Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

En Drosophila In Vivo skada modell för att studera Neuroregeneration i perifera och centrala nervsystemet

Published: May 5, 2018 doi: 10.3791/57557
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2
1Raymond G. Perelman Center for Cellular and Molecular Therapeutics, The Children's Hospital of Philadelphia, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Pennsylvania
* These authors contributed equally

Summary

Här presenterar vi ett protokoll med de Drosophila sensoriska neuron - dendritiska arborization (da) neuron skada modell, som kombinerar i vivo live imaging, två-photon laser axotomy/dendriotomy och kraftfull flyga genetiska verktygslådan, som en plattform för screening potentiella projektansvariga och hämmare av neuroregeneration.

Abstract

Återväxt kapaciteten av skadade nervceller reglerar neuroregeneration och funktionell återhämtning efter nervsystemet trauma. Under de senaste decennierna, har olika inre och yttre hämmande faktorer inblandade i begränsningen av axon förnyelse identifierats. Helt enkelt ta bort dessa hämmande signaler är emellertid otillräckliga för framgångsrika regenerering, som visar förekomsten av ytterligare reglerande maskiner. Drosophila melanogaster, bananflugan, delar evolutionärt bevarade gener och signalvägar med ryggradsdjur, inklusive människan. Kombinera kraftfull genetisk verktygslådan av flugor med två-photon laser axotomy/dendriotomy, beskriver vi här Drosophila sensoriska neuron – dendritiska arborization (da) neuron skada modell som en plattform för systematiskt screening för roman regenerering regulatorer. Kort, detta paradigm omfattar en) utarbetande av larver, b) lesion induktion till dendrite(s) eller axon(s) med en två-photon laser, c) live confocal imaging efter skada och d) dataanalys. Vår modell gör mycket reproducerbara skada enda märkt nervceller, axoner och dendriter av väldefinierade neuronala undertyper, i både perifera och centrala nervsystemet.

Introduction

Axons oförmåga att regenerera efter en skada det centrala nervsystemet (CNS), kan leda till permanent funktionsnedsättning hos patienter, och spelar också en roll i de irreversibla neurologiska bortfall i neurodegenerativa sjukdomar1,2 ,3,4,5. CNS miljön, liksom inneboende tillväxt förmågan av nervceller, avgör om axoner är att regenererar efter trauma. Extracellulära faktorer från oligodendrocyte, astroglial och fibroblastic källor har visat sig hämma nervcellernas tillväxt4,6,7,8, men i eliminering av dessa molekyler endast tillåter begränsad groning5. Inneboende regenerering signaler kan påverka regenerativ framgång5,9 och representerar potentiella terapeutiska mål, men dessa processer är fortfarande inte väldefinierade på molekylär nivå. Ökningar av trofiska faktor signalering eller eliminering av endogena bromsar, såsom Pten fosfatas-10, kan resultera i axonal förnyelse under vissa omständigheter. Kombinationer av olika metoder som visat sig vara individuellt effektivt också endast ge begränsad total återhämtning hittills11,12,13,14. Därför, det finns ett desperat behov att identifiera ytterligare vägar för riktad terapi. Förutom inledande av axon återväxt, huruvida och hur axoner re-tråd till rätt mål, reformen synaps specificitet, och uppnå funktionell återhämtning är viktiga obesvarade frågor.

Sammanfattningsvis är aktuell kunskap om de maskiner som dikterar axon regenerering fortfarande mycket fragmentariska. Del av problemet är den tekniska svårigheten av att studera axon förnyelse i däggdjur i realtid, ett arbetssätt som är dyrt, tidskrävande och utmanande för att genomföra storskaliga genetiska skärmar. Drosophila melanogaster, däremot, har visat sig vara ett exceptionellt kraftfulla system för studier av komplexa biologiska frågor. Bananflugan har varit avgörande för definiera gener och signalering vägar som bevaras påfallande hos människa och har varit en framgångsrik modell för studier av människans villkor, såsom neurodegenerativa sjukdomar, genom vidsträckta molekylärgenetik verktyg tillgängliga att manipulera gen funktion15. I synnerhet anses bananflugor vara ett idealiskt verktyg för upptäckten av gener som är involverade i neurala skador och återväxt15,16. Flera flyga neurala skada modeller har utarbetats, inklusive vuxen-huvudet eller larvformer ventrala nerv sladd (VNC) stickande med nålar, larval VNC eller nerv krossa med pincett, larval neuron laser axotomy, luktreceptor neuron borttagning, bladsticklingar hjärnskada, och perifera nerver lesion av wing avgångsvederlag15,17,18,19,20,21,22,23. Excitingly, har senaste arbete utnyttja Drosophila skada modellerna avancerade vår förståelse av cellulär och genetisk vägar används av nervsystemet för att bemöta neurala skador, av vilka några har visat sig vara bevarad i däggdjur24 ,25. Igen, Detta betonar nyttan av denna modellorganism för att identifiera nya mekanismer av neurala reparation.

Beskrivs här är en två-photon laserbaserad Drosophila larval sensoriska neuron skador modell. En två-photon laser användes först klippa axoner i zebrafiskar i vivo i 200326. I samma år spelades den första laser-dendriotomy i Drosophila använder en pulsad kväve laser27. Kort därefter använde flera C. elegans labs femtosecond lasrar för att upprätta modeller av axon regenerering28. I 2007, Wu och kollegor jämfört och redovisas skillnaderna mellan laser skador i C. elegans induceras av olika typer av lasrar29. 2010 visades första gången axon förnyelse efter laser axotomy förekomma i Drosophila30. Bygga på denna omfattande laser skada litteratur, har vi utvecklat en flyga neurala skada modell med två-photon lasern, som tillåter exakta induktion av skada till riktade webbplatser med minimal störning av angränsande vävnader, som ger en relativt ren system för att studera både inre och yttre egenskaper av neuroregeneration med encelliga upplösning. Specifikt, har vi en uppsättning skada metoder för dendritiska arborization (da) sensoriska nervceller i både det perifera nervsystemet (PNS) och CNS. Da nervceller kan grupperas i fyra olika klasser kännetecknas främst av deras dendrite förgrenade komplexitet: klass I till IV31. Våra publicerade arbete visar att da neuron förnyelse liknar däggdjur skada modeller på fenotypisk och molekylär nivå: da nervceller Visa klass specifika förnyelse egenskaper, med klass IV men inte klass I eller III da nervceller uppvisar förnyelse i den PNS; klass IV da neuron axoner regenerera kraftfullt i periferin, men deras regenerativ potential reduceras dramatiskt i CNS, som därmed liknar dorsalrotsganglier ganglion (DRG) nervceller i däggdjur. förbättra mTOR aktiviteten via Pten förbättrar radering eller Akt överuttryck axon förnyelse i flugan CNS19. Utnyttja denna skada modell, vi har varit utför genetiska skärmar och har identifierat enzymet RNA bearbetning Rtca som en evolutionärt bevarade hämmande faktor för axon regenerering, länka axon skada till cellulär stress och RNA modifiering20 .

I den presenteras paradigmen induceras skadan via laser axotomy/dendriotomy av larval klass IV eller III da nervceller, märkt av ppk-CD4-tdGFP eller 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80, respektive. Skadan som utförs på 2nd till 3rd instar larver på runt 48-72 h efter värpning (h AEL). För PNS är axotomy lesionen riktad till avsnittet axon ~ 20-50 µm bort från cellkroppen, för CNS axotomy till ett område ~ 20 µm i diameter vid commissure korsningen i VNC och dendriotomy till de primära dendritiska gren punkterna. Samma neuron är avbildade på 8-24 h efter skada (AI) att bekräfta fullständig transection och på 48-72 h AI att bedöma regenerering. Genom time-lapse confocal imaging, kan den degeneration och regeneration av enskilda axoner/dendriter som har varit skadade i vivo övervakas över tid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. beredning av kultur tallrikar och flaskor

  1. Beredning av druvsaft agarplattor
    1. Tillsätt 10 g agar pulver, 200 mL grape juice och 192 mL ddH2O i en bägare och mikrovågsugn i ca 4-5 min, under omrörning emellanåt tills ägarn är helt upplöst.
    2. I ett dragskåp, kyla ner lösningen till ca 60 ° C. Lägga till 4,2 mL 95% etanol och 4,0 mL isättika. Justera den totala volymen av lösningen på 400 mL med ddH2O. Blanda väl.
    3. För varje 35 mm plåt, Lägg till ca 2-3 mL av lösningen. Gör ca 120-150 plattor för sammanlagt 400 mL druvsaft agar lösningen.
    4. Vänta 10 min att kyla ner plattorna och stelnar agar lösningen. Packa druvsaft agarplattor i själv förseglade ziplock påsar och förvaras vid 4 ° C för framtida bruk.
  2. Beredning av Drosophila kultur flaskor
    1. Använd ett blad att stämpla ett 1,5 cm sida längd triangulära hål på ena väggen i Drosophila kultur flaskan och fyll hålet med en 2-2,5 cm diameter boll av bomull för ventilation.
    2. Anslut flaskan med en agarplatta för druvsaft som kompletteras med om 0,5 cm3 jäst pasta.

2. insamling av Drosophila larver

  1. Ställa in korsningar av vuxna flugor
    1. Plats 10 oskuld honor och 5 manliga vuxen flyger tillsammans i en kultur flaska inkopplad med en druvsaft agarplatta.
    2. Placera flaskan bottnarna upp vid 25° C, så att flugor lägger ägg på druvsaft agarplattan. Ändra plattan med jäst klistra in minst en gång om dagen. För en period på 2-h samling som tillåter skörd av larver av en homogen utvecklingsstadier, börja med 10 och mer än 20 jungfruliga hondjur i steg 2.1.1.
    3. Kultur plattan vid 25° C i en 60 mm petriskål med en våt vävnad, exempelvis indränkt i lösning 0,5% propionsyra. Ordna vävnaden så att den inte blockerar syre flöde.
      Obs: Propionsyra lösningen används för att bibehålla fuktigheten i skålen och undvika tillväxt av mögel.
  2. Skörda larver av en viss ålder
    1. Använda ett par pincett för att överföra larver av önskad scenen, till exempel 2nd till 3rd instar larver på 48-72 h efter värpning (AEL), till en ny druvsaft agarplatta utan jäst pasta.
    2. Ta bort jästen från larvernas hud genom att låta dem krypa runt på nya plattan, att förhindra potentiella stör jäst laser axotomy och imaging. Alternativt, ren noggrant larverna genom att tvätta dem i ett fat med PBS och torkning kort på en vävnad papper.

3. två-photon skada och Confocal Imaging

  1. Mikroskopet setup
    Obs: En confocal laser skanning Mikroskop med en två-photon laser användes för detta experiment, men andra system med en motsvarande installation räcker också. Två-foton laser (930 nm) användes för att leverera skada och en Argon laser (488 nm) användes för confocal avbildning av GFP.
    1. I början av varje session, slå på två-photon laser eller de confocal laser(s) och mikroskopet. Öppna avbildningsprogrammet.
    2. För två-photon skada, ställa in följande parametrar för imaging GFP med två-photon lasern på 930 nm (1 950 mW).
      1. Välj linje scan-läge. Öppna upp pinhole hela vägen. Öka till ~ 20% intensitet på laser (390 mW).
      2. Välj 512 x 512 RAM genomsökningen. Använd maximal skanningshastighet (normalt med pixel dröjtiden på 0,77 µs). Se till att det genomsnittliga antalet är 1 och bitdjup är 8 bitar.
      3. Ställ in förstärkningen till ~ 750, och offset till 0.
      4. Spara detta förinställda experimentprotokoll som 2 P GFP 930 Ablation, som möjliggör enkel återanvändning experiment i framtiden.
    3. För confocal imaging, ställa in följande parametrar för imaging GFP med Argon laser på 488 nm:
      1. Välj fliken förvärv och då Z-stack.
      2. Under ”Laser”, slå på strömmen för 488 nm Argon laser.
      3. Gå till kanaler, Välj 488 mm laser och öka laser kraften till 5-10%. För hål, Använd 1-2 luftiga enheten (AU). Justera känsligheten till 650.
      4. I Förvärvet-läge, Välj 1024 x 1024 som ram genomsökningen, Använd den maximal skanningshastigheten, ett genomsnittligt antal 2 och bitdjup på 8 bitar.
      5. Spara detta förinställda experimentprotokoll som GFP Imaging.
  2. Larverna anestesi med dietyleter och montering
    1. I ett dragskåp, placera en 60 mm glas skålen i en 15 cm plast petriskål. Vik och låg en bit vävnad papper på botten av glas skålen, placera sedan en druvsaft agarplatta på vävnad. Lägga till dietyleter i glas skålen, till den punkt där mjukpapper är blöt och det finns ett lager av flytande eter kvar i skålen. Hålla locket hela tiden.
    2. Förbereda en glasskiva med en droppe av halocarbon 27 olja i mitten. Lägga till 4 ställen vakuum Grease på de fyra hörnen på bilden, för att senare stöd av täckglas.
    3. Använda pincett för att plocka upp en rengjorda larv och placera den på en agarplatta i 60 mm glas skålen. Täck glas skålen med lock och vänta tills larven stannar. För PNS skada/imaging, ta ut larven så snart sin svans stannar ryckningar. För CNS, vänta tills hela larven blir orörlig, särskilt huvud segmenten.
      Obs: Tidpunkten för eter exponering är kritisk. Se diskussion.
    4. Försiktigt plocka upp sövda larven och placera det huvud-upprätt i släpp av halocarbon olja på bilden. Lägga till ett täckglas ovanpå bilden. Använd lätt tryck för att trycka ner täckglaset, tills den vidrör larven (figur 1A).
    5. Justera Larvens position genom att försiktigt trycka täckglaset mot vänster eller höger för att rulla larven, så att de neuron/axon/dendrite sevärdheter är på topp och närmast Mikroskop linsen.
    6. Till PNS skada, montera larv ryggsidan upp, så att båda tracheas syns. Rulla sedan larven ~ 30 grader till vänster för skadade klass III da neuron axoner (figur 1B och 1 C), 90 grader för skadade klass IV da neuron axoner (figur 1B och 1E) eller ~ 30 grader för skadade klass IV da neuron dendriter) Figur 2A).
    7. Till CNS skada, placera larv för att vara perfekt ventrala sida upp (figur 3A), så att regionen av intresse är närmast Mikroskop linsen i z-planet.
  3. Skada genom två-photon laser
    1. Placera bilden med larven under mikroskopet och säkra den på plats med innehavaren bild på scenen. Användning av 10 X (0.3 NA) mål att hitta larven.
    2. Tillsätt 1 droppe av objektiva olja på täckglaset, växla till 40 X (1.3 NA) mål och justera fokus.
    3. Växla till genomsökningsläget och återanvända det experimentellt protokollet 2 P GFP 930 Ablation. Kontrollera att pinhole öppnas hela vägen.
      Obs: Konfigurationen måste optimeras baserat på enskilda system.
    4. Starta Live läge leta upp regionen av intresse (ROI) och finjustera inställningarna för att uppnå bra bildkvalitet med lämpliga zoom.
      Obs: Syftet med detta steg är att hitta de neuron/axon/dendrite att skada, snarare än att ta den bästa bildkvalitet. Använd därför minimal inställningarna räcker för att visualisera målområdet, för att undvika överexponering eller fotoblekning.
    5. Stoppa Live scan, så att knappen Beskär blir tillgängliga. Låt bilden utgöra färdplanen. Välj funktionen Beskär och justera fönstret scan att fokusera på målet att bli skadade.
    6. Minska ROI för att vara storleken på den tilltänkta platsen för skadan. Till exempel bara täcka bredden på ett axon eller en dendrite, att säkerställa precisionen av skadan och minska skadorna på angränsande vävnader. Om du vill zooma in på ROI innan beskärning, vilket möjliggör mer exakt skada.
    7. Öppna ett nytt imaging fönster. Minska spolningshastighet och öka laser intensitet. Bestämma ökningen i laser intensitet baserat på signalen vävnad fluorescens skannas i Live -läge.
    8. Oftast, satt två-photon laser intensitet från 25% till PNS skada och 50-100% för VNC skada. Till PNS axon skada, säkerställa att laser intensitet är ~ 480 mW och pixel dröjtiden är 8.19 μs. För VNC axon skadan, säkerställa att laser intensitet och pixel dröjtiden är vanligtvis 965-1930 mW och 8.19-32,77 μs, respektive.
    9. Starta kontinuerlig skanning. Lämna markören svävar över knappen kontinuerlig . Hålla ett öga på bilden och stoppa sökningen så snart en drastisk ökning av fluorescens.
      Obs: Uppkomsten av fluorescens spike är tack vare auto-fluorescens vid skadan webbplats.
    10. Växla tillbaka till Live-läget genom att återanvända inställningarna. Hitta regionen av intresse som bara riktades genom att justera fokus.
      Obs: En bra indikation på framgångsrika skada är uppkomsten av en liten krater, ringliknande struktur eller lokaliserade skräp precis vid skadan webbplats.
    11. Flytta till nästa neuron och upprepa från steg 3.3.5, att skada flera nervceller hos ett enskilt djur. Eller upprepa steg 3.3.5 samtidigt gradvis ökar kraften och/eller minska scan hastighet om den initiala skadan var otillräcklig.
      Obs: Ifall lasereffekten är alltför hög, en stor skadade området syns i bilden efter skada levande scan. För mycket skada kan orsaka döden av larven.
    12. Återställa larven genom att försiktigt ta bort täckglaset och överföra skadade larven på en ny tallrik med jäst pasta. Dike flera grottor på en agarplatta med tången; Alternativt göra en ö av agar i plåten istället för att använda hela plattan, för att minska möjligheten att larven kryper ur plattan.
    13. Satte plattan i en 60 mm petriskål med våt vävnad (indränkt med propionsyra lösning 0,5%) och kultur vid rumstemperatur eller 25° C.
      Obs: Det larven finns kvar i larvstadium i ungefärligt en extra dag i rumstemperatur (22° C) jämfört med vid 25° C.
  4. Efter skada confocal imaging
    1. Bild skadade larven vid önskade tidpunkter genom att förbereda larven med samma procedur av anestesi och montering som i steg 3,2, sedan imaging med confocal laser.
      Obs: Bilden larven på 24 h efter skada (AI) att bekräfta axonal skada och 48 h AI (klass IV da nervceller) eller 72 h AI (klass III da nervceller) att bedöma regenerering.
    2. Leta upp larven med målsättningen 10 X och sedan växla till en 25 X (0.8 NA) mål. Återanvända det experimentellt protokollet GFP Imaging.
    3. Klicka på knappen Live och hitta samma neuron skadade tidigare.
    4. Ange de första och sista Z positionerna i live scan-fönstret. Tryck på stop och klicka på börja experimentera för att förvärva en Z-stack bild.
      Obs: Se till att det ingår en normalisering punkt (den axon konvergerande punkten) när fånga bilder så att kvantifiering av regenerering är möjligt (figur 1 d, 1F) – detta diskuteras vidare i avsnittet data analys.
    5. Växla till Bildbehandling, Välj den bild som just tagit och generera en maximal intensitet projektion. Spara både z-stack och maximal intensitet projektion bilder.

4. dataanalys

  1. Bearbeta och kvantifiera bilder med antingen imaging programvara eller ImageJ.
  2. Kvantifiering av axon förnyelse i PNS
    1. Beräkna regenerering procentandel, som avser procent av regenererande axoner bland alla axoner som var bort. Poäng ett axon som regenererande så länge det regrows okända skadan webbplats.
    2. Åtgärd regenerering längd, vilket är ökningen i axon längd. Om kvantifiera med ImageJ, använda verktyget Segmenterad linje för att spåra regenererad axon och Använd åtgärd i analysera droppa-ned menyn för att få längden på raden som representerar regenererad axon.
    3. Beräkna Regenerering Index, vilket är ökningen i normaliserade axon längd.
      Obs: Axon längd är normaliserat av avståndet mellan cellkroppen och axon konvergerande punkt (DCAC) – axon längd/DCAC (figur 1 d och 1F). Det här värdet kan konto för någon axonal tillväxt beror på larval skalning. Ett positivt värde representerar förnyelse, värdet 0 betyder ingen förnyelse och ett negativt värde innebär indragning.
  3. Kvantifiering av dendrite regenerering
    1. Beräkna regenerering procent, vilket är procenten av da nervceller bland alla de avhuggna som visar uppenbara dendrite återväxt.
      Obs: Dendrite återväxt är mål positivt om nya dendriter återföds ständigt ut från infällt dendritiska stammen och okända skadan webbplats. Skadan webbplats bestäms av sevärdheter, och i vissa fall, är synlig på grund av den kvarstående skada-inducerad autofluorescens.
    2. Beräkna öka gren punkter, som räknar tillägg av nya dendritiska gren punkter efter skada.
    3. Beräkna ökning av totala dendrite längd, som är kumulativa längden av alla nya dendriter läggas till efter skada.
  4. Kvantifiering av axon förnyelse i CNS
    Obs: Om en lesion webbplats visar degeneration vid den första tidpunkten avbildas (figur 3B), det kommer att ingå i analysen av regenerering längd och hastighet.
    1. Åtgärd regenerering längd, vilket är längden på den förnybara axonen.
      Obs: Den förnybara axonen för en enstaka lesion webbplats identifieras som det härrör från den ursprungliga axon rutten innan skadan.
    2. Beräkna Normalized regenerering längdsom normaliserar regenerering längden till längden på segmentet commissure - longitudinella avståndet mellan commissures (”Y” i figur 3A och 3B).
      Obs: Detta värde hjälper korrekt för effekten av larval storlek skillnader.
    3. Beräkna regenerering räntasom är procent av regenererande segment bland alla segment som var bort, att återspegla regenerering kapaciteten av en bestämd genotyp.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Da nervceller visar differentiell föryngring potential mellan den perifera och centrala nervsystemet samt klass specificitet. Detta ger unika möjligheter till skärmen för romanen faktorer som krävs för axon regenerering (med klass IV PNS skada), samt de som är hämmande för regenerering (med klass IV CNS skada och klass III PNS skada).

Axon förnyelse i PNS

Som exempel beskrivs karakterisering av regenerering av klass III och klass IV da nervceller. Dessa nervceller finns bilateralt i varje kropp segment. Flera nervceller kan skadas i samma larv; normalt 3-4 nervceller i höger sida av buken segment A7-A2. Klass III och klass IV da nervceller kan visualiseras genom 19-12-Gal4, UAS-CD4tdGFP, repo-Gal80 och ppk-CD4tdGFP, respektive. Söva och montera 48-72 h AEL larver som beskrivs, justera position larver så att da nervceller av intresse vänd uppåt (figur 1A och 1B). Vi skadar vanligtvis den klass III ddaF och klass IV v'ada nervceller (figur 1 c och 1E). Utföra axotomy och återställa larver som beskrivs. Strax efter skada (AI), larverna kommer att ha återhämtat sig från kirurgi och uppvisar normala locomotion. Överlevnaden här är typiskt över 80%. Kassera larver som är döda eller sjuka. Montera resten som beskrivs och bedöma degeneration. På 24 h AI, distala axoner bör ha avslutat degeneration vid denna tid punkt19, och axon stammen blir synlig (figur 1 d och 1F). Reimage samma larverna på 48 h AI för klass IV da nervceller eller 72 h AI för klass III da nervceller att bedöma regenerering. Vanligtvis försöker vi bedöma minst 20 skadade nervceller per experimentella villkor. I (vildtyp) WT framgår djur, medan normalt ~ 70% av avhuggna klass IV da nervceller kommer har regenereras okända skadan webbplats (figur 1F), klass III da nervceller misslyckas att återföds ständigt, av tillväxt kon stagnerar (figur 1 d).

Dendrite regenerering

Vi utför vanligen dendriotomy på klass IV da nervceller ddaC (figur 2A). Som visas i diagrammet schematisk, är skadan riktad till den primära dendritiska gren punkten. Baserat på erfarenhet, när skadade på 48 h AEL, regenerera ~ 50% av ddaC nervceller deras dendriter (figur 2B). I resterande 50%, angränsande dendriter invadera och täcka lediga utrymme. Dessutom minskas regenerering potentialen i dessa nervceller om skadade vid en senare utvecklingsstadier.

Axon förnyelse i CNS

För VNC axon skada, överlevnaden av larver varierar kraftigt och beror på ålder vid vilken skada induceras. Baserat på erfarenhet, larver av 48-72 h AEL har vanligtvis den högsta överlevnaden (> 60%) bland de olika stadierna testade. Larver som är yngre än 48 h AEL överleva dåligt efter skada, medan i de äldre än 72 h AEL är det svårt att införa skada i VNC. Dessutom är det lättare att framkalla skada på segmenten posterior commissure än den främre, bakre segmenten av VNC är närmare den ventrala ytan och därmed mer tillgänglig med laser (figur 3A).

För att skada klass IV da neuron axoner i CNS, montera larvaena som tidigare beskrivits (figur 3A). Under mikroskopet, lokalisera axon buntar stege-liknande struktur som utgör en del av VNC (figur 3A), och utföra axotomy som beskrivs. Degeneration bekräftas på 8 h AI och regenerering bedöms vid 24 och 72 h AI. Som visas i figur 3B, axoner på 8 h AI börjat redan urarta, och vid 24 h AI, axon regenerering observeras medan axon skräp kan fortfarande hittas runt skada webbplatser. WT axoner Visa begränsade återväxt i VNC och misslyckas att återansluta de luckor som genereras av skadan (figur 3B). För att kvantifiera den regeneration förmågan av skadade axoner, används återväxt längden efter skada mäts och längden på segmentet commissure (Y i figur 3A) för normalisering (figur 3 c).

Figure 1
Figur 1: Da neuron axon förnyelse i periferin visar klass specificitet. (A och B) Schematisk ritning visar positionen för larverna. (C) Schematisk ritning av klass III da nervceller. (D) axoner av klass III da nervceller ddaF, märkt med 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80 / +, misslyckas att återföds ständigt. (E) Schematisk ritning av klass IV da nervceller. (F) axoner av klass IV da nervceller v'ada, märkt med ppk-CD4-tdGFP / +, återföds ständigt utanför lesion platsen. (D och F) Röd linje visar axon längd medan grön streckad linje markerar avståndet mellan cellkroppen och axon konvergerande punkt (DCAC). Den blå punkten markerar den axon konvergerande punkten. Skalstapeln = 20 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Da neuron dendrite regenerering. (A) belysande representation av klass IV da nervceller. (B) belysande representation av dendrite förnyelse i klass IV da neuron ddaC, märkt av ppk-CD4-tdGFP / +. Laser ablation är riktad till den primära vägdelningen och bedrivs på 48 h AEL. På 24 h AI skada transection av neurite bekräftas, och på 72 h AI regenerering är kvantifierad. Dendriter av ddaC nervceller visar betydande återväxt, med nya dendritiska grenar GRO från avhuggna stammen att kakel det lediga utrymmet. Det är värt att notera att nya terminalen grenar kontinuerligt läggs till oskadd dendriter på denna utvecklingsfas. Skalstapeln = 20 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Da neuron axon förnyelse i VNC. (A) Schematisk ritning av en Drosophila larv monterad på en bild och avbildas under mikroskopet. Klass IV da neuron axoner i VNC visualiseras i en ppk-CD4tdGFP / + larv. Två kandidat commissure segment visas i den inzoomade bilden och schematiska ritningen. Var och en av dem har två skada platser (röda cirklar). (B) Confocal bilder av ett skadade segment avbildas på 8, 24 och 72 h efter skada (AI). Röda linjer skildra den förnybara axoner. (C) mätning och normalisering av förnybara axoner. Skalstapeln = 20 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

När inställningen upp farten korsar, kan antalet honor och hanar som används variera beroende på genotyperna och antalet larver som behövs för specifika experiment. För WT flugor använder typisk cross 10 tikar och 5 hanar. Fönstret samling kan reduceras, beroende på riktigheten av den larver ålder som krävs. Exempelvis ger en 2-h kredittid larver av en mer homogen befolkning. I det här fallet hjälper använder hondjur 20 eller mer oskuld för att ställa in korsen ge tillräcklig ägg. Avkastningen från den första dagen är oftast knappa, så samla plattan med ägg två eller flera dagar efter inställning av kammaren. När ytterligare odling plattan med ägg, rekommenderas det att blöta vävnaden i 60 mm petriskål i lösning 0,5% propionsyra istället för vatten, vilket kommer inte bara hjälpa bibehålla fuktigheten i skålen men också undvika tillväxt av mögel.

När du ställer in enheterna för larver anestesi och montering, se till att använda en glasskål eftersom eter smälter genom plast. Glas skålen är inrymt i en 15 cm plast petriskål vid en läcka. Mjukpapper hjälper till att bevara eter i skålen så att larven kan vara effektivt utslagen av eter dunsten. Rekommenderas använda amber att lämna flaskor för att lagra alikvoter av eter och lägga till eter i droppar med glas pipetten. Fylla på eter och alltid hålla ett lager av flytande eter på botten av skålen för optimal effekt.

Tidpunkten för eter exponering är kritisk: under anestesi kommer att leda till larv återhämtning i mitten av bildsession och skakiga bilder; en anestesi överdosering eller direktkontakt med eter vätskan, kommer att orsaka dödlighet. För att maximera överlevnad och framgång, vår tumregel är följande: för PNS skada/imaging, ta ut larven så snart sin svans stannar ryckningar; för CNS, vänta tills hela larven blir orörlig, särskilt huvud segmenten. Även en liten rörelse kommer att störa skada och avbildning av VNC axoner. Äldre larver tenderar att ta längre tid att slå ut. Det tar vanligtvis mindre än 2 min för larver yngre än 72 h AEL och 2-5 min för larver som är äldre än 72 h AEL.

När du ställer in intensiteten av de två-photon lasern för skada, bestäms värdet av vävnad fluorescens signal erhålls från ”Live” scan. Skadan som införts av ”kontinuerlig” scan som i steg 3.3. Den nervskade-inducerad ökningen av fluorescens beror autofluorescens på skadan webbplats och fungerar som en bra indikator på avbränning av neurite. Typiskt, det tar 1-10 s att se fluorescens spike. Det är viktigt att styra bildläsningstiden när fluorescens är förhöjd. Till PNS skada är det viktigt att stoppa skanning omedelbart. Långvarig exponering kommer att förstora skadan webbplats och skada närliggande vävnader. Detta ger dock möjlighet att justera söktiden och manipulera svårighetsgraden av skadan. En framgångsrik skada bör ha en lesion storlek diameter mindre än 3-4 μm. För VNC axon skada, VNC axoner är inbäddade mycket djupare axoner/dendriter, som just under huden, och således kräver högre jämfört med da neuron PNS och laser intensitet. Vi lämnar oftast genomsökningen på för några sekunder. Detta är att säkerställa att hela axon bunten är avskurna. Om radien av lesion webbplatser är mer än halva bredden av commissure bunten, räknas sådan skada platser som misslyckade. Sådana larver har en låg överlevnad och kommer inte att inkluderas i analysen.

För axon regenerering är regenerering förmågan liknande larval investeringsfaser. Men för dendrite regenerering efter en enda dendrite skära, regenerering potentiella reduceras efter 72 h AEL19. Således, axon skada utförs normalt vid 48 h - 72 h AEL och dendrite skada på 48h AEL, med bedömning av regenerering vid 120h AEL. Larver av 24h AEL kan också användas, men de kräver mer noggrann hantering, med tanke på deras storlek. Larverna förpuppas efter 120 h AEL, att göra imaging mer utmanande. Därför är våra slutpunkt vanligtvis 120 h AEL.

Vad är sambandet mellan degeneration och regeneration? Till PNS skada, på 24 h AI, har normalt den distala axonet/dendrite i WT slutfört Wallerian degeneration medan regenerering inte har startat vid denna tidpunkt. Därför anser vi att degeneration av avhuggna neuriter i WT larver, endast har en mycket begränsad inverkan på förnyelse, om alls. Axoner på 8 h AI har redan börjat urarta till VNC skada, och vid 24 h AI, axon regenerering är observerade medan axon skräp kan fortfarande hittas runt skada webbplatser. Skräpet verkar inte blockera regenerering. Det är dock möjligt att under vissa omständigheter, det kan finnas en överlappning eller ens en överhörning mellan degeneration och regeneration. I själva verket har det rapporterats att skräp clearance efter perifera nervskador i åldern möss, är långsammare än hos unga djur. Samtidigt, observerades långsammare reinnervation av den neuromuskulära förbindelsen, som kan hänföras till det större antalet hinder regenererande axoner möte i gamla djur. Överraskande, men axoner från äldre djur regenerera snabbt och reinnervate neuromuskulära förbindelsen webbplatser effektivt när de inte konfronteras med skräp32. Detta tyder på att underlätta skräp clearance kan vara en potentiell strategi att främja förnyelse.

Jämfört med andra neuroregeneration modeller, har flyga sensoriska neuron skada modellen unika fördelar. Musmodeller brukar ta veckor till månader att utföra och är inte lämpliga för att genomföra storskaliga genetiska skärmar; C. elegans har bara en primitiv centrala nervsystemet som inte kan nära recapitulate regenerering hindren i däggdjur CNS; skiljer sig från däggdjur, zebrafiskar CNS axoner regenerera kraftfullt. Flugorna snabba livscykel, mångsidigheten hos flyga genetik, tillgänglighet och stereotypa mönster av axoner/dendriter av flyga sensoriska nervceller och karakteristiska förnyelse egenskaper av flyga sensoriska nervceller – subtyp specifika förnyelse i den PNS och begränsad föryngring i CNS – gör Drosophila da nervceller en attraktiv modell för att studera neuroregeneration. Dessutom senaste studier från krossade mus retinala ganglionceller (RGCs) tyder också på att neuronala subtyper bära distinkta regenerering befogenheter. vissa RGC undertyper kan regenerera, medan andra i till synes homogen nerv bunt misslyckas att återföds ständigt33. Detta viktiga fynd antyder att neuronala typspecifika strategier bör utnyttjas för att främja regenerering och funktionell återhämtning och hävdar starkt att induktion av axon skada och efterföljande regenerering analys bör utföras i en neuronala subtyp-specifika sätt. Dessutom förblir de cellulära och molekylära bestämningsfaktorerna för denna förnyelse typ-specificitet i stort sett okänd19,33. Därför, da neuron skada modellen erbjuder perfekt paradigm för att tackla dessa problem.

Jämfört med axon regenerering, är studier med fokus på dendrite regenerering mycket knappare. Dendrite skada uppstår, såsom i traumatisk hjärnskada, stroke och många former av neurodegeneration, men nästan inget är känt om dendriter förmåga att reparera och reformera neurala anslutningar. Da neuron skada modellen ger igen en mycket tillgänglig system som visar stereotypa mönster, klass specificitet och temporal förordning19, för att utforska denna riktning.

Det är också värt att nämna att även om det är möjligt att skada en märkt enda axon i PNS, utförs den sätt skadan i CNS resulterar i lesionen av en bunt av axoner. Om så önskas, kan MARCM34 eller metoden FLP-out klon35 användas för att märka enda axoner i CNS. Dessutom, när gliaceller är samtidigt märkt med mRFP (Repo-Gal4, UAS-mRFP), observeras ansamling av glia processer speciellt på webbplatsen lesion. Dessutom ett uttryck för Ptp99A, den flyga homolog av chondroitin sulfate proteoglykan (CSPG) phosphacan / PTPRZ1, är uppreglerat på webbplatsen lesion. Ptp99A Co lokaliserar med gliaceller och omger skadan webbplats, bildar en ringliknande struktur liknar vad har rapporterats för astroglial ärr i däggdjur19,36,37. Sammanfattningsvis, kommer att da neuron skada modellen, i kombination med markörer för andra celltyper som gliaceller eller immuna celler, tillåta i vivo realtid övervakning av flercelliga interaktion mellan en skadelidande neuron och dess omgivande miljö.

Medan denna fluglarver sensoriska neuron skada modell ger oss möjligheter att hitta potentiella neuroregeneration tillsynsmyndigheter både CNS och PNS, har det fortfarande flera begränsningar. Först, det är inte för hög genomströmning i nuläget. Normalt kan 5-6 genotyper kontrolleras av en person i en vecka. Det måste optimeras för att utföra en opartisk skärm. Andra, som den eter anestesi på larver kan pågå från flera minuter till mer än tjugo min, är det inte optimalt för långsiktiga imaging. Således, specifika tidpunkter som är representativa för axon degeneration och regeneration respektive väljs för avbildning. Tredje, även om detta protokoll är att införa ett sätt att skada axoner just, möjligheten att skada på omgivande vävnader kan inte helt uteslutas. I VNC, kan dessa vävnader vara gliaceller, axoner och dendriter av andra nervceller. För att minimera denna potentiella varning, vi minimera skada webbplatser, tillämpa den lägsta laser power möjligt och utföra samma förfaranden parallellt att både styra och experimentera grupper. Fjärde, håller på att inrätta CNS skada paradigm, olika skada webbplatser testades, inklusive webbplatserna nära axon termini som vi valde att använda och posten pekar av axoner i VNC. Startpunkter befanns vara svårare att skada eftersom de är djupare i vävnaden och mer benägna att flytta. Således, för dessa praktiska skäl vi välja den nuvarande metoden, som är mer konsekvent, bättre kontrollerad och bra för storskaliga experiment. En potentiell oro, är som nämnts ovan, möjligheten att skada närliggande vävnader, såsom de postsynaptiska komponenterna och gliacellerna. Däremot, är det en enastående fråga hur skadade omgivande vävnader påverka degeneration och regeneration av axoner. Exempelvis hur påverkar gliaceller ärret axon regenerering. Detta utgör ytterligare en anledning varför vår skada modell kan likna skada modeller i däggdjur, där axoner och vävnader runt lesionen webbplatser är oftast skadade samtidigt.

Laser skada följt av time-lapse mikroskopi är en känslig analys för att studera axon/dendrite regenerering. En huvudfråga för denna analys är dock den upplevda kostnaden, som sträcker sig från <$ 10K för low-end solid-state puls lasrar, $25-100K för femtosecond lasrar till >$ 100K för två-photon lasrar. Det finns flera bra diskussioner om olika lasersystem som används för axotomy29,38,39,40,41,42,43, 44 , 45. Sammanfattningsvis konventionella lasrar är optimala för styckning axoner inom om 30-50 µm från ytan. Det blir mer skador med nano och pico andra lasrar jämfört med femtosecondlaser, särskilt som djupet av målområdet ökar45. För skadade axoner i VNC, djup som är vanligtvis cirka 50-100 µm, är det viktigt att minimera vävnadsskada. I det här fallet två-photon lasern är perfekt, som fokuserar laser kraften till fokalplanet, minska säkerheter vävnadsskada utan att kompromissa med vävnad penetration. Avslutningsvis två-photon systemet är dyrt, men erbjuder det bästa precision och vävnad bevarandet. Om bara PNS axoner är målet för axotomy, kan konventionell puls lasrar dock ett mer prisvärt alternativ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Jessica Goldshteyn för teknisk support. Arbete i låt labbet finansieras av NIH bidraget R00NS088211, och de intellektuella och utvecklingsstörningar Research Center (IDDRC) nya Program Development Award.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Diethyl ether, ACS reagent, anhydrous Acros Organics AC615080010
Halocarbon 27 Oil Genesee Scientific 59-133
Phosphate buffered saline (PBS), 20x Concentrate, pH 7.5, supplier # E703-1L VWR 97062-948 
Agar powder, Alfa Aesar, 500GM VWR AAA10752-36
Grape juice Welch’s
Ethanol 95% (Reagent Alcohol 95%) VWR 64-17-5
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283
Propionic Acid J.T.Baker U33007
Cover Glasses: Rectangles Fisher Scientific 12-544-D 50 mm X 22 mm
Zeiss LSM 880 laser scanning microscope Zeiss
Zen software Zeiss
Chameleon Ultra II Coherent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yakura, J. S. Recovery following spinal cord injury. , (1996).
  2. Harel, N. Y., Strittmatter, S. M. Can regenerating axons recapitulate developmental guidance during recovery from spinal cord injury? Nature reviews. Neuroscience. 7, 603-616 (2006).
  3. Jurewicz, A., Matysiak, M., Raine, C. S., Selmaj, K. Soluble Nogo-A, an inhibitor of axonal regeneration, as a biomarker for multiple sclerosis. Neurology. 68, 283-287 (2007).
  4. Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat Rev Neurosci. 7, 617-627 (2006).
  5. Sun, F., He, Z. Neuronal intrinsic barriers for axon regeneration in the adult CNS. Curr Opin Neurobiol. , (2010).
  6. Liu, B. P., Cafferty, W. B., Budel, S. O., Strittmatter, S. M. Extracellular regulators of axonal growth in the adult central nervous system. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 361, 1593-1610 (2006).
  7. Liu, K., Tedeschi, A., Park, K. K., He, Z. Neuronal intrinsic mechanisms of axon regeneration. Annu Rev Neurosci. 34, 131-152 (2011).
  8. Schwab, M. E., Strittmatter, S. M. Nogo limits neural plasticity and recovery from injury. Curr Opin Neurobiol. 27, 53-60 (2014).
  9. He, Z., Jin, Y. Intrinsic Control of Axon Regeneration. Neuron. 90, 437-451 (2016).
  10. Park, K. K., et al. Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway. Science. 322, 963-966 (2008).
  11. Geoffroy, C. G., Hilton, B. J., Tetzlaff, W., Zheng, B. Evidence for an Age-Dependent Decline in Axon Regeneration in the Adult Mammalian Central Nervous System. Cell Rep. 15, 238-246 (2016).
  12. Geoffroy, C. G., et al. Effects of PTEN and Nogo Codeletion on Corticospinal Axon Sprouting and Regeneration in Mice. J Neurosci. 35, 6413-6428 (2015).
  13. Jin, D., et al. Restoration of skilled locomotion by sprouting corticospinal axons induced by co-deletion of PTEN and SOCS3. Nat Commun. 6, 8074 (2015).
  14. Wang, X., et al. Axonal regeneration induced by blockade of glial inhibitors coupled with activation of intrinsic neuronal growth pathways. Exp Neurol. 237, 55-69 (2012).
  15. Fang, Y., Bonini, N. M. Axon degeneration and regeneration: insights from Drosophila models of nerve injury. Annual review of cell and developmental biology. 28, 575-597 (2012).
  16. Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
  17. Leyssen, M., et al. Amyloid precursor protein promotes post-developmental neurite arborization in the Drosophila brain. The EMBO journal. 24, 2944-2955 (2005).
  18. MacDonald, J. M., et al. The Drosophila cell corpse engulfment receptor Draper mediates glial clearance of severed axons. Neuron. 50, 869-881 (2006).
  19. Song, Y., et al. Regeneration of Drosophila sensory neuron axons and dendrites is regulated by the Akt pathway involving Pten and microRNA bantam. Genes Dev. 26, 1612-1625 (2012).
  20. Song, Y., et al. Regulation of axon regeneration by the RNA repair and splicing pathway. Nat Neurosci. 18, 817-825 (2015).
  21. Kato, K., Forero, M. G., Fenton, J. C., Hidalgo, A. The glial regenerative response to central nervous system injury is enabled by pros-notch and pros-NFkappaB feedback. PLoS Biol. 9, e1001133 (2011).
  22. Fang, Y., Soares, L., Teng, X., Geary, M., Bonini, N. M. A novel Drosophila model of nerve injury reveals an essential role of Nmnat in maintaining axonal integrity. Curr Biol. 22, 590-595 (2012).
  23. Xiong, X., et al. Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury. J Cell Biol. 191, 211-223 (2010).
  24. Brace, E. J., DiAntonio, A. Models of axon regeneration in Drosophila. Exp Neurol. 287, 310-317 (2017).
  25. Hao, Y., Collins, C. Intrinsic mechanisms for axon regeneration: insights from injured axons in Drosophila. Curr Opin Genet Dev. 44, 84-91 (2017).
  26. Galbraith, J. A., Terasaki, M. Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation. Mol Biol Cell. 14, 1808-1817 (2003).
  27. Sugimura, K., et al. Distinct developmental modes and lesion-induced reactions of dendrites of two classes of Drosophila sensory neurons. J Neurosci. 23, 3752-3760 (2003).
  28. Yanik, M. F., et al. Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy. Nature. 432, 822 (2004).
  29. Wu, Z., et al. Caenorhabditis elegans neuronal regeneration is influenced by life stage, ephrin signaling, and synaptic branching. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15132-15137 (2007).
  30. Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. Global up-regulation of microtubule dynamics and polarity reversal during regeneration of an axon from a dendrite. Mol Biol Cell. 21, 767-777 (2010).
  31. Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129, 2867-2878 (2002).
  32. Kang, H., Lichtman, J. W. Motor axon regeneration and muscle reinnervation in young adult and aged animals. J Neurosci. 33, 19480-19491 (2013).
  33. Duan, X., et al. Subtype-specific regeneration of retinal ganglion cells following axotomy: effects of osteopontin and mTOR signaling. Neuron. 85, 1244-1256 (2015).
  34. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
  35. Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
  36. Buss, A., et al. NG2 and phosphacan are present in the astroglial scar after human traumatic spinal cord injury. BMC Neurol. 9, 32 (2009).
  37. McKeon, R. J., Jurynec, M. J., Buck, C. R. The chondroitin sulfate proteoglycans neurocan and phosphacan are expressed by reactive astrocytes in the chronic CNS glial scar. J Neurosci. 19, 10778-10788 (1999).
  38. Raabe, I., Vogel, S. K., Peychl, J., Tolic-Norrelykke, I. M. Intracellular nanosurgery and cell enucleation using a picosecond laser. J Microsc. 234, 1-8 (2009).
  39. Hutson, M. S., Ma, X. Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo. Phys Rev Lett. 99, 158104 (2007).
  40. Venugopalan, V., Guerra, A. 3rd, Nahen, K., Vogel, A. Role of laser-induced plasma formation in pulsed cellular microsurgery and micromanipulation. Phys Rev Lett. 88, 078103 (2002).
  41. Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. elegans. Opt Express. 16, 5963 (2008).
  42. O'Brien, G. S., et al. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. , (2009).
  43. Tsai, P. S., et al. Plasma-mediated ablation: an optical tool for submicrometer surgery on neuronal and vascular systems. Curr Opin Biotechnol. 20, 90-99 (2009).
  44. Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation. BMC Neurosci. 7, 30 (2006).
  45. Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. Constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in C. elegans. J Vis Exp. , (2011).

Tags

Medicin fråga 135 Drosophila sensoriska neuron dendritiska arborization neuron neurala skada neuroregeneration axotomy dendriotomy PNS CNS
En <em>Drosophila In Vivo</em> skada modell för att studera Neuroregeneration i perifera och centrala nervsystemet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, D., Li, F., Guttipatti, P.,… More

Li, D., Li, F., Guttipatti, P., Song, Y. A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System. J. Vis. Exp. (135), e57557, doi:10.3791/57557 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter