Summary
다른 영의 계수 또는 두께 가진 고분자 박막 복합 구조의 제조 프로세스에 대 한 프로토콜 제공 됩니다. 영화는 고급 셀 문화 연구에 대 한 또는 피부 접착제로 생산 됩니다.
Abstract
이 프로토콜에서 선물이 얇은 탄성 복합 필름 고급 셀 문화 응용 프로그램 및 피부 접착제의 개발에 대 한 조작 하는 방법. 두 개의 다른 폴 리-(dimethyl siloxanes) (PDMS와 소프트 스킨 접착제 (SSA)), 생물학적 효과 및 접착 특성의 깊이 조사에 대 한 사용 되었습니다. 유연한 백업 층 및 접착 최고 코팅 복합 필름에 의하여 이루어져 있다. 두 레이어 의사 블레이드 응용 프로그램 기술에 의해 제조 되어 있다. 현재 조사에 복합 필름의 접착 동작 레이어 두께의 함수 또는 상위 계층의 영의 모듈러스의 변형으로 조사 되었습니다. PDMS의 영의 계수는 crosslinker 혼합 비율에 기초를 변화 하 여 변경 되었습니다. 또한, 특수 필름의 두께 약 16 µ m에서 약 320 µ m. 스캐닝 전자 현미경 (SEM)으로 변화 되 고 광학 현미경 두께 측정을 위해 사용 되었습니다. 탄성 중합체 필름의 접착 속성 강하게 필름 두께, 중합체 및 표면 특성의 영의 계수에 따라 달라 집니다. 따라서, 부드럽고 거친 표면 전시 유리 기판에이 영화의 일반 접착 조사 되었습니다. 스트레스 풀 오프와 분리의 실리콘 탄성 체의 혼합 비율에 따라 달라 집니다.
또한, 지원 배경 레이어 위에 부드러운 피부 접착제의 두께 피부 응용 프로그램에 대 한 패치를 생성 하기 위하여 변화 되었다. 세포 독성, 확산 및 PDMS 영화 (혼합 비율 10:1)와 특수 필름 (비율 50: 50 혼합)에 L929 murine 섬유 아 세포의 세포 접착 실시 되었습니다. 우리는 여기에 표시 된, 처음으로, 두 고분자의 제조 복합 박막의 측면에서 비교 하 고 그들의 생물 학적 및 접착 속성의 조사를 제시.
Introduction
이 프로토콜에서 얇은 탄성 중합체 필름 생산을 위한 상세한 방법 제공 됩니다. 널리 의사 블레이드 기술은 복합 박막의 생산에 사용 되었습니다. 제조 방법 polyethylenterephtalate (애완 동물) 포 일, 대규모에서이 영화의 후속 생산 사용에 수행 되었습니다. 이 프로토콜의 중점은 재현성, 정확한 합성 영화의 다른 레이어와 최종 합성 패치의 생물 및 접착 속성의 결정의 제조의 평가 이다. 실리콘 엘라 스토 머 poly-(dimethylsiloxane) (PDMS)은 피부 접착제, 마이크로 응용 프로그램 및 추가 연구 분야1,2,3의 생산을 포함 하 여, 생물 의학 기술에 광범위 하 게 사용 ,4. 최근, PDMS, 부드러운 피부 접착제 (SSAs) 소위의 다른 서브 클래스 도입, 부드러운 피부 결합 및 결합 해제에 대 한 특정 있다.
실리콘 SSAs 실리 카5강화의 부재에 의해 유사한 중합체에서 서로 다른 기능성된 비닐 탄성 체입니다. 비슷한 다른 PDMS, SSA의 탄성 계수 수 적응 시킬 다양 한 변조 cross-linker 농도 또는 경화 시간6,,78. 이 실리콘 탄성 체의 탄성 계수에 크게 재료의 접착 특성에 영향을 미치는 변화와 간결한 및 진 핵 세포 표면9,10 에 교양에 깊은 결과가 또한 있다 , 11. 세포 생물학 수준에서 그것은 표시 했다, 진 핵 세포 신호 변환 수준에 매트릭스 탄성의 변조 또는 표면9,10,12의 두께에 대응 ,,1314. 따라서, 셀 문화 가변 기계적 특성을 가진 고분자의 애플 리 케이 션에 광범위 한 관심을 존재 한다. 중요 한 것은, 본질적으로 낮은 표면 에너지 기반 실리콘 탄성 체의 진 핵 세포의 세포 배양을 위한 최적의 조건을 제공 하지 않습니다. 산소 플라즈마 처리는 증가 PDMS 낮은 표면 에너지 일시적으로, 풀-오프 강도 향상을 선도 하는 널리 사용 되 기술 감소 첨부, 확산을 추진 하는 동시에 분자의 표면 흡착 하 고 진 핵 세포15,16,,1718의 확산.
재료 속성 뿐만 아니라 표면 지형을 크게 세포 접착 및 두 재료19,20,,2122사이 접착 상호 작용 영향을 줍니다. 표면 거칠기는 연락처 형성 두 표면 사이 여러 가지 효과: 접촉 지역, 높은의 감소 뿐만 아니라 균열 전파에 영향 접착 력23, 변경할 수 있는 asperities를 둘러싼 탄성 에너지 저장 24. 인간의 피부에 접착 필름의 접착은 한 신흥 응용 분야, 예를 들어, 상처 드레싱, ECG 전극의 고정 또는 다른 전자 장치를 착용 할 수 있는25,,2627, 28. 표면 지형에 관하여 자기-접착제의 접착 성능을 측정 하기 위해 거칠기의 학위를 변화와 함께 유리 기판 일반 접착 측정8,21에서 사용할 수 있습니다. 여기, 두 개의 유리 기판 고분자 필름의 접착 속성을 조사 선정 됐다. 10 1 중량 부품 PDMS 다른 혼합 비율 적용의 혼합 비율에 PDMS 백업 층으로 첫째, 복합 필름 특징 이었다. 두 번째 단계에서 접착제 특수 계층 동등한 무게 양의 두 구성 요소와 지원 PDMS 필름 위에 두께 변화를 준비 했다.
Protocol
주의: 사용 하기 전에 모든 관련 물질 안전 데이터 시트 (MSDS)를 참조 하십시오. 이 프로토콜에 사용 되는 화학 물질 중 일부는 irritants, 심하게 독성 및 발암 성입니다. 이러한 화학 물질을 취급 하는 때 모든 적절 한 안전 관행을 사용 하십시오. 이 공학 (화학 실) 및 개인의 사용을 포함 보호 장비 (안전 안경, 장갑, 랩 코트, 전체 길이 바지와 폐쇄 발가락 신발). 다음 절차의 일부는 동물 세포 선의 문화를 포함 한다. 따라서, 특정 biosafety 규정을 따르시기 바랍니다. 화학 및 생물 학적 폐기물 특정 국가 및 기관 규칙 및 권장 사항에 따라 폐기 해야 합니다.
1. 실리콘 탄성 박막 복합 구조 준비
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고분자의 준비
- 1.1 g PDMS의 비율은 10:1, 혼합 준비 복합의 1.0 g b 화합물 0.1 g
- 혼합 및 degase에서 2350 rpm 속도 믹서에 사전 고분자 진공 3 분.
- 45:1와 70:1 화합물 A와 화합물 B 간의 대량 비율을 변경 합니다. 1.1.2에서 설명 하는 방법을 유사한 그들을 준비 합니다.
- 50: 50의 비율로 부드러운 피부 접착제 (SSA)의 1 g을 준비 합니다. 1.1.2에 설명 된 대로 따라서 0.5 g 복합 A와 화합물 B의 0.5 g을 혼합.
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폴 리-(vinyl alcohol) (PVA)의 준비 애완 동물 호 일 코팅
- 이온된 수에 PVA를 추가 하 여 물에 18% (w/w) PVA 솔루션을 준비 하 고 밤새는 자력으로 혼합. 4 ° c.에이 솔루션을 저장
- 100 µ m 칼 날의 간격과 약 2.0 m m/s의 속도 사용 하 여 닥터 블레이드 응용 프로그램 컴퓨터와 15 µ m의 효과적인 간격을 전시 하는 얇은 필름을 준비 합니다.
- 오븐에서 15 분 동안 95 ° C에 영화를 놓습니다.
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PDMS 의사 블레이드 기술에 의해 혼합 비율을 10: 1의 지지 계층의 준비
- 자동으로 제어 의사 블레이드 응용 프로그램 컴퓨터를 사용 하 여 얇은 필름의 준비에 대 한.
- 100% 소 프로 파 놀과 애완 동물 호 일을 청소 하 고 의사 블레이드 응용 프로그램 영역의 표면에 놓습니다.
- 닥터 블레이드 호 위에 놓고 나사 위치 마이크로 두께 조정 합니다. 젖은 레이어의 제조, 60 µ m, 100 µ m, 200 µ m, 500 µ m의 두께 적용 합니다.
- 단일 사용 주사기 단계 1.1 의사 블레이드의 저수지에서에서 준비 된 PDMS 10:1 폴리머를 입력 합니다. 약 2.0 m m/s의 속도와 잎의 움직임을 시작 합니다.
- 기계에서 필름 적용된 10:1 코팅으로 애완 동물을 제거 하 고 40%와 65% 사이 습도 전시 방에 있는 95 ° C에서 1 시간 동안 오븐에 배치.
- 닥터 블레이드 소 프로 파 놀과 종이 타 올 청소.
- 모든 필요한 두께 대 한이 절차를 반복 합니다.
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닥터 블레이드 기술에 의해 다른 혼합 비율에서 PDMS의 꼭대기 층의 준비
- 길이 메스 또는 면도칼 블레이드 배치 수 있도록 기본 영화의 측면과 애완 동물 호 일에 의사 블레이드의 슬라이딩의 얇은 줄무늬를 제거 합니다.
- 1.3.3 1.3.6 프로토콜 단계 수행 합니다. 영화에 대 한 적용 젖은 두께 160 µ m 이다.
- PDMS 구성 요소 (45:1 및 70:1)의 다른 혼합 비율의 각각 두 개의 독립적인 필름 생산을 위한이 절차를 반복 합니다. 실 온에서 영화를 저장 (약 22 ° C와 40와 65% 사이 습도에) 오염 및 먼지에서 그들을 방지 하기 위해 광장 페 트리 디쉬에.
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SSA 50: 50 층의 다른 두께 전시 복합 박막의 준비
- 전에 1.3 단계에서 설명한 대로 백업-레이어, PDMS 10:1 영화를 준비 합니다.
- 1.4.1, 1.4.2이이 영화 생산 프로토콜 단계를 따릅니다. 50: 50의 혼합 비율에 SSA를 사용 하 고 젖은 두께 40 µ m의와 함께 영화를 제조.
- 추가 젖은 두께 대 한 절차를 반복: 120 µ m와 300 µ m, 500 µ m.
2. 일반 접착 측정 다른 표면 거칠기와 기질을 사용 하 여
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준비 및 다른 표면 거칠기와 유리 기판의 특성
- 직경 2 mm와 함께 유리 실린더를 사용 하 여 '부드러운 기질'로.
- 서 리 낀된 유리 슬라이드에서 약 4 x 4 mm의 크기와 더불어 조각 유리 커터 '거친 기판' 소비 세를 제조 한다. 약 3 m m 직경의 원형 영역을 연마 다이아몬드 핸드 패드를 사용 합니다.
- UV 접착제로 알루미늄 원뿔 유리를 부착 하 고 3 분 동안 UV 조명 실에서 그것을 밝히는.
- 광학 현미경으로는 기판의 표면 영역의 반지름을 결정 합니다. 계산 하는 수식 A에 따르면 영역 = πr2.
- 결정은 거칠기 매개 변수 R는a Rz (에 따라: DIN EN ISO 4287, ASME B46.1) 스타일러스 profilometer와 함께.
- 기판은 profilometer의 샘플 단계에 부착 하 고 팁을가지고 (다이아몬드, 표준: 2 µ m/60 °) 샘플 접촉.
- 0.3 m m/s의 속도와 길이 1 m m의 거칠기 프로 파일을 기록 합니다.
- 표면 지 세를 분석 하려면 정확히 1 m m2 와 스타일러스 profilometer, 운영 하는 관련된 소프트웨어의 영역을 측정 합니다.
참고: 있는 profilometer는 외부 컴퓨터 운영 합니다. 1 mm의 변위 x에서에 도달 하면 소유자 0.001 m m y 방향으로 이동은 방향. 기록입니다. 3D 이미지를 만드는 Surfcom 지도 전문가 소프트웨어 RS3 파일이 가져옵니다.
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일반 접착 PDMS의 특수 제조 된 박막의 측정
- 면적 약 4.0 c m2 와 장소 UV 접착제로 슬라이드 유리에 그들의 작은 조각으로 애완 동물 호 일에 영화를 잘라 면도날을 사용 합니다. UV 3 분 동안 빛을 밝히는.
- 샘플 홀더에 고분자 샘플을 탑재 합니다.
- 에탄올과 부드럽게 표면 및 질소 가스로 건조 기판 청소.
- 알루미늄 콘 로드 셀에 장착 된 유리 기판에 연결.
- Tiltable 테이블 (각도)를 사용 하 여 정확 하 게 접근 하는 폴리머 필름 기판의 기울기 각도 조정 하 여 서피스를 정렬. 이 위해서 영화 접촉 수동으로 기질을 가져. 카메라 이미지에 의해 시각 서로 두 서피스의 완전히 병렬 정렬 얻을 때까지 기울기 각도 변경 합니다.
참고: 로드 셀 tiltable 테이블에 연결 됩니다. 그림 4, 연락처 두 카메라의 시각화 및 폴리머 필름 기판의 정렬 있도록 유리 프리즘은 샘플 아래 위치 해 있습니다. - 13 ± 5 kPa의 미리 긴장 될 때까지 고분자 필름 표면에 기판 달성 (그림 4) 이동 합니다.
- 와 같은 필요한 측정 파라미터 개최 시간과 접근/철회 속도 제어를 LabView에서 작성 된 사용자 지정 프로그램된 소프트웨어 패키지를 시작 합니다. 보류 시간 t개최 1 초, 접근 이며 분리 속도 각각 30 µ m/s와 10 µ m/s 이다.
- 3 개의 독립적인 제조 샘플 및 각 필름 표면에 6 개의 서로 다른 위치에 접착 력 측정을 수행 합니다.
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데이터 분석 및 기계적 요인의 계산: 풀에서 스트레스와 분리의 작품.
- 스트레스를 계산
나누어 기록 된 강제로 기판 영역에 의해S.
- 풀에서 스트레스, 정상적인 스트레스의 최대 값으로 설명 된 결정 합니다.
- 빼기 어디 드 본딩 완료 된 인장 정권의0 샘플 위치의끝 에서 시작 위치에 의해 변위 Δs를 얻을. S0 으로 인장 정권의 시작을 정의 = 0.
- 다음 방정식에 따라 시스템 규정 준수 C에 의해 샘플 위치의 측정 된 값을 수정:
- 분리의 작품을 계산 하기 위해 s0 와 s끝 사이의 응력-변위 곡선을 통합 합니다.
- 스트레스를 계산
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수학 계산 소프트웨어 출처를 사용 하 여 기계적 요인의 계산.
- 원본 테이블에서 단일 접착 측정에서 기록 된.dat 파일을 가져옵니다. 기록 된 매개 변수는 시간, 샘플 위치 및 힘. 이러한 매개 변수는 열 A에에서 (시간), B (샘플 위치)와 C (힘)을 삽입 합니다.
- 빈 값을 확인 하려면 폴리머 필름에 문의 하기 전에 힘의 약 20 측정 값의 평균입니다. 이 평균 값 F오프셋 이름과 열 D.에 붙여
- 수정 배경 계산 강제로 F * 다음 방정식에 따라
열 중에 아래와 같이이 방정식을 삽입
- 0 변위, 즉, s0 으로 인장 정권의 시작을 정의 = 0. 따라서, 결정 s0 B 열 변위에서 빼기 하 고 열 f:에 저장
- 또한, 기계 준수에 의해 샘플 위치를 수정 합니다. 이 수정 열 G. 삽입 열 G으로 다음 방정식에서 수행
- H. 다음 열에서 스트레스를 계산 따라서 기판 영역에 의해 힘을 나눕니다. 다음 방정식을 삽입
A m m2 (2.1에서 결정)에서 유리 기판의 표면 영역입니다. - 스트레스와 변위 값 으로부터 분리 작업을 계산 합니다. 따라서, x 축 따라 변위 및 y 축 따라 스트레스 플롯. S끝의 최종 변위는 인장 응력이 0 반환으로 정의 됩니다 s0 에서이 그래프를 통합, 즉 전체 분리 했다. 그래프를 통합, 통합 기능을 선택 합니다. 어 제이 열에 계산 된 값을 추가
나누어 기록 된 강제로 기판 영역에 의해S.
3. 광학 현미경 및 전자 현미경 (SEM)을 스캔 하 여 영화의 특성
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광학 현미경 검사 법
- 면도날으로 작은 조각 (약 0.25 c m2)으로 고분자 필름을 절단 하 고 유리 슬라이드의 가장자리에 그들을 첨부. 유리 슬라이드 수직으로 직 립 현미경 지향 장소와 영화 횡단면의 두께 측정.
참고: 사용 20 X 목표 (NA = 0.45, 이론적 해상도 800 nm 1.1 µ m의) 약 ≤ 20 µ m의 필름 두께 값을 측정 하. 영화에 대 한 두께 50 µ m까지 20 µ m의 범위에서 사용 하는 10 X 목표 (나 = 0.30, 이론적 해상도 800 1.6 µ m의 nm) 영화에 대 한 두께 ≥ 50 µ m 5 X 목표 사용 (나 = 0.15, 이론적 해상도 800 3.3 µ m의 nm).
- 면도날으로 작은 조각 (약 0.25 c m2)으로 고분자 필름을 절단 하 고 유리 슬라이드의 가장자리에 그들을 첨부. 유리 슬라이드 수직으로 직 립 현미경 지향 장소와 영화 횡단면의 두께 측정.
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Sem의 조사
- 애완 동물 호 일을 잘라 유리 슬라이드에 약 2 c m2 의 샘플을 첨부 하 고 샘플 홀더 ≤ 소유자의 위쪽 표면 아래 2 m m 내부 클램핑 메커니즘을 수직으로 배치.
- 선택 하는 10의 가속 전압 kV, backscattered 전자 검출기 (BSD) 및 낮은 진공 조건 (60 Pa).
- 초점, 배율, 밝기, 이미지의 대비를 조정 합니다.
- 28의 이미지 수집 시간 선택 s 1024 x 2048 픽셀의 해상도 함께.
- SEM.에서 샘플 홀더를 제거
4. 생물 조사
- 일상적인 셀 문화 L929 세포
- Murine fibroblast 세포 라인 L929를 사용 하 여 조사에 대 한. Rosewell 공원 기념 연구소 (RPMI) 1640 기저 매체, 셀 문화 10% 태아 둔감 한 혈 청 및 페니실린 und 스 37 ° C에서 보완, 5% CO2 T75 셀 문화 플라스 크. 약 70% ~ 80%의 합류에 셀 통로
- 셀 뿌리고에 대 한 포부에 의해 매체를 제거 하 고 씻어 칼슘 및 마그네슘 무료 인산 버퍼 (DPBS-/-) 30 층 류 캐비닛 아래 s. 이후에 Accutase, 분해와 효소 솔루션의 2 mL로 세포를 품 어 고 37 ° C, 5% CO2에서 최대 5 분 동안 collagenolytic 활동.
- 단계 대조 현미경으로 세포 문화 플라스 크 표면에서 세포의 분리를 확인 합니다.
- 추가 포함 하는 혈 청의 8 mL 플라스 크에 세포 현 탁 액 15 mL 반응 관에 전송 매체.
- 세포 현 탁 액에서 10 µ L 샘플 고 10 µ L Trypan 파랑의 혼합.
- Neubauer 챔버와 휴대 전화 번호를 확인 하 고 셀의 총 수를 계산 합니다.
주의: Trypan 파랑은 독성, MSDS, MSDS에 설명 된 필수 절차를 따라서 컨설팅, 적절 한 개인 안전 보호의 착용 및 화학 캐비닛에서 처리 필요 합니다. 화학 폐기물 증 착에 대 한 폐기물을 수집 합니다.
참고: Trypan 블루 긍정적인 세포 비 그대로 세포 막 나타내는 블루 컬러는. - 다음 구절에 대 한 문화 5 x 105 셀에 새로운 살 균 세포 새로운 매체의 10 mL로 플라스 크 문화. 실험 조건, 문화 3 x 10 6 잘 플레이트에5 셀에 포함 된 폴리머 샘플 (프로토콜 단계 4.2) 24 잘 플레이트의 각 잘 6 x 104 셀에 대 한.
- 세포 배양 실험에 대 한 복합 영화 준비 합니다.
- 소비 세 단일 조각의 유리 커버 전표는 직경 12 m m.의 전시의 표면에 핀셋으로 메스와 장소 애완 동물 지원 계층에서 프로토콜 단계 1.4와 1.5에서에서 제조 하는 원하는 크기의 영화는 2의 우물에 샘플 배치 4 잘 플레이트.
- 세포 독성 측정 및 셀 계산, 애완 동물 호 일에서 영화를 제거 하지 마십시오. 약 9.4 c m2의 원형 영역을 잘라, 6 잘 플레이트, 영화에서의 단일 우물에 깔끔하게 피팅 1.4와 1.5에서 생산 하 고 세포 배양 접시의 우물에 그들을 배치.
- 이온 H2O ≥ 폴리머 샘플에 담가 30 분.
참고: 고분자 샘플은 압력가 마로 소독에 의해 살 균 될 수 있습니다. 따라서, 셀 문화 요리에서 모든 폴리머 포함 샘플을 제거 하 고 유리 페 트리 접시 안에 넣어. 살 균은 121 ° C의 온도에서 20 분 2.05 바에서 압력솥에 수행
- 고분자의 플라즈마 처리
- 애완 동물 호 일에 또는 둥근 유리 커버 전표 (4.2.1에서 제조) 플라즈마 장치의 반응 챔버 내부에 붙어 있는 필름을 놓습니다.
- 뚜껑 닫고 대피 1.6 x 10-2 mbar의 압력에 도달할 때까지.
- 3 분에 대 한 플라즈마 처리를 수행 합니다.
- 반응 챔버를 환기 하 고 24 잘 또는 더 셀 문화 조사 6 잘 요리 샘플을 배치.
- 각도와 물 접촉 각 측정 한 샘플을 사용 합니다. 따라서, 소프트웨어 패키지를 사용 하 여 고분자 표면 가까이 주사기를 이동 하 고 표면 위에 3 µ L 물 한 방울을 배치. 각도 소프트웨어 정적 물 접촉 각을 계산 합니다.
- 얼룩 그리고 현미경 검사 법
- 4.1.7 단계 및 37 ° C, 5% CO23 d에 대 한 문화에서 설명한 대로 셀을 준비 합니다.
- 깨끗 한 일 동안 배양 세포의 위상 대비 사진 캡처-플라즈마 처리 고정 직전 영화.
- 0.2% 보충 PBS 준비 트리톤-X-100. 천천히 100 mL의 PBS (PBS-T)로 재고 솔루션의 200 µ L 플라스틱.
- 4 %paraformaldehyde / PBS 솔루션 (PFA/PBS-T)를 준비 합니다.
주의: Paraformaldehyde 독성, 따라서 컨설팅 MSDS, MSDS에 설명 된 필수 절차 이며 적절 한 개인 안전 보호의 착용 및 화학 캐비닛에서 처리 하는 것이 필요. - 5 %BSA / PBS-T 솔루션을 준비 합니다.
- Lamina 흐름 캐비닛 아래 포부에 의해 매체를 제거 합니다. 중간 잔류물을 제거 하려면 우물에 PBS를 추가 합니다.
- 화학 캐비닛에 접시를 전송 하 고 실 온에서 25 분간 PFA/PBS 솔루션의 400 µ L의 PBS 바꿉니다.
- 4 번 한 우물, 신중 하 게 PBS로 세척에서 PFA/PBS 솔루션을 제거 합니다. 각 세척 단계 사이 3 분을 기다려야 하 고 화학 폐기물 처리에 대 한 솔루션을 수집 합니다. 접시를 사용 하 여 직접, 또는 4 ° c.에 그것을 저장합니다
- 추가 5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) / 우물에 PBS-T와 난다 바인딩 사이트를 차단 하는 RT에 60 분 동안 품 어.
- 솔루션을 발음 및 알 렉 사-488 (1:160 희석)를 활용 하는 phalloidin로 교체 / PBS T 솔루션 보충 0.2% 트리톤-X-100.
주의: Phalloidin-488는 독성, 따라서 MSDS에 설명 된 필수 절차 MSDS를 컨설팅 하며 적절 한 개인 안전 보호의 착용 및 화학 캐비닛에서 처리 필요 합니다. - 커버 알루미늄 호 일로 접시와 RT에 3 h에 그것을 품 어 또는 4 ° c.에서 하룻밤
- 솔루션을 발음 하 고 PBS로 3 회 세척. 각 세척 단계 사이 3 분을 기다립니다. 화학 폐기물 처리에 대 한 솔루션을 수집 합니다.
- 염료 Hoechst 33342 1 µ L의 솔루션을 준비 (솔루션 주식 1 mg/mL). Hoechst의 1:1000 희석 피 펫 1 µ L에 대 한 염색 3334 1 mL의 PBS-T와 섞어 잘. 우물에 Hoechst 염료 33342 솔루션의 300 µ L을 추가 하 고 어둠 속에서 RT에서 10 분 동안 품 어.
주의: 염료 Hoechst 33342 DNA intercalating 시 약 이며 따라서 잠재적으로 돌연변이, 따라서 컨설팅 MSDS, 필수 절차 설명에 MSDS 및 적절 한 개인 안전 보호의 착용에서 처리 한 화학 캐비닛은 필요 합니다. - 솔루션을 발음 하 고 4 시간 PBS와 샘플을 씻어. 각 세척 단계 사이 3 분을 기다립니다. 화학 폐기물 처리에 대 한 솔루션을 수집 합니다.
- 포함, 신중 하 게 영화 문화 표면에서 제거 하 고 현미경 유리 슬라이드에 배치. 영화 물 녹는 포함 매체의 20 ~ 40 µ L을 추가 하 고 약간의 압력을 사용 하 여 위에 새로운 원형 유리 커버 슬립을 첨부.
- 형광 현미경 이미지를 수행 합니다. 조명에 필요한 필터: 알 렉 사-488 496에 흥분 최대는 519에 발생 하는 및 최대 방출 nm. 따라서, 방출 색깔은 녹색입니다. Hoechst 33342 염료 trihydrochlorid 안 DNA에 complexed 있다는 여기 355 nm 및 최대 최대 DNA 복잡 한 방출 발생 465 nm.
- 세포 독성 측정 및 셀 수의 결심
- 6 잘 플레이트 단계 4.3에서에서 준비 및 준비 단계 4.1.7에서에서 셀에서 성장 하는 세포와 실험을 수행 합니다. 37 ° C, 5% CO23 일 동안 셀 문화. 긍정적인 통제에 대 한 아무 고분자 필름을 포함 하는 세포 치료 문화 폴리스 티 렌 표면에 성장 했다 셀을 사용 합니다. 배경 결정 (부정적인 조건), 대 한 세포 없이 우물에서 매체를 구하십시오.
참고: 매체 또한 배양 세포 치료 문화 폴리스 티 렌 표면에 잘 포함 하 세포에서 가져올 수 있습니다. - 실험 샘플 라벨 15 mL 튜브의 수에 따르면.
- 긍정적인 통제에 0.9% 트라이 톤 X-100 포함 PBS 솔루션의 40 µ L을 추가 하 고 1000 µ L 팁 적극적으로 혼합. 약 3 분까지 기다립니다.
- 표면에 부착 된 세포를 제거 하지 않고 4.5.3에서 준비 하는 샘플을 포함 한 모든 샘플에서 매체를 발음 하 고 15 mL 튜브에 매체를 전송 합니다. 단일 웰 스 DPBS-/- 3 mL를 추가 하 고 층 류 4.5.9에 설명 된 대로 휴대 전화 번호의 결정에 대 한 캐비닛 아래 접시를 저장.
- 3 분 동안에 200 x g centrifuge 고 LDH 활동 결정에 대 한 상쾌한의 1 mL를 제거 합니다. 셀을 포함 하 고 층 류 캐비닛 아래 매체 남은 15 mL 튜브를 저장 합니다.
- 분석 결과 대 한 평면 바닥 블랙 96 잘 접시 사용 됩니다. 샘플 매체와 30에 대 한 잘 섞어 50 µ L를 50 µ L CytoTox-한 시 약의 추가 s.
- 커버 알루미늄 호 일로 접시와 실시간에 10 분 동안 저장
- 각 음을 정지 솔루션의 25 µ L을 추가 하 고 형광 플레이트 리더 형광 강도 기록. 10 접시를 흔들어 s 520의 여기 파장 형광 신호를 감지 하 고 및 560의 방출 파장 nm. 공기 방울을 피하십시오.
- 4.5.4 단계 셀 번호 aspirate는 DPBS-/- 프로토콜 문화 접시의 우물에서의 결정에 대 한 고 supernatants 프로토콜 단계 번호 4.5.5 수집을 포함 하는 15 mL 반응 관에 솔루션을 추가 합니다.
- 200 x g 3 분 동안에 15 mL 반응 관을 원심 하 고 상쾌한 발음. 트립 신/EDTA의 0.5 mL을 추가 하 고 37 ° c.에서 10 분 동안 품 어
- 접시의 우물에 트립 신/EDTA에의 2 개 mL를 추가 하 고 고분자 필름에서 세포를 분리를 37 ° C에서 약 10 분에 대 한 품 어.
- 세포 현 탁 액 단계 번호 4.6.10에서에서 15 mL 반응 관에 전송 됩니다. 또한, 적극적으로 매체를 포함 하는 혈 청으로 접시를 씻어.
- 3 분 200 x g에서 샘플을 원심, 발음은 상쾌한 고 튜브를 매체를 포함 하는 혈 청을 추가 합니다.
- 4.1.5 및 4.1.6 단계에 설명 된 대로 휴대 전화 번호를 결정 합니다.
- 6 잘 플레이트 단계 4.3에서에서 준비 및 준비 단계 4.1.7에서에서 셀에서 성장 하는 세포와 실험을 수행 합니다. 37 ° C, 5% CO23 일 동안 셀 문화. 긍정적인 통제에 대 한 아무 고분자 필름을 포함 하는 세포 치료 문화 폴리스 티 렌 표면에 성장 했다 셀을 사용 합니다. 배경 결정 (부정적인 조건), 대 한 세포 없이 우물에서 매체를 구하십시오.
Representative Results
첫 번째 실험에서 다양 한 두께와 상수 비율 10: 1의 혼합 PDMS 영화 애완 동물 필름 (그림 1)에 제조 되어 있다. 백업 층의 두께 영향 크게 수 있기 때문에 강성 및 13 ± 2 µ m와 296 ± 13 µ m 사이 단일 영화 했다 초기 실험에서 전체 복합 필름의 속성 처리 제조 (그림 1). 그것은 잘 알려진, 그 고분자 필름의 경화 프로세스 수축 하는 동안 발생 합니다. 얇은 필름을 위해 우리는 78% ±의 차이 습식 및 경화 조건 사이 3.1%를 관찰 했다. 두꺼운 필름을 위해 수축 40.9% ± 2.6% 되었습니다 검색 (그림 1).
이 프로토콜에서 제공 하는 응용 프로그램에 대 한 영화 애완 동물 호에서 수동으로 제거 해야 합니다. 우리는 특히 박막 집게로 처리 하기 어려운 있으며이 과정에서 종종 파괴 된다 인정. 따라서, 우리는의 얇은 폴 리 (비닐 알코올) 지원 층으로 코팅 영향 조사. PVA는 높은 강성을 소유 하 고 다운스트림 응용 프로그램에 있는 그것의 물 가용성으로 인해 쉽게 제거 될 수 있다. 적용 된 PVA 코팅 약 17 µ m 두께 있으며 따라서 PDMS 영화가이 레이어 위에 코팅 된 PVA 코팅 (데이터 표시 되지 않음) 없이 영화에 비해 약간 얇은. 특히 처리 속성에 초점을, 우리는 얇은 필름 애완 동물 호 일에서 제거에 대 한 지원 PVA 필름을 필요로 결론.
효과적인 필름 두께 40 µ m의 모든 추가 실험에 선정 됐다. 복합 필름 생산에 대 한 PDMS의 혼합 비율 45:1와 70:1 10: 1에서 다양 하 고 의사 블레이드 기술 (그림 2A)와 이전 polymerized PDMS 필름 위에 적용 했다. 10:1 비율 제외한 다른 영화는 적절 한 정밀 광학 현미경에 의해 명확 하 게 구별 될 수 있습니다. 현미경 분석에 대 한 영화는 메스로 잘라 되었고 유리 슬라이드의 모서리에 첨부. 상위 계층의 더 높은 혼합 비율 지원 계층 (그림 2B)의 10:1 비율에 비해 미세한 이미지에 시각적으로 밝게 나타났다. 또한, 스캐닝 전자 현미경 검사 법 (그림 2C) 약 860 X의 확대에서 샘플 이미지를 사용 되었다. 10:1 비율 달리 두 PDMS 영화, 높은 혼합 비율에서 제조 사이의 밝기에 명확 하 게 현저한 차이 인정 받았다. 절단 절차 부호, SEM 사진 (그림 2B)에 나뭇잎. 이러한 결과 바탕으로, 복합 영화의 평균 전체 두께 112 µ m ± 5.0 µ m (그림 2D) 이었다.
추가 실험에서이 영화의 접착 속성 직력 접착 측정 두 개의 서로 다른 유리 기판 (그림 3)를 사용 하 여 결정 되었습니다. '부드러운 기판'와는 산술 평균 거칠기 R는는 0.013 ± 0.0002 µ m의 0.12 ± 0.004 µ m (그림 3A)의 평균 피크-밸리 Rz 표면 질감을가지고 있습니다. 기판 2 (GS2, 거친 지정) 전시 0.338 ± 0.021 (R를) µ m 및 2.055 ± 0.017 µ m (Rz)의 거칠기 값 (그림 3B). 평균으로 반경 2.1.4 '부드러운' 기판의 표면적은 '거친' 기판 6.07 m m2 의 면적에 대 한 동안 3.2 m m2 에서 얻은 계산 되었습니다.
이러한 두 개의 기판으로 다른 필름 접착제 동작 결정 되었습니다. 두 개의 매개 변수는 필름의 접착 속성 설명 선택:는 스트레스 풀 오프 σ최대 및 분리 W9 월의 작품. 본딩 및 드 샘플 위치 결합의 전체 과정에서 s와 직력 F 기록 됩니다. 결과 응력-변위 곡선 (그림 4)에 표시 됩니다.
실험 결과의 정확한 해석에 대 한 그것은 고분자 필름 표면에 기판에 정확 하 게 맞게 중요입니다. 또한, 측정 장치의 기계 준수 변위를 수정 하려면 간주 해야 한다. 측정 하는 동안 적용 된 힘 샘플 뿐만 아니라 전적으로 다른 부분의 테스트 장치 역할을 합니다. 따라서, 각각 두 개의 기판의 13 ± 5 kPa의 압축 응력으로 유리 슬라이드에 대 한 누르면. 측정 하려면 준수, 부하 곡선은 고려, 즉, 힘-변위 곡선의 부분 두 표면 정확한 미리 힘에 도달 샘플 위치까지 접촉으로 온. 곡선의 상호 슬로프는 기계 준수 c. C에 대 한 계산 된 값은 0.12 µ m/m n.
첫 번째 실험에서 PDMS의 다른 혼합 비율 영화 분석 되었다 (그림 5). 복합 영화에 대 한 두께 및 PDMS 10: 1의 제조는 지지 계층의 혼합 비율이 일정 유지 되었다. 상위 레이어 두께 또한 65 µ m의 값과 상수 유지 되었다. 109 ± 27.6 kPa의 높은 풀에서 스트레스 (그림 5A) PDMS 10:1 영화에 부드러운 유리 기판으로 결정 했다. 혼합 비율의 증가 45:1 혼합 비율에 대 한 76.7 ± 17 kPa 당겨-오프 스트레스의 감소와 41.4 ± 17 kPa 70:1 비율에 대 한 이끌어 낸다. 22 ±의 거친 유리 기판 풀 오프 스트레스 2.2 kPa PDMS 10:1 필름에 결정 했다. 일반적으로, 분리의 작품 사이 두 유리 기판, 예를 들어비교 했다., 1.4 ± 0.6 J/m2 는 얇은 필름에 부드러운 기질과 얇은 필름에 1.84 ± 0.7 J/m2 으로 얻은 거친 기판 ( 로 얻은 그림 5B).
다음, 피부 응용 프로그램 및 응용 하는 세포 배양에 대 한 박막의 생산 탐험 (그림 6). SSA 50: 50 복합 영화의 상위 레이어 생산에 사용 되었습니다. 1:10 비율 약 40 μ m의 두께 가진 혼합에서 PDMS은 백업 계층으로 사용 되었습니다. 그림 5에 묘사 된 이전 실험과는 달리 상위 레이어 두께 다양 했다, 혼합 비율이 일정 하 게 유지 했다 하는 동안 (그림 6A). 특수 혼합 비율은 50: 505,8의 제조 업체 추천을 사용 하 여 높은 표면 거칠기, 특히 인간의 피부와 표면에 첨부 파일을 포함 하는 응용 프로그램에서의 접착 특성 때문에 선정 되었습니다. 인간 표 피에는 높은 표면 거칠기를 소유한 다. 나이 해 부 지역 48 µ m와 71 µ m 사이 평균 표면 거칠기 깊이 (RZ) 되었습니다29보고. 안전 하 고 부드러운 피부 접착은 중요 하다, 또는 거의 신생아의 민감한 피부에 대 한 까다로움 노인의 피부 재생. 다른 젖은에서 다양 한 두께 40 µ m, 120 µ m, 300 µ m, 500 µ m에 적용 된 (그림 6A). 젖은 두께 따라 복합 필름의 총 두께 51 µ m 및 344 µ m (그림 6B) 사이 다릅니다. 치료, 후 컴포지트는 자원 봉사자의 손 (그림 6 c)의 뒷면에 첨부 되었습니다. 다른 필름 두께 (그림 6 c) 피부 거칠기에 그들의 적응 속성에 차이가 명확 하 게 표시합니다. 얇은 필름 (50 µ m, 100 µ m 총 두께) 두꺼운 필름 (220 µ m와 340 µ m 총 두께)에 비해 피부 주름에 적응의 높은 속도 표시 합니다. 이 결과 다양 한 두께와 복합 필름 적용된 의사 블레이드 기술로 정확 하 게 생산 될 수 나타냅니다.
이러한 복합 필름 (그림 7) 접착 실험 수행 했다. SSA 최고 필름의 두께 따라 우리 증가 필름 두께와 풀 오프 스트레스의 감소를 관찰 했습니다. 높은 풀 오프 힘 133 ± 36.6 kPa의 부드러운 기판 (그림 7A)에 측정 되었다. 낮은 풀-오프-스트레스 18 ± 4 kPa의 두꺼운 필름에 거친 기판으로 얻은 것입니다. 흥미롭게도 두 기판 사이의 비교는 얇은 필름 (그림 7A)에 2.7 배 차이 보여준다. 증가 필름 두께가 두꺼운 필름에 특히 현저한 차이가 관찰 (그림 7A) 했다. 부드러운 기판으로 1.8 ± 0.8 J/m2 약 100 µ m의 총 두께 전시 하는 영화에서 발견 되었습니다의 분리의 작품 다음 필름 두께 의존 감소 (220 µ m 두께: 1.6 ± 0.6 J/m2 와 330 µ m: 1.3 ± 0.4 J/m2 (그림 7B)). 거친 기판으로 측정 하는 분리의 작품 일반적 부드러운 기판에 비해 약간 낮은 (100 µ m 두께: 1.63 ± 0.6 J/m2, 220 µ m 두께: 1.1 ± 0.6 J/m2 와 330 µ m: 1.0 ± 0.2 J/m2 (그림 7B )).
또한, 분리 메커니즘 측정 (그림 ℃) 동안 기록 되었다. 작은 현상 동안 균열 같은 손가락의 모양을 띄는 두꺼운 필름 (그림 ℃)에 얇은 필름에 관찰 되었다.
필름의 제조 후 1 개월 이내 측정 수행 되었습니다. 그러나, 안정성과 탄력 있는 영화의 기계적 특성의 보존 온도 습도 등 환경 요인에 의해 영향 수도 있습니다. 1.4.3 프로토콜 단계에 설명 된 대로 영화 실내 온도 습도 40-65%에 저장 되어 있다. 방지 하기 위해 오염 및 먼지, 영화에서 어둠 속에서 플라스틱 접시에 저장 되었습니다. 장기 안정성, 접착 력 측정 및 SSA의 두께 결정 조사를 50: 50 영화 제작 후 약 4 개월 동안 수행 되었습니다. 필름 두께, 풀에서 스트레스와 분리의 작품에 큰 영향 없이 저장 후 검색 되었습니다. 예를 들어 특수 복합 필름 120 µ m SSA의 젖은 두께와 젖은 두께 100 µ m PDMS의 제조의 스트레스 풀 오프 제조 후 46.6 ± 6 kPa와 분리 1627 ± 592 mJ/m2 의 작품 이었다. 약 4 개월 후 제조, 48.8 ± 5.4 kPa의 스트레스 풀 오프와 1666 ± 723 mJ/m2 의 분리의 일 결정 했다. 또한, 잠시 후 제조,이 필름의 총 두께 103.3 ± 13.9 µ m 및 스토리지 98.1 ± 9.1 µ m 후.
더 PDMS 10: 1을 실험 하 고 SSA 50: 50 약 105 µ m의 총 두께 가진 복합 영화 문화 기판 (그림 8) 세포로 사용 되었습니다. 프로토콜 단계 번호 1에서에서 제조 된 복합 영화를 쉽게 애완 동물 호 일에서 제거 하 고 필요한 치수와 기하학적 형태에 잘라 될 수 있습니다. 또한, 영화는 엄격한 준수 표면, 예를 들어 유리에 대 한 다른 영의 계수를 표시 하는 여러 영화 나란히 연결 된 고 셀 문화 판의 단일 우물 안에 배치 될 수도. 영화 추가 coverslip 없이 직접 폴리스 티 렌 표면에 부착 될 수 있습니다. 또한, 영화 튜브 또는 고리, 추가 하지 달성 기존의 셀 문화 자료와 연구 활성화 같은 기하학적 구조 및 다른 표면에 적용할 수 있습니다. 그림 8 에 표시 된 수행된 실험에서 애완 동물 호 일에 복합 영화 셀 문화 접시에 직접 배치 되었습니다 또는 영화 애완 동물 호 일에서 제거 되었고 유리 커버 슬립에 배치. 실험 조건에 대 한 몇 가지 고분자 그들의 자유 표면 에너지를 증가 공기 플라즈마로 처리 되었습니다. 일반적으로 PDMS 플라즈마 치료 전에 약 115 °의 물 접촉 각을가지고 되 고 높은 친수성 (물 접촉 각 < 30 °) aftertreatment8. 플라즈마 처리는 생체 표면을 렌더링 하 고 진 핵 세포의 부착을 용이 하 게 한다. 치료 시간과 강도 따라 폴리머 표면 변경, 거칠기의 높은 학위를 표시 하 고 균열 또한 나타날 수 있습니다. 치료 후 즉시 소수 복구 과정은 관찰 된다. 프로토콜 단계 4.3.5에서 설명 된 것 처럼 정적 물 접촉 각을 결정 하는 각도 사용 되었다. 따라서, 고분자 공기 플라즈마 처리 후 ddH2O를 h 1에 배치 된 이후 분석 되었다. 플라즈마 처리 물 접촉 각을 크게 감소 (PDMS 깨끗 한: 117.0 ± 2.2 °; SSA 깨끗 한: 127.9 ± 5.6 °; PDMS 플라즈마: 18.0 ± 7.2 °; 특수 플라즈마: 29.3 ± 11.5 °).
수성 장착을 포함 하는 샘플에 대 한 매체 적용 되었습니다. 시간 언제 든 지 샘플을 다시 제거할 경우는 표본 하룻밤 배양 접시를 포함 하는 물에서 놓일 수 있다. 결국, 커버 전표 추가 분석을 위해 제거할 수 있습니다.
첨부 파일 동작 및 PDMS와 특수 50: 50 복합 필름에 3 일 동안 시드 L929 세포의 형태는 단계 대조 현미경 검사 법 및 활용 된 형광 phalloidin-488와 염료 Hoechst 33342 (그림 8) 얼룩 후 결정 되었습니다. 단계 대조 현미경 검사 법에 있는 이미지 수집이 좋습니다, 특히 고분자 플라즈마 치료 하지 않을 대 한. 이러한 고분자 표면에 약한 세포 접착 때문에 단일 셀 또는 집계는 쉽게 분리, 복잡 한 후속 분석 방법의 올바른 해석.
깨끗 한 고분자에 시드 셀 표시 가난한 첨부 및 휴대 confluent 단층 동안 동작 (그림 8A1 와 C1)를 확산 플라즈마 처리 표면 (8B1 그림 및 D1)에 경작 하는 셀에 대 한 관찰 . 세포질 집계 및 표면에서 분리의 형성 더 깨끗 한 표면에 발음 했다. 말라 필 라 멘 트 4 %paraformaldehyde 고정 밝혀 몇 세포는 세포의 주변 및 초기 PDMS와 특수 50: 50 복합 필름 (그림 8A2 lamellipodia 돌출의 발산 물으로 마이그레이션의 시각화 및 C2, 화살표)입니다. 주요 질적 차이가 두 고분자 재료를 비교 하는 동안 관찰 될 수 있었다. 사이드 메모로 서, 그것은 나타나는 적은 양의 세포 집계 PDMS에 비해 특수 50: 50에 참석 했다. 또한, 특수 50: 50에 표면에 부착 된 집계 더 평평 (그림 8C 1) 등장. 예상 했던 대로, 세포 부착 및 크게 두 표면에 확산, 놀라운 lamellipodia 돌출 고 (8B를 그림2와 8D 2) confluent 단층의 형성에 지도 공기 플라즈마 치료 개선.
문화의 3 일 후 LDH의 릴리스 세포 독성 효과 (그림 9A)를 확인 하려면 표시기로 사용 되었다. 일반적으로, LDH 수준 5% 미만으로 두 고분자 재료에 배양 세포에 대 한 비교 했다 세포 독성 (초기 PDMS: 2.8 ± 2.0%, 원시 특수 50: 50: 4.5 ± 3.6%; 플라즈마 치료 PDMS: 3.4 ± 1.5%, 플라즈마 처리 특수 50: 50: 3.4 ± 1.6%). 이 결과 두 탄성 체의 조사에 초점을 맞추고 우리의 이전 게시 된 연구 데이터를 비교할 수 있습니다. 8 더 LDH 시험의 결과 확인을 trypan 블루 제외 테스트 수행 되었다. 또한, 전체 세포 인구 확산 활동 (그림 9B) 차이점을 표시 하도록 결정 했다. 일반적으로 5% 미만 Trypan 블루 긍정적인 셀 계산 했다 (초기 PDMS: 2.4 ± 0.3%, 원시 특수 50: 50: 3.8 ± 2.5%; 플라즈마 치료 PDMS: 0.74 ± 1.3% 플라즈마 치료 특수 50: 50: 0.95 ± 1.6%).
그림 1: 폴 리-(vinyl alcohol) (PVA)에 PDMS 영화의 준비 애완 동물 호 일 코팅: PDMS 영화 애완 동물 호 일에 다양 한 두께와 제조 과정 재현성 및 처리 성능 (A) 결정에 적용 했다. PDMS 필름의 두께 95 ° C (B)에서 치료 후 광학 현미경으로 분석 되었다. N = 3 독립적으로 제조 된 영화 분석 했다. 각 영화에서 3 개의 다른 위치 선택, 잘라내기 및 각 샘플에 3 위치 분석 했다 (k = 27). 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 준비의 다른 혼합 비율에 준비 된 PDMS의 복합 필름: PDMS의 crosslinker (구성 요소 B)를 베이스 (구성 요소 A)의 다른 혼합 비율을 전시 하는 복합 필름 의사 블레이드 기술에 의해 제조 되었다. PDMS의 비율은 10:1 (A:B 구성 요소)로 구성 된 상위 계층, 45:1 및 70:1 이전 치료 PDMS 10:1 필름 (A) 위에 적용 했다. 95 ° C에서 후속 치료 후 복합 필름의 두께 광학 현미경 (B) 및 스캐닝 전자 현미경 검사 법 (C)에 의해 분석 되었다. N = 3 독립적인 실험 수행 되었고 광학 현미경 (D)와 분석. 각 독립적인 제조 막을 형성, 3 개의 다른 위치 선택, 잘라내기 및 각 샘플에 3 위치 분석 했다 (k = 27). 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 접착 력 측정을 위해 사용 하는 두 기판의 지형 표면 거칠기의 측정: 다른 표면 거칠기 보유 하는 두 개의 유리 기판 특징 이었다. 표면의 3 차원 profilometric 분석은 '부드러운' 기판 GS (A1)와 '거친' 기판 GR (B1)에서 수행 되었다. 해당 단일 라인 곡선 묘사 된다 a 2와 B2에서). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 일반 접착 력 측정의 원리: 사용자 지정 빌드 설정 접착 속성 폴리머 샘플의 특성 사용 되었다. 측정 설치 (A)에 표시 하 고 세부 정보 (B)에 표시 됩니다. 측정 분석에 대 한 스트레스 스트레스 시간 곡선 (C)에서 결정 했다. 분리의 작품의끝 과 s0 (D) 사이의 응력-변위 곡선의 통합에 의해 결정 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: PDMS의 다른 혼합 비율의 복합 필름 접착 속성의 결정: 스트레스 풀 오프 (A) 및 PDMS의 혼합 비율 10:1, 45:1 및 70:1에서 제조 하는 복합 영화의 분리 (B)의 측정 되었다. 분석을 위해 '부드러운' 유리 기판 (GS)는 Ra 전시 = 0.013 µ m 및 R로는 '거친' 유리 기판 (GR) = 0.338 µ m 사용 되었다. N = 3 독립적으로 제조 된 영화 분석 했다. 각 영화에서 두 가지 선택 하 고 각 샘플에는 세 가지 다른 위치 분석 했다 (k = 18). 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 다양 한 두께 특수 복합 영화의 준비: SSA 50: 50 이전 치료 PDMS 10:1 필름 (A) 위에 적용 했다. 다른 40에서 500 µ m에 이르는이 계층의 젖은 두께 적용 했다와 치료 후 두께 (B) 광학 현미경으로 조사. 손 표시 영화 약 100 µ m (영화 #2)의 총 두께 가진 피부 (C)의 조도를 잘 맞 췄 나 자원 봉사자의 뒷면에는 영화의 첨부 합니다. 단일 레이어의 두께 및 복합 필름의 총 두께 그림 6B에 나와 있습니다. 분석 n = 3 독립적으로 제조 된 샘플은 광학 현미경으로 측정 되었다. 각 영화에서 3 개의 다른 위치 선택, 잘라내기 및 각 샘플에 3 위치 분석 했다 (k = 27). 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 6 C에서 눈금 막대 묘사 약 1 cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: 부드러운 피부 접착제의 복합 필름의 접착 속성의 결정: 복합 박막 SSA의 상위 계층 및 PDMS 지원 계층으로 10: 1로 제조 되었다. 상위 레이어 두께 50 330 µ m. 풀 오프 스트레스 (A) 사이의 다양 했다 및 복합 영화 두 다른 유리 기판 측정의 분리 (B)의 작품 분석 했다 (R전시 '부드러운' 유리 기판 (GS)는 = 0.013 µ m 및 R로는 '거친' 유리 기판 (GR) = 0.338 µ m). 분리 메커니즘의 모범적인 그림 C에서 시각화 됩니다. 데이터 분석 n = 3 독립적으로 제조 된 실험 분석 했다. 각 영화에서 두 가지 선택 하 고 각 샘플에는 세 가지 다른 위치 분석 했다 (k = 18). 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 7 c에서 스케일 바 묘사 0.5 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8: 박막에 교양 L929 섬유 아 세포의 세포질 형태학: L929 murine fibroblasts PDMS (A1, A2, B1, B2) 또는 특수 (C1, C2, D1, D2)에서 제조 하는 얇은 필름에 3 일 동안 배양 되었다. 화란의 공기 플라즈마 처리 된 표면 증가 (B1, B2, D1, D2)를 수행 합니다. 스케일 바 d 1과 d 2에 묘사 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 9: 세포 독성 및 세포 확산의 결정: 세포 독성 효과 세포 확산의 결정에 대 한 PDMS 10: 1과 특수 50: 50 복합 필름에 3 일 동안 L929 세포 시드 했다. 젖 산 효소 (LDH)의 릴리스 LDH 활동 분석 결과 의해 결정 되었다 고 밝혀 5% 미만 세포 독성 (A). 재배 기간 후 총 휴대폰 번호 수동 Neubauer 챔버 (B) 단일 셀 계산 후 평가 했다. N = 3 실험을 독립적으로 수행 분석 했다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
복합 구조의 디자인에는 물질의 성질, 탄성 계수 또는 샘플의 두께 등의 간단한 조정 수 있습니다. PDMS의 영의 계수는 두 구성 요소 간의 혼합 비율을 변경 하거나 다른 실리콘 탄성 중합체30,31를 사용 하 여 혼합 제조 하 여 넓은 범위에서 효과적으로 바뀔 수 있다. 설명된 방법에 국한 되지 않습니다 PDMS의 현재 조사에 사용 하지만 특히 접착 성능 강하게 사용 특정 유형에 따라 다릅니다. 이 프로토콜 내에서 중요 한 단계는 복합 필름 (그림 1)의 제조 과정입니다. 그것은 그 두께 영화의 동작에 영향을 크게 접착 피부 (그림 5 및 그림 6)를 포함 하 여 다른 기판에 영화의 표시 했다. 필름 두께 뿐만 아니라 시간과 치료 과정 동안 온도 물성32을 영향을 줍니다. 따라서, 고분자 층의 두께 매개 변수 신중 하 게 적응 하 고 확인 해야 합니다.
박막의 접착 속성의 분석 직력 접착 측정 다른 표면 거칠기 Ra 최대 두 개의 유리 기판 사용 하 여 수행한 = 0.338 µ m (그림 3). 일반적으로, 거칠기에 미치는 영향 크게 표면, 특히 탄성 재료33,34의 접착. 유리의 거칠기 다른 asperity 크기, 따라서 수 있도록 높은 거칠기 값21전시 기판의 제조의 샌드 페이퍼로 연마 하 여 쉽게 변화 될 수 있다. 또한, 기타 자료, 예를 들어 에폭시 수 지 사용할 수 있습니다 기판15,35의 생산을 위해. 이 제시 프로토콜의 중요 한 수정 전략을 수 있습니다. 예를 들어 서로 다른 표면 자유 에너지를 전시 하는 기판은 필요한 또는 특정 topographies 있다면 필요. 여기, 풀에서 스트레스와 PDMS와 특수 제조 된 박막의 분리의 작품 사용자 설정 (거시적인 접착 력 측정 장치 (매드, 그림 4))으로 분석 되었다. 36 기판의 indenter 광학 정렬 측정 결과의 분석을 위한 중요 한 단계입니다. 따라서, 기울기 각도의 조정 가능한 정확한 각도 사용 하 여 수행 해야 합니다. 이 여 수동으로 필름 표면 접촉 기판 수평 접촉 달성 될 때까지 충분 한 정밀도를 얻을 수 있습니다.
현재 프로토콜에서 지속 시간 1 초 (그림 5 및 그림 7)에서 일정 유지 되었다. 거친 기판 표면에 탄력 있는 영화의 접착 성능 조사를 위해 특히 보류 시간 확장 추가 정보를 제공합니다. 예를 들어 보류 시간 증가 함께 풀 오프 스트레스 증가 보고8되었습니다. 현재 프로토콜을 다른 방법에서 수행 하는 측정 이외에 예 필 테스트 수 수행할 수, 접착 성능37의 포괄적인 조사를 허용.
복합 필름 다른 필름 소프트 스킨 접착제의 두께 결정 되었다 전시 (그림 7)의 접착 속성. 우리의 결과 게시 된 데이터, 그는 감 금, 즉, 기판 직경 및 필름 두께, 증가38,39 사이의 비율 풀에서 스트레스의 증가를 필름 두께의 감소를 보여주는 라인 . 이러한 결과 그림 7에 표시 된 데이터를 바탕으로, 우리는 결론을 약 100 µ m (약 40 μ m의 두께 가진 PDMS 영화에 적용 약 60 µ m의 특수 층의 두께)의 총 두께 가진 복합 영화 유리한 접착 p 전시 거친 표면에 roperties입니다.
다음, 깨끗 한 복합 영화에 생물 학적 특성에 관련 된 실험 수행 되었습니다 그리고 플라즈마 치료 복합 필름 (그림 8). 실리콘 탄성 체의 플라즈마 처리 표면 및 세포 부착 및 휴대40,41확산의 친수성 특성을 증가 하는 자주 적용, 다양 한 기법입니다. 실리콘 그들의 낮은 독성과 높은 biostability에 대 한 유명 하지만 잔여 단위체 또는 세포 독성42,43에 또한 지도 하는 생리 적 프로세스에 영향을 줄 수 있는 촉매를 포함 될 수 있습니다. 에 우리가 관찰 실시 실험 보다 5% 세포 독성 LDH 릴리스 표시기 및 Trypan 블루 제외 분석 결과 사용 하 여. 제시 프로토콜, 전체 세포 인구 세포 집계를 포함 한 표면 확산 분석 (그림 9B) 위해 분석 된 형태로 분리. 프로토콜의 보다 차별화 된 결과 생산할 수 있는. 각 샘플에 대 한 상쾌한 분리 된 세포 집계를 포함 하는 별도 반응 관에 전송 고 효소 폴리머 표면에서 제거 하는 세포와 결합 되지 않이 될 수 있습니다. 이 세포 표면에 부착 된의 정확한 평가 허용 하 고 결국 세포 접착 과정에는 폴리머의 영향의 더 상세한 결정을 공개 것입니다. 여기에 제시 된 immunocytochemical 방법, 이외에 셀 immunoblot 방법, 단백질 식의 구체적인된 양적 평가 수 있도록 조사에 대 한 수확 수 있습니다.
요약, 우리는 탄성 복합 박막 고급 셀 문화 연구에 응용 프로그램에 대 한 생산 제조 조건 확립. 또한, 이러한 박막 거칠음, 피부 접착제의 정교한 디자인을 사용 하면 피부에 높은 적응성을 소유한 다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
마틴 Danner 샘플 및 세포 문화 절차의 설립 준비에 그의 원조에 대 한 인정 이다. 저자는 베른하르트 Spezialchemie GmbH (함부르크, 독일), 지속적인 지원 및 토론에 대 한 특히 로버트 Radsziwill에 게 감사 하 고 싶습니다. 이러한 결과 연구는 유럽 연합의 7 차 프레임 워크 프로그램 (FP/2007-2013) ERC 부여 계약 n. 340929 아래 유럽 연구 위원회에서 자금을 받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol, 97% | Stockmeier Chemie | 1000452610000 | Isopropanol |
| Abrasive diamnod hand pad | Bohle | MO 5007522 | Grit: 220 |
| Accutase | Capricorn Scientific | ACC-1B | |
| Albumin Fraktion V | Roth | 0163.2 | BSA |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | ThermoFischer Scientific | A12379 | highly toxic |
| Aquamount | Polysciences | 18606-20 | water soluble mounting medium |
| CytoTox-ONE Homogeneous Membrane Integrity Assay | Promega | G7890 | |
| DPBS, without Ca2+, Mg2+ | ThermoFischer Scientific | 14190094 | |
| Fetal bovine serum gold | GE Health Care Life Science | A15-151 | FBS |
| Goniometer OCA35 | Dataphysics | for the determination of the static water contact angle | |
| Hoechst Dye 33342 | Sigma-Aldrich | B1155-100MG | bisBenzimide H 33342 trihydrochloride, highly toxic |
| Microscope Axiovert 25 | Zeiss | Microscope used for cell culture documentation | |
| Microscope Eclipse LV100ND | Nikon | Microscope used for film thickness determination | |
| Paraformaldehyde, aqueous solution 16% | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | electron microscopy grade |
| penicillin und streptomycin solution | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Phenom XL Scanning Electron Microscope (SEM) | Phenom | ||
| Poly-(vinyl alcohol) 4-88, MW 31000 | Sigma-Aldrich | 81381-1KG | Mowiol 4-88 |
| Poly-dimethyl siloxanes, Sylgard 184 | Dow Corning | (400)000108351397 | PDMS |
| RPMI 1640 basal medium | ThermoFischer Scientific | 21875034 | |
| soft skin adhesive (SSA) | Dow Corning | (400)000108251792 | MG 7-9800 Soft Skin Adhesive (SSA) |
| speed mixer DAC 600.2 VAC-P | Hauschild | ||
| stylus profilomter | Zeiss | Model: SURFCOM 1500SD3 | |
| Tecan Infinite M200 pro | Tecan | fluorescence plate reader | |
| Triton X 100 | Calbiochem | 648466 | |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | highly toxic |
| Trypsin/EDTA solution | PAN-Biotech | P10-023500 | 0.05% Trypsin, 0.02% EDTA in PBS |
| UV glue | Bohle | BO MV76002 | medium viscosity |
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