Протокол для производства композиционных полимерных тонкопленочных структур, обладающих различными молодые модули или толщины представлен. Пленки производятся для изучения передовых клетки культуры или как клей кожи.
В этом протоколе мы представляем методы для изготовления тонких эластомер композитных фильмов для приложений передовых клеток культуры и развития кожи клей. Два различных поли-(dimethyl siloxanes) (PDMS и мягкой кожи клей (SSA)), были использованы для глубины исследования биологических эффектов и адгезионные характеристики. Композитные пленки состоят из слоя гибкой поддержкой и клей верхнего покрытия. Оба слоя были изготовлены методом доктор лезвие приложения. В ходе настоящего расследования была исследована клей поведение композиционных пленок как функция толщины слоя или вариации Юнга верхнего слоя. Юнга PDMS был изменен путем изменения базы для сшивателя смешивая коэффициент. Кроме того толщина пленки SSA менялась от 16 мкм до приблизительно 320 мкм. сканирование электронная микроскопия (SEM) и оптической микроскопии были использованы для измерения толщины. Адгезивные свойства эластомера фильмов сильно зависит от толщины пленки, Юнга полимеров и характеристик поверхности. Таким образом была исследована нормальной адгезии этих фильмов на подложках стекла экспонирования гладкие и шероховатые поверхности. Отрыва стресс и работа разделения зависит от смешивания соотношения Эластомеры силиконовые.
Кроме того Толщина мягкой кожи клей, укладывают поверх слоя вспомогательную поддержку изменялось для того чтобы произвести патчи для приложений кожи. Были проведены цитотоксичность, распространением и клеточной адгезии мышиных фибробластов L929 на PDMS (смешивания соотношении 10:1) и кино SSA (смешивания соотношение 50: 50). Мы показали здесь, в первый раз, бок о бок сравнение композитных пленок, изготовленных из обоих полимеров и представить исследование их свойств биологического – и клей.
В этом протоколе представлены подробные методы для производства тонких эластомер фильмов. Широко доступны доктор лезвие методика использовалась для производства композитных пленок. Технология изготовления была выполнена на polyethylenterephtalate (ПЭТ) пленки, что позволяет последующее производство этих фильмов в больших масштабах. Внимание этот протокол является оценки воспроизводимости, точное изготовление различные слои композиционных пленок и определения биологического и адгезии свойств Заключительный композитный патч. Poly-(dimethylsiloxane) силиконовые эластомеры (PDMS) широко используется в биомедицинской технологии, включая производство кожи клей, микрофлюидика приложений и дополнительных исследований поля1,2,3 ,4. Недавно еще один подкласс PDMS, так называемые мягкие кожи клеи (SSAs) были введены, особенно для нежной кожи, склеивание и де склеивание.
Силиконовые SSAs, винил функционализированных эластомеры, отличаются от аналогичных полимеров отсутствие усиления кремнезема5. Похож на других PDMS, SSA Юнга может быть адаптирована в широком диапазоне регулирования концентрации крест-компоновщик или отверждения время6,,7–8. Это изменение в Юнга силиконовые эластомеры значительно влияет на адгезивные свойства материала и имеет также серьезные последствия на клетки прокариот и эукариот, культивируемых на поверхности9,10 , 11. на клеточном уровне биологической, было показано, что эукариотических клеток реагировать на уровне трансдукции сигнала модуляции матрица упругости или толщина поверхности9,10,12 ,,1314. Таким образом существует широкий интерес в приложениях культуры клеток с перестраиваемой механических свойств полимеров. Важно отметить, что неразрывно низкой поверхностной энергией силиконовой основе эластомеров не обеспечивать оптимальные условия для клеточной культуры эукариотических клеток. Плазменной очистки кислорода является широко используемый метод для увеличения PDMS низкой поверхностной энергией временно, привело к увеличению численности ее отрыва, уменьшилось поверхности адсорбции молекул, в то время как параллельно поощрение вложения, распространение и распространение эукариотических клеток15,16,17,18.
Помимо свойств материалов топографии поверхности значительно влияет на клеточной адгезии и клей взаимодействие между двумя материалы19,20,21,22. Шероховатость поверхности имеет несколько эффектов на формирование контакта между двумя поверхностями: сокращение площади контакта, высокая хранится упругая энергия, окружающих городами, а также влияние на распространение трещин может изменить слипчивая прочность23, 24. Адгезия Пленки самоклеющиеся для кожи человека является полем новых приложений, например, перевязочные, фиксации электродов ЭКГ или других носимых электронных устройств25,26,27, 28. Для измерения производительности клей self-клеи применительно к топографии поверхности, стеклянные подложки с различной степенью шероховатости может использоваться в обычных сцепления измерения8,21. Здесь были выбраны две стеклянные подложки расследовать адгезивные свойства полимерных пленок. Во-первых, Композитные пленки слоем PDMS бэк в смешивая соотношении 10: 1 вес частей, охватываемых PDMS с различным соотношением смешивания были охарактеризованы. В качестве второго шага клеевой слой SSA был подготовлен с одинаковое количество обоих компонентов и с различной толщины пленки поверх поддержки PDMS фильм.
Дизайн композитных конструкций позволяет простой регулировки свойств материала, например Юнга или толщины образцов. Юнга PDMS может быть эффективно изменено в широком диапазоне изменяя соотношение смешивания между двумя компонентами или производство смесей с использованием различных силиконовые эластомера30,31. Описаны методы не ограничиваются PDMS используется в текущем расследовании, но особенно клей производительность сильно зависит от конкретного типа используется. Важнейшим шагом в рамках этого протокола является процесс производства композитных фильмов (Рисунок 1). Было показано, что толщина пленки значительно влияет на поведение адгезии фильмов на разных субстратах, включая кожи (Рисунок 5 и Рисунок 6). В дополнение к толщины пленки время и температуру во время процесса сушки влияет на свойства материала32. Таким образом параметры, как толщина полимерных слоев должны быть тщательно адаптированы и проверены.
Был проведен анализ адгезивные свойства тонких пленок с нормальной силы сцепления измерения с использованием две стеклянные подложки с различными шероховатость поверхности до Ra = 0.338 мкм (рис. 3). В общем шероховатость влияет существенно сцепления поверхности, особенно эластичные материалы33,34. Неровности стекла может быть легко изменено методом шлифования наждачной бумагой неустроенность различных размеров, таким образом позволяя изготовления подложек, экспонируется более высокие значения шероховатости21. Кроме того, другие материалы, например эпоксидной смолы может использоваться для производства субстратов15,35. Это может быть важным модификации стратегией представленных протокола. Например если субстратов, экспонирование различные поверхности свободной энергии необходимы или конкретных топографии не требуется. Здесь pull-off стресс и работа разделения тонких пленок, изготовленные из PDMS и ССС были проанализированы с заказ установки (макроскопическая адгезии устройство измерения (MAD, рис. 4)). 36 оптических выравнивание субстрата и индентора является важным шагом для анализа результатов измерений. Таким образом регулировка угла наклона необходимо выполнить с гониометр, как можно точнее. Это достигается с достаточной точностью вручную чего субстрата контакт с поверхности пленки, вплоть до горизонтального контакта.
В протоколе текущее время был неизменным в одну секунду (Рисунок 5 и Рисунок 7). Особенно для расследования клей производительности эластичную пленку на поверхности грубые субстрата расширение время предоставляет дополнительные сведения. Например увеличение отрыва стресс с увеличением времени удержания был сообщил8. Помимо измерений, выполненных в текущем протоколе, другие методы, например пил тесты могут выполняться, позволяя более всестороннего расследования адгезии производительности37.
Адгезивные свойства композитных пленок экспонируется различные пленки, которую толщины мягкой кожи клей были определены (рис. 7). Наши результаты согласуются с опубликованных данных, показывают, что снижение пленки толщиной приводят к увеличению стресса отрыва родов, то есть, соотношение между субстрата диаметр и кино толщина, увеличение38,39 . На основе этих результатов и данных, изображенный на рисунке 7, мы заключаем, что композитные пленки с общей толщиной 100 мкм (толщина слоя SSA 60 мкм применяется для PDMS фильм с толщиной 40 мкм) exhibit благоприятные адгезии p ссылок на шероховатых поверхностях.
Далее были проведены эксперименты, связанные с биологической характеристике на нетронутой композитных пленок и плазмы рассматриваются составные фильмов (Рисунок 8). Плазменная обработка кремния эластомеров является часто прикладной, универсальная техника для увеличения гидрофильные свойства поверхности и поощрения сотовой привязанности и сотовых, распространяя40,41. Силиконы хорошо известны за их низкой токсичностью и высокой биостойкостью, но может содержать остаточных мономеров или катализаторов, которые могут повлиять на физиологические процессы, приводит также к цитотоксичность42,43. В проведенных экспериментов, которые мы наблюдали меньше, чем 5% цитотоксичность, с помощью выпуска ЛДГ как индикатор и пробирного исключения Трипановый синий. В представленных протокол, всей клеточной популяции, включая клеточных агрегатов отдельные формы, когда поверхность была проанализирована для анализа распространения (рис. 9B). Более дифференцированной результаты могут быть изменения протокола. Для каждого образца супернатанта, содержащий отдельный клеточных агрегатов может перенесены в отдельный реакции трубку и не сочетается с клетками ферментативно удалены с поверхности полимера. Это позволит точные оценки клеток на поверхности и в конечном итоге выявить более подробное определение влияния на процесс клеточной адгезии полимеров. Помимо иммуноцитохимическое методы, представленные здесь клетки может быть собрано для расследования с immunoblot методы, позволяющие подробные количественные оценки выражения протеина.
Таким образом мы создали условий производства для производства эластичных композитных пленок для применений в исследованиях культуры передовых клеток. Кроме того эти тонкие пленки обладают высокой приспособляемости кожи шероховатости, позволяя утонченный дизайн кожи клеев.
The authors have nothing to disclose.
Мартин Danner признается за его помощь в подготовке проб и установление процедур культуры клеток. Авторы хотели бы поблагодарить Биестерфелд Spezialchemie GmbH (Гамбург, Германия), особенно Роберт Radsziwill для непрерывной поддержки и дискуссий. Исследований, приведших к эти результаты получил финансирование от Европейского Совета исследований под Европейского союза соглашение о Субсидировании КЧП седьмой рамочной программы (FP/2007-2013) н. 340929.
2-Propanol, 97% | Stockmeier Chemie | 1000452610000 | Isopropanol |
Abrasive diamnod hand pad | Bohle | MO 5007522 | Grit: 220 |
Accutase | Capricorn Scientific | ACC-1B | |
Albumin Fraktion V | Roth | 0163.2 | BSA |
Alexa Fluor 488 Phalloidin | ThermoFischer Scientific | A12379 | highly toxic |
Aquamount | Polysciences | 18606-20 | water soluble mounting medium |
CytoTox-ONE Homogeneous Membrane Integrity Assay | Promega | G7890 | |
DPBS, without Ca2+, Mg2+ | ThermoFischer Scientific | 14190094 | |
Fetal bovine serum gold | GE Health Care Life Science | A15-151 | FBS |
Goniometer OCA35 | Dataphysics | for the determination of the static water contact angle | |
Hoechst Dye 33342 | Sigma-Aldrich | B1155-100MG | bisBenzimide H 33342 trihydrochloride, highly toxic |
Microscope Axiovert 25 | Zeiss | Microscope used for cell culture documentation | |
Microscope Eclipse LV100ND | Nikon | Microscope used for film thickness determination | |
Paraformaldehyde, aqueous solution 16% | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | electron microscopy grade |
penicillin und streptomycin solution | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
Phenom XL Scanning Electron Microscope (SEM) | Phenom | ||
Poly-(vinyl alcohol) 4-88, MW 31000 | Sigma-Aldrich | 81381-1KG | Mowiol 4-88 |
Poly-dimethyl siloxanes, Sylgard 184 | Dow Corning | (400)000108351397 | PDMS |
RPMI 1640 basal medium | ThermoFischer Scientific | 21875034 | |
soft skin adhesive (SSA) | Dow Corning | (400)000108251792 | MG 7-9800 Soft Skin Adhesive (SSA) |
speed mixer DAC 600.2 VAC-P | Hauschild | ||
stylus profilomter | Zeiss | Model: SURFCOM 1500SD3 | |
Tecan Infinite M200 pro | Tecan | fluorescence plate reader | |
Triton X 100 | Calbiochem | 648466 | |
Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | highly toxic |
Trypsin/EDTA solution | PAN-Biotech | P10-023500 | 0.05% Trypsin, 0.02% EDTA in PBS |
UV glue | Bohle | BO MV76002 | medium viscosity |