Summary
성인 zebrafish (Danio rerio)에서 독 소 루비 유발 심근 모델을 생성 하는 메서드는 여기에 설명 되어 있습니다. 복 주입의 2 개의 다른 방법을 제시 하 고 다른 실험적인 그룹 사이 변이 줄이기 위해 조건을 설명.
Abstract
유전자 액세스할 수 성인 제 브라 (Danio rerio) 점점 척추 모델 심근과 같은 인간의 질병을 이해 하기 위한를 사용 했다. 편의 및 높은 처리량 유전자 조작에 순종 획득된 심근 모델의 세대 성인 zebrafish, 독 소 루비 유도 심장 근육 병 증 (DIC) 모델 등은 문을 열고 새로운 연구도로에 앞으로 유전자 검사를 통해 심근 한정자를 발견 포함 하 여. 다른 배아 zebrafish DIC 모델, 초기 급성 및 만성 단계 후 심근의 무대-종속 신호 메커니즘 및 치료 전략의 연구를 활성화 성인 zebrafish DIC 모델에서 확인할 수 있습니다. 그러나, 경험 있는 수 사관의 손 에서도 현재 모델 변수 결과 얻을 수 있습니다. DIC 모델의 미래 구현을 촉진 하기 위하여 성인 zebrafish이 DIC 모델을 생성 하 고 복 (IP) 주입의 두 가지 대체 방법을 설명 하는 방법에 자세한 프로토콜을 선물이. 우리는 더 신뢰할 수 있는 결과 얻을 결과 적절 하 게 해석 하는 방법에 제안을 제공 하는 유사에 옵션을 논의.
Introduction
독 소 루비 (DOX), Adriamycin, 라는 1960 년대1,2이후는 항 종양 약 약물으로 개발 되었습니다. 그것은 지금 아직도 적극적으로 광범위 한 종양에 대 한 중요 한 화학요법 약물으로 사용. 그러나, DOX의 임상 응용의 복용량 의존 독성에 의해 방해 되었다, 특히 cardiotoxicity asymptomatic electrocardiographic 변경에서 pericarditis에 배열 하는 가변 증상이 특징 및 decompensated 심장 근육 병 증 1 , 2. 현재까지, 적어도 3 개의 주요 가설 일어났습니다 DIC, 활성화 된 반응성 산소 종 (선생님)1,3,,45, topoisomerase II-β (의 억제를 포함 하 여 설명 하 TOP2β)6,7, 그리고 세포내 칼슘의 릴리스1,,89. 또한 DIC10,11,,1213대 중요 위험 요인으로 유전적 제안 증거를 축적. 그러나 이러한 DIC 선천적인 유전자 정체성 관련, 크게 알려지지 않은 남아 있다. Dexrazoxane 유일한 보조 에이전트는 하지만 제한 된 구현14,,1516, DIC, 치료 하는 미국 식품 및 의약품 안전 청 (FDA)에 의해 승인 추가 확인 하는 필요를 강조 치료 전략입니다. DIC의 동물 모델 따라서 이러한 목적에 대 한 탐구 된다. 때문에 그들의 접근 및 단순, DIC 모델에 기계 연구 수 잠재적으로 영향을 미칠 광범위 한 cardiomyopathies의 다른 종류에: 일반적인 병 인 수 들 간에 공유 될 다른 etiologies의 cardiomyopathies에서 특히 나중 병 적인 단계17,18,,1920.
DIC의 설치류 모델, 뿐만 아니라 더 높은 처리량을 가진 zebrafish DIC 모델 새로운 유전적 요인 및 치료의 발견을 촉진 하기 위하여 개발 되었습니다. 배아 DIC 모델 치료 화합물21심사 투명 zebrafish 태아에 설립 되었습니다. 감안할 때 그는 cardiomyopathies는 진보적인 병을 가진 성인 개시 질병, 성인 zebrafish 심근 모델 되었습니다22,,2324,,2526개발. 만성 빈 혈24, DIC 성인 zebrafish23의 두 번째 인수 심근 모델 뒤에서 발생 하는 심근에 대 한 첫 번째 인수 모델을 생성 되었습니다. 우리는 성인 zebrafish에 DOX의 단일 bolus 주사 뒤 심장 근육 병 증의 만성 단계 6 개월 후 주입 약 1 주 후 주입 (wpi), 이내 급성 단계 구성 된 cardiotoxicity 유도 발견. Rapamycin의 기계적 대상의 haploinsufficiency 동안(mtor) 심근을 살펴볼 만성 단계에서 그것은 과장 물고기 사망률 급성 단계에 단계-종속 분별을 성인 DIC 모델의 가치를 강조 메커니즘23. 우리 성인 DIC 모델 스트레스 zebrafish insertional 심장 (ZIC) 돌연변이의27insertional mutagenesis transposon 기반 접근 통해 생성 되는 컬렉션을 사용할 수 있습니다 입증 되었습니다. 3 알려진된 심근 유전자로 DnaJ (Hsp40) 체, 인도의 B, 및 회원 6b 파일럿 화면 확인 (dnajb6b) 새로운 DIC 민감성 유전자28. 따라서, zebrafish에 성인 DIC 모델의 세대 주도 체계적으로 보완 기존 게놈 넓은 협회 연구 결과 (GWAS) 및 양이 많은 특색 소재 시 (QTL DIC에 대 한 유전 한정자의 식별을 가능 하 게 하는 새로운 방법론 ) 분석.
생성 및 성인 zebrafish DIC 모델의 구현 동안 우리는 다른 연구자 들 사이 또는 다른 주사 같은 조사에 의해 수행 중 에서도 상당한 변화 것으로 나타났습니다. 모델의 경도 특성 도전 다른 조사에서 결과 등록 하 고 순차 문제 해결 과정을 부과 한다. 이 간단한 심근 유도 스트레스 방법의 연구 공동체에 의해 사용을 촉진, 하 우리 자세히, 현재 두 가지 유형의 IP 주입, 우리의 프로토콜을 설명 하 고 다른 연구자 들 사이 유사를 줄이기 위해 고려 사항에 대해.
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Protocol
여기에서 설명한 모든 절차 관리 및 실험 동물 사용 (국가 아카데미 압박. 2011), 대 한 가이드에 따라 수행 했다 그리고 그들은 메이 요 클리닉 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 했다.
1. 성인 Zebrafish 준비
- 얻으려면 적어도 두 배나 많은 DOX 주입에 필요한 총 물고기 탱크를 건너에 충분 한 번 식 쌍을 설정 합니다. 서로 다른 유전적 배경 가진 물고기를 비교 하는 경우 나이 일치 하는 컨트롤 되도록 같은 주 내의 모든 물고기를 사육 한다.
- 수집 물고기 배아 다음날 아침, 100 mm 페 트리 접시에 그들을 전송 하 고 28.5 ° C 배양 기에서 그들을 유지. 낮은 밀도에서 배아를 유지 (< 100 배아/페 트리 접시).
- 성별 불균형을 피하기 위해 배아 물을 매일 새로 고 수동으로 전송 피 펫을 사용 하 여 적시에 죽은 계란을 제거 합니다.
- 각 탱크에 배아의 동일한 수를 넣어 (예를 들어 60 배아/3 L 매체 탱크 처음) 밀도 일치 하는 컨트롤을 위해.
- Paramecia 4 일 후 수정 (dpf)에서 먹이 시작 합니다.
- 청소년 단계 매일 물고기를 검사 합니다. 물고기 수 비슷한 물고기를 보장 하기 위해 필요에 따라 조정 밀도.
- 물고기 나이의 4 주에 도달, 더 성장 위한 각 새로운 3 L 중간 탱크에 최대 20 물고기를 전송 합니다. 라이브 빗금된 소금물 새우를 가진 물고기를 먹이를 시작 합니다.
2. 준비 및 DOX 재고 솔루션의 저장
참고: DOX는 다양 한 바이오 기업에서 구입하실 수 있습니다. 화합물은 일반적으로 어두운 갈색 용기에 파우더로 인수 됩니다.
- 철저 하 게 아무 덩어리 재고 솔루션으로 5 mg/mL의 최종 농도 표시 되도록 드 이온된 수에 DOX 분말 분해. 각 1.5 mL 안전 잠금 튜브에 DOX 주식의 aliquot 1 mL. 1.5 mL 튜브는 DOX 가벼운 노출에서 보호 하기 위해 알루미늄 호 일 종이 랩.
참고: 화학 후드에이 단계를 수행 합니다. - 저장을 위한 4 ° C에서 DOX 재고 솔루션을 유지. 장기 저장을 위해 (> 4 주) DOX 재고 솔루션을 아래에 설명 된 옵션 섹션 3을 수행.
3. 품질 관리 DOX Zebrafish 태아 (옵션)를 사용 하 여의
참고: DOX 이므로이 분 및 빛-민감한, 그것은 확장된 저장 후 DIC를 모델링 하기 위한 약물 효능을 잃을 수 있다. DOX 다른 회사, 또는 같은 회사에서 다른 일괄 처리에서 구입, 대 한 성인 물고기에 대 한 실험을 수행 하기 전에 야생-타입 (WT) zebrafish 태아를 사용 하 여 약물 효능을 보정 하기 위해 유용 합니다. 이 메서드는 보고 된 zebrafish 배아 DIC 모델21에서 파생 됩니다.
- 물고기의 2 쌍에서 WT zebrafish 태아를 수집 합니다. 마이크로 바늘과 주사기를 사용 하 여 수동으로 24 h 후 수정 (hpf)에 Dechorionate 배아 또는, 30 ° C 배양 기에서 10-15 분 10 µ g/mL의 최종 농도에서 가수분해 K와 배아를 취급 합니다. Dechorionation 후 배아 수를 새로 고칩니다. 죽은 태아를 제거 하 고 각 일괄 처리의 적어도 36 배아를 유지.
- 신선한 배아 물 100 µ M의 최종 농도에 DOX 재고 솔루션을 희석. 솔루션의 모든 3 배아에 대 한 100 µ L입니다. 소용돌이 의해 희석된 DOX 솔루션을 믹스. 마지막 희석된 솔루션 빛, 붉은 색 이어야 한다.
- 100 µ L/투명 깨끗 한 96 잘 접시의 희석된 DOX 솔루션의 우물을 추가 합니다.
- 3 dechorionated 배아 전송 플라스틱 피 펫과 고 피 펫 팁의 끝 가까이 배아를 유지. 피 펫 팁 DOX 솔루션과 각 잘 넣어. 끝 끝의 터치 솔루션 우물에 수영 배아를 허용 하자.
참고: 수동으로 우물으로 더 많은 물을 추가 하 고 희석 DOX 솔루션 배아를 추진 하지 마십시오. - 48에 DOX 솔루션을 새로 hpf. 이 시간까지, 웰 스와 부 종으로 죽은 태아의 (정지) 또는 배아를 식별 하기 위해 10 배 확대 현미경으로 관찰 합니다. 계산 고도 시기, 그렇지 않으면 죽은 태아와 함께 솔루션에 노출 하는 나머지 배아 신속 하 게 죽을 수 있는 어떤 죽은 태아를 제거 합니다.
- 72에서 배아 확인 hpf 그들을 계산 하 고. DOX 처리 간주 "좋은 약 효능" > 25% 죽음 (심장 박동의 정지) 배아의 두 일괄 처리에서 관찰 될 수 있다.
4. 사전 사출 준비
참고: 6 개월 나이의 8 주 물고기 DOX 주입에 사용 됩니다. 주입 성숙된 야생 인도 Karyotype (WIK) 물고기의 몸 무게 (BWs) 0.2-0.5에서 배열할 수 있다 g.
- 주입 하기 전에 24 h에 대 한 빠른 물고기입니다.
- 배아 물 0.16 mg/mL tricaine를 포함 하는 물고기를 anesthetize. 깨끗 한 필터 종이 사용 하 여 신체의 양쪽에서 물을 건조. 각 물고기는 규모의 BW를 측정 합니다. BW에 10% 차이에서 생선을 나중 주입에 대 한 그룹.
참고:이 단계에서 작업 부하를 최소화 하기 위해 BW에 10% 차이 내 물고기 간주 됩니다 같은 크기; 따라서, 그들의 말은 BW에 따라 하나의 DOX 작업 솔루션을 준비 합니다. - 솔루션의 5 µ L를 각 성인 물고기를 삽입 하려고 합니다. 물고기 숫자 및 BWs DOX 작업 농도 계산 합니다.
참고: 공부 하 고 만성 cardiotoxicity 최대 6 개월, 20 mg/kg의 복용량에 DOX를 사용 합니다. DOX의 급성 cardiotoxicity 공부, 50 mg/kg BW의 최대 DOX 복용량을 늘릴 수 있습니다. - 행 크의 균형된 소금물 (HBSS) 해당 작업 농도 대 한 x 1에 DOX 재고 희석. 혼합 솔루션을 소용돌이입니다. 짧게 수집 솔루션을 아래로 회전 합니다.
5. DOX 성인 물고기에 주입
- 장소는 깨끗 한 100 mm 페 트리 접시 해 부 현미경, 내부의 스폰지와 함께 초점을 조정 합니다. 물고기를 잡고 길이 약 4 ㎝의 구멍을 스폰지를 잘라. 큰 물고기에 대 한 더 긴 구멍을 확인 합니다.
- 34 G 바늘 10 µ L 마이크로 주사기를 준비 합니다. 주사기와 튜브에서 어떤 거품과 블록을 제거 하려면 1 x HBSS 버퍼와 바늘을 씻어.
- 2 분 동안 0.16 mg/mL tricaine를 포함 하는 태아 물에 성인 물고기 anesthetize
참고: 장기간된 anesthetization DOX 주입 뒤 5 분 이상 쉽게 하면 물고기 죽음. - Tricaine, 태아 물에 스폰지를 적시 게 하 고 주입을 위한 스폰지에 물고기를 전송.
-
아래 설명 하는 두 가지 방법 중 하나에 의해 IP DOX 주입을 수행 합니다.
- 클래식 IP 주입29
- 스폰지의 구멍에서 복 부와 함께 물고기를를 놓습니다. 신속 하 게 45 °와 바늘, 골반 지 느 러 미 사이의 중간 선으로 물고기 시체에 각도 침투 약 1-2 m m. 삽입은 천천히 모든 DOX 솔루션 해제. 바늘을 꺼내 전에 대기 5 s. 물고기 뱃속에 보이는 붉은 색 여 DOX 배달을 확인 합니다.
- 대체 IP 주입
- 오른쪽 앞쪽으로 스폰지에 옆으로 물고기를 놓습니다. 부드럽게 왼쪽 손으로 무뚝뚝한 끝 집게를 사용 하 여 물고기를 안정 누르고 오른손으로 마이크로 주사기.
- 향하도록 하는 경사와 골반 지 느 러 미 위에 측면 라인 아래 바늘을 위치. 45 ° 각도에 7 시 위치에서 가리킵니다는 골반과 항문 탄 미 익 사이 위치한 물고기 구멍을 3-4 m m 바늘을 삽입 하 고 플런저를 천천히 우울. 물고기 뱃속에 보이는 붉은 색 여 DOX 배달을 확인 합니다.
- 클래식 IP 주입29
- 신속 하 게 전송 깨끗 한 횡단 탱크에 주입 된 물고기 물고기를 복구할 수 있도록 신선한 시스템 물으로 가득 합니다. 한 번 주사 사이 1 x HBSS 버퍼와 바늘을 씻어.
6. 포스트 주입 물고기 관리
- 주입 후 실행 순환 시스템에 생선을 반환 합니다. 만약에 가능 하다 면, DOX 처리 물고기 순환 공유 하는 다른 탱크 사이 상호 오염을 피하기 위해 메인 시스템에서 별도로 유지 합니다.
- 빠른 복구에 대 한 또 다른 24 h에 대 한 삽입 된 물고기. 첫 주 동안 매일 물고기를 관찰 합니다. 다른 물고기에 감염을 피하기 위해 적시 패션에서 죽은 물고기를 제거 합니다.
참고: 첫 번째 24 시간 내의 물고기 죽음 주입으로 인 한 신체 병 변으로 인해 높습니다. - 또한 경도 관측을 위해 DOX 스트레스 물고기를 유지 합니다. 탱크에 있는 다른 물고기를 감염을 피하기 위해 시간에 죽은 물고기를 제거 합니다.
참고: 물고기 숫자는 생존 곡선을 생성 하는 설명 되어 있습니다. - 형 DOX 스트레스 물고기의 심장 초음파30, 심장 기능의 리포터 유전자 변형 라인23, 수영 도전26, 그리고 다른 병 적인 개장의 정량화 등을 다른 실험적인 분석 실험을 사용 하 여 마커23.
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Representative Results
여기, 성인 zebrafish 모델 DIC에 IP 삽입을 수행 하는 두 가지 방법이 제공 됩니다. 고전, 설립 IP 주입 방법29를 사용 하 여, 하는 동안 그것은 주사 된 DOX 솔루션 (빨간색) 바늘 관통 하는 위치에서 밖으로 가끔 진흙 수 지적 했다. 대체 IP 주입은 복 막에서 3-4 m m는 DOX 출시 하는 바늘 침투에 대 한 다른 위치를 사용 하 여 (그림 1A)는 효과적으로 (그림 1B, 1c) 누설 방지. 두 방법에 대 한 복 막에 DOX의 배달 주입 로커 스의 반대 측에 볼 수 있는 물고기 뱃속에 걸쳐 붉은 색의 급속 한 배급에 의해 입증 됩니다.
DOX 대체 IP 메서드를 사용 하 여 50 mg/kg에 복용의 주사 심한 독성, 물고기의 대부분 1 주일 (그림 2) 이내 죽을 리드. 대조적으로, DOX의 주사 20mg/kg과 사용 하 여 대체 IP 메서드 원인 첫 2 주 동안 거의 아무 물고기 죽음 ~ 10% 물고기 죽음 4 wpi (그림 3A)에 약을 복용. DOX 고전적인 IP 메서드를 사용 하 여 20 mg/kg에 복용의 주입 ~ 30% 물고기 죽음 4 wpi (그림 3C)에서 전시 한다. 어느 방법으로 주입 하는 물고기 4 wpi에서 비슷한 ~ 20% 물고기 죽음 10 wpi (그림 3B, D)을 전시 한다.
우리 캐스퍼; 활용 Tg(cmlc2:nusDsRed) DIC에 심장 부전의 진행을 평가 하기 위해 물고기 모델 (그림 4A)23. 투명 한 바디 레드 심장 수축 (그림 4B)와 형광 현미경 확장기 (그림 4C) 단계에서의 문서 수 있습니다. DOX 대체 IP 메서드를 사용 하 여 20 mg/kg의 주입, 후 심 실 기능 감소 4 wpi (그림 4D)에서 시작 하는 검색 수 있습니다.
그림 1: 주입 경로. (A) 방법 하는 (1A) 고전적인 IP 주입 (b)의 도식과 대체 IP 주입 빨간색 동그라미 두 개의 주입 방법에 대 한 사이트를 공개 하는 일반적인 DOX를 나타냅니다. 녹색 원형 바늘 침투 사이트를 나타냅니다. 거리는 약 0.3 g. (1B, 1c) 대표적인 결과 나타내는 두 개의 복 주입 방법을 사용 하 여 성공적인 DOX 배달 무게는 성인 WIK 물고기에 따라 견적 된다. 빨갛게 성인 물고기 배 안에 주사 후 즉시 기재 됩니다. 주입 된 물고기는 신선한 시스템 물에 5 분 복구 후 다시 체크 했다. HBSS: 1 x 행 크의 균형 소금 솔루션. WT WIK zebrafish 채택 되었다. 눈금 막대: 5 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 다음 50 mg/kg DOX 주입 DOX 스트레스 성인 zebrafish의 대표적인 생존 곡선. 나이의 3-6 개월에 WT 성인 물고기의 다른 배치에 DOX 주사의 3 세트입니다. 총, n에서 = 24 물고기 고용 1 x HBSS 제어 그룹, 및 n = 8 물고기 DOX 주사 각 일괄 처리에서 채택 되었다. 물고기 생존에 차이가 두 주입 방법 사이 지적 했다. WT WIK zebrafish 채택 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 두 복 주입 방법 사이 20 mg/kg DOX 주사와 비교 DOX 스트레스 다음 성인 zebrafish의 대표적인 생존 곡선. 0-4 주 클래식 복 주입에 따라 DOX 배달 내에서 (3A) 물고기 생존 %0 100%로 간주 되었다 주 수 물고기. (3B) 물고기 생존 후 4 주 클래식 복 주입 DOX 배달 게시물. %4 100%로 간주 되었다 주 수 물고기. 0-4 주 대체 복 주입에 따라 DOX 배달 내에서 (3 C) 물고기 생존 %0 100%로 간주 되었다 주 수 물고기. (3D) 대체 복 주입 DOX 배달 다음 4 주 후 생존 물고기. %4 100%로 간주 되었다 주 수 물고기. (3A)에 표시 된 데이터와 (3B) 나이의 3-6 개월에 총 223 주입된 물고기에서 DOX 주입의 9 다른 배치는. (3 C)에 표시 된 데이터와 (3D) 2-6 개월에 총 335 주입된 물고기에서 DOX 주입의 14 다른 배치는. 활 어의 숫자 매주 기록 됩니다. 오차 막대는 각 주에 다른 배치 사이에서 생존의 비율에 대 한 표준 편차를 나타냅니다. WT WIK zebrafish 채택 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 대표적인 심장 기능 평가 DOX 스트레스 캐스퍼;를 사용 하 여 다음 Tg(cmlc2:nusDsRed) 물고기. (4A) 성인 의 사진 캐스퍼; Tg(cmlc2:nusDsRed) 물고기. 눈금 막대 성숙된 캐스퍼;의 끝 심장 수축 단계에서 = 1 cm. (4B) 빨간 심의 대표 이미지 Tg(cmlc2:nusDsRed) 물고기. 대시 선 끝 수축 기 직경을 (ESD)을 나타냅니다. 빨간 심 성숙된 캐스퍼;의 최종 수련 단계에서의 (4 C) 대표 이미지 Tg(cmlc2:nusDsRed) 물고기. 이미지 (4B)와 (4 C) 6.3 배 확대를 사용 하 여 형광 해 부 현미경으로 캡처한 뛰는 심장의 영화에서 추출 되었다. 대시 선 끝 확장기 직경을 (EDD)를 나타냅니다. 눈금 막대 = 1 m m. (4d) 대표 심장 기능 캐스퍼;를 사용 하 여 측정 Tg(cmlc2:nuDsRed) 20 mg/kg DOX 주입 후 성인 제 브라. EDD 및 ESD (4B)와 같이 측정 되었다 (4 C) 및 일부 단축 (EDD − ESD) 공식에 의해 계산 됩니다 개별 생선, 그리고 심 실 / EDD. 크게 단축 감소 심 실 분수 4 주 하 고 그 후 발견 되었다. 대체 복 방법은 사용 되었다. 값은 평균 ± 표준 오류로 표시 됩니다. 각 그룹에서 n ≥ 3입니다. 학생 t 검정은 두 그룹의 비교를 위해 사용 되었다. p < 0.05. 이러한 수치 딩 외 에서 수정 된 23 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
진보적인 DIC 모델, DOX 20 mg/kg의 복용량은 물고기 죽음에 1 wpi 하지만 여전히 결과 중 중요 한 물고기 죽음 및 4 wpi (그림 3 및 후 심장 기능의 감소를 발생 하지 않는 가장 높은 복용량으로 실험적으로 결정 그림 4C). 이 복용량은 설치류 DIC 모델 (15-25 mg/kg)에서 자주 사용 되 고 인간 (550 m g/m2는 15 mg/kg에 해당)에 누적 복용량을4,7,,3132 , 33. 50 mg/kg, 등, DOX의 높은 복용량 1 wpi 동안 중요 한 물고기 죽음 표시만 급성 심장 독성에 대 한 응답 DOX23,28공부에 사용할 수 있습니다.
이 DIC 모델의 구현 동안 우리는 그것이 처음 같은 결과 재현 하는 새로운 조사에 대 한 어려운 것으로 나타났습니다. 경험 있는 조사자에도 20%에 대 한 만성 단계에서 사망률의 변화 여전히 찾을 수 있습니다 다른 주사 (그림 3), 현재 모델에서 새롭거나 생물 학적 혼란 요소를 나타내는 중. 보다 완벽 한 모델에 불구 하 고 우리는 여전히이 현재 DIC 모델은 다음과 같은 증거 때문에 사운드 검색 있도록 충분 믿습니다. 첫째, 몇 가지 사례 후 DIC 모델에서 결과 등록할 수 있습니다 나중에 사이에서 모든, 조사 하는 경우. 둘째, 4 의미 있는 유전자 한정자를 식별이 DIC 모델을 바탕으로, 우리. 문학 보고서에서 기존 기록 3 심근 유전자34,35,,3637으로 그들의 지원. 4일 하나입니다 DnaJ 체 subfamily B 회원 6 (DNAJB6), 새로운 심근 유전자28인간 유전자 연구 의해 지원 될 입증 된. 따라서, 우리는 엄격 하 게 나이 일치 하는 컨트롤을 사용 하 여 내 실험 그룹에 따라 결과 여전히 높은 반복, 이기는 하지만 그것의 현재 모양에 DIC 모델은 간 실험 비교에 대 한 신뢰할 수 있는 결론 지었다.
가능성이 우리의 현재 DIC 모델에서 관찰 불일치에 기여 하는 혼란 함을 주 죠 요소는 다음과 같습니다: (1) 노화와 성별 차이 DIC38을 포함 한 심혈 관 질환에 대 한 중요 한 위험 요인으로 간주 되고있다 39,40. 두 가설된 연장이 우리의 모델에서 구체적으로 테스트를 유지, 우리는 세 물고기 DOX 독성 (데이터 표시 되지 않음)에 더 민감한 경향이 통지를 않았다. 두 IP 방법 (그림 3)를 사용 하 여 관찰 간 배치 변이 또한 가능성이 이러한 두 연장이에 기여 했다. (2) 다른 더 큰 동물 모델에서 성인 zebrafish의 크기는 작다. 따라서, DOX 주입으로 인 한 지역 피해는 더 심각 하 고 가변 될 수 있습니다. (주입 된 물고기의 죽음 3) 심장 이외 다른 기관 (예, 신장 독성), DOX 독성에서 발생할 수 있습니다. 더 신중 하 게 설계 된 실험은 상기 혼동 요인의 각각을 해결 하기 위해 필요 하지만, 이전 작업 제안 다음 주의 phenotypic 변이 줄이는 데 도움이 됩니다: 첫째, DOX의 효능을 보장 하는 중요 한 이다. DOX 분말 건조 하 고 어두운 지역에 항상 지켜져야 한다 고 주의 빛에 노출을 줄이기 위해 솔루션을 처리 해야 합니다. DOX 작업 솔루션 물고기 주입 하기 전에 때마다 신선 하 게 준비 하는 것이 좋습니다. 우리가 일반적으로 사용 하지 않습니다 재고 DOX 솔루션 저장소에서 4 주 후. 의심의 여 지 있을 때 각 DOX 일괄 처리의 약 효능을 보정 하기 위해 빠른 배아 DIC 모델을 사용 하 여이 프로토콜에 옵션 섹션 3을 수행 합니다. 둘째, 성인 물고기 동기화 중추입니다. 같은 물고기 스트레인 비슷한 몸 크기를 보장 하기 같은 밀도에서 올려질 필요가 있다. 우리 다음 미리 선택 복용량 계산에 대 한 비슷한 BWs와 물고기. 이 사전 선택 과정에 대 한 전체에 적어도 두 번 많은 물고기를 유지 하는 것이 좋습니다. 모든 물고기는 사전 선택 과정을 하기 전에 24 시간 금식. 셋째, 항상 비슷한 나이의 그리고 그들의 다른 성장 속도 및 잠재적으로 다른 심장 응답 DOX DOX 주입 전에 물고기를 섹스에 물고기를 사용 하는 것이 좋습니다.
우리는 일치 하지 않는 결론의 대부분 의심 제어 그룹에 관찰 될 수 것으로 나타났습니다. 따라서, 우리가 실제 실험을 수행 하기 전에 연습 DOX 주사 조사 DIC 모델에 새로운 권장 합니다. 20 mg/kg DOX 대체 IP 주입 방법을 사용 하 여 주입 때 좋은 사출 기술은 DOX 2-3 개월 게시물 DOX 주입에서 비교적 일관 된 사망 율의 1 wpi 동안 거의 제로 물고기 죽음으로 표시 수 있습니다. 성공적인 모델링에 대 한 궁극적인 증거는 캐스퍼;를 사용 하 여 심장 초음파25,30를 통해 측정할 수 있는 심장 기능 인덱스의 감소 Tg(cmlc2:nusDsRed) 유전자 변형 라인, 나는 새로 개발 된 비보 전을 사용 하 여-심장 기능 분석 결과 (데이터 표시 되지 않음)을 기반으로.
IP 주입, 복고풍 궤도 주입41, 같은 다른 마약 배달 경로 뿐만 아니라 구두42, 그리고 물 외피 먹이 자주 성인 zebrafish에 사용 됩니다. 우리는 순환 시스템의 성공적인 약물 전달, DOX의 빨간 수 쉽게 복 면 잠재적인 출혈에 의해 유효성 검사 하는 방법의 부족 때문에 그것의 직접 약물 방출에 불구 하 고 복고 궤도 주입 접근을 채택 하지 않았다. 우리가 흡수 글루텐42, 성인 물고기 피드 식사와 함께 혼합 했다와 DOX 포함 통해 구두 배달 프로토콜을 시도 했다. 불행히도, 함께 150 mg/kg 4 주 먹이 기간 내 사용의 누적 복용량까지 우리 않았다 관찰 하지 어떤 심각한 cardiotoxicity 구두 DOX 배달의 무효를 제안. 또는, 구강 기술을 더 탐험된43를 수 있습니다. 또한, DOX를 포함 하는 솔루션에 물고기 몸을 담글의 인큐베이션 프로토콜 나중에 테스트할 수 있는 잠재적인 배달 경로 이기도 합니다.
우리는 현재 DIC 모델의 주요 제한 사항 중 하나는 단일 bolus 주입 방법으로, 내부 장기에 높은 독성 및 현지 손상 귀 착될 수 있는 인정 합니다. 이 이렇게 성인 물고기28높은 처리량에서 유전자 검사를 실시 수 있도록 처리량을 증가 하 고 작업 부하를 줄이기 위해 설계 되었습니다. 미래에, 더 낮은 복용량에 DOX의 여러 주사와 모델 해야 추구는 화학 요법으로 치료 하는 암 환자에서 관찰 하는 DIC 정리 더 나은 것입니다.
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Disclosures
저자 관심 없음 충돌 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품에서 미국 심장 협회 과학자 개발 교부 금에 의해 부분적으로 지원 되었다 (14SDG18160021 야드), 미국 NIH R01 보조금 HL 81753와 HL 107304 xx, xx 메이 요 재단.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Crossing tank | Aquaneering | ZHCT100 | Fish breeding |
| Incubator | ThermoFisher | Maintaining embryo | |
| 3 L medium tank | Aquaneering | ZT280 | Maintaining fish |
| Paramecia | Carolina | 131560 | Food for juvenile fish |
| Live hatched brine shrimp | in house | Food for adult fish | |
| Doxorubicin hydrochloride | Sigma | D1515-10MG | |
| 1.5 ml safe-lock tube | Eppendorf | No. 022363204 | For drug storage |
| Aluminum foil paper | Fisher | 1213104 | For preventing light exposure |
| Proteinase K | Roche | No. 03115887001 | For dechorionating embryo |
| Hank's balanced salt solution (HBBS) | ThermoFisher | 14025076 | Vehicle for DOX |
| 100 mm petri dish | Falcon | 431741 | |
| 10 μL NanoFil micro-syringe | WPI | NANOFIL | For injection |
| 34 gauge needle | WPI | NF34BV-2 | For injection |
| Tricaine | Argent | MS-222 | Anesthetizing fish |
| 96 well plate | Costar | 3539 | For embryo drug treatment |
| Transfer pipette | Bel-art product | F37898 | For transfering embryo |
References
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