Summary
Hier presenteren we een protocol om te kwantificeren follikels in gekweekte eierstokken van jonge Muizen zonder seriële segmenteren. Met behulp van hele orgel immunofluorescentie en weefsel wissen, is fysieke segmenteren vervangen door optische segmenteren. Deze methode voor de bereiding van de monsters en visualisatie handhaaft integriteit van orgel en vergemakkelijkt geautomatiseerde kwantificering van specifieke cellen.
Abstract
Onderzoek op het gebied van zoogdieren reproductieve biologie brengt vaak evaluatie van de algehele gezondheid van eierstokken en teelballen. Met name bij vrouwtjes, wordt ovariële fitness vaak beoordeeld door visualiseren en kwantificeren van de follikels en eicellen. Omdat het vruchtbeginsel een ondoorzichtige drie-dimensionale weefsel is, vereisen traditionele benaderingen moeizaam het weefsel in talrijke seriële secties opsplitsen om te visualiseren van cellen in het gehele orgaan. Bovendien, omdat kwantificering door deze methode houdt meestal slechts een subset van de secties gescheiden door de geschatte diameter van een oöcyt scoren is het vatbaar voor onjuistheden. Hier, wordt een protocol beschreven dat in plaats daarvan maakt gebruik van hele orgel weefsel clearing en immunofluorescentie kleuring van muis eierstokken te visualiseren follikels en eicellen. Vergeleken met meer traditionele benaderingen, dit protocol is gunstig voor het visualiseren van de cellen binnen het ovarium voor tal van redenen: 1) het vruchtbeginsel blijft intact gedurende de bereiding van de monsters en verwerking; 2) kleine eierstokken, die moeilijk te sectie, kunnen worden onderzocht met gemak; 3) cellulaire kwantificering meer gemakkelijk en nauwkeurig gebeurt; en 4) het hele orgel beeld.
Introduction
Om het onderzoek naar de cellulaire samenstelling en morfologische kenmerken van zoogdieren eierstokken, afhankelijk wetenschappers vaak van in vivo experimenten gevolgd door immunohistological kleuring van paraffine ingesloten eierstokken. Meer recent echter hele eierstok orgel cultuur heeft bewezen een effectief alternatief voor het bestuderen van ovariële functie1,,2,,3,4 , omdat de techniek kan gepaard gaan met betere visualisatie en kwantificering tools. Traditioneel, analyse van ovariële morfologie is afhankelijk van reconstructie driedimensionale ovariële het platform van paraffine ingesloten seriële secties, maar naast het feit dat moeizaam en tijdrovend, serieel afdelen paraffine ingesloten weefsel garantie niet juiste reconstructie van het orgel en secties zijn vaak verloren of verkeerd besteld in het proces.
Naast de technische uitdagingen in verband met seriële afdelen, zijn er ook variaties in de gehanteerde routinematig kwantificeren follikel nummers per eierstok5,6. De methodologische variabiliteit momenteel gebruikt schaadt meta-analyse van ovariële reserve over studies5,7. Follikel nummers uit verschillende onderzoeksartikelen kan bijvoorbeeld variëren door 10-fold of meer tussen soortgelijke developmental leeftijden binnen een specifieke stam6. Deze grote verschillen in de gerapporteerde follikel kwantificering kunnen leiden tot verwarring en cross-studie vergelijkingen hebben gestaan. Experimenteel, traditionele benaderingen follikel kwantificering van seriële secties worden uitgevoerd door het tellen van de follikels van een vooraf gedefinieerde aantal secties (b.v., elke vijfde, tiende, of een andere sectie). Variabiliteit in de follikel graven met behulp van deze aanpak ontstaat niet alleen uit de periodiciteit in welke secties worden geteld maar ook uit de variaties in de dikte van de sectie, en technische ervaring bij het genereren van seriële secties5,6. Naast haar variabiliteit is een ander nadeel van traditionele weefsel segmenteren dat het segmenteren van kleine eierstokken van jonge dieren vooral een uitdaging en sterk afhankelijk is van een weefsel geaardheid8 is.
Het onderstaande protocol beschrijft een routinematig gebruikte eierstok cultuur techniek1 maar sterk verbetert bij traditionele follikel kwantificering te vervangen door fysieke segmenteren met weefsel clearing en optische afdelen met behulp van de confocal microscopie8 ,9. Wissen met behulp van weefsel onderdompeling (zonder de noodzaak voor transcraniale perfusie of voor elektroforese) in een ureum en sorbitol-gebaseerde oplossing (b.v., ScaleS(0)10) bewezen compatibel met de immunokleuring en toegestaan voor de vermindering van clearing tijd zonder diepte voor imaging. Andere gemelde methoden (b.v., ScaleA28,10, SeeDB11, ClearT12, en ClearT212) bevinden zich meer tijd consumeren of niet toestaan grondig optische resolutie van het monster. Optische segmenteren is voordelig, omdat het is minder arbeidsintensief en het orgel van driedimensionale het platform7,8 onderhoudt. Een ander voordeel van deze aanpak is dat de voorbereiding van de monsters geen dure reagentia vereist te wissen van het weefsel en kan worden uitgevoerd met relatief gemak.
Met name het protocol beschreven is geoptimaliseerd voor gekweekte muis eierstokken op postnatale dag vijf maar werd uitgevoerd op de eierstokken variërend van postnatale dag 0 - 10. De methode maakt gebruik van een eierstok cultuur systeem waarin het weefsel natuurlijk aan het membraan waarop het is gekweekt hecht, orgel behandeling en manipulatie te vergemakkelijken. Het systeem van de cultuur zoals beschreven kan worden gebruikt om transplanteren eierstokken voor maximaal 10 dagen en te beoordelen hoe verschillende experimentele omstandigheden kunnen interfereren met de oöcyt overleving13. De kwantificering beschreven procedure wordt uitgevoerd met behulp van de niet-commerciële pakket FIJI-ImageJ14 voor beeldverwerking en kan worden uitgevoerd op de meeste personal computers. Bovendien kunnen beelden gebruikt voor kwantificering wijd-beschikbaar gemaakt te worden voor de wetenschappelijke gemeenschap, waardoor voor toekomstige meta-analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Cornell University's institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) heeft ingestemd met alle methoden beschreven hier, onder protocol 2004-0038 bij JCS.
1. voorbereiding van instrumenten en kweekmedia
- Veeg het werkgebied met 10% bleekwater schoon en laat het bleekmiddel te blijven op het oppervlak gebied werk voor ten minste 5 min. Na 5 min, verwijder het overtollige bleekmiddel met schone papieren handdoeken en 70% ethanol (EtOH). Schoon het ontleden Microscoop grondig met 70% EtOH.
Opmerking: Het is belangrijk dat het werkgebied worden ten minste semi-steriele om verontreiniging van orgel culturen te voorkomen. - Wikkel schone pincet en schaar met een papieren handdoek getemperd met 70% EtOH tot het tijdstip van gebruik.
Opmerking: De ideale dissectie tools kunnen variëren naargelang de leeftijd/grootte van het ovarium. Beste resultaten worden verkregen met behulp van een scherpe micro ontleden scissor, twee fijne punt pincet (ofwel nummer 5 of 55) en één micro ontrafeling van iris schaar. - Breng 50 mL eierstok cultuurmedia en warm in een waterbad 37 ° C in een conische buis.
- Aanvulling om eierstok kweekmedium4, 1 x minimale Essential Media (MEM) met 10% foetale boviene Serum (FBS), 25 mM (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic zuur (HEPES) 100 eenheden/mL penicilline, 100 µg/mL streptomycine, 0,25 µg Mo/mL Amfotericine B (bijvoorbeeld 45 mL MEM, 5 mL van warmte geïnactiveerd FBS, 1,25 milliliters HEPES en 0,5 mL 100 x voorraad van amfotericine B, penicilline en streptomycine).
- Bereiden platen en inserts voorafgaand aan de cultuur van de eierstok.
- In de kap van een weefselkweek, voeg 1 mL eierstok kweekmedium aan een 35 mm weefselkweek plaat.
- Inweekmiddel invoegen membraan met het kweekmedium. Voeg voldoende media, meestal ongeveer 0,55 mL per goed, naar de 24-well draagplaat weefselkweek geleverd, en plaats een celkweek invoegen in de put. Zorg ervoor dat het invoegen van membraan raakt de media.
- Het aantal 35 mm platen en putjes met cel cultuur inzetstukken volgens het verwachte aantal van de eierstokken in de experiment voor te bereiden. Plaats de platen van de 35 mm met 1 mL van cultuurmedia en de 24-well draagplaat geleverd met cultuurmedia en inserts in een 37 ° C, 5% CO2en atmosferische O2 incubator.
- Een warmhoudplaat naast de dissectie bereik te regelen en de temperatuur instellen tot 37 ° C. Houd een 37 ° C, 5% CO2 en de atmosferische O2 incubator ligt dicht bij de dissectie-kamer.
2. de eierstok dissectie en orgel cultuur
Opmerking: Eierstokken kunnen worden ontleed bij kamertemperatuur, zolang de blootstelling aan de niet-ideale temperatuur minimaal is.
- De vrouwelijke muizen euthanaseren op postnatale dag 5, door onthoofding, één filter tegelijk.
Opmerking: Euthanasie moet worden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de IACUC aanwezig zijn op de faciliteit waar het onderzoek wordt uitgevoerd. - Spray het dier met 70% EtOH. Plaats het dier op de bovenkant van de droge papieren handdoek onder de Microscoop dissectie. Plaats een 35 mm weefselkweek schotel met eierstok voedingsbodems dichtbij de dissectie Microscoop.
- Met pincet of een micro dissectie iris schaar, maak een incisie via de huid van het dier en in de buikholte, met behulp van voorzichtig niet te snijden in de darmen. Duw de ingewanden uit de buikholte en zoek de eierstokken. Pak de eierstokken en plaats ze in de schotel van de 35-mm weefselkweek met voedingsbodems.
- Zodra de eierstokken hebben ontleed geweest van het dier, het zoompercentage van de dissectie-Microscoop om eierstokken en eventuele bijgevoegde weefsel beter te visualiseren. Met fijne punt pincet schoon, verwijder alle niet-ovariaal weefsel, zoals bursa en vetweefsel. Wees voorzichtig om te houden van de eierstokken intact bij het verwijderen van de bijgevoegde niet-eierstokweefsel.
- Zodra de eierstokken geïsoleerd zijn, het paar in de vooraf doorweekt cel cultuur inzetstukken van de vervoerder 24-well plaat plaatsen (zie stap 1.4.2 en 1.4.3) en het volume van het medium om ervoor te zorgen dat er voldoende het orgaan om vochtig te houden (zonder volledig dompelen het).
Let op: Wees voorzichtig niet te porren een gat in het membraan van de cel cultuur invoegen bij het overbrengen van de eierstokken. - Transplanteren plaats organen in een 37 ° C, 5% CO2en atmosferische O2 incubator.
- Herhaal stap 2.1-2.6 totdat de eierstokken van elk dier zijn ontleed en op de cultuur van de cel geplaatst invoegen van de 24-well plaat met het ovarium-kweekmedium.
- Verandering het ovarium kweekmedium elke 2 dagen, met behulp van eierstok media aliquots opgewarmd uit een waterbad 37 ° C en gaat u verder met deel 3 van het protocol op het gewenste tijdstip voor experimentele.
3. de weefsels fixatie
- In een conische tube van 15 mL, 4% paraformaldehyde (PFA) in 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bereiden (b.v., Voeg 2 mL 16% PFA elektronenmicroscopie rang 6 ml 1 x PBS).
Let op: PFA is een gevaarlijke stof en onder een chemische motorkap moet worden behandeld. - Het vaststellen van de gekweekte eierstokken, zonder het verwijderen van het weefsel van de cultuur invoegen, door het bestuderen van het weefsel met de vers bereide oplossing van 4% PFA. Zegel van de randen van de plaat met plastic lijm (vermijden van verdamping) en plaats de monsters bij 4 ° C's nachts.
Opmerking: Ter vergemakkelijking van de behandeling en weefsel integriteit, Vermijd verdringt eierstokken uit de cel cultuur invoegen gedurende de gehele procedure. Gekweekte eierstokken gekoppeld aan het oppervlak van de insert zijn voordelig voor behandeling zonder beschadiging of verlies van het orgel. - Spoel het weefsel 3 x met 70% EtOH en ofwel gaat u verder met stap 4.1 of winkel in Scintillatie flesjes gevuld met 70% EtOH bij 4 ° C tot verdere verwerking.
Opmerking: Als het gebruik van weefsel endogeen uiting van fluorescente proteïnen, opslag van de monsters met 70% EtOH kan sterk verminderen het signaal. U kunt ook kan weefsel worden gespoeld en opgeslagen in de PBS met 0,2% natriumazide (NaN3). NaN3 is echter zeer giftig en vormt een gevaar voor ernstige inademing. Maak de stockoplossing in de zuurkast en omgaan met het dragen van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen zoals een laboratorium jas en nitril handschoenen.
4. hele Mount immunofluorescentie
- Plaats de vaste weefsel in 1 x PBS op RT gedurende ten minste 4 uur vóór de permeabilization stap 4.3.
- Permeabilization oplossing en blokkerende oplossing voorbereiden.
- Bereid permeabilization oplossing zoals beschreven. Naar 1 x PBS, 0,2% polyvinylalcohol (PVA), 0,1% natrium natriumboorhydride (NaBH4) oplossing (van 12 wt.% in 14 M natriumhydroxide (NaOH) oplossing) en 1,5% polyethyleenglycol tert -octylphenyl ether (niet-ionogene oppervlakteactieve stof detergenten) toevoegen. In een conische buis van 50 mL, voeg 5 mL van de 10 x PBS, 0,1 g van PVA en 50 µL van NaBH4750 µL van niet-ionogene oppervlakteactieve stof wasmiddel, voeg dan ultrazuiver water tot 50 mL en bij kamertemperatuur goed doorroeren tot het mengsel geheel in oplossing.
- Bereid blokkerende oplossing zoals beschreven. Naar 1 x PBS, toevoegen van 0,1% niet-ionogene oppervlakteactieve stof wasmiddel, 0,15% van 2,5 M glycine pH 7.4, 10% normale geit serum, 3% bovien serumalbumine (BSA), 0,2% NaN3, 100 eenheden/mL penicilline, 100 µg/mL streptomycine en 0,25 µg/mL amfotericine B. bereiden een stockoplossing van 2.5 M glycine door het oplossen van 93.8 g van glycine in ultrazuiver water tot een eindvolume van 500 mL (pH 7.4) en een stockoplossing van 10% NaN3 door ontbinding van 5 g in 50 mL ultrazuiver water; dan, in een conische tube van 50 mL bereid de blokkerende oplossing door toevoeging van 5 mL van de 10 x PBS, 50 µL van niet-ionogene oppervlakteactieve stof wasmiddel, 750 µL van glycine stockoplossing, 5 mL geit serum, 1.5 g van BSA, 1 mL van de stockoplossing van NaN3 , en 0,5 mL 100 x voorraad van amfotericine B, penicilline en streptomycine. Voeg ultrazuiver water tot een eindvolume van 50 mL en spuit filter de definitieve oplossing.
- Verwijderen en negeren de PBS 1 x uit de flacon en voegt u genoeg permeabilization oplossing volledig onderdompelen van de eierstokken. Breng de monsterhoeveelheid in permeabilization oplossing op een roteerschudapparaat (bijvoorbeeld nutator) bij kamertemperatuur gedurende 4 uur.
Opmerking: Incubatietijd kan variëren naargelang de dikte van het orgel. - De permeabilization oplossing vervangen door genoeg blokkerende oplossing te volledig dompelen de eierstokken. Zegel van het flesje met de plastic lijm en laat het weefsel aan het broeden voor een minimum van 12 h bij kamertemperatuur op een roteerschudapparaat.
- Maak primair antilichaam verdunning in de blokkerende oplossing volgens de fabrikant gegevensblad.
Opmerking: Merk op dat niet alle antilichamen compatibel met de clearing-agent zijn. Het gemiddelde volume nodig per monster is ongeveer 750 µL.- Gebruik voor de kwantificering van de oöcyt, TAp63 (nucleaire oöcyt marker) en MVH (cytoplasmatische geslachtscellen marker).
Opmerking: De antilichamen die gebruikt in de beelden van de immunofluorescentietest zijn muis anti-p63 en konijn anti-MVH). Het primaire antilichaam-oplossing kunnen opnieuw 2 x of meer als bij 4 ° C opgeslagen tussen het bevlekken van protocollen en voorkom bacteriële groei op correcte wijze verwerkt.
- Gebruik voor de kwantificering van de oöcyt, TAp63 (nucleaire oöcyt marker) en MVH (cytoplasmatische geslachtscellen marker).
- Plaats van het invoegen met het weefsel in een 24-well-plate en voeg ongeveer 750 µL van primair antilichaam oplossing. Zorg ervoor dat de eierstokken zijn volledig ondergedompeld. Het zegel van de plaat met plastic lijm minimaliseren van verdamping en laat het weefsel aan het broeden voor 4 dagen bij kamertemperatuur op een roteerschudapparaat.
- Bereid wassen-oplossing.
- Bereid wassen oplossing zoals beschreven. Maken van 1 x PBS, 0,2% PVA en 0,15% niet-ionogene oppervlakteactieve stof wasmiddel toevoegen. In een conische buis van 50 mL, voeg 5 mL van de 10 x PBS, 0,1 g van PVA, 75 µL van niet-ionogene oppervlakteactieve stof wasmiddel en ultrazuiver water tot een eindvolume van 50 mL.
- Verwijder van primair antilichaam verdunning en voeg een royaal bedrag van wassen oplossing. Zorg er altijd voor het onderdompelen van de eierstokken. Toestaan dat de eierstokken te genieten in de oplossing 's nachts bij kamertemperatuur op de rondschudapparaat.
- Vervang de oplossing wassen en broeden op de roteerschudapparaat voor 2U of meer.
- Herhaal de stap 4.9 één extra tijd.
- Maak de verdunning secundair antilichaam in het blokkeren van de oplossing.
Opmerking: De secundaire antilichamen gebruikt zijn anti-muis 488 fluorescente kleurstof opgegroeid in geit en anti-konijn 594 fluorescente kleurstof opgegroeid in geit. Zie stap 4.5. voor het gemiddelde volume per monster nodig. - Wassen oplossing uit de eierstokken verwijderen en toevoegen van secundair antilichaam oplossing. De monsters te beschermen tegen licht (wrap plaat met aluminiumfolie) en verzegel de plaat met plastic lijm om te minimaliseren van verdamping. Incubeer monsters op een roteerschudapparaat bij kamertemperatuur gedurende 2 dagen.
Opmerking: Blijven de monsters te beschermen tegen licht met behulp van aluminiumfolie tijdens alle daaropvolgende incubatie stappen. - Verwijder secundair antilichaam oplossing uit de monsters en voeg wassen oplossing. Incubeer op een roteerschudapparaat gedurende 8 uur.
Opmerking: Als 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) kleuring wordt gewenst, 50 ng/mL DAPI aan de eerste wassen stap (~ 8 h incubatie) toevoegen. - Vervang de wassen-oplossing voor een overnachting wassen.
- Bij de voorbereiding van de clearing-oplossing (zie punt 5), vervangt de overnachting wassen oplossing met verse oplossing en houdt van de monsters op de roteerschudapparaat bij kamertemperatuur.
5. de eierstok Clearing en Imaging
- ScaleS(0) clearing oplossing voor te bereiden.
- ScaleS(0) clearing oplossing10 door toevoeging van reagentia in de bepaalde hoeveelheid bereiden: 40% D-(-) sorbitol (w/v), 10% glycerol, 4,3 M ureum en 20% dimethylsulfoxide (DMSO), pH 8.1 (bijvoorbeeld in een conische buis van 50 mL, voeg 2,5 mL glycerol, 10 g van sorbitol , 5 mL van DMSO, en 12 mL 9 M ureum voor een totaal volume van 25 mL. Meng de oplossing door inversie bij 50 ° C gedurende 30 minuten en ontgas vóór gebruik.)
- Verwijder de oplossing wassen en dompelen de monsters in het ontruimen van de oplossing. Voor betere resultaten bijhouden monsters op de rondschudapparaat.
- Vervangen van de clearing oplossing 2 x dagelijks het weefsel pas transparant (ongeveer 2 dagen).
- Zodra het weefsel is uitgeschakeld, voorbereiden op het monster beeldvorming door het zorgvuldig verwijderen van het membraan van de invoegen met de gekweekte eierstokken met een fijne tip scalpel en plaatsen van het monster op een glasplaatje.
- Ga naar de monsters op een Microscoop geschikt voor optische afdelen imaging.
6. oöcyt kwantificering
Opmerking: Er zijn veel verschillende computerprogramma's die kunnen kwantificeren van cellen. Hieronder is een protocol voor oöcyt kwantificering met behulp van de niet-commerciële image processing pakket, FIJI-ImageJ14.
- Met behulp van een afgevlakte maximale intensiteit projectie van de Z -stapel afbeelding serie voor de specifieke cellulaire markers van belang (zonder de DAPI-kanaal), zet u de afbeelding in een zwart-wit beeld van de 8-bit onder Type in de vervolgkeuzelijst van afbeelding menu.
- Onder het beeld drop-down menu, selecteer het tabblad aanpassen en selecteer vervolgens drempel.
- Pas handmatig de drempel tot een niveau dat best elke individuele oöcyt identificeert. Zodra het niveau wordt bepaald, klikt u op toepassen voor het genereren van een zwart-wit beeld. Zodra voltooid, kwantificeren het monster onder via het ovaal of Freehand pictogram.
Opmerking: FIJI-ImageJ heeft verschillende opties om te fine-tunen van de image die worden voor de kwantificering van de particle gebruikt zal. Bijvoorbeeld, in proces | Binaire tab, zijn er verschillende opties die kunnen worden gebruikt ter verbetering van de opsporing van wat zal worden geteld. In Figuur 4was de opties die worden gebruikt om beter individualiseren follikels eroderen, gevolgd door het vullen van gaten, en ten slotte waterscheiding. - Selecteer onder het analyseren drop-down menu, analyseren deeltjes. Stel de parameters volgens de gewenste resolutie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol omvat 6 belangrijke stappen volgen dissectie van de eierstokken, zoals uiteengezet in Figuur 1. Figuur 2 , Figuur 3 , Figuur 4 wijzen op de meest nieuwe kenmerken van dit protocol, die omvatten de optimalisatie van weefsel voor eierstokken en hele weefsel oöcyt kwantificering met behulp van FIJI-ImageJ wissen. Figuur 2A toont beelden van een onbeschaafd 5-daagse postnatale vaste eierstok vóór (links) en 1 h na (rechts) toe te voegen clearing oplossing voor het ovarium. De eierstok zal beginnen te worden doorschijnend binnen minuten worden ondergedompeld in het ontruimen van de oplossing. Zodra optie is uitgeschakeld, worden kleine eierstokken als het beeld in figuur 2A moeilijk te behandelen zonder te beschadigen. Daarom is werken met gekweekte transplanteren eierstokken gunstig omdat ze worden aangesloten op het poreuze oppervlak van het membraan van de invoegen waarop ze gekweekt zijn. Bevestiging van de eierstok naar de membraan invoegen staat de experimentator te behandelen van het membraan invoegen in plaats van het ovarium zelf (figuur 2B en Figuur 3). Ook, eierstokken gekweekt in de nabijheid zal smelten en figuur 2B shows aangesloten gesmolten eierstokken vóór (links) en na (rechts) op de Haematoxyline verrekening gekleurd monsters.
Uitvoeren van de optische afdelen van gekweekte eierstokken zonder verrekening mogelijk is; echter cellen diep in het weefsel hebben een signaal dat is moeilijk te onderscheiden van de achtergrond en het ontbreken van een duidelijk signaal belemmert juiste oöcyt kwantificering (figuur 3A). In tegenstelling tot figuur 3Ais figuur 3B een representatief beeld van een gewiste monster waarin kwantificering van de oöcyt gedurende het gehele orgaan mogelijk is. Figuur 3B toont aan dat de hele orgel beeldvorming van gewiste gekweekte eierstokken zonder een significant verlies van signaal diep in het weefsel en de beelden plaatsvinden kan zoals degene komt te staan (figuur 3B) kan gemakkelijk worden gekwantificeerd. Een benadering voor het kwantificeren van de eicellen in monsters zoals deze is door het omzetten van de Z-stack serie van optische secties in een maximale intensiteit projectie en vervolgens verdere verwerking van het bestand met een afbeelding verwerking pakket. Figuur 4 en aanvullende figuur 1 Markeer op de stappen bij de berekening van het aantal eicellen in figuur 3B met FIJI-ImageJ. FIJI-ImageJ deeltje (oöcyt) kwantificering bevat aanvullende tabel 1 . Kwantificering van deeltjes met behulp van deze methode ook zorgt voor de analyse van verschillende follikels op basis van de grootte van de oöcyt, omdat informatie over zowel het aantal deeltjes en het overeenkomstige gebied van elk deeltje wordt berekend door de software en verstrekt aan de gebruiker.
Figuur 1: schematische weergave van het gehele protocol. Grafisch overzicht van het protocol begin met dissectie van de eierstok (1), gevolgd door de eierstok cultuur (2), weefsel fixatie met 4% PFA (3), met behulp van specifieke antilichamen (4), clearing weefsel voor diepe imaging (5), verkrijgen met behulp van de optische sectie immunokleuring een confocal microscoop (6) en eindigt met de oöcyt kwantificering (7). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: verschil in weefsel dekking tussen VN uitgeschakeld en gewist eierstokken. (A) ovarium van een postnatale dag vijf pup zonder wissen (links) en na milde clearing van ongeveer 1 h (rechts). (B) meerdere eierstokken gekweekte dicht bij elkaar gedurende zeven dagen. Twee verschillende vergrotingen van elk monster worden weergegeven. Meest linkse beelden zijn zonder verrekeningsovereenkomsten en meest rechtse beelden met clearing zijn. Eierstokken zal hechten aan het membraan van de cultuur-insert en beter kunnen worden behandeld als gehouden bijgevoegd in het gehele protocol. Ter verbetering van het contrast van weefsel voor beeldvorming met behulp van wit licht, werden eierstokken ondergedompeld in de Haematoxyline voor 5 min na fixatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: immunofluorescentie beeldvorming van VN-uitgeschakeld en gewist eierstokken. Eierstokken van postnatale dag 5 pups waren gekweekte voor 7 dagen en gekleurd volgens de hele berg immunofluorescentie kleuring protocol beschreven. In rood weergegeven zijn cellen met muis Wasa homolog (MVH) te identificeren van geslachtscellen en in het groen aangeduid met de nucleaire oöcyt-specifieke marker, p63 cellen. DAPI, werd in blauw, gebruikt voor het etiketteren van alle celkernen. (A) immunofluorescentie afbeelding van eierstokken zonder clearing. (B) immunofluorescentie afbeelding van eierstokken met clearing. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: visuele workflow voor hoe te kwantificeren van oöcyten FIJI-ImageJ softwarematig. Ter vergemakkelijking van data-analyse, kunnen beelden afgeleid van de confocal vliegtuigen worden teruggebracht tot een maximale intensiteit projectie in plaats van een 3D-beeld. Met de maximale intensiteit projectie, kan de gebruiker afbeelding drempel parameters definiëren op een zodanige wijze dat de deeltjes doel duidelijk geworden. Zodra het vereenvoudigde beeld is verkregen, wordt de software gebruikt om te tellen van de eicellen. Kritisch onderzoek van afbeeldingen tijdens het instellen van de parameters is van cruciaal belang. Deze figuur toont een voorbeeld van hoe de deeltjes/oöcyt drempel kan worden ingesteld. De tekst boven elk beeld wijst op de parameter die wordt gebruikt om dat beeld in FIJI-ImageJ te krijgen. De software genereert een tabel met de gemeten oppervlak van de deeltjes (Zie aanvullende tabel 1). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende figuur 1: visuele workflow voor hoe te kwantificeren van oöcyten FIJI-ImageJ softwarematig (lagere vergroting). Deze figuur toont oöcyt kwantificering voor twee eierstokken in de nabijheid. De stappen die uitgevoerd zijn hetzelfde als in Figuur 4. 2.436 deeltjes/follikels werden geteld door de software. Kwantificering gegevens verkregen uit de software kan worden gevonden in de aanvullende tabel 1. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel 1: follikel kwantificering berekend door FIJI-ImageJ. Deze tabel bevat een overzicht van de getelde follikels en het overeenkomstige gebied gegenereerd op basis van de afbeelding in aanvullende figuur 1. De grootte van de deeltjes gebruikt voor kwantificering werd ingesteld van 10 µm2-oneindigheid. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De studie van zoogdieren reproductie vereist gebruiken en kwantificeren van gespecialiseerde cellen die niet routinematig vatbaar voor celkweek. Ex vivo cultuur systemen zijn echter effectief bij het handhaven van de eierstok en follikel levensvatbaarheid1,15. Tijdens de eierstok cultuur vereist het weefsel een groter oppervlak voor uitwisseling van voedingsstoffen via diffusie. Daarom 5 - dagen oude muis eierstokken zijn ideaal in grootte en vorm voor orgel cultuur. Dit protocol is geoptimaliseerd voor de eierstokken gehandhaafd gedurende zeven dagen cultuur, maar eierstok cultuur lengte kan worden aangepast volgens de specifieke wetenschappelijke vraag1,4. Vergelijkbare resultaten zijn bereikt in de eierstokken gekweekte voor zo weinig als drie dagen en zolang tien dagen (gegevens niet worden weergegeven), maar de eierstokken van dieren ouder dan tien dagen groot zijn en cultuur mogelijk niet zo effectief, dus een beperking van het protocol markeren.
Als ex vivo kweken van de eierstokken niet nodig is, is het mogelijk op te lossen en oudere eierstokken vlek met het protocol beschreven, hoewel wijzigingen mogelijk moet aanpassen aan de grotere weefsel grootte9,16. De kleuring protocol beschreven hangt af van passieve diffusie van de antilichamen in het orgel, waarmee wordt aangegeven dat het mogelijk is om grotere eierstokken met beide langer antilichaam-incubatie stappen of door het verdelen van het weefsel in enkele kleinere stukken die kunnen vlek na de beeldvorming worden gereconstrueerd. Het gebruik van ureum en sorbitol in de ScaleS(0) clearing agent bewezen effectief voor neonatale gekweekte eierstokken omdat het vereiste een kortere incubatieperiode dan die gemeld voor clearing agenten met ureum en glycerol (ScaleA2)8,10 . Bovendien, het gebruik van een lage concentratie van natriumboorhydride (NaBH4) in de permeabilization oplossing daalde de achtergrondgeluiden en, samen met langere incubations van de monsters met primaire en secundaire antilichamen, vergemakkelijkt kleuring diep in het weefsel. Bovendien, voorkomt het gebruik van PVA in de permeabilization en het wassen van oplossingen valse deeltjes vasthouden aan het weefsel17,18.
In dit protocol, zal gekweekte gezonde eierstokken hechten aan het membraan invoegen, terwijl ongezond eierstokken van het bij de fixatie en behandeling losmaken kunnen. Behandeling van losse weefsel met een tang beschadigt de eierstok en waarschijnlijk compromis beeldvorming. Als alternatief, losse weefsel kan worden ingebed in 5% agarose stekkers of overdracht pipetten behandeld, zolang de tip opening is breed genoeg om niet te beschadigen. Ten aanzien van immunokleuring, primaire antilichamen dan degene die gebruikt zijn in dit protocol anders kunnen vervullen en optimalisatie in de permeabilization en incubatie stappen kunnen vereisen.
Tot slot, het protocol beschrijft een alternatieve aanpak van het kwantificeren van de follikels uit jonge eierstokken in vergelijking met traditionele paraffine ingesloten seriële secties of andere eerder beschreven volumetrische kwantificering van de follikels uit hele mount beelden 5 , 9 , 16. de verschillende stadia van characterize van folliculaire ontwikkeling19afhankelijk van de onderzoeker eisen, de procedure voor de kwantificering van de oöcyt beschreven in het protocol kan ook worden gebruikt. Het gebied van de deeltjes die door de software gegenereerd kan worden gebruikt om te bepalen van de diameter van de cel en dus afleiden folliculaire fase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Rebecca Williams en Johanna Dela Cruz van de Cornell BRC Imaging en Andrew Recknagel voor nuttige suggesties en technische bijstand. Dit werk werd gesteund aan de nationale instituten van gezondheid subsidie S10-OD018516 (naar Cornell's Imaging Facility), T32HD057854 tot J.C.B. en R01-GM45415 naar J.C.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro dissecting scissor 4.5", straight, sharp points | Roboz | RS-5912 | Micro dissecting scissor |
| Jewelers style forceps 4-3/8", style 5 | Integra Miltex | 17-305X | Fine tip forceps |
| Micro Iris Scissors 4", straight, sharp points | Integra Miltex | 18-1618 | Micro dissecting iris scissor or micro dissecting spring scissor |
| 1X Minimal Essential Media (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11090-081 | |
| Fetal Bovine Serium | Corning | 35011CV | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | Used in Step 1.3.1 |
| 35mm Tissue Culture Treated Dish | Corning | 430165 | |
| Nunc™ 24-Well Carrier Plate for Cell Culture Inserts | ThermoFisher Scientific | 141006 | Pore size: 8μm |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% solution |
| 1X Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
| Nutator mixer GyroTwister™ | Labnet | S1000-A-B | three dimensional shaker |
| Normal Goat Serum | VWR | 103219-578 | |
| Bovine Serum Albumen (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002-25G | |
| Sodium borohydride solution (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452904-25ML | Use the solution, rather than the tablet or powder form |
| Polyvinyl Alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136-250G | Cold water soluble |
| Triton™ X-100 | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | polyethylene glycol tert-octylphenyl ether |
| Syringe filters | ThermoFisher Scientific | 725-2520 | 25mm |
| 10mL Syringes | BD | 309695 | |
| Mouse anti-p63 antibody (4A4) | Biocare Medical | CM 163A | Dilution 1:500 |
| Rabbit anti-MVH antibody | Abcam | ab13840 | Dilution 1:600 |
| Alexa Fluor® goat anti-mouse 594 | ThermoFisher Scientific | A-11032 | Dilution 1:1000 |
| Alexa Fluor® goat anti-rabbit 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | Dilution 1:1000 |
| 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| D-(-)sorbitol | Sigma-Aldrich | 240850-100G | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012-100ML | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-5X10ML | |
| FIJI-ImageJ | Image processing software | ||
| Disposable plastic transfer pipettes | VWR | 414044-034 |
References
- O'Brien, M. J., Pendola, J. K., Eppig, J. J. A Revised Protocol for In Vitro Development of Mouse Oocytes from Primordial Follicles Dramatically Improves Their Developmental Competence. Biology of Reproduction. 68 (5), 1682-1686 (2003).
- Morgan, S., Campbell, L., Allison, V., Murray, A., Spears, N. Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Livera, G., Rouiller-Fabre, V., Valla, J., Habert, R. Effects of retinoids on the meiosis in the fetal rat ovary in culture. Molecular and Cellular Endocrinology. 165 (1), 225-231 (2000).
- Livera, G., Petre-Lazar, B., Guerquin, M. -J., Trautmann, E., Coffigny, H., Habert, R. p63 null mutation protects mouse oocytes from radio-induced apoptosis. Reproduction. 135 (1), 3-12 (2008).
- Tilly, J. L. Ovarian follicle counts - not as simple as 1, 2, 3. Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11 (2003).
- Bucci, T. J., Bolon, B., Warbritton, A. R., Chen, J. J., Heindel, J. J. Influence of sampling on the reproducibility of ovarian follicle counts in mouse toxicity studies. Reproductive Toxicology. 11 (5), 689-696 (1997).
- Skodras, A., Marcelli, G. Computer-Generated Ovaries to Assist Follicle Counting Experiments. PLOS ONE. 10 (3), e0120242 (2015).
- Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. A Whole-Mount Approach for Accurate Quantitative and Spatial Assessment of Fetal Oocyte Dynamics in Mice. Biology of Reproduction. 93 (5), (2015).
- Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Scientific Reports. 7, (2017).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Ke, M. -T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Rinaldi, V. D., Hsieh, K., Munroe, R., Bolcun-Filas, E. M., Schimenti, J. C. Pharmacological Inhibition of the DNA Damage Checkpoint Prevents Radiation-Induced Oocyte Death. Genetics. , genetics.117.203455 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Obata, Y., Kono, T., Hatada, I. Oogenesis: Maturation of mouse fetal germ cells in vitro. Nature. 418 (6897), 497 (2002).
- Faire, M., et al. Follicle dynamics and global organization in the intact mouse ovary. Developmental Biology. 403 (1), 69-79 (2015).
- Byrne, C., Hardman, M. J. Whole-Mount Assays for Gene Induction and Barrier Formation in the Developing Epidermis. Epidermal Cells. , 127-136 (2005).
- Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain. Neural Development. 6, 10 (2011).
- Laronda, M. M., et al. A bioprosthetic ovary created using 3D printed microporous scaffolds restores ovarian function in sterilized mice. Nature Communications. 8, ncomms15261 (2017).
