתמש מידה בתפריט הנפתח נתח להשגת אורכו של קו המייצג את האקסון מחדש.
- חישוב מדד התחדשות, וזו הגדלת אורך האקסון מנורמל.
הערה: אורך האקסון הוא מנורמל על-ידי המרחק בין גוף התא הדנדריטי לאקסון מתכנס בנקודה (DCAC) – האקסון אורך/DCAC (איור 1D ו- 1F). ערך זה מסייע חשבון עבור כל הצמיחה עצב כי עקב שינוי גודל זחל. ערך חיובי מייצג התחדשות, ערך של 0 פירושו אין התחדשות, וערך שלילי מציין התנצלות.
- כימות של התחדשות דנדריט
- לחשב התחדשות אחוז, המהווה האחוזים של נוירונים da בין כל אלו ניתקה המציגים דנדריט ברור לצמיחה מחודשת.
הערה: דנדריט לצמיחה מחודשת הוא הבקיע כפי דנדריטים חיובי אם חדש ולצמיחה מחודשת החוצה מן הגבעול דנדריטים שקועה ומעבר לפציעה באתר. אתר פגיעה נקבע על-ידי-אתרים, ובמקרים מסוימים, גלויות בשל autofluorescence הנוצרות על-ידי פגיעה שיורית. - לחשב עלייה של סניף נקודות, אשר מונה התוספת של נקודות דנדריטים הסניף החדש לאחר פציעה.
- לחשב להגדיל אורך דנדריט הכולל, אשר הוא אורך כל דנדריטים חדש הוסיף לאחר פגיעה מצטברת.
- לחשב התחדשות אחוז, המהווה האחוזים של נוירונים da בין כל אלו ניתקה המציגים דנדריט ברור לצמיחה מחודשת.
- כימות של האקסון התחדשות ב מערכת העצבים
הערה: אם אתר הנגע מראה ניוון בנקודה הראשונה זמן עם תמונה (איור 3B), זה יהיה כלול בניתוח של התחדשות אורך וקצב.- מדד אורך התחדשות, אשר אורך האקסון regrowing.
הערה: האקסון regrowing של אתר יחיד הנגע מזוהה בתור מוצאה את המסלול האקסון המקורי לפני הפגיעה. - חישוב אורך התחדשות Normalized, אשר מווסת את האורך התחדשות אורך המקטע commissure - המרחק האורך בין commissures ("Y" איור 3A ו- 3B).
הערה: ערך זה מסייע הנכון עבור האפקט של גודל זחל הבדלים. - לחשב קצב התחדשות, האחוזים של רגנרציה מקטעים בין כל הקטעים שהיו lesioned, כדי לשקף את יכולת התחדשות גנוטיפ מסוים.
- מדד אורך התחדשות, אשר אורך האקסון regrowing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Da נוירונים להראות התחדשות דיפרנציאלית פוטנציאלי בין ההיקפית ואת מערכת העצבים המרכזית, וכן מחלקה ירידה לפרטים. זה מספק הזדמנויות ייחודיות על המסך עבור גורמים הרומן הנדרשים עבור התחדשות האקסון (באמצעות הכיתה פגיעה מערכת העצבים ההיקפית הרביעי), כמו גם אלה מעכבות ולשם רגנרציה (עם הכיתה פגיעה IV CNS ו הכיתה פגיעה מערכת העצבים ההיקפית השלישי).
האקסון התחדשות ב מערכת העצבים ההיקפית
לדוגמה, אפיון התחדשות של class III ו class IV דה הנוירונים מתואר. נוירונים אלה ממוקמים בשני הצדדים כל אחד מהמקטעים הגוף. נוירונים מרובים יכולים להיות נפגע הזחל אותו; בדרך כלל, 3-4 נוירונים בצד ימין של הבטן מקטעים A7-A2. Class III ו- class IV דה נוירונים, ניתן לאבחן על ידי 19-12-Gal4, UAS-CD4tdGFP, ריפו-Gal80 ממ ק-CD4tdGFP, בהתאמה. עזים ומתנגד והר 48-72 h AEL הזחלים כמתואר, התאמת המיקום של הזחלים כך הנוירונים da עניין פונות מעלה (איור 1A ו 1B). אנחנו בדרך כלל לפצוע את השיעור השלישי ddaF ואת השיעור הרביעי v'ada נוירונים (איור 1C ו- 1E). לבצע axotomy ולשחזר הזחלים כמתואר. זמן קצר לאחר פציעה (AI), הזחלים התאוששו מן הניתוח והתצוגה ומכניקה נורמלי. שיעור ההישרדות כאן היא בדרך כלל יותר מ 80%. למחוק את הזחלים שהם מתים או חולה. טען מחדש את השארית כמתואר ולהעריך ניוון. ב 24 שעות AI, האקסונים דיסטלי צריכים השלמת ניוון-זו נקודת זמן19, הגבעול האקסון יהיו גלויות (איור 1D ו- 1F). Reimage את הזחלים אותו ב 48 ה AI עבור class IV דה נוירונים או 72 h AI עבור class III da נוירונים כדי להעריך את התחדשות. בדרך כלל אנו שואפים להעריך לפחות 20 פצועים נוירונים לכל תנאי הניסוי. בסוג (פראי) WT חיות, ואילו בדרך כלל ~ 70% קטועה class IV דה נוירונים חידש מעבר האתר פציעה (איור 1F), class III da נוירונים להיכשל לצמוח מחדש, שמעידים חרוט הצמיחה השתהות (איור 1D).
דנדריט התחדשות
אנחנו בדרך כלל מבצע dendriotomy class IV דה הנוירונים ddaC (איור 2 א). כפי שמוצג בתרשים סכמטית, הפגיעה מכוון לנקודה סניף ראשי דנדריטים. ~ 50% של נוירונים ddaC מבוסס על ניסיון, כאשר נפגע ב 48 שעות AEL, להתחדש שלהם דנדריטים (איור 2B). ב-50% הנותרים, דנדריטים שכנות פולשים ולכסות את החלל הריק. בנוסף, פוטנציאל התחדשות של נוירונים אלה פוחתת אם נפגע בשלב התפתחותי מאוחר יותר.
האקסון התחדשות ב מערכת העצבים
פגיעה האקסון VNC, שיעור ההישרדות של הזחלים משתנה באופן משמעותי, תלוי הגיל שבו פגיעה הנגרמת. בהתבסס על ניסיון, הזחלים של 48-72 h AEL בדרך כלל יש שיעור ההישרדות הגבוהים (> 60%) בין השלבים השונים שנבדקו. הזחלים הצעירים יותר מ- 48 שעות AEL לשרוד לקוי לאחר פציעה, ואילו באלו שגילן עולה על 72 h AEL קשה להציג את פגיעת VNC. יתר על כן, קל יותר לגרום פגיעה בכל המקטעים commissure האחורי מאשר הקדמי, כמו אלה חלקי האחוריים VNC גם קרוב יותר אל פני השטח הגחון, ובכך יותר נגיש על ידי לייזר (איור 3 א).
לפגוע class IV דה נוירון אקסונים ב מערכת העצבים, הר הזחלים כאמור תיאר (איור 3 א). תחת המיקרוסקופ, לאתר המבנה דמוי סולם של האקסון חבילות זה חלק הטופס VNC (איור 3 א), ולבצע axotomy כמתואר. ניוון הוא אישר ב-8 h AI והתחדשות הם העריכו ב h 24 ו-72 AI. כפי שמוצג באיור 3B, אקסונים ב 8 שעות AI כבר החלו להידרדר, ב- 24 שעות AI, התחדשות האקסון הוא ציין בזמן האקסון פסולת עדיין ניתן למצוא סביב האתרים פציעה. WT אקסונים הצג מוגבלת לצמיחה מחודשת VNC, להיכשל לחבר מחדש את הפערים שנוצרו על-ידי הפגיעה (איור 3B). כדי לכמת את יכולת התחדשות של אקסונים פצוע, האורך לצמיחה מחודשת לאחר פציעה נמדד ואת אורך המקטע commissure (Y ב- איור 3A) משמש נורמליזציה (איור 3C).
איור 1: Da נוירון האקסון התחדשות בפריפריה מציגה ירידה לפרטים הכיתה. (A ו- B) שרטוט המציג את המיקום של הזחלים סכמטי. (ג) שרטוט סכמטי של class III da נוירונים. (ד) אקסונים של ddaF נוירונים da השלישי בכיתה, עם 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, ריפו-Gal80 / +, תוויות להיכשל לצמוח מחדש. (ה) שרטוט סכמטי של class IV דה נוירונים. (נ) אקסונים של class IV דה הנוירונים v'ada, עם תוויות ממ ק-CD4-tdGFP / +, לשחזר מעבר האתר הנגע. (D ו- F) הקו האדום מציין אורך האקסון בעוד קו ירוק מקווקו מסמן את המרחק בין גוף התא הדנדריטי לאקסון מתכנס בנקודה (DCAC). הנקודה הכחולה מסמנת נקודת מתכנסים האקסון. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: Da נוירון דנדריט התחדשות. (א) ייצוג המחשה של class IV דה נוירונים. ייצוג דנדריט התחדשות ב- class IV דה נוירון ddaC, תווית באמצעות המחשה (B) ממ ק-CD4-tdGFP / +. אבלציה לייזר מכוון לנקודה סניף ראשי, הוא ניצח ב 48 שעות AEL. ב 24 שעות AI פציעה חיתוך של neurite הוא אישר, ב- 72 h AI לכמת התחדשות. דנדריטים של נוירונים ddaC להפגין משמעותי לצמיחה מחודשת, עם סניפים דנדריטים מגיחה גזע כרות כדי לפרוש את החלל הריק. ראוי לציין כי סניפים מסוף ללא הרף נוספות של דנדריטים שציווית בשלב התפתחותי זה. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: Da נוירון האקסון התחדשות ב VNC. (א) ציור סכמטי של זחל דרוזופילה רכוב על שקופית, עם תמונה תחת המיקרוסקופ. שיעור IV דה נוירון אקסונים ב VNC דמיינו ב ממ ק-CD4tdGFP / + זחל. שני המועמדים commissure מקטעים מוצגים בתמונה שהתצוגה בלבין הציור סכמטי. לכל אחד מהם יש פגיעה בשני אתרים (עיגולים אדומים). (B) תמונות קונאפוקלית של קטע פצוע אחד עם תמונה-8, 24 ו- 72 שעות לאחר פציעה (AI). הקווים האדומים מתארים את האקסונים regrowing. (ג) מדידה, נורמליזציה של regrowing אקסונים. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בעת הגדרת הזבוב חוצה, המספר של נקבות וזכרים בשימוש יכולה להשתנות בהתאם אחרים את המספר של הזחלים לצורך ניסויים ספציפיים בבעלי. WT זבובים, הצלב טיפוסי משתמש 10 נקבות וזכרים 5. החלון אוסף עשוי להצטמצם, בהתאם למידת הדיוק של עידן הזחלים נדרש. לדוגמה, פרק 2-h אוסף תניב הזחלים של אוכלוסיה הומוגני יותר. במקרה זה, שימוש נקבות 20 או יותר בתולות להגדיר חוצה תעזור תשואה מספיק ביצים. התשואה מהיום הראשון הוא בדרך כלל נדיר, כדי לאסוף את הצלחת עם ביצים יום שני או יותר לאחר הגדרת הלשכה. כאשר נוסף culturing לצלחת עם ביצים, מומלץ להשרות את הרקמה בצלוחית הפטרי 60 מ מ ב- 0.5% חומצה propionic פתרון במקום מים, אשר לא רק שיסייע לשמור על לחות בצלחת אבל גם למנוע הצמיחה של עובש.
בעת הגדרת ההתקנים עבור הזחלים והרדמה הרכבה, הקפד להשתמש צלחת זכוכית כי האתר יותך פלסטיק. המנה זכוכית שוכן פלסטיק 15 ס מ פטרי במקרה של דליפה. ממחטת נייר מסייעת לשמור על אתר בצלחת כך הזחל יכול ביעילות לנוק אאוט על ידי האדים אתר. מומלץ להשתמש בכתום לזרוק בקבוקים לאחסון aliquots של האתר, הוספת אתר טיפות עם טפטפת זכוכית. לחדש את האתר ואני תמיד לשמור על שכבה של אתר נוזלי בחלק התחתון של המנה לאפקט אופטימלי.
העיתוי של אתר חשיפה הוא קריטי: תחת הרדמה תוביל להחלמה זחל באמצע ההפעלה הדמיה ושם תמונות רעועה; מנת יתר הרדמה, או במגע ישיר עם הנוזל אתר, יגרום הקטלניות. להגדיל את הישרדות, שיעור ההצלחה, כלל האצבע שלנו הוא כדלקמן: עבור מערכת העצבים ההיקפית פציעה/הדמיה, להוציא את הזחל ברגע זנבו מפסיק בפקעת; עבור מערכת העצבים, המתן עד הזחל כולו הופך ללא תנועה, במיוחד את מקטעי ראש. אפילו תנועה קלה יתערב עם פציעה, הדמיה של VNC אקסונים. הזחלים בוגרים נוטים להתארך לתת נוק-אאוט. זה בדרך כלל לוקח פחות מ 2 דקות עבור הזחלים הצעירים יותר מאשר 72 h AEL, 2-5 דקות עבור הזחלים שגילן עולה על 72 h AEL.
בעת הגדרת עוצמת הלייזר שני הפוטונים על הפגיעה, הערך נקבע ע י האות פלורסצנטיות רקמות המתקבל הסריקה "לחיות". הפגיעה הוא הציג ידי סריקה "רציף" כמו שלב 3.3. העלייה הנוצרות על-ידי פגיעה ברמת קרינה פלואורסצנטית נובע autofluorescence הפציעה ומשמש אינדיקטור טוב של ניתוק neurite. בדרך כלל, לוקח 1-10 s כדי לראות את הדקר זריחה. זה חיוני כדי לקבוע את הזמן הסריקה לאחר קרינה פלואורסצנטית הוא גבוה. עבור מערכת העצבים ההיקפית הפציעה, זה חיוני כדי למנוע סריקה מיידית. חשיפה ממושכת להגדיל את האתר פגיעה ונזק ברקמות שכנות. עם זאת, זה מספק את ההזדמנות כדי להתאים את זמן הסריקה ולטפל את חומרת הפגיעה. פגיעה מוצלחת צריך קוטר גודל הנגע קטן מ- 3-4 μm. על הפגיעה האקסון VNC, האקסונים VNC מוטבעים עמוק לעומת הנוירון da מערכת העצבים ההיקפית אקסונים/דנדריטים, אשר נמצאים ממש מתחת לעור, וכך דורשים גבוה לייזר בעוצמה. בדרך כלל לפני שנעזוב את הסריקה עבור עוד כמה שניות. זה נועד להבטיח הצרור האקסון כולה היא ניתקה. אם הרדיוס של האתרים הנגע יותר ממחצית מרוחב הצרור commissure, אתרים אלה פציעה נספרים גם לא מוצלח. הזחלים כזה יש שיעור הישרדות נמוך, לא ייכלל בניתוח.
האקסון ההתחדשות, יכולת התחדשות דומה על פני דרגות זחל. אבל עבור התחדשות דנדריט לאחר חתך דנדריט אחד, פוטנציאל ההתחדשות מצטמצם לאחר 72 h AEL19. לכן, פגיעה האקסון מבוצעת בדרך כלל ב 48 h - 72 h AEL ופציעה דנדריט ב 48 שעות AEL, עם הצהרתו של התחדשות-120h AEL. ניתן להשתמש גם הזחלים של 24 שעות AEL, אך הם דורשים טיפול זהיר יותר, בהתחשב גודלם הקטן יותר. הזחלים pupate לאחר h 120 AEL, ביצוע הדמיה מאתגרת יותר. לכן, הקצה שלנו הוא בדרך כלל 120 h AEL.
מהו הקשר ההדדי בין ניוון והתחדשות? עבור פגיעה מערכת העצבים ההיקפית, ב- 24 שעות ביממה AI, בדרך כלל האקסון דיסטלי/פיתוח ב WT השלימה וולריאני בזמן התחדשות לא התחיל בנקודת זמן זו. לכן, אנו מאמינים כי ב WT הזחלים, ניוון של כרות neurites יש רק השפעה מוגבלת מאוד על התחדשות, אם בכלל. עבור פגיעה VNC, אקסונים ב 8 שעות AI כבר החלה להידרדר, ב- 24 שעות AI, התחדשות האקסון הוא ציין בזמן האקסון פסולת עדיין יכול להימצא סביב האתרים פציעה. ההריסות לא נראה לחסום את התחדשות. עם זאת, ייתכן כי בנסיבות מסוימות, ייתכן שיש חפיפה או אפילו של crosstalk בין ניוון והתחדשות. למעשה, זה דווח כי בעכברים בגילאי, חיסול פסולת לאחר נזק במערכת העצבים ההיקפית הוא איטי יותר מאשר זה בבעלי חיים צעירים. / ת, reinnervation איטי יותר של צומת עצב-שריר נצפתה, אשר לייחס מספר גדול יותר של חסימות רגנרציה אקסונים המפגש את החיות הישן. באופן מפתיע, עם זאת, אקסונים מחיות בגילאי להתחדש במהירות, באופן כירורגי צומת עצב-שריר אתרים בצורה יעילה כאשר לא התעמת עם פסולת32. הדבר מצביע על הקלת חיסול פסולת יכול להיות אסטרטגיה אפשרית כדי לקדם התחדשות.
לעומת דגמים אחרים neuroregeneration, המודל פציעה נוירון חישה לטוס יש יתרונות ייחודיים. מודלים העכבר בדרך כלל לקחת שבועות עד חודשים כדי לבצע, אינם מתאימים לביצוע מסכי גנטי בקנה מידה גדול; C. elegans יש רק של פרימיטיביים מערכת העצבים המרכזית אשר עשויים לא לסכם מקרוב את המחסומים התחדשות ב מערכת העצבים יונקים; שונה יונקים, דג זברה CNS אקסונים להתחדש robustly. מחזור החיים מהיר של זבובים, צדדיות של גנטיקה לעוף, נגישות, המתבנת סטריאוטיפית של אקסונים/דנדריטים של נוירונים סנסוריים לעוף, והמאפיינים התחדשות האופיינית של נוירונים סנסוריים לעוף – סוג הנכס התחדשות מסוימת ב- מערכת העצבים ההיקפית והתחדשות מוגבלת ב מערכת העצבים – להפוך דרוזופילה da נוירונים מודל אטרקטיבי עבור לומד neuroregeneration. יתר על כן, מחקרים שנעשו לאחרונה מתאי גנגליון העכבר כתוש (RGCs) גם להציע יחוברו עצביים לסבול את יכולת התחדשות ברורים; כמה סוגי מהרשות לשיקום האסיר יכול להתחדש, ואילו האחרים הצרור עצב לכאורה הומוגנית להיכשל לצמוח33. ממצא חשוב זה מרמז כי ראוי שינוצל עצביים ייחודיים לסוג אסטרטגיות לקידום התחדשות והתאוששות פונקציונלי, טוען בתוקף אינדוקציה של האקסון פציעה וניתוח שלאחר מכן התחדשות, יש לבצעו ב באופן ספציפי המשנה עצביים. יתר על כן, גורמים תאית ומולקולרית עבור הסוג-סגוליות זה התחדשות עדיין אינו מודע לקיומם19,33. לפיכך, המודל פציעה של נוירון da מציע הפרדיגמה אידיאלי כדי להתמודד עם בעיות אלה.
לעומת האקסון התחדשות, לימודי התמקדות דנדריט התחדשות הם הרבה scarcer. דנדריט פציעה להתרחש, כגון פגיעה מוחית טראומטית, שבץ מוחי, צורות רבות של הקשורים ניוון מוחיים, אך כמעט ולא ידוע על היכולת של דנדריטים תיקון ורפורמה קשרים עצביים. המודל פציעה של נוירון da שוב מספק מערכת ונגישות גבוהה המציג המתבנת סטריאוטיפי, ירידה לפרטים בכיתה ו זמני תקנה19, לחקור בכיוון הזה.
זה גם ראוי לציין כי בזמן זה אפשרי לפגוע של האקסון יחיד שכותרתו ב מערכת העצבים ההיקפית, הפגיעה דרך מתבצע בתוצאות CNS בתוך הנגע של צרור של אקסונים. אם רצונך בכך, MARCM34 או הגישה של שיבוט FLP35 עשוי לשמש להוספת תווית אקסונים יחיד ב מערכת העצבים. בנוסף, כאשר תאי גליה מסומנות בעת ובעונה אחת עם mRFP (Repo-Gal4, UAS-mRFP), ההצטברות של תהליכים עכשיו, דונלד הוא ציין במפורש באתר הנגע. יתר על כן, הביטוי של Ptp99A, homolog לעוף של כונדרויטין גופרתי פרוטאוגליקן (CSPG) phosphacan / PTPRZ1, הוא מוסדר למעלה באתר הנגע. Ptp99A שיתוף. רגישה עם גלייה ולאזור באתר הפציעה, ויוצרים מבנה דמוי טבעת דומה מה שדווח עבור צלקות astroglial36,19,יונקים37. לסיכום, המודל פציעה נוירון da, בשילוב עם סמנים של סוגי תאים אחרים כגון גלייה או תאים חיסוניים, יאפשר ויוו מעקב בזמן אמת של אינטראקציות multicellular בין של נוירון פצוע והסביבה סביבה.
בעוד מודל פציעה זה הזחלים לטוס נוירון חישה מספק לנו הזדמנויות למצוא פוטנציאל הרגולטורים neuroregeneration הן את מערכת העצבים ההיקפית ואת מערכת העצבים המרכזית, עדיין יש מספר מגבלות. קודם כל, זה לא של תפוקה גבוהה בשלב הנוכחי. בדרך כלל, 5-6 אחרים יכול להיות מוקרן על ידי אדם אחד בשבוע אחד. זה צריך להיות מותאם במיוחד על מנת לבצע ומציג מסך לא משוחדת. שנית, כפי ההרדמה אתר על הזחלים יכול להימשך בין מספר דקות כדי לא יותר מעשרים דקות, זה לא אופטימלי עבור הדמיה לטווח ארוך. לפיכך, נקודות זמן מסוים כי הם נציג של האקסון בליה והתחדשות בהתאמה נבחרים עבור הדמיה. שלישית, אף-על-פי פרוטוקול זה מציגה דרך לפגוע אקסונים בדיוק, האפשרות לפגיעה הרקמות הסובבות לחלוטין אפשרות. VNC, רקמות אלו יכולה להיות גלייה אקסונים, דנדריטים של נוירונים אחרים. כדי למזער את הקונה הפוטנציאלי, אנחנו למזער פגיעה באתרים, להחיל הכי נמוך שאפשר כוח לייזר, ולבצע אותם הליכים במקביל הן שליטה ואת הניסוי קבוצות. רביעית, בתהליך של הגדרת הפרדיגמה פציעה CNS, פציעה שונות אתרים נבדקו, כולל את האתרים קרוב טרמיני האקסון בחרנו להשתמש, כדי לאפשר כניסה הצבע של אקסונים לתוך VNC. נקודות הכניסה נמצאו להיות יותר קשה לפגוע כי הם עמוק בתוך רקמת ו סביר יותר לעבור. לפיכך, מסיבות מעשיות אלו, אנו בוחרים בשיטת הנוכחית, שהיא עקבית יותר, יותר ונשלט, טוב לניסויים ורחבה. חשש פוטנציאלי אחד, כאמור לעיל, היא האפשרות של ופצעו רקמות שכנות, כגון רכיבי postsynaptic וזאנה. מצד שני, זה שאלה מצטיינים איך הרקמות הסובבות פגום להשפיע על ניוון והתחדשות של אקסונים. לדוגמה, איך הצלקת גליה משפיע האקסון התחדשות. מהווה סיבה נוספת למה המודל שלנו פציעה עשוי הדומים פציעה מודלים ביונקים, שבו אקסונים של רקמות סביב האתרים הנגע בדרך כלל נפגעים בו זמנית.
פגיעת לייזר ואחריו מיקרוסקופ זמן לשגות הוא assay רגיש לימוד האקסון/דנדריט התחדשות. אולם, אחד הדאגה העיקרית של זה וזמינותו היא העלות הנתפסת, שנעה בין <$ 10K עבור לייזרים זולים הדופק של מצב מוצק, 25 דולר - 100 אלף דולר עבור לייזרים הפמטו-שנייה >$ 100K עבור שני הפוטונים לייזרים. ישנם מספר דיונים טובים על מערכות לייזר שונים שימשו axotomy29,38,39,40,41,42,43, 44 , 45. לסיכום, לייזרים קונבנציונלית הם אופטימליים עבור חיתוך האקסונים בתוך על 30-50 מיקרומטר מפני השטח. יהיה נזק משני עם ננו ולא pico לייזרים השנייה לעומת לייזר הפמטו-שנייה, בעיקר כי העומק של אזור היעד מגביר45. עבור ופצעו אקסונים ב VNC, עומק אשר בדרך כלל כ 50-100 מיקרומטר, זה חיוני כדי למזער נזק לרקמות. במקרה זה, הלייזר שני הפוטונים הוא אידיאלי, אשר ינתב את כוח לייזר למטוס מוקד, הפחתת נזק לרקמות משני מבלי להתפשר על חדירה לרקמות. לסיכום, מערכת שני הפוטונים הוא יקר, אך מציעה שימור הדיוק ואת הרקמה הטובה ביותר. עם זאת, אם רק האקסונים מערכת העצבים ההיקפית הם היעד עבור axotomy, הדופק הקונבנציונלית לייזרים עשוי להיות חלופה במחיר נוח יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים ג'סיקה Goldshteyn לקבלת תמיכה טכנית. העבודה במעבדה השיר ממומן על ידי המענק-NIH R00NS088211, ואת הקניין הרוחני פרס לפיתוח תוכנית חדשה מרכז מחקר התפתחותיות (IDDRC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Diethyl ether, ACS reagent, anhydrous | Acros Organics | AC615080010 | |
| Halocarbon 27 Oil | Genesee Scientific | 59-133 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), 20x Concentrate, pH 7.5, supplier # E703-1L | VWR | 97062-948 | |
| Agar powder, Alfa Aesar, 500GM | VWR | AAA10752-36 | |
| Grape juice | Welch’s | ||
| Ethanol 95% (Reagent Alcohol 95%) | VWR | 64-17-5 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Propionic Acid | J.T.Baker | U33007 | |
| Cover Glasses: Rectangles | Fisher Scientific | 12-544-D | 50 mm X 22 mm |
| Zeiss LSM 880 laser scanning microscope | Zeiss | ||
| Zen software | Zeiss | ||
| Chameleon Ultra II | Coherent |
References
- Yakura, J. S. Recovery following spinal cord injury. , (1996).
- Harel, N. Y., Strittmatter, S. M. Can regenerating axons recapitulate developmental guidance during recovery from spinal cord injury? Nature reviews. Neuroscience. 7, 603-616 (2006).
- Jurewicz, A., Matysiak, M., Raine, C. S., Selmaj, K. Soluble Nogo-A, an inhibitor of axonal regeneration, as a biomarker for multiple sclerosis. Neurology. 68, 283-287 (2007).
- Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat Rev Neurosci. 7, 617-627 (2006).
- Sun, F., He, Z. Neuronal intrinsic barriers for axon regeneration in the adult CNS. Curr Opin Neurobiol. , (2010).
- Liu, B. P., Cafferty, W. B., Budel, S. O., Strittmatter, S. M. Extracellular regulators of axonal growth in the adult central nervous system. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 361, 1593-1610 (2006).
- Liu, K., Tedeschi, A., Park, K. K., He, Z. Neuronal intrinsic mechanisms of axon regeneration. Annu Rev Neurosci. 34, 131-152 (2011).
- Schwab, M. E., Strittmatter, S. M. Nogo limits neural plasticity and recovery from injury. Curr Opin Neurobiol. 27, 53-60 (2014).
- He, Z., Jin, Y. Intrinsic Control of Axon Regeneration. Neuron. 90, 437-451 (2016).
- Park, K. K., et al. Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway. Science. 322, 963-966 (2008).
- Geoffroy, C. G., Hilton, B. J., Tetzlaff, W., Zheng, B. Evidence for an Age-Dependent Decline in Axon Regeneration in the Adult Mammalian Central Nervous System. Cell Rep. 15, 238-246 (2016).
- Geoffroy, C. G., et al. Effects of PTEN and Nogo Codeletion on Corticospinal Axon Sprouting and Regeneration in Mice. J Neurosci. 35, 6413-6428 (2015).
- Jin, D., et al. Restoration of skilled locomotion by sprouting corticospinal axons induced by co-deletion of PTEN and SOCS3. Nat Commun. 6, 8074 (2015).
- Wang, X., et al. Axonal regeneration induced by blockade of glial inhibitors coupled with activation of intrinsic neuronal growth pathways. Exp Neurol. 237, 55-69 (2012).
- Fang, Y., Bonini, N. M. Axon degeneration and regeneration: insights from Drosophila models of nerve injury. Annual review of cell and developmental biology. 28, 575-597 (2012).
- Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
- Leyssen, M., et al. Amyloid precursor protein promotes post-developmental neurite arborization in the Drosophila brain. The EMBO journal. 24, 2944-2955 (2005).
- MacDonald, J. M., et al. The Drosophila cell corpse engulfment receptor Draper mediates glial clearance of severed axons. Neuron. 50, 869-881 (2006).
- Song, Y., et al. Regeneration of Drosophila sensory neuron axons and dendrites is regulated by the Akt pathway involving Pten and microRNA bantam. Genes Dev. 26, 1612-1625 (2012).
- Song, Y., et al. Regulation of axon regeneration by the RNA repair and splicing pathway. Nat Neurosci. 18, 817-825 (2015).
- Kato, K., Forero, M. G., Fenton, J. C., Hidalgo, A. The glial regenerative response to central nervous system injury is enabled by pros-notch and pros-NFkappaB feedback. PLoS Biol. 9, e1001133 (2011).
- Fang, Y., Soares, L., Teng, X., Geary, M., Bonini, N. M. A novel Drosophila model of nerve injury reveals an essential role of Nmnat in maintaining axonal integrity. Curr Biol. 22, 590-595 (2012).
- Xiong, X., et al. Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury. J Cell Biol. 191, 211-223 (2010).
- Brace, E. J., DiAntonio, A. Models of axon regeneration in Drosophila. Exp Neurol. 287, 310-317 (2017).
- Hao, Y., Collins, C. Intrinsic mechanisms for axon regeneration: insights from injured axons in Drosophila. Curr Opin Genet Dev. 44, 84-91 (2017).
- Galbraith, J. A., Terasaki, M. Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation. Mol Biol Cell. 14, 1808-1817 (2003).
- Sugimura, K., et al. Distinct developmental modes and lesion-induced reactions of dendrites of two classes of Drosophila sensory neurons. J Neurosci. 23, 3752-3760 (2003).
- Yanik, M. F., et al. Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy. Nature. 432, 822 (2004).
- Wu, Z., et al. Caenorhabditis elegans neuronal regeneration is influenced by life stage, ephrin signaling, and synaptic branching. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15132-15137 (2007).
- Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. Global up-regulation of microtubule dynamics and polarity reversal during regeneration of an axon from a dendrite. Mol Biol Cell. 21, 767-777 (2010).
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129, 2867-2878 (2002).
- Kang, H., Lichtman, J. W. Motor axon regeneration and muscle reinnervation in young adult and aged animals. J Neurosci. 33, 19480-19491 (2013).
- Duan, X., et al. Subtype-specific regeneration of retinal ganglion cells following axotomy: effects of osteopontin and mTOR signaling. Neuron. 85, 1244-1256 (2015).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
- Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
- Buss, A., et al. NG2 and phosphacan are present in the astroglial scar after human traumatic spinal cord injury. BMC Neurol. 9, 32 (2009).
- McKeon, R. J., Jurynec, M. J., Buck, C. R. The chondroitin sulfate proteoglycans neurocan and phosphacan are expressed by reactive astrocytes in the chronic CNS glial scar. J Neurosci. 19, 10778-10788 (1999).
- Raabe, I., Vogel, S. K., Peychl, J., Tolic-Norrelykke, I. M. Intracellular nanosurgery and cell enucleation using a picosecond laser. J Microsc. 234, 1-8 (2009).
- Hutson, M. S., Ma, X. Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo. Phys Rev Lett. 99, 158104 (2007).
- Venugopalan, V., Guerra, A. 3rd, Nahen, K., Vogel, A. Role of laser-induced plasma formation in pulsed cellular microsurgery and micromanipulation. Phys Rev Lett. 88, 078103 (2002).
- Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. elegans. Opt Express. 16, 5963 (2008).
- O'Brien, G. S., et al. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. , (2009).
- Tsai, P. S., et al. Plasma-mediated ablation: an optical tool for submicrometer surgery on neuronal and vascular systems. Curr Opin Biotechnol. 20, 90-99 (2009).
- Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation. BMC Neurosci. 7, 30 (2006).
- Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. Constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in C. elegans. J Vis Exp. , (2011).
