Summary
Burada, köklerinin genç farelerin kültürlü yumurtalık içinde seri kesit olmadan ölçmek için bir protokol mevcut. Ayirt bütün organ ve doku takas kullanarak, fiziksel kesit optik kesit ile değiştirilir. Bu yöntem örnek hazırlama ve görselleştirme organ bütünlüğü korur ve belirli hücre otomatik miktar kolaylaştırır.
Abstract
Memeli üreme biyolojisi alanında araştırma sık sık yumurtalıklar ve testis genel sağlık değerlendirme içerir. Özellikle, kadın, yumurtalık fitness kez görselleştirme ve köklerinin ve yumurta miktarının değerlendirilir. Çünkü yumurtalık opak bir üç boyutlu dokusu, geleneksel yaklaşımlar zahmetle doku hücreleri tüm organ boyunca görselleştirmek için çok sayıda seri bölümlere Dilimleme gerektirir. Ayrıca, miktar tarafından bu yöntem genellikle yalnızca bir alt kümesini bir oosit yaklaşık çapı tarafından ayrılan bölümler puanlama gerektirir çünkü yanlışlık için eğilimli olduğunu. Burada, bir iletişim kuralı yerine tüm organ doku takas ve köklerinin ve yumurta görselleştirmek için fare yumurtalık ayirt boyama kullanan açıklanmıştır. Daha geleneksel yaklaşımlar, bu iletişim kuralını yumurtalık hücrelerde çok sayıda nedenlerle görselleştirme için avantajlı karşılaştırılır: 1) yumurtalık numune hazırlama ve işleme; bozulmadan kalır 2) bölüm için zor olan küçük yumurtalıkların, kolaylıkla incelenebilir; 3) hücresel miktar daha kolay ve doğru bir şekilde elde edilir; ve 4) yansıma tüm organ.
Introduction
Hücresel kompozisyon ve memeli yumurtalık morfolojik özelliklerinin çalışması için bilim adamları çoğunlukla parafin gömülü yumurtalık immunohistological boyama tarafından takip vivo deneyler kullanır. Son zamanlarda tüm yumurtalık organı kültür tekniği daha iyi görselleştirme ile birleştiğinde olabilir çünkü yumurtalık işlev1,2,3,4 çalışma için etkili bir alternatif olduğu ispatlanmıştır rağmen daha fazla ve miktar araçları. Geleneksel olarak, yeniden inşa üç boyutlu yumurtalık mimari gömülü parafin seri bölümlerden ama zahmetli ve zaman tüketmek, seri olarak gömülü parafin doku kesit olmanın yanı sıra yumurtalık Morfoloji analizi bağlıdır değil garanti uygun yeniden yapılanma organ yapar ve bölümler kez kaybolan veya süreç içinde yanlış emretti.
Teknik sorunlar seri kesit ile ilişkili ek olarak, ayrıca düzenli olarak yumurtalık5,6başına folikül numara ölçmek için kullanılan yöntemleri değişimler vardır. Şu anda kullanılan metodolojik değişkenlik meta-analiz yumurtalık rezervinin çalışmaları5,7bozar. Örneğin, farklı araştırma makaleleri folikül numaralardan 10 kat veya daha fazla belirli zorlanma6içinde benzer gelişimsel yaş arası değişebilir. Bu büyük farklılıklar bildirilen folikül miktar karışıklığa yol açabilecek ve çapraz-çalışma karşılaştırmalar engel. Deneysel, folikül miktar geleneksel yaklaşımlar seri bölümlerden bölümleri önceden tanımlanmış bir dizi köklerinin sayarak gerçekleştirilir (Örneğin, her beşinci, onuncu, veya diğer bölüm). Bu yaklaşımı kullanarak folikül sayıları değişkenlik değil sadece hangi bölümlerin sayılır içinde periyodik olarak aynı zamanda varyasyonlarından bölüm kalınlığı ve seri bölümler5,6üreten teknik deneyim ortaya çıkar. Onun değişkenliği ek olarak, geleneksel doku kesit başka bir dezavantaj genç hayvanlardan küçük yumurtalıkların kesit özellikle zorlu ve doku yönlendirme8son derece bağımlı olmasıdır.
İletişim kuralı aşağıdaki rutin olarak kullanılan yumurtalık kültür tekniği1 açıklanır ama fiziksel takas doku ile kesit ve optik confocal mikroskopi8 kullanarak kesit yerine kullanarak geleneksel folikül miktar geliştirir ,9. Bir üre ve sorbitol-tabanlı içinde doku daldırma (ezelî belgili tanımlık lüzum için Transkraniyal perfüzyon veya Elektroforez) kullanarak Temizleme (Örneğin, ScaleS(0)10) çözüm immunostaining ile uyumlu olduğunu kanıtladı ve azaltılması için izin zaman görüntüleme derinliğini ödün vermeden temizlemek. Diğer bildirilen yolu (örneğin, ScaleA28,10, SeeDB11, berrak12ve ClearT212) ya daha fazla zaman alıcı veya derinlemesine optik çözünürlük örnek izin vermez. O daha az emek yoğun olması ve organ'ın üç boyutlu mimari7,8tutar optik kesit avantajlıdır. Örnekleri hazırlanması doku temizlemek için pahalı reaktifler gerektirmez ve göreli kolaylıkla yapılabilir Bu yaklaşımın başka bir şeydir.
Özellikle, açıklanan protokol kültürlü fare yumurtalık için doğum sonrası gün beş optimize edilmiş ama doğum sonrası gün 0 - 10 arasında değişen yumurtalıklarda gerçekleştirilmiştir. Yöntem doku doğal olarak membran üzerinde bu kültürlü, organ işleme ve işleme kolaylaştırmak için verdiği bir yumurtalık kültür sistemi kullanır. Açıklanan kültür sistemi 10 güne kadar ve ne kadar farklı deneysel koşullar değerlendirmek için explanted yumurtalıkların yumurta hayatta kalma13ile girişime neden olabilir korumak için kullanılabilir. Açıklanan miktar yordam ticari olmayan görüntü işleme paket FIJI-ImageJ14 kullanılarak gerçekleştirilir ve çoğu kişisel bilgisayarda yapılabilir. Ayrıca, miktar için kullanılan görüntüleri böylece gelecek meta-analiz için izin bilimsel topluluk için yaygın olarak kullanılabilir duruma getirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Cornell Üniversitesi'nin kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) burada, JCS iletişim kuralına 2004-0038 altında açıklanan tüm yöntemleri onayladı.
1. hazırlanması kültür ortam ve aygıtlar
- Çalışma alanı % 10 çamaşır suyu ile temiz ve en az 5 min için çalışma alanı yüzeyinde kalır çamaşır suyu izin silin. 5 dk sonra fazla çamaşır suyu temiz kağıt havlu ve % 70 etanol (alkol) ile kaldırın. % 70 ile iyice diseksiyon mikroskop temiz alkol.
Not: Bu çalışma alanının en az yarı steril organ kültürlerin kirlenmesini önlemek için önemlidir. - Şal temiz forseps ve makas % 70 ile nemlendirilmiş bir kağıt havlu ile alkol kullanım zaman kadar.
Not: İdeal diseksiyon araçları yumurtalık yaş/boyutuna göre değişebilir. En iyi sonuçları bir mikro keskin diseksiyon makas, iki iyi ipucu forseps (ya sayı 5 veya 55) kullanarak elde edilir ve bir mikro Iris makas anatomi. - Konik bir tüp içinde 50 mL yumurtalık kültür medya ve sıcak bir 37 ° C su banyosu içinde olun.
- Yumurtalık kültür orta4yapmak için en az temel medya (MEM) ile %10 Fetal sığır Serum (FBS), 25 mM (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic asit (HEPES), 100 adet/mL penisilin, 100 µg/mL streptomisin, 0,25 µg/mL x 1 ek Amfoterisin B (Örneğin, MEM, 45 mL 5 mL ısı de inaktive FBS, HEPES 1,25 mL ve penisilin, streptomisin ve Amfoterisin B 100 x stokunun 0.5 mL).
- Kaplamalar ve ekler yumurtalık kültür önce hazırlayın.
- Bir doku kültürü başlık, bir 35 mm doku kültürü plakasına yumurtalık kültür orta 1 mL ekleyin.
- INSERT membran kültür orta ile önceden ıslatın. Genellikle 0.55 mL başına, 24 iyi taşıyıcı doku kültürü levha ve yer bir hücre kültürü eklemek kuyuda yeterli miktarda ortam ekleyin. Medya Ekle'nın membran dokunur emin olun.
- 35 mm plakalar ve wells ile hücre kültür ekler yumurtalık deneyinde beklenen sayısına göre hazırlayın. Kültür medya ve kültür medya ve 37 ° C, % 5 CO2ve atmosferik O2 kuluçka ekler içeren 24-iyi taşıyıcı plaka 1 mL içeren 35 mm tabak koyun.
- Sıcak bir tabak diseksiyon kapsamın yanındaki düzenlemek ve 37 ° c sıcaklık ayarla Bir 37 ° C, % 5 CO2 tutun ve atmosferik O2 kuluçka diseksiyon oda yakın.
2. yumurtalık diseksiyon ve Organ kültür
Not: Sigara-ideal sıcaklık maruz en az olduğu sürece yumurtalık oda sıcaklığında disseke.
- Doğum sonrası gündüzleri 5, işten çıkarma, teker teker, dişi fareler ötenazi.
Not: Ötenazi araştırma gerçekleştirildiği tesiste mevcut IACUC kurallarına göre yapılmalıdır. - Hayvan % 70 ile sprey alkol. Hayvan diseksiyon mikroskop altında kuru kağıt havlu üzerine yerleştirin. Yumurtalık kültür ortamı diseksiyon mikroskop yakın içeren bir 35 mm doku kültürü tabak yerleştirin.
- Forseps veya mikro diseksiyon Iris makas ile bağırsak kesmemeye dikkat kullanarak bir kesik deri yoluyla hayvan ve karın boşluğu içine olun. Bağırsak karın boşluğu dışarı itmek ve yumurtalıklar bulun. Yumurtalık ayıklamak ve kültür ortamı içeren 35-mm doku kültürü çanak içine koyun.
- Sonra yumurtalık hayvandan disseke, yumurtalıklar ve ekli herhangi bir doku daha iyi görmek için diseksiyon mikroskop büyütme artırın. İle iyi ipucu forseps temiz, tüm olmayan yumurtalık dokusu, bursa ve yağ dokusu gibi kaldırın. Yumurtalık ne zaman ekli olmayan yumurtalık dokusunu korumak için dikkatli olun.
- Yumurtalık izole olduğunda, çift taşıyıcı 24-şey plaka öncesi hücre kültür ekler yerleştirin (Adım 1.4.2 ve 1.4.3 bakın) ve organ nemli tutmak için yeterli olduğundan emin olmak için orta ses seviyesini (olmadan tamamen Bu batış).
Dikkat: hücre kültürü Ekle membran bir delik yumurtalık aktarırken poke değil dikkatli olun. - Yer organları 37 ° C, % 5 CO2ve atmosferik O2 kuluçka explanted.
- 2.1-2.6 her hayvan yumurtalık disseke kadar hücre kültürü üzerinde yerleştirilen yumurtalık kültür ortamı içeren 24-şey Montaj levhası adımları yineleyin.
- Değişiklik yumurtalık kültür orta 2 günde kullanarak Over medya aliquots 37 ° C su banyosundan ısıttı ve Bölüm 3 istenen deneysel zamanda noktada protokolünün geçin.
3. doku fiksasyon
- %4 paraformaldehyde (PFA) 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x 15 mL konik tüp hazırlayın (Örneğin, Ekle % 16 PFA elektron mikroskobu grade 2 mL 1 x PBS için 6 mL).
Dikkat: PFA tehlikeli bir maddedir ve kimyasal bir başlık altında ele alınmalıdır. - Kültürlü yumurtalık dokusu ile taze hazırlanmış % 4 İngiltere'de yılın çözüm kapsayan tarafından gelen Kültür Ekle, doku çıkarmadan düzeltmek. (Buharlaşma) önlemek için plastik yapıştırıcı ile plaka kenarlarını kapatın ve örnekleri gecede 4 ° C'de yer.
Not: kullanım ve doku bütünlüğü kolaylaştırmak amacıyla, yumurtalıklar üzerinden hücre kültür Ekle bütün prosedür boyunca yerinden kaçının. Kültürlü yumurtalık ekleme yüzeye bağlı işleme için avantajlı zarar veya organ kaybetme olmadan. - 3 doku durulama x % 70 ile alkol ve ya 4.1 veya mağaza içinde mercek şişeleri dolu ile adım geçin % 70 alkol kadar 4 ° C'de daha fazla işleme.
Not: Eğer doku endogenously kullanarak floresan protein, % 70 örnekleriyle depolama ifade alkol büyük ölçüde sinyali azaltabilir. Alternatif olarak, doku durulanır ve PBS ile % 0,2 sodyum azid (NaN3) saklanır. NaN3 olduğunu, ancak, çok zehirli ve ciddi solunum yolu tehlike teşkil etmektedir. Hisse senedi çözüm duman mahallede olun ve uygun kişisel koruyucu ekipman gibi bir laboratuvar mont ve nitril eldiven giyiyor kolu.
4. bütün Dağı ayirt
- 4 h permeabilization adım 4.3 önce en az 1 x PBS RT, sabit doku yerleştirin.
- Permeabilization çözüm ve engelleme çözüm hazırlamak.
- Permeabilization çözüm açıklandığı şekilde hazırlayın. 1 x PBS için % 0,2 polivinil alkol (PVA), % 0,1 sodyum borhidrür (NaBH4) çözümden (14 M sodyum hidroksit (NaOH) çözüm içinde 12 wt.%) ve % 1.5 polietilen glikol tert -octylphenyl eter (iyonik olmayan yüzey aktif deterjan) ekleyin. 50 mL konik tüp 10 PBS x 5 mL, PVA, NaBH450 µL ve iyonik olmayan yüzey aktif deterjan 750 µL 0.1 g ekleyin, sonra ultrasaf ekleyin ilâ 50 mL su ve karışım tamamen çözümünde olana de oda sıcaklığında kışkırtmak.
- Engelleme çözüm açıklandığı şekilde hazırlayın. 1 x PBS, % 0,1 iyonik olmayan yüzey aktif deterjan, %0,15 2.5 M glisin pH 7.4 eklemek için % 10 normal keçi serum, % 3 sığır serum albumin (BSA), %0,2 NaN3, 100 adet/mL penisilin, 100 µg/mL streptomisin ve 0,25 µg/mL Amfoterisin B. stok çözeltisi hazırlamak 2.5 glisin ultrasaf su için bir 500 mL son hacim (pH 7,4) 93.8 g ve % 10 NaN3 hisse senedi bir çözüm ultrasaf su 50 ml 5 g çözülerek eriterek tarafından M glisin; sonra bir 50 mL konik tüp içinde 10 x PBS, 50 µL iyonik olmayan yüzey aktif deterjan, 750 µL glisin hisse senedi çözüm, keçi serum, BSA, 1.5 g NaN3 hisse senedi çözüm 1 mL 5 mL 5 mL ekleyerek engelleme çözüm hazırlamak ve penisilin, streptomisin ve Amfoterisin B 100 x stokunun 0.5 mL. 50 mL ve şırınga filtre son hacmi kadar ultrasaf su nihai çözüm ekleyin.
- Kaldırın ve 1 x PBS şişeyi üzerinden atmak ve sonra yumurtalık tamamen batırmak için yeterli permeabilization çözüm ekleyin. Örnek permeabilization çözüm üzerinde bir orbital Çalkalayıcı (Örneğin, nutator) oda sıcaklığında 4 h için yerleştirin.
Not: Kuluçka zaman organ kalınlığı göre değişebilir. - Permeabilization çözüm yumurtalıklar tamamen batırmak için yeterli engelleme bir çözüm ile değiştirin. Şişe plastik yapıştırıcı ile kapatın ve en az 12 h bir orbital Çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında kuluçka doku bırakın.
- Başı olarak üreticinin veri sayfası engelleme çözümde birincil antikor seyreltme hazırlayın.
: Not tüm antikorlar Temizleme Aracı ile uyumludur. Örnek gerekli ortalama hacmi yaklaşık 750 µL var.- Oosit miktar için TAp63 kullanın (nükleer oosit marker) ve MVH (sitoplazmik germ hücre işaretçisi).
Not: fare anti-p63 ve tavşan anti-MVH ayirt Albümdeki kullanılan antikor vardır). Birincil antikor eriyik-ebilmek var olmak yeniden kullanılan 2 x veya 4 ° C'de Protokoller boyama arasında saklanan ve bakteriyel büyüme önlemek için uygun şekilde yönetilmesini daha fazla.
- Oosit miktar için TAp63 kullanın (nükleer oosit marker) ve MVH (sitoplazmik germ hücre işaretçisi).
- 24-şey plaka dokusunda içeren INSERT yerleştirin ve yaklaşık 750 µL birincil antikor çözüm ekleyin. Yumurtalık tamamen batık emin olun. Buharlaşma en aza indirmek ve orbital Çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 4 gün için kuluçka doku bırakmak için plastik yapıştırıcı ile plaka mühür.
- Yıkama çözüm hazırlamak.
- Yıkama çözüm açıklandığı şekilde hazırlayın. 1 x PBS, olun % 0,2 PVA ve % 0.15 iyonik olmayan yüzey aktif deterjan ekleyin. 50 mL konik tüp 10 PBS x 5 mL, PVA 0.1 g, 75 µL iyonik olmayan yüzey aktif deterjan ve son hacmi 50 mL kadar ultrasaf su ekleyin.
- Birincil antikor seyreltme kaldırın ve yıkama çözüm bol miktarda ekleyin. Her zaman yumurtalık daldırın emin olun. Yumurtalık orbital Çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında gecede çözümde emmek izin.
- Yıkama çözüm yerini ve orbital Çalkalayıcı 2 saat veya daha fazla üzerinde kuluçkaya.
- 4,9 adımı yineleyin bir ek süre.
- Çözüm kapatmaktır ikincil antikor seyreltme hazırlayın.
Not: kullanılan ikincil antikorlar keçi ve keçi kaldırdı Anti-tavşan 594 floresan boya büyüdü Anti-fare 488 floresan boya vardır. Adım 4.5 bakın. ortalama birim için örnek gerekli. - Yıkama çözüm yumurtalıklar kaldırın ve ikincil antikor çözüm ekleyin. Işık (alüminyum folyo ile sarma plaka) örnekleri korumak ve buharlaşma en aza indirmek için plastik yapıştırıcı ile plaka mühür. Oda sıcaklığında bir orbital Çalkalayıcı örnekleri için 2 gün kuluçkaya.
Not: Alüminyum folyo sırasında tüm sonraki kuluçka adımları kullanarak ışık örnekleri korunmaya devam. - İkincil antikor çözüm örnekleri kaldırın ve yıkama çözüm ekleyin. Orbital Çalkalayıcı 8 h için üzerinde kuluçkaya.
Not: 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) Boyama isterseniz, DAPI 50 ng/mL yıkama için ilk adım (~ 8 h kuluçka) ekleyin. - Bir gecede yıkama yıkama çözüm değiştirin.
- Hazırlanırken takas çözüm (bakınız Bölüm 5), çözüm ile taze çözüm yıkama gecede değiştirin ve orbital Çalkalayıcı üzerinde örnekleri oda sıcaklığında tutmak.
5. yumurtalık temizlenmesi ve görüntüleme
- ScaleS(0) çözüm temizleyerek hazırlayın.
- Belirli oranda ayıraçlar ekleyerek çözüm10 takas ScaleS(0) hazırlamak: % 40 D-(-) sorbitol (w/v), % 10 gliserol, 4,3 M üre ve % 20 Dimetil sülfoksit (DMSO), pH 8.1 (örneğin bir 50 mL konik tüp 2.5 mL gliserol sorbitol 10 g ekleyin , DMSO 5 mL ve 9 M üre için 25 mL toplam hacmi 12 mL. İnversiyon için 30 dk 50 ° C'de tarafından çözüm mix ve kullanımdan önce degas.)
- Çamaşır çözümü kaldırmak ve çözüm Temizleme örnekleri daldırın. Daha iyi sonuçlar için orbital Çalkalayıcı örnekleri korumak.
- Takas çözüm 2 yerine doku şeffaf (yaklaşık 2 gün) hale gelinceye kadar her gün x.
- Doku temizlenir sonra örnek bir para cezası ile kültürlü yumurtalık içeren INSERT membran dikkatlice kaldırarak görüntüleme için hazırlamak ipucu neşter ve örnek bir cam slayt üzerinde yerleştirerek.
- Mikroskop optik kesit yetenekli üzerinde örnekleri Imaging'e devam edin.
6. oosit miktar
Not: Hücreleri ölçmek mümkün birçok farklı bilgisayar programları vardır. Aşağıda açıklanan kullanarak ticari olmayan görüntü işleme paketi, FIJI-ImageJ14yumurta miktar için bir protokoldür.
- Z -yığın görüntü serisi bir düzleştirilmiş maksimum yoğunluk projeksiyon (olmadan DAPI kanal) ilgi belirli hücresel işaretleri kullanarak, görüntüyü bir siyah beyaz görüntü açılan 8-bit görüntü türü ' nün altında dönüştürün. menü.
- Görüntü damla-aşağı yemek listesi altında ayarla sekmesini vurgulamak ve Eşikseçin.
- El ile tek tek her yumurta en iyi tanımlayan bir düzeye eşik ayarlayın. Düzeyi belirlendikten sonra siyah ve beyaz bir görüntü oluşturmak için Uygula ' yı tıklatın. Bir kez tam, örnek belirlenmesinde Oval veya Freehand simgesini kullanarak ölçmek.
Not: FIJI-ImageJ ince ayar parçacık miktar için kullanılacak görüntü için farklı seçenekler vardır. Örneğin, süreci içinde | İkili sekmesinde, ne sayılır algılama geliştirmek için kullanılabilecek farklı seçenekler vardır. Şekil 4' te, daha iyi köklerinin kişiselleştirmek için kullanılan seçenekleri Erode boşluğu doldurman gerekve dönüm noktasıson olarak takip, yapıldı. - Analiz açılır menüsünün altında analizseçen. Parametrelere göre istenen çözünürlüğü ayarla.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu iletişim kuralı 6 önemli adımları içerir diseksiyon yumurtalıklar, şekil 1' de özetlenen takip. Resim 2 , Şekil 3 , Şekil 4 optimizasyonu yumurtalıklar ve FIJI-ImageJ kullanarak tüm doku oosit miktar için Temizleme doku dahil en yeni şekil-in bu protokolü. Şekil 2A (sağ) ekleyerek takas çözüm yumurtalık için sonra bir kültürsüz 5 günlük doğum sonrası sabit yumurtalık önce (sol) ve 1 h görüntüleri gösterir. Yumurtalık çözüm takas sular altında dakika şeffaf olmaya başlayacak. Bir kez temizlenmiş, şekil 2A görüntüsü bir gibi küçük yumurtalıkların zarar vermeden işlemek zor olur. Bu nedenle, kültürlü explanted yumurtalık ile çalışma çünkü onlar kültürlü olduğunuz Ekle membran gözenekli yüzeye bağlı olmak avantajlıdır. Yumurtalık eki ekle membran için membran Ekle yerine yumurtalık kendisi (şekil 2B ve şekil 3) işlemek deneyci sağlar. Ayrıca, yakın kültürlü yumurtalık sigorta ve şekil 2B gösterir önce (sol) erimiş yumurtalık bağlı ve örnekleri (sağda) Hematoksilen temizledikten sonra lekeli.
Takas mümkün olmadan kültürlü yumurtalık optik kesit gerçekleştirme; Ancak, hücrelerin doku içinde derin arka plandan ayırt etmek zordur bir sinyal ve uygun oosit miktar (şekil 3A) açık sinyal bu eksikliği engellemektedir. Şekil 3Aaksine, şekil 3B oosit miktar tüm organ boyunca olanaklı olduğu temizlenen örneği temsilcisi bir görüntüdür. Şekil 3B bir gösterilmiştir (şekil 3B) kolayca sayısal olarak temizlenen kültürlü yumurtalık bütün organ görüntüleme önemli sinyal derin doku ve görüntü içinde kaybı olmadan yapılabilir olduğunu gösterir. Yumurta gibi bu örnekte miktarının için bir optik bölümleri Z-yığın dizi içine bir maksimum yoğunluk projeksiyon dönüştürerek ve sonra başka bir görüntü işleme paketi dosyasıyla işleme yaklaşımdır. Şekil 4 ve tamamlayıcı şekil 1 şekil 3B yumurta sayısını ölçmek için kullanılan adımları FIJI-ImageJ kullanarak vurgulayın. Ek tablo 1 FIJI-ImageJ'ın parçacık (oosit) miktar içerir. Miktar parçacıkların da bu yöntemi kullanarak verir çünkü her iki parçacık sayısı ve her bir parçacık karşılık gelen alan hakkında bilgi yazılım tarafından hesaplanan ve sağlanan yumurta büyüklüğüne göre farklı köklerinin analizi için kullanıcı.
Şekil 1: tüm iletişim kuralının şematik gösterim. Protokolü başında görsel Özeti (1), yumurtalık diseksiyon ile yumurtalık kültür (2), doku fiksasyon % 4 ile izledi PFA (3), belirli antikor (4), (5) görüntüleme, optik bölümünü kullanarak alma derin doku takas kullanarak immunostaining bir confocal mikroskop (6) ve yumurta miktar (7) ile biten. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: doku opaklık un temizlenmiş ve temizlendi yumurtalık arasındaki farkı. (A) yumurtalıktan postnatal günde beş (solda) takas olmadan ve 1 h (sağda) hafif takas sonra kuçu kuçu. (B) birden fazla yumurtalıkların birbirlerine yakın yedi gün boyunca kültürlü. İki farklı büyüklüklerde her örneğinin gösterilir. Takas ve en sağdaki görüntüleri ile takas olmadan en soldaki görüntülerdir. Yumurtalık kültür Ekle membran için eklemek olacaktır ve daha iyi boyunca protokolünün bağlı tutulması halinde ele alınabilir. Doku beyaz ışık kullanarak görüntüleme için karşıtlığı artırmak amacıyla, yumurtalık Hematoksilen 5 min için yapılan fiksasyon sonra sular altında. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: un temizlenmiş ve temizlendi yumurtalık ayirt görüntüleme. Yumurtalık doğum sonrası 5 gün pups üzerinden 7 gün boyunca kültürlü ve açıklanan protokol boyama bütün Dağı ayirt göre lekeli. Kırmızıyla gösterilen fare vasa homolog (MVH germ hücreleri tanımlamak için) ile ve yeşil etiketli hücreleri nükleer oosit özgü marker, p63 ile etiketli hücreleri vardır. DAPI, Mavili, tüm hücre çekirdeği etiketlemek için kullanıldı. (A) ayirt görüntüsü yumurtalık takas olmadan. Yumurtalık temizlenmesi ile (B) ayirt görüntüsü. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: görsel iş akışı için nasıl yumurta FIJI-ImageJ yazılım kullanarak ölçmek için. Veri analizi kolaylaştırmak için confocal uçak elde edilen görüntüleri maksimum yoğunluk projeksiyon bir 3D görüntü yerine azaltılabilir. Maksimum yoğunluk projeksiyon ile kullanıcı hedef parçacıklar belirgin hale gelir şekilde görüntü eşik parametreleri tanımlayabilirsiniz. Basitleştirilmiş görüntü alındıktan sonra yazılımı yumurta saymak için kullanılır. Parametreler ayarlanırken görüntüleri eleştirel incelenmesi çok önemlidir. Bu şekilde nasıl parçacık/oosit eşik ayarlayabilirsiniz bir örnek gösterilmektedir. Her görüntü yukarıdaki metin FIJI-ImageJ o görüntü elde etmek için kullanılan parametre vurgulamaktadır. Belgili tanımlık bilgisayar yazılımı (bkz. ek tablo 1) parçacıklar alan ölçümü içeren bir tablo oluşturur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Tamamlayıcı şekil 1: görsel iş akışı için nasıl yumurta FIJI-ImageJ yazılım (alt büyütme) kullanarak ölçmek için. Bu şekilde yakın iki yumurtalık için oosit miktar gösterilir. Gerçekleştirilen adımlar şekil 4ile aynıdır. 2,436 parçacıklar/köklerinin yazılım tarafından sayıldı. Yazılım lisansı alınan miktar verileri ek tablo 1' de bulunabilir. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
Ek tablo 1: folikül miktar FIJI-ImageJ tarafından hesaplanan. Bu tablo sayılan köklerinin ve tamamlayıcı şekil 1' deki görüntüden oluşturulan karşılık gelen alan listesini içerir. Miktar için kullanılan partikül büyüklüğü 10 µm2den kuruldu-Infinity. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Memeli üreme çalışma kullanarak ve hücre kültürü için rutin olarak mükellef olmayan özel hücreler miktarının gerektirir. Ancak, ex vivo kültür sistemleri yumurtalık ve folikül canlılık1,15Bakımı etkilidir. Yumurtalık kültür sırasında doku Difüzyon yoluyla besin alışverişini için geniş bir yüzey alanı gerektirir. Bu nedenle, yumurtalık boyutunda idealdir ve şekil organ kültür için 5 - gün eski fare. Bu iletişim kuralı yumurtalık kültür yedi gün boyunca muhafaza için optimize edildi ama yumurtalık kültür uzunluğu belirli bilimsel soru1,4göre ayarlanabilir. Yumurtalık kadar az üç gündür kültürlü ve on gün (veri gösterilmez) sürece, ama yumurtalık hayvanlardan on gün büyük ve kültür-ebilmek değil var olmak etkili, böylece bir sınırlama Protokolü'nün vurgulayarak daha yaşlı benzer sonuçlar elde ettik.
Ex vivo yumurtalık kültür gerekmiyorsa, düzeltmek ve değişiklikler daha büyük doku boyutu9,-16ayarlamak için gerekli, ancak büyük yumurtalıklar açıklanan, protokolü ile leke mümkündür. Daha büyük yumurtalıklar her iki uzun antikor kuluçka adımlarla veya doku olabilir birkaç küçük parçalar halinde bölümleme tarafından leke mümkün olabileceğini gösterir organ içine antikorların pasif difüzyon açıklanan boyama Protokolü bağlıdır görüntüleme sonra yeniden olabilir. Üre ve sorbitol çünkü bu daha kısa bir kuluçka dönemi gerekli yenidoğan kültürlü yumurtalık için etkili oldu ajan Temizleme ScaleS(0) içinde (ScaleA2)8,10 üre ve gliserol ile takas aracıları için rapor . Ayrıca, düşük yoğunlukta sodyum borhidrür (NaBH4) permeabilization çözümünde kullanımı arka plan gürültü düşmüştür ve, birlikte daha uzun incubations birincil ve ikincil antikorlar ile örneklerinin kolaylaştırdı derin doku içinde boyama. Ayrıca, PVA kullanımında permeabilization ve çözümler yıkama sahte parçacıklar için doku17,18yapışmasını önler.
Sağlıksız yumurtalıklar fiksasyon ve işleme ayırarak iken bu protokol için INSERT membran kültürlü sağlıklı yumurtalık eklemek olacaktır. Forseps ile gevşek doku işleme yumurtalık ve büyük olasılıkla uzlaşma görüntüleme zarar verir. Alternatif olarak, gevşek doku % 5 özel prizler içinde katıştırılmış veya açılış belgili tanımlık uç ona zarar vermemeye kadar geniş olduğu sürece transfer Pipetler ile ele. İle ilgili immunostaining, birincil antikorlar haricinde bu protokol için kullanılan farklı performans gösterebilir ve en iyi duruma getirme permeabilization ve kuluçka adımda gerektirebilir.
Son olarak, protokol ile karşılaştırıldığında geleneksel parafin gömülü seri bölümler genç yumurtalıklar üzerinden köklerinin miktarının doğru alternatif bir yaklaşım açıklar veya diğer daha önce açıklanan bütün Dağı görüntülerden köklerinin hacimsel miktar 5 , 9 , 16. araştırmacı gereksinimleri, yordamı için iletişim kuralında tanımlanan oosit miktar da olabilir bağlı olarak kullanılan karakterize farklı aşamalarında foliküler gelişim19. Yazılım tarafından oluşturulan parçacık alan hücre çapı belirlemek ve böylece foliküler sahne çıkarmak için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Biz Rebecca Williams ve Cornell BRC görüntüleme Johanna Dela Cruz ve Andrew Recknagel yararlı öneriler ve teknik yardım için teşekkür ederiz. Bu eser Ulusal Sağlık grant Enstitüleri için desteklenen S10-OD018516 (için Cornell tesis görüntüleme), T32HD057854 J.C.B. için ve R01-GM45415 J.C.S. için
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro dissecting scissor 4.5", straight, sharp points | Roboz | RS-5912 | Micro dissecting scissor |
| Jewelers style forceps 4-3/8", style 5 | Integra Miltex | 17-305X | Fine tip forceps |
| Micro Iris Scissors 4", straight, sharp points | Integra Miltex | 18-1618 | Micro dissecting iris scissor or micro dissecting spring scissor |
| 1X Minimal Essential Media (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11090-081 | |
| Fetal Bovine Serium | Corning | 35011CV | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | Used in Step 1.3.1 |
| 35mm Tissue Culture Treated Dish | Corning | 430165 | |
| Nunc™ 24-Well Carrier Plate for Cell Culture Inserts | ThermoFisher Scientific | 141006 | Pore size: 8μm |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% solution |
| 1X Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
| Nutator mixer GyroTwister™ | Labnet | S1000-A-B | three dimensional shaker |
| Normal Goat Serum | VWR | 103219-578 | |
| Bovine Serum Albumen (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002-25G | |
| Sodium borohydride solution (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452904-25ML | Use the solution, rather than the tablet or powder form |
| Polyvinyl Alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136-250G | Cold water soluble |
| Triton™ X-100 | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | polyethylene glycol tert-octylphenyl ether |
| Syringe filters | ThermoFisher Scientific | 725-2520 | 25mm |
| 10mL Syringes | BD | 309695 | |
| Mouse anti-p63 antibody (4A4) | Biocare Medical | CM 163A | Dilution 1:500 |
| Rabbit anti-MVH antibody | Abcam | ab13840 | Dilution 1:600 |
| Alexa Fluor® goat anti-mouse 594 | ThermoFisher Scientific | A-11032 | Dilution 1:1000 |
| Alexa Fluor® goat anti-rabbit 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | Dilution 1:1000 |
| 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| D-(-)sorbitol | Sigma-Aldrich | 240850-100G | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012-100ML | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-5X10ML | |
| FIJI-ImageJ | Image processing software | ||
| Disposable plastic transfer pipettes | VWR | 414044-034 |
References
- O'Brien, M. J., Pendola, J. K., Eppig, J. J. A Revised Protocol for In Vitro Development of Mouse Oocytes from Primordial Follicles Dramatically Improves Their Developmental Competence. Biology of Reproduction. 68 (5), 1682-1686 (2003).
- Morgan, S., Campbell, L., Allison, V., Murray, A., Spears, N. Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Livera, G., Rouiller-Fabre, V., Valla, J., Habert, R. Effects of retinoids on the meiosis in the fetal rat ovary in culture. Molecular and Cellular Endocrinology. 165 (1), 225-231 (2000).
- Livera, G., Petre-Lazar, B., Guerquin, M. -J., Trautmann, E., Coffigny, H., Habert, R. p63 null mutation protects mouse oocytes from radio-induced apoptosis. Reproduction. 135 (1), 3-12 (2008).
- Tilly, J. L. Ovarian follicle counts - not as simple as 1, 2, 3. Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11 (2003).
- Bucci, T. J., Bolon, B., Warbritton, A. R., Chen, J. J., Heindel, J. J. Influence of sampling on the reproducibility of ovarian follicle counts in mouse toxicity studies. Reproductive Toxicology. 11 (5), 689-696 (1997).
- Skodras, A., Marcelli, G. Computer-Generated Ovaries to Assist Follicle Counting Experiments. PLOS ONE. 10 (3), e0120242 (2015).
- Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. A Whole-Mount Approach for Accurate Quantitative and Spatial Assessment of Fetal Oocyte Dynamics in Mice. Biology of Reproduction. 93 (5), (2015).
- Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Scientific Reports. 7, (2017).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Ke, M. -T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Rinaldi, V. D., Hsieh, K., Munroe, R., Bolcun-Filas, E. M., Schimenti, J. C. Pharmacological Inhibition of the DNA Damage Checkpoint Prevents Radiation-Induced Oocyte Death. Genetics. , genetics.117.203455 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Obata, Y., Kono, T., Hatada, I. Oogenesis: Maturation of mouse fetal germ cells in vitro. Nature. 418 (6897), 497 (2002).
- Faire, M., et al. Follicle dynamics and global organization in the intact mouse ovary. Developmental Biology. 403 (1), 69-79 (2015).
- Byrne, C., Hardman, M. J. Whole-Mount Assays for Gene Induction and Barrier Formation in the Developing Epidermis. Epidermal Cells. , 127-136 (2005).
- Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain. Neural Development. 6, 10 (2011).
- Laronda, M. M., et al. A bioprosthetic ovary created using 3D printed microporous scaffolds restores ovarian function in sterilized mice. Nature Communications. 8, ncomms15261 (2017).
