Summary
ここでは、としてショウジョウバエ感覚ニューロンの樹状分枝 (da) ニューロン損傷モデルは、体内を組み合わせたライブ イメージング、2 光子レーザー膠/dendriotomy、および強力なハエの遺伝的ツールボックス,を使用してプロトコルを提案します。潜在的なプロモーターと再生に関する阻害物質をスクリーニングするためのプラットフォームです。
Abstract
破損した細胞の再生能力には、神経系の外傷後支配する再生に関すると機能回復が。過去数十年間、さまざまな組み込みと外因性抑制に関与する因子軸索再生の制限が特定されています。しかし、単にこれらの抑制のキューを削除する再生が成功する、追加規制機械の存在を示すため不十分です。キイロショウジョウバエ、フルーツ フライは、ヒトを含む脊椎動物の進化上保存された遺伝子とシグナル伝達経路を共有します。2 光子レーザー膠/dendriotomy とハエの遺伝子の強力なツールボックスを組み合わせること、ここで述べたいショウジョウバエ感覚ニューロン-樹状分枝 (da) ニューロン損傷モデル体系的に小説のスクリーニングのためのプラットフォームとして再生レギュレータ。簡単に言えば、このパラダイムには) dendrite(s) または axon(s) 2 光子レーザー、c) ライブの共焦点イメージング受傷後、d) データ分析を使用する幼虫、巣 b) 誘導の準備が含まれます。私たちのモデルにより、末梢および中枢神経系の適切に定義された神経細胞の樹状突起、軸索、単一標識細胞の再現性の高い傷害です。
Introduction
軸索の中枢神経系 (CNS) への損傷の後で再生することができない患者では、永続的な障害につながる可能性があります、また神経変性疾患1,2 で不可逆的な神経障害の役割を果たしています。 ,3,4,5。神経細胞の本質的な成長能力と同様に、中枢神経系の環境では、軸索が外傷の後で再生することができるかどうかを決定します。神経成長4,6,7、8、しかし、これらの分子の除去を阻害するオリゴデンドロ サイト、グリア、および線維芽ソースから細胞外の要因が示されています。発芽5限定のみことができます。本質的な再生信号することができます再生成功5,9に影響し、潜在的な治療上のターゲットを表すが、これらのプロセスは分子レベルでまだよく定義されていません。栄養因子の役割や Pten のホスファターゼ10などの内因性のブレーキの除去の増加は、特定の状況における軸索再生で起因できます。個別に有効にする別のメソッドの組み合わせはまた、唯一11,12,13,14まで限られた全体的な回復を提供します。そのため、標的療法の追加の経路を識別するために絶望的な必要性があります。軸索再生の開始、かどうか、および軸索再改革シナプス特異性、正しいターゲットに線を達成するためにどのように機能回復も重要な未解答の質問。
要約すると、軸索の再生を口述機械の現在の理解は非常に断片的です。問題の部分は軸索の勉強が困難であったリアルタイムで哺乳類の再生がかかり、時間がかかり、大規模な遺伝子スクリーニングを実施するために挑戦的なアプローチ。その一方で、キイロショウジョウバエは複雑な生物学的問題の研究のための非常に強力なシステムであると証明しました。ショウジョウバエの遺伝子を定義し、人間の驚くほど保存されているパスウェイに尽力されているし、広大な分子遺伝学ツールを介して、神経変性疾患など、人間の条件の調査のための成功モデルをされています。遺伝子機能15の操作に使用できます。特に、ショウジョウバエは、神経損傷と再生15,16にかかわる遺伝子の発見のための理想的なツールと見なされます。大人頭または幼虫 VNC または鉗子、幼虫ニューロン レーザー膠、嗅覚受容ニューロンの除去、脳外植体損傷と神経ときめきの針で刺すような幼虫の腹側神経コード (VNC) を含むいくつかのフライ神経障害モデルを開発されています。翼退職15,17,18,19,20,21,22,23によって末梢神経病変。最近仕事利用したショウジョウバエ傷害モデルが哺乳類24 に保存されると示されているいくつかの神経損傷に応答する神経システムで使用される細胞と遺伝経路の私達の理解を高度な興奮して、 ,25。繰り返しますが、これは神経修復の識別機構のこのモデル有機体の有用性を強調します。
ショウジョウバエ幼虫の感覚ニューロン損傷モデルをレーザーを用いた 2 光子は、ここで説明しました。2 光子レーザーは、ゼブラフィッシュのの体内2003年26軸索を切断する最初に使用されました。同じ年、最初のレーザー dendriotomy はショウジョウバエパルス窒素レーザー27を使用で行われました。まもなく、いくつかc. の elegansのラボは、軸索再生28のモデルを確立するのにフェムト秒レーザーを使用しました。2007 年に呉と同僚は比較、各種レーザー29による線虫のレーザー損傷間の相違点を報告します。2010 年レーザー膠後軸索再生最初ショウジョウバエ30で発生する示されました。この豊富なレーザー損傷文献上に構築された開発した隣接する組織の最小限の摂動による対象サイトへの損傷の正確な誘導を可能にする 2 光子レーザーを用いたフライ神経損傷モデル比較的きれいなを提供すること単一セルの解像度で再生に関するの組み込みと外因性の両方の特性を調査するシステムです。具体的には、我々 両方末梢神経系 (PNS) の感覚ニューロンは樹状パターン形成 (da) の傷害メソッドのセットを設け、中枢神経系。Da ニューロンが、樹状突起の分岐の複雑さによって主に 4 つのクラスにグループ化できます: IV31種します。私たちの出版された仕事は da ニューロン再生表現型および分子レベルで哺乳類の損傷モデルに似ている示しています: da ニューロン クラス IV のクラス特定の再生プロパティを表示がないクラス III da 細胞で再生するか、PNS;クラス IV da ニューロン軸索再生周辺で力強く、従って哺乳類; 後根神経節 (DRG) ニューロンに似た中枢神経系の再生の可能性を大幅に削減Pten による mTOR の活性を促進させる削除や Akt の発現は、飛ぶ CNS19軸索の再生を向上させます。遺伝子スクリーニングを行っている私たち細胞ストレスおよび RNA の修飾20 へ軸索損傷のリンク軸索再生、進化上保存された阻害要因として RNA プロセシング酵素 Rtca を識別したこの損傷モデルを活用し、.
提示のパラダイムでは、傷害がレーザー膠/幼虫クラス IV または III da ニューロン、 ppk CD4 tdGFPまたは19-12-Gal4、UAS-CD4-tdGFP、レポ Gal80、それぞれラベルの dendriotomy を介して誘導されます。傷害、2nd約 48-72 時間で 3rdの幼虫に産卵 (h AEL) 後に実行されます。PNS の膠病変は、VNC で交連交差点 ~ 20 μ m の領域に中枢神経系膠と主樹状突起分岐ポイントに dendriotomy の細胞体から軸索 20 ~ 50 μ m のセクション ターゲットです。8-24 h 完全断裂を確認する (AI) の負傷後、48-72 時間再生を評価するために AI を使用して同じニューロンのイメージを作成します。タイムラプス顕微鏡を用いたイメージングを通じて、変性および生体内で負傷されている個々 の軸索/樹状の再生時間の経過と共に監視できます。
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Protocol
1. 培養皿とボトルの準備
- グレープ ジュース寒天プレートの準備
- ビーカー、寒天が完全に溶解するまで断続的に攪拌しながら、約 4-5 分電子レンジに 192 mL ddH2O、200 mL グレープ ジュース、粉寒天 10 g を追加します。
- 約 60 ° C への解決策をクールな発煙のフード4.2 mL 95% エタノールと 4.0 mL の氷酢酸を追加します。よく ddH2o ・ ミックスと 400 mL にソリューションの総量を調整します。
- 各 35 mm プレート ソリューションの約 2-3 mL を追加します。400 mL グレープ ジュース寒天液の合計は約 120-150 プレートを作る。
- プレートを冷やす寒天液を固化して 10 分待ちます。自己密封ジップロック袋に寒天グレープ ジュースをパックし、将来の使用のための 4 ° C で保存します。
- ショウジョウバエ培養ボトルの準備
- ショウジョウバエ培養ボトルの 1 つの壁に 1.5 cm 側長さ三角穴を開けるし、換気のための綿の 2 〜 2.5 cm 径のボールの穴を記入するブレードを使用します。
- 酵母ペーストの 0.5 cm3程度を添加したグレープ ジュース寒天プレートにボトルを差し込みます。
2。ショウジョウバエ幼虫のコレクション
- 成虫の十字架を設定します。
- 場所 10 処女の女性と 5 成人男性はグレープ ジュースの寒天と差し込まれる培養ボトルに一緒に飛ぶ。
- ハエはグレープ ジュースの寒天に卵を産むので、上 25 ° c、ボトルの底に置きます。一日に少なくとも一回酵母ペーストでプレートを変更します。均一な発育段階の幼虫の収穫を可能にする 2 h コレクション期間の以上 20 の処女雌と 2.1.1 の手順で 10 の男性で開始します。
- 文化 25 ° c、ウェットティッシュで 60 mm のペトリ皿でプレートは、たとえば、0.5% プロピオン酸溶液に浸漬します。酸素の流れを妨げないように組織を配置します。
注: 皿の中の湿度を維持し、カビの成長を避けるプロピオン酸溶液を使用します。
- 特定の年齢の幼虫を収穫します。
- たとえば、2nd (AEL) 産卵後 48-72 時間で 3rdの幼虫に必要なステージの幼虫を転送するのに酵母貼り付けることがなく新しいグレープ ジュース寒天プレートに鉗子のペアを使用します。
- 酵母幼虫の皮膚からして削除させるレーザー膠とイメージングと酵母の潜在的な干渉を防ぐために、新しいプレートの周りのクロール。また、PBS の皿にそれらを洗浄し、ティッシュ ペーパーの部分を簡潔に乾燥幼虫を徹底的に掃除します。
3. 2 光子傷害および共焦点レーザー顕微鏡
- 顕微鏡のセットアップ
メモ: 2 光子レーザー顕微鏡共焦点レーザーを用いてこの実験が同等のセットアップの他のシステムも十分です。2 光子レーザー (930 nm) 傷害とアルゴン レーザーを提供するために使用された (488 nm) GFP の共焦点イメージ投射のために使用されました。- 各セッションの初めに、2 光子レーザーや共焦点の laser(s) と顕微鏡を入れます。イメージング ソフトウェアを開きます。
- 930 で二光子励起レーザーを用いた GFP をイメージングの次のパラメーターを設定 2 光子傷害の nm (1,950 mW)。
- ライン スキャン モードを選択します。すべての方法をピンホールを開きます。〜 20% のレーザー強度を高める (390 mW)。
- フレーム スキャンとして 512 x 512 を選択します。(通常は 0.77 μ s にピクセル滞留時間) 最大走査速度を使用します。数の平均値は 1 ビット深度 8 ビットであることを確認します。
- 〜 750、およびオフセット 0 にするゲイン。
- 2 P GFP 930 アブレーション、簡単に再利用は将来的に実験することとして、この事前に設定実験的プロトコルを保存します。
- 488 でアルゴン レーザーと GFP をイメージングの次のパラメーターを設定共焦点イメージングの nm。
- 取得] タブと [ Z スタックを選択します。
- 「レーザー」の下には、488 nm のアルゴン レーザーの電源を入れます。
- チャンネル、488 mm レーザーを選択し、5-10% にレーザー パワーを上げて行きます。ピンホール 1 2 風通しの良い単位 (AU) を使用します。650 にゲインを調整します。
- アクイジション ・ モード、フレーム スキャンとして 1024 x 1024 を選択、最大スキャン速度、2 の平均数、8 ビットのビット深度を使用します。
- GFP イメージングとして事前に設定この実験的プロトコルを保存します。
- ジエチル エーテルと取付幼虫麻酔
- ヒューム フードで 15 cm のプラスチック シャーレ 60 ミリメートルのガラス皿を置きます。倍とレイ紙切れガラス皿の下部組織で組織にグレープ ジュース寒天プレートを配置します。ガラス皿にティッシュ ペーパーがはつポイントにジエチル エーテルを追加し、皿に残りの液体エーテルの層があります。すべての回で蓋をしてください。
- 中心部で 27 日、石油一滴ハロカーボンのスライド グラスを準備します。後、coverslip をサポートするスライドの 4 つのコーナーに真空用グリースの 4 点を追加します。
- 鉗子を使用して、洗浄幼虫をピックアップし、60 mm のガラス皿に寒天プレート上に配置します。その蓋とガラスの皿をカバーし、幼虫が移動しなくなるまで待ちます。PNS 傷害/イメージング、しっぽがけいれんを停止すぐに幼虫を取り出します。全体の幼虫が動かず、なるまで待ちます、中枢神経系、特に頭のセグメント。
注: エーテルの暴露のタイミングは重要です。ディスカッションを参照してください。 - 慎重に麻酔下の幼虫をピックアップし、スライドのハロカーボン油滴に頭アップライトに配置。スライド上に coverslip を追加します。それが幼虫 (図 1 a) に触れるまで、coverslip のプッシュ ダウンする穏やかな圧力を使用します。
- 興味のニューロン/軸索・樹状突起が上部と顕微鏡レンズに最も近いなるよう優しく、幼虫をロールバックする左右に向かって coverslip を押すことによって幼虫の位置を調整します。
- PNS の傷害のため、両方の気管が見えるように、幼虫の背側をマウントします。クラス III の da のニューロンの軸索 (図 1 b と 1 C) やクラス IV の da のニューロンの軸索 (図 1 b ・ 1 e) が負傷のため 90 度 〜 30 度クラス IV da ニューロン樹状突起 (が負傷したために負傷、左に 〜 30 度、幼虫を回してください。図 2 a)。
- 中枢神経損傷の関心領域は z 平面の顕微鏡のレンズに最も近い (図 3 a) を完全に腹側に幼虫を配置します。
- 2 光子励起による傷害
- 顕微鏡下で幼虫とスライドを配置し、ステージ上にスライド ホルダー付け場所に固定します。幼虫を見つけるに使用、10 X (0.3 NA) 目的。
- Coverslip の上に目的のオイルを 1 滴を追加、(1.3 NA) X 40 に切り替える目的とフォーカスを調整します。
- スキャン モードに切り替えるし、 2 P GFP 930 アブレーションの実験のプロトコルを再利用します。ピンホールの開いたすべての方法を確認します。
注: 構成を最適化する個々 のシステムに基づく必要があります。 - 利益率 (ROI) の地域を検索するLiveモードを起動し、適切なズームと良いイメージ品質を達成するために設定を微調整します。
注: この手順の目的は、最高品質の画像を撮影するのではなくには怪我、ニューロン/軸索・樹状突起を見つけることです。したがって、露出オーバーまたは退色を避けるためにターゲット領域を視覚化するのにのに十分な最低限の設定を使用します。 - ライブスキャンを停止して、[トリミング] ボタンが利用可能になります。ロードマップとして静止画をしましょう。クロップ機能を選択し、負傷することターゲットに焦点を当てるスキャン ウィンドウを調整します。
- 傷害の将来のサイトのサイズに投資収益率を減らします。たとえば、軸索や樹状突起、傷害の精度を確保し、隣接組織への損傷を減らすの幅をちょうどカバーします。必要な場合にズームイン ROI トリミングする前により正確な損傷を可能にします。
- 新しい画像ウィンドウを開きます。スキャン速度を低減し、レーザー強度を高めます。Liveモードでスキャンされた組織蛍光信号を用いたレーザー光源の強度の増加を確認します。
- 通常、PNS の傷害のための 25% と VNC 傷害のための 50-100% から始まって 2 光子レーザーの強度を設定します。PNS 軸索損傷 〜 480 mW とピクセル レーザー強度があることを確認のドウェル時間は 8.19 μ s。VNC の軸索損傷、レーザー強度とピクセルの滞留時間は、通常 965-1930 年 mW 8.19 32.77 μ s、それぞれを確認します。
- 連続スキャンを開始します。連続ボタンの上にマウスを移動するカーソルをまま。画像を注視し続けるし、蛍光性の大幅な増加が観察されるとすぐにスキャンを停止します。
注: 蛍光スパイクの外観は傷害のサイトで自動蛍光によるものです。 - 設定を再利用する、ライブ モードに切り替えます。フォーカスを調整することによって、ターゲットにだけ興味の領域を見つけます。
注: 成功した傷害の良い指標は、小さなクレーター、リングのような構造、または傷害のサイトでローカライズされた破片の外観です。 - 次のニューロンに移動し、単一動物の複数のニューロンを傷つける 3.3.5、ステップからを繰り返します。または、徐々 に能力を高めることおよび/または初期傷害が十分でなかった場合、スキャン速度を下げる、3.3.5 の手順を繰り返します。
注: レーザー パワーがあまりにもケースで高、大規模な被災地に表示されます受傷後ライブ スキャン画像。あまりにも多くの傷害は、幼虫の死亡を引き起こす可能性があります。 - 慎重に、coverslip の取り外しと酵母ペーストで新しい板に負傷した幼虫を転送して幼虫を回復します。寒天プレートに鉗子; いくつかの洞窟を溝します。また、プレートの中のクロール幼虫の可能性を減らすために、全体の板を使用する代わりに板で寒天培地の島を行います。
- 60 mm のペトリ皿にウェットティッシュ (0.5% プロピオン酸溶液に浸した) と部屋の温度または 25 ° C で培養皿を置く
メモ: (22 ° C) 室温 25 ° C でに比べてで余分 1 日約幼虫の段階でその幼虫のまま、
- 受傷後の共焦点レーザー顕微鏡
- 麻酔と、共焦点レーザー イメージング手順 3.2 のように取り付けの手順を同じ幼虫を準備することによって必要な時点で負傷した幼虫の画像。
注: 軸索損傷を確認する (AI) 受傷後 24 h、48 h AI (クラス IV da ニューロン) または 72 h 再生を評価する AI (クラス III da ニューロン) 幼虫をイメージします。 - (0.8 NA) X 25 に切り替えて対物レンズ 10 倍を使用して幼虫を見つける目的。GFP のイメージング実験的プロトコルを再利用します。
- Liveボタンをクリックし、以前に負傷した同じニューロンを見つけます。
- ライブ スキャン ウィンドウ内の最初と最後の Z 位置を設定します。停止を押し Z スタックのイメージを取得する開始の実験ををクリックします。
注: は、再生の定量化が可能なイメージをキャプチャするときに正規化ポイント (軸索収束ポイント) が含まれることを確認してください (図 1、1 階)-詳細については、データ分析セクションで詳しく。 - 画像処理に切り替える、ちょうど撮影した画像を選択し、最大強度投影を生成します。Z スタックと最大強度投影画像を保存します。
- 麻酔と、共焦点レーザー イメージング手順 3.2 のように取り付けの手順を同じ幼虫を準備することによって必要な時点で負傷した幼虫の画像。
4. データ解析
- 処理してイメージング ソフトウェアや ImageJ のいずれかを使用してイメージを定量化します。
- PNS の軸索再生の定量化
- 再生率、破壊されたすべての軸索の間で軸索の再生のパーセントを参照するを計算します。限り、それは損傷部位を超えて剥げを再生として軸索をスコアします。
- メジャーの再生の長さ、軸索の長さの増加であります。ImageJ の定量化、再生軸索をトレースする分割線] ツールを使用し、分析のドロップ ダウン メニューで再生軸索を表す線の長さを取得するメジャーを使用します。
- 計算再生インデックス、正規化された軸索の長さの増加であります。
注: 軸索の長さは、細胞体と軸索収束ポイント (航空機)-軸索の長さ/DCAC (図 1および1 f) の間の距離によって正規化されます。この値は、幼虫のスケーリングのため、任意の軸索成長のためアカウントをのに役立ちます。正の値は、再生を表す、 0の値は、再生を意味、撤回を意味する負の値。
- 樹状突起再生の定量化
- 再生割合計算、それらのすべての切断の間の da ニューロンのパーセントである明白な樹状突起再生を示す。
注: 樹状突起再生にスコア撤回の樹状の幹から、損傷部位を超えて場合新しい肯定的な樹状突起を再生するとします。傷害のサイト歴史的建造物、およびいくつかのケースでは、残留傷害による蛍光のため容易に目に見える。 - ブランチ ポイントの増加が傷害の後新しい樹状突起分岐ポイントの加算カウントを計算します。
- 計算総樹状突起の長さの増加負傷後に追加すべての新しい樹状突起の長さは合計であります。
- 再生割合計算、それらのすべての切断の間の da ニューロンのパーセントである明白な樹状突起再生を示す。
- 中枢神経系の軸索再生の定量化
注: 病変のサイトは、最初の時間のポイントでイメージ (図 3 b) 変性を示している場合は、再生の長さとレートの分析に含まれるが。- メジャーの再生の長さ、刈株の軸索の長であります。
メモ: 単一病変サイトの刈株の軸索は、怪我する前に元の軸索ルートを発してとして識別されました。 - 正規化再生長、交連セグメント - 交連 (図 3 aと3 bでは"Y") の間の縦方向の間隔の長さと再生の長さを正規化を計算します。
注: この値幼虫サイズの違いの影響の正しいことができます。 - 再生率、特定遺伝子型の再生能力を反映するように、破壊されたすべてのセグメント間でセグメントを再生の割合を計算します。
- メジャーの再生の長さ、刈株の軸索の長であります。
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Representative Results
Da ニューロンの差動再生クラス特異性と同様、末梢および中枢神経系の可能性を示し。これは、画面の再生 (クラス IV 中枢神経損傷とクラス III PNS 傷害) の抑制と同様、(クラス IV PNS 傷害を使用)、軸索再生に必要な新規の要因にユニークな機会を提供します。
PNS の軸索再生
たとえば、クラス III とクラス IV da ニューロンの再生の特性を説明します。これらの神経細胞は、各部位の両側に位置します。複数のニューロン; 同じ幼虫でけがをすることができます。通常、3-4 神経細胞腹部セグメント A7 A2 の右側面にあります。クラス III とクラス IV da ニューロンはそれぞれ19-12-Gal4、UA CD4tdGFP、レポ Gal80とppk CD4tdGFP、視覚化できます。麻酔し、説明したとおり、幼虫の位置を調整します (図 1 aと1 b) 関心の da ニューロンが直面している、48-72 h AEL 幼虫をマウントします。我々 は通常、クラス III ddaF とクラス IV v'ada ニューロン (図 1と1E) を傷つけます。膠を実行して、前述の幼虫をリカバリします。傷害 (AI)、直後に幼虫は、通常歩行の外科・展示が治った。ここでの生存率は通常、80% 以上です。死んでいるか病気幼虫を破棄します。前述の残りの部分を再マウントし、変性を評価します。24 h AI、遠位軸索変性この時間ポイント19を完了している必要があります、軸索幹は容易に目に見える (図 1および1 f) になります。クラス IV の da ニューロンの 48 h AI または 72 h 再生を評価するためにクラス III の da ニューロンの AI で同じ幼虫を減らせます。通常、実験条件ごとの少なくとも 20 の負傷したニューロンを評価するために目指しています。(野生型) WT で動物、通常切断クラス IV da ニューロン損傷部位 (図 1 階)、クラス III da ニューロンを超えて再生 〜 70% に再生、失敗に対しによって立証される (図 1) を失速成長円錐。
樹状突起再生
我々 は通常、クラス IV da ニューロン ddaC (図 2 a) で dendriotomy を実行します。模式図のように、傷害は樹状分枝点向けです。DdaC ニューロンの ~ 50 %48 h AEL でけがをしたときの経験に基づき、その樹状突起 (図 2 b) を再生成します。残りの 50% の近隣の樹状突起が侵入し、空いているスペースをカバーします。さらに、後で発達段階で負傷した場合、これらの神経細胞の再生の可能性が減少します。
中枢神経系の軸索再生
VNC 軸索傷害、幼虫の生存率は大幅に変わるし、怪我を誘発する年齢によって異なります。最高の生存率を持っている、通常 48-72 h AEL の幼虫を経験に基づいて、(> 60%) 中のさまざまな段階でテストします。48 h AEL より若い幼虫悪い生き残る負傷後 72 h AEL より古いそれらに VNC で傷害を導入することは困難です。さらに、それはよりも前方、後方交連セグメントで怪我を誘発しやすくこれらの VNC の後部セグメント、腹側の表面に近い、従って (図 3 a) レーザーによってアクセシビリティの高い。
クラス IV の da ニューロン中枢神経系の軸索を傷つけないように、前述した幼虫 (図 3 a) をマウントします。顕微鏡で VNC (図 3 a) の一部を形成する軸索束のはしごのような構造を見つけるし、のとおり、膠を実行します。8 h では変性を確認した AI と再生は 24、72 h AI で評価しました。図 3Bに示すとおり、8 h AI で軸索が、退化して始めているし、軸索の破片が傷害のサイトの周り見つけることができますはまだ AI 24 h で、軸索の再生が観察されます。WT の軸索は、VNC で限られた再生を示し傷害 (図 3 b) によって生成されたギャップを再接続に失敗します。傷つけられた軸索の再生能力を定量化するには、損傷を測定後再生長さと交連セグメント (Y 図 3 a) の長さは、正規化 (図 3) に使用されます。
図 1: 周囲の Da ニューロン軸索再生クラス特異性が表示されます。(A と B)図幼虫の位置を示します。(C)クラス III の da ニューロンの図(D) 19-12-Gal4、UAS CD4 tdGFP、レポ Gal80/+、ラベル、クラス III da ニューロン ddaF の軸索は再生に失敗します。(E)の模式図クラス IV da ニューロン。(F)軸索の付いた、クラス IV の da ニューロン v'ada ppk CD4 tdGFP/+、病変サイトを越えて再生します。(D および F)赤い線は、緑の破線は、細胞体と軸索収束ポイント (航空機) の間の距離をマークしながら、軸索の長さを示します。青いドットは、軸索の収束点をマークします。スケール バー = 20 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: Da ニューロン樹状突起再生。(A)クラス IV da ニューロンの例示表現。(B)でラベル付け、クラス IV da ニューロン ddaC の樹状突起再生の例示表現ppk CD4 tdGFP/+。レーザーアブレーションは主な分岐点を対象と、48 h AEL で。24 h 人工知能傷害で、突起の断裂を確認し、再生の定量化に 72 h AI。DdaC ニューロンの樹状突起は、タイルの空いているスペースに切断の茎から発芽新しい樹状突起分岐と実質的な再生を示しています。新しい端末の枝がこの発達段階では継続的に無傷の樹状突起に追加されますを注目に値するです。スケール バー = 20 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: VNC の Da ニューロンの軸索の再生。(A) ショウジョウバエ幼虫の概略図はスライドにマウントされ、顕微鏡下でイメージを作成します。クラス IV da ニューロン軸索で視覚化される VNC で、 ppk CD4tdGFP/+幼虫。候補者交連の 2 つのセグメントは、ズームインした画像と概略図のとおりです。それぞれが 2 つの傷害サイト (赤円) です。(B)損傷 (AI) 後 8、24、72 h でイメージ 1 つの負傷したセグメントの共焦点画像。赤い線は、刈株の軸索を描かれています。(C)測定と軸索を regrowing 国交正常化。スケール バー = 20 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
フライのセットアップを通過するとき女性と男性の使用数、遺伝子型と特定の実験に必要な幼虫の数によって異なります。WT ハエには、典型的なクロスは、女性 10 名、男性 5 を使用します。コレクション ウィンドウは、必要な幼虫時代の精度によって絞り込まれる可能性があります。たとえば、2 h コレクション期間より同種の人口の幼虫が得られます。この場合、十字架を設定する 20 またはより処女の女性を使用して、もたらすを助ける十分な卵。最初の日から収量が通常不足している、だからの収集卵プレート商工会議所を設定した後の 2 つ以上の日。さらに卵とプレートを培養、水は、皿の中の湿度を維持するためだけではなくが、また、カビの成長を避けるのではなく 0.5% プロピオン酸溶液に 60 mm のペトリ皿の組織を吸収することをお勧めします。
エーテルはプラスチックを溶かすためにガラスの皿を使用する幼虫麻酔と取り付けのためのデバイスを設定する場合を確認します。ガラスの皿は、15 cm のプラスチック シャーレ リークの場合で収容されています。ティッシュ ペーパーに幼虫は、エーテル蒸気を効果的にノックアウトすることができますので、皿の中のエーテルを保持できます。エーテルを格納するボトルを落とすとガラスのスポイト液滴のエーテルを追加する黄色を使用することをお勧めします。エーテルを補充するため、常に最適な効果のための皿の底で液体エーテルの層。
エーテルの暴露のタイミングは重要な: 下麻酔は撮像セッションと不安定な画像の真ん中に幼虫の回復につながる麻酔の過剰摂取またはエーテルの液体に直接接触は致死になります。生存率と成功率を最大にする親指の私達のルールは次のように: 幼虫を取り出す PNS 傷害/イメージングのため、すぐにしっぽを停止けいれん;全体の幼虫が動かず、なるまで待ちます、中枢神経系、特に頭のセグメント。でも、わずかな動きは、傷害と VNC 軸索のイメージングと干渉します。古い幼虫はノックアウトに時間がかかる傾向があります。通常、72 h AEL より若い幼虫の 2 分以内、72 h AEL より古い幼虫の 2-5 分かかります。
傷害のための 2 光子レーザーの強度を設定する場合、値は「ライブ」スキャンから得られた組織蛍光信号によって決まります。ステップ 3.3 のように「連続」スキャンによって傷害を導入します。蛍光性の傷害による増加は傷害のサイトで自発、および、神経突起の退職の良いインジケーターとして機能です。通常、蛍光スパイクを表示する 1 10 秒をかかります。蛍光が上昇したら、スキャン時間を制御するが重要です。PNS 損傷、すぐにスキャンを停止するが欠かせません。長期暴露は損傷部位を拡大し、周辺組織に損傷を与えます。ただし、これはスキャン時間を調整し、損傷の重傷度を操作する機会を提供しています。成功した傷害 3-4 μ m より小さい病変の径が必要です。VNC 軸索損傷の VNC 軸索に深く埋め込まれている da ニューロン PNS に比べて軸索・樹状突起、皮膚の下に右、即ち高いレーザー強度。我々 は通常、いくつかのより多くの秒のためにスキャンを残します。これは、全体の軸索の束が切断されていることを確認することです。損傷部位の半径は、交連の束の半分以上の幅は、そのような傷害のサイトが失敗としてカウントされます。このような幼虫は、低い生存率を持っているし、分析に含まれません。
軸索の再生、再生能力は幼生に似ています。しかし、72 h AEL19樹状突起再生単一の樹状突起のカットの後、潜在的な再生が低下します。したがって、軸索損傷は、通常 48-72 h AEL とデンドライト傷害に 48 h AEL、120 h AEL で再生の評価で行います。24 h AEL の幼虫も使用できます、しかし、彼らは彼らのより小さいサイズを与えられてより慎重な取り扱いを必要とします。幼虫は、120 h 画像を難しく作る AEL 後蛹します。したがって、エンドポイントは、通常 120 h AEL です。
変性と再生の間の相互関係は何ですか。PNS 傷害、24 h、AI のため通常 WT で遠位軸索と樹状突起が完了したワーラー変性再生がこの時点で開始されていない間。したがって、我々 を信じている WT 幼虫で切断された神経突起の変性だけ非常に限られた影響再生時に、すべての場合。VNC 傷害が退化し、8 h AI で軸索がすでにし、傷害のサイトの周り、軸索の残骸がまだ見つからなかった中 AI 24 h で、軸索の再生が観察されます。破片は、再生をブロックしません。ただし、特定の状況下であることを重複または変性と再生の間クロストークも不可能です。実際には、高齢マウスの末梢神経損傷後に破片クリアランスは若い動物のそれよりも遅いが報告されています。付随して、古い動物の出会いを軸索の再生の障害物の大きい数に帰因するかもしれない神経筋接合部の遅い抜歯は観察されました。しかし、驚いたことに、老化させた動物からの軸索はすぐに再生する、ない破片32に直面したときに効率的に神経筋接合部サイトを reinnervate します。これは瓦礫のクリアランスを促進する再生を促進するために潜在的な戦略かもしれないことを示唆しています。
他の再生に関するモデルと比較して、飛ぶ感覚ニューロン損傷モデル ユニークな利点があります。マウス モデルは通常ヶ月を実行する週を取るし、大規模な遺伝的画面を行うには適していません線虫は密接に哺乳類の中枢神経系の再生の障壁を再現可能性がありますいない原始的な中枢神経系哺乳類とは異なり、ゼブラフィッシュ中枢神経系の軸索再生確実。ハエの急速なライフ サイクル、ハエの遺伝学、アクセシビリティおよびステレオタイプのパターニングの飛ぶ感覚ニューロンの軸索・樹状突起と飛ぶ感覚ニューロン-特徴的な再生特性の多様性サブタイプの特定の再生、PNS と中枢神経系-限られた再生ショウジョウバエda ニューロン再生に関する研究のための魅力的なモデルを作る。また、砕いたマウス網膜神経節細胞 (Rgc) からの最近の研究はまた神経細胞サブタイプが異なる再生能力; を耐えることお勧め一見同種神経束内の他は33の再生に失敗するのに対し、いくつかの RGC のサブタイプを再生成できます。この重要な発見は神経型に特化した戦略を再生および機能回復を促進するために悪用することを示唆しているし、の誘導軸索傷害とそれに続く再生成解析を実行することを強く主張している、神経細胞サブタイプ特異的。さらに、この再生の型特異性の細胞および分子要因主不明19,33のままです。したがって、da ニューロン損傷モデルには、これらの問題に取り組むために理想的なパラダイムが提供しています。
軸索の再生と比較して、樹状突起再生に着目した研究が多くより乏しいです。樹状突起の損傷が発生する、外傷性脳損傷、脳卒中と神経変性の多くの形態のようなまだ修復し、神経結合を改革する樹状突起の能力についてほとんど何も知られています。Da ニューロン損傷モデルは再び、この方向性を探る陳腐なパターン、クラスの特異性、および時間制御19が表示されます非常にアクセス可能なシステムを提供します。
また、PNS でラベル付けされた単一の軸索を傷つけることは、方法傷害が軸索の束の病変で中枢神経系の結果で実行されることを言及する価値です。必要な場合、中枢神経系における単一軸索のラベルに MARCM34または FLP をクローン35アプローチを使用可能性があります。さらに、グリア細胞が同時に mRFP (レポ Gal4、UAS mRFP) を付け、グリア細胞プロセスの蓄積が病変のサイトで特に観察されます。さらに、Ptp99A、コンドロイチンのフライの相同物の式硫酸プロテオグリカン (CSPG) phosphacan/病変サイト PTPRZ1 は調整されます。Ptp99A 共同グリア細胞でローカライズし、損傷部位を囲む哺乳類19,36,37グリア瘢痕の報告されたものに類似したリング状構造を形成します。結論としては、da ニューロン損傷モデル、グリア細胞や免疫細胞など他の細胞型のマーカーと組み合わせるとは、生体内で負傷したニューロンとその周辺の細胞相互作用のリアルタイム監視をできるようになります環境。
このハエの幼虫感覚ニューロン損傷モデルは私たちに PNS と中枢神経系の両方の潜在的な再生に関する規制当局を見つける機会を提供します、それはまだいくつか制限があります。まず、それはない高スループットの現段階です。通常、1 週間で 1 人 5-6 品種を選別できます。それは公平な画面を実行するために最適化する必要があります。第二に、幼虫にエーテル麻酔は、20 分以上にいくつか分から持続できるよう、長期的なイメージングに最適ですないです。したがって、イメージングのため軸索変性と再生の代表は、それぞれ特定の時間ポイントを選択します。第三に、にもかかわらず、このプロトコルは正確に軸索を傷つける方法を導入して、、周囲の組織への損傷の可能性を完全に否定できません。VNC は、これらの組織の他のニューロンの樹状突起や軸索、グリア細胞ができます。この潜在的な警告を最小限に抑えるため、傷害サイトを最小限に抑えるため、最下位のレーザー パワーを適用し、制御し、実験グループの両方に同時に同じ手順を実行します。第四に、中枢神経系の損傷パラダイムを設定する過程で異なった傷害サイトがテストされた、近くにサイトを含むを使用した軸索テルミニとエントリ ポイントの軸索の VNC に。彼らは組織の深いですので、傷つけないより困難で移動する可能性が高いするエントリ ポイントが見つかりません。したがって、これらの実用的な理由のため、我々 はより一貫性のあるより良い制御、大規模な実験に適しては、現在のメソッドを選ぶ。1 つの潜在的な懸念、上述のように、シナプスのコンポーネントやグリア細胞などの周辺組織を傷つける可能性であります。その一方で、破損した周囲の組織がどのように変性および軸索の再生に影響を与える顕著な質問です。たとえば、どのようにグリア瘢痕は軸索の再生に影響します。これは、なぜ私たちの損傷モデルによく似た、軸索と損傷部位の周りの組織が通常負傷同時に哺乳類の損傷モデル別の理由を示します。
微速度顕微鏡観察が続くレーザー損傷は軸索と樹状突起再生を研究するための敏感な試金です。しかし、このアッセイの主な関心事の 1 つは範囲の 2 光子レーザーの < ローエンド固体パルス レーザー、フェムト秒レーザーへの $25-100 K のための $10 K >$ 100 K から知覚のコストです。膠29,38,39,40,41,42,43、で使用される異なるレーザー システムについていくつかの良い議論があります。44,45。 要約すると、従来のレーザ、切削内の軸索に最適表面から 30-50 μ m。特に、ターゲット領域の深さ増加45フェムト秒レーザーと比較してナノ ・ ピコ秒レーザーで巻き添え被害があります。VNC で軸索を傷つけるための深さは通常約 50-100 μ m 組織の損傷を最小限に抑えることが肝要です。この例では、2 光子レーザーは理想的な焦点を合わせた焦点面を損なうことの組織浸透せず担保の組織損傷を軽減させるためのレーザー出力。結論としては、二光子励起システムは高価、最高の精度と組織の保全を提供します。ただし、PNS 軸索は膠のターゲット、場合にのみ、従来のパルス レーザーはより手頃な価格の代替可能性があります。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
ジェシカ Goldshteyn は、テクニカル サポートを感謝いたします。歌ラボでの仕事は NIH グラント R00NS088211 と知的・発達障害研究センター (IDDRC) 新しいプログラム開発賞によって資金を供給します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Diethyl ether, ACS reagent, anhydrous | Acros Organics | AC615080010 | |
| Halocarbon 27 Oil | Genesee Scientific | 59-133 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), 20x Concentrate, pH 7.5, supplier # E703-1L | VWR | 97062-948 | |
| Agar powder, Alfa Aesar, 500GM | VWR | AAA10752-36 | |
| Grape juice | Welch’s | ||
| Ethanol 95% (Reagent Alcohol 95%) | VWR | 64-17-5 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Propionic Acid | J.T.Baker | U33007 | |
| Cover Glasses: Rectangles | Fisher Scientific | 12-544-D | 50 mm X 22 mm |
| Zeiss LSM 880 laser scanning microscope | Zeiss | ||
| Zen software | Zeiss | ||
| Chameleon Ultra II | Coherent |
References
- Yakura, J. S. Recovery following spinal cord injury. , (1996).
- Harel, N. Y., Strittmatter, S. M. Can regenerating axons recapitulate developmental guidance during recovery from spinal cord injury? Nature reviews. Neuroscience. 7, 603-616 (2006).
- Jurewicz, A., Matysiak, M., Raine, C. S., Selmaj, K. Soluble Nogo-A, an inhibitor of axonal regeneration, as a biomarker for multiple sclerosis. Neurology. 68, 283-287 (2007).
- Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat Rev Neurosci. 7, 617-627 (2006).
- Sun, F., He, Z. Neuronal intrinsic barriers for axon regeneration in the adult CNS. Curr Opin Neurobiol. , (2010).
- Liu, B. P., Cafferty, W. B., Budel, S. O., Strittmatter, S. M. Extracellular regulators of axonal growth in the adult central nervous system. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 361, 1593-1610 (2006).
- Liu, K., Tedeschi, A., Park, K. K., He, Z. Neuronal intrinsic mechanisms of axon regeneration. Annu Rev Neurosci. 34, 131-152 (2011).
- Schwab, M. E., Strittmatter, S. M. Nogo limits neural plasticity and recovery from injury. Curr Opin Neurobiol. 27, 53-60 (2014).
- He, Z., Jin, Y. Intrinsic Control of Axon Regeneration. Neuron. 90, 437-451 (2016).
- Park, K. K., et al. Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway. Science. 322, 963-966 (2008).
- Geoffroy, C. G., Hilton, B. J., Tetzlaff, W., Zheng, B. Evidence for an Age-Dependent Decline in Axon Regeneration in the Adult Mammalian Central Nervous System. Cell Rep. 15, 238-246 (2016).
- Geoffroy, C. G., et al. Effects of PTEN and Nogo Codeletion on Corticospinal Axon Sprouting and Regeneration in Mice. J Neurosci. 35, 6413-6428 (2015).
- Jin, D., et al. Restoration of skilled locomotion by sprouting corticospinal axons induced by co-deletion of PTEN and SOCS3. Nat Commun. 6, 8074 (2015).
- Wang, X., et al. Axonal regeneration induced by blockade of glial inhibitors coupled with activation of intrinsic neuronal growth pathways. Exp Neurol. 237, 55-69 (2012).
- Fang, Y., Bonini, N. M. Axon degeneration and regeneration: insights from Drosophila models of nerve injury. Annual review of cell and developmental biology. 28, 575-597 (2012).
- Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
- Leyssen, M., et al. Amyloid precursor protein promotes post-developmental neurite arborization in the Drosophila brain. The EMBO journal. 24, 2944-2955 (2005).
- MacDonald, J. M., et al. The Drosophila cell corpse engulfment receptor Draper mediates glial clearance of severed axons. Neuron. 50, 869-881 (2006).
- Song, Y., et al. Regeneration of Drosophila sensory neuron axons and dendrites is regulated by the Akt pathway involving Pten and microRNA bantam. Genes Dev. 26, 1612-1625 (2012).
- Song, Y., et al. Regulation of axon regeneration by the RNA repair and splicing pathway. Nat Neurosci. 18, 817-825 (2015).
- Kato, K., Forero, M. G., Fenton, J. C., Hidalgo, A. The glial regenerative response to central nervous system injury is enabled by pros-notch and pros-NFkappaB feedback. PLoS Biol. 9, e1001133 (2011).
- Fang, Y., Soares, L., Teng, X., Geary, M., Bonini, N. M. A novel Drosophila model of nerve injury reveals an essential role of Nmnat in maintaining axonal integrity. Curr Biol. 22, 590-595 (2012).
- Xiong, X., et al. Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury. J Cell Biol. 191, 211-223 (2010).
- Brace, E. J., DiAntonio, A. Models of axon regeneration in Drosophila. Exp Neurol. 287, 310-317 (2017).
- Hao, Y., Collins, C. Intrinsic mechanisms for axon regeneration: insights from injured axons in Drosophila. Curr Opin Genet Dev. 44, 84-91 (2017).
- Galbraith, J. A., Terasaki, M. Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation. Mol Biol Cell. 14, 1808-1817 (2003).
- Sugimura, K., et al. Distinct developmental modes and lesion-induced reactions of dendrites of two classes of Drosophila sensory neurons. J Neurosci. 23, 3752-3760 (2003).
- Yanik, M. F., et al. Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy. Nature. 432, 822 (2004).
- Wu, Z., et al. Caenorhabditis elegans neuronal regeneration is influenced by life stage, ephrin signaling, and synaptic branching. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15132-15137 (2007).
- Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. Global up-regulation of microtubule dynamics and polarity reversal during regeneration of an axon from a dendrite. Mol Biol Cell. 21, 767-777 (2010).
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129, 2867-2878 (2002).
- Kang, H., Lichtman, J. W. Motor axon regeneration and muscle reinnervation in young adult and aged animals. J Neurosci. 33, 19480-19491 (2013).
- Duan, X., et al. Subtype-specific regeneration of retinal ganglion cells following axotomy: effects of osteopontin and mTOR signaling. Neuron. 85, 1244-1256 (2015).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
- Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
- Buss, A., et al. NG2 and phosphacan are present in the astroglial scar after human traumatic spinal cord injury. BMC Neurol. 9, 32 (2009).
- McKeon, R. J., Jurynec, M. J., Buck, C. R. The chondroitin sulfate proteoglycans neurocan and phosphacan are expressed by reactive astrocytes in the chronic CNS glial scar. J Neurosci. 19, 10778-10788 (1999).
- Raabe, I., Vogel, S. K., Peychl, J., Tolic-Norrelykke, I. M. Intracellular nanosurgery and cell enucleation using a picosecond laser. J Microsc. 234, 1-8 (2009).
- Hutson, M. S., Ma, X. Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo. Phys Rev Lett. 99, 158104 (2007).
- Venugopalan, V., Guerra, A. 3rd, Nahen, K., Vogel, A. Role of laser-induced plasma formation in pulsed cellular microsurgery and micromanipulation. Phys Rev Lett. 88, 078103 (2002).
- Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. elegans. Opt Express. 16, 5963 (2008).
- O'Brien, G. S., et al. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. , (2009).
- Tsai, P. S., et al. Plasma-mediated ablation: an optical tool for submicrometer surgery on neuronal and vascular systems. Curr Opin Biotechnol. 20, 90-99 (2009).
- Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation. BMC Neurosci. 7, 30 (2006).
- Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. Constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in C. elegans. J Vis Exp. , (2011).
