Summary
여기, 선물이 직렬 구분 없이 교양된 난소 젊은 쥐의 모 낭을 계량 하는 프로토콜. 전체 기관 면역 형광 및 조직 삭제를 사용 하 여, 실제 단면 광 단면으로 대체 됩니다. 샘플 준비 및 시각화의이 방법은 기관 무결성을 유지 하 고 특정 셀의 자동화 된 정량화를 용이 하 게.
Abstract
포유류 생식 생물학의 분야에 있는 연구는 종종 난소와 고환의 전반적인 건강을 평가 포함 됩니다. 특히, 여성, 난소 피트 니스는 시각화 및 낭과 oocytes를 측정 하 여 평가 자주. 난소는 불투명 한 3 차원 조직 이기 때문에 전통적인 접근 힘들게 부 러 뜨 리는 조직의 수많은 직렬 섹션으로 전체 기관에 걸쳐 세포를 시각화 하기 위해 필요 합니다. 또한,이 방법으로 정량화는 일반적으로 점수는 oocyte의 대략적인 직경에 의해 구분 된 섹션의 하위 집합만 수반, 때문에 그것은 부정확 하 경향이 있다. 여기, 프로토콜 대신 전체 장기 조직 개간 및 면역 형광 마우스 난소 낭과 oocytes 시각화의 얼룩을 활용 하 여 설명 합니다. 전통적인 방법에 비해,이 프로토콜은 수많은 이유로 난소 내 세포를 시각화에 대 한 유리: 1) 난소 보존할 샘플 준비와 처리; 섹션에 어렵다, 2) 작은 난소; 쉽게 시험 될 수 있다 3) 세포질 부 량은 더 쉽게 그리고 정확 하 게 달성; 그리고 4) 몇 군데 전체 기관.
Introduction
세포질 구성 및 포유류 난소의 형태학 상 특징을 공부 하기 위하여 과학자 들은 종종 vivo에서 실험 뒤에 immunohistological 포함 된 파라핀 난소의 얼룩에 의존 합니다. 최근에 그러나, 전체 난소 기관 문화 기술은 더 나은 시각화와 결합 될 수 있다 때문에 난소 기능1,2,,34 를 공부 하는 효과적인 대안이 될 수 입증 하고있다 더 많은 고 정량화 도구입니다. 전통적으로, 난소 형태학의 분석 3 차원 재구성 난소 아키텍처 파라핀 임베디드 직렬 섹션에서 하지만 되기 힘들고 시간이 걸리고, 순차적으로 포함 된 파라핀 조직 단면에 따라 달라 집니다. 기관의 적절 한 개조를 보장 하지 않으며 섹션 자주 분실 또는 잘못 주문 과정에서.
직렬 구분과 관련 된 기술 과제, 이외에 정기적으로 여 포 난소5,6당 숫자를 계량 하는 데 사용 하는 방법에 변화가 있습니다. 현재 사용 하는 방법론 변화 연구5,7에 걸쳐 난소의 메타 분석을 손상 한다. 예를 들어 다른 연구 기사에서 여 포 숫자 특정 스트레인6내에서 유사한 발달 세 사이 이상의 사진에 의해 달라질 수 있습니다. 보고 뿌리 부 량에 큰 차이이 혼란으로 이어질 수 있습니다 고 간 연구 비교를 방해. 실험적으로, 직렬 섹션에서 뿌리 정량화 하는 기존의 방법과 섹션의 미리 정의 된 수의 모 낭을 계산 하 여 수행 됩니다 (예를 들어, 모든 다섯 번째, 10 번째, 또는 다른 섹션). 이 방법을 사용 하 여 포 수 있는 가변성 섹션 두께, 경험과 기술 직렬 섹션5,6생성에 섹션 계산에 주기에서 뿐만 아니라 변화에서 발생 합니다. 그것의 다양성 뿐만 아니라 다른 전통적인 조직 단면 단점은 젊은 동물에서 작은 난소의 단면화는 특히 도전적이 고 매우 조직 방향8에 의존.
프로토콜 아래 일상적으로 사용 된 난소 문화 기술1 설명 하지만 전통적인 뿌리 정량화 조직 삭제와 실제 단면 및 광학 단면 confocal 현미경8 사용 하 여 대체 하 여 크게 향상 시켰습니다. ,9. 에 요소 및 솔 비 톨-기반 조직 집중 (하지 않아도 transcranial 관류 또는 전기 이동 법)을 사용 하 여 삭제 솔루션 (예를 들어, ScaleS(0)10)는 immunostaining와 호환 되 고 입증의 감소에 대 한 허용 화상의 깊이 손상 없이 개간 시간. 다른 보고 된 방법 (예, ScaleA28,10, SeeDB11,12, ClearT 및 ClearT212) 하나 더 많은 시간을 소비 또는 샘플의 깊이 있는 광학 해상도 허용 하지 않습니다. 광 단면 적은 노동 집약 이며 오르간의 3 차원 건축7,8을 유지 하기 때문에 유리 하다. 이 방법의 또 다른 이점은 샘플의 준비 조직을 값비싼 시 약을 필요로 하지 않습니다 및 상대적으로 쉽게 수행할 수 있습니다.
특히, 설명 하는 프로토콜은 출생 후 하루 5 교양된 마우스 난소에 대 한 최적화 되었습니다 하지만 출생 후 일 0-10에서에서 배열 하는 난소에 실시 되었습니다. 메서드는 자연스럽 게 조직에 그것은 경작, 기관 처리 및 조작을 용이 하 게 하는 막에 부착 하는 난소 문화 시스템을 사용. 설명 하는 문화 시스템 최대 10 일 동안을 어떻게 다른 실험 조건 평가 explanted 난소 oocyte 생존13방해할 수 유지 하기 위해 사용할 수 있습니다. 설명 정량화 절차 처리 패키지 피지 ImageJ14 비 상업적 이미지를 사용 하 여 수행 하 고 대부분 개인용 컴퓨터에서 수행할 수 있습니다. 또한, 정량화에 대 한 사용 되는 이미지 만들 수 있습니다 광범위 하 게 사용할 수 있는 미래의 메타 분석에 대 한 되므로, 사회 과학에 대 한.
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Protocol
코넬 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 여기, JCS 2004-0038 프로토콜에서 설명 하는 모든 방법을 승인 했습니다.
1입니다. 악기와 문화 미디어 준비
- 지우기 작업 영역 10% 표 백제와 깨끗 하 고 적어도 5 분 동안 작업 영역 표면에 표 백제를 허용. 5 분 후 깨끗 한 종이 타 올, 70% 에탄올 (EtOH) 초과 표 백제를 제거 합니다. 70%와 철저 하 게 해 현미경 청소 EtOH.
참고: 작업 영역 적어도 반 기관 문화의 오염을 피하기 위하여 메 마른 것이 중요 하다. - 70%를 적신 종이 타월로 깨끗 한 집게와가 위를 랩 EtOH 사용의 시간까지.
참고: 이상적인 해 부 도구 난소의 나 이/크기에 따라 달라질 수 있습니다. 최상의 결과 얻으려면 한 날카로운 마이크로 해 시저, 두 좋은 팁 집게 (중 번호 5 또는 55)를 사용 하 여 얻을 수 있습니다와 아이리스가 위를 해 부 한 마이크로. - 원뿔 튜브에 50 mL의 난소 문화 미디어와 37 ° C 물 욕조에 따뜻한 확인 합니다.
- 난소 배양4을 하려면 최소한의 필수 미디어 (MEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 25 m m (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 산 (HEPES), 100 단위/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스, 0.25 µ g/mL x 1을 보충 암포 B (예를 들어, 열 5 mL의 MEM, 45 mL FBS, HEPES, 1.25 mL 및 100 x 재고 페니실린, 스, 암포 B의 0.5 mL 비활성화).
- 접시와 난소 문화 전에 삽입을 준비 합니다.
- 조직 문화 후드에서 35 m m 조직 문화 접시에 난소 문화 매체의 1 mL를 추가 합니다.
- 전 담가 문화 매체와 막을 삽입 합니다. 당 약 0.55 mL, 24-잘 캐리어 조직 배양 플레이트, 그리고 장소는 세포 배양에에서 삽입 잘 일반적으로 충분 한 미디어를 추가 합니다. 삽입의 막 접촉 매체 다는 것을 확인 하십시오.
- 35mm 판과 실험에 난소의 예상된 번호에 따라 셀 문화 삽입과 우물의 수를 준비 합니다. 문화 미디어와 문화 미디어와 37 ° C, 5% CO2, 그리고 대기 O2 인큐베이터에 삽입을 포함 하는 24-잘 캐리어 격판덮개의 1 mL를 포함 하는 35 m m 접시를 놓습니다.
- 옆 절 개 범위 뜨거운 접시를 준비 하 고 37 ° c 온도 설정 37 ° C, 5% CO2 를 유지 하 고 해 부 룸은 대기 O2 인큐베이터.
2. 난소 절 개 및 기관 문화
참고: 난소 수 수 해 부 상 온에서 비 이상적 온도에 노출은 최소한으로.
- 잘린, 한 번에 한 하 여 5, 출생 일에 여성 쥐를 안락사.
참고: 안락사 IACUC 지침 연구 수행 되 고 있는 시설에 따라 실시 해야 합니다. - 동물 스프레이 70 %EtOH. 동물 해 부 현미경 아래 건조 종이 타월 위에 놓습니다. 해 부 현미경 가까운 난소 문화 미디어 포함 35 m m 조직 문화 접시를 놓습니다.
- 집게 또는 마이크로 해 부 아이리스 시저, 절 개는 피부를 통해 동물의 그리고 복 부 구멍으로 잘라 내장을 안 주의 사용 하 여 확인 합니다. 복 부 구멍에 밀어 내장 하 고 난소를 찾습니다. 난소를 추출 하 고 문화 미디어를 포함 하는 35 m m 조직 문화 접시에 그들을 배치.
- 일단 난소에서 동물 해 부 되어 있다, 난소 및 모든 연결 된 조직 증가 하기 위해서는 더 나은 해 부 현미경의 배율 시각화. 좋은 팁 집게 청소, 부르사, 지방 조직 등 모든 비-난소 조직을 제거. 연결 된 비 난소 조직을 제거 하는 경우 난소를 그대로 유지 하는 주의 해야 합니다.
- 난소는 격리, 일단 캐리어 24-잘 접시의 미리 젖된 세포 문화 삽입으로 쌍을 배치 (1.4.2와 1.4.3 단계 참조) 오르간을 축축한 유지 하기에 충분을 매체의 볼륨을 조정 하 고 (하지 않고 완전히 물속에 넣는 그것).
주의: 수 난소를 전송할 때 셀 문화 삽입의 막에 있는 구멍을 찌 르 지 않도록 주의 하십시오. - 장소 explanted 37 ° C, 5% CO2, 그리고 대기 O2 인큐베이터에서 장기.
- 2.1 2.6 각 동물의 난소는 해 부 및 세포 배양에 배치 될 때까지 난소 문화 매체를 포함 하는 24-잘 접시의 삽입 하는 단계를 반복 합니다.
- 변경 사용 하 여 난소 문화 매체 2 일 마다 난소 미디어 aliquots 37 ° C 물 탕에서 따뜻하게 하 고 원하는 실험 시간 지점에서 프로토콜의 3 부로 진행.
3. 조직 고정
- 15 mL 원뿔 튜브에 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1에 4 %paraformaldehyde (PFA) 준비 (예를 들어, 추가 16 %PFA 전자 현미경 학년의 2 mL 1 x PBS의 6 mL).
주의: PFA 유해 물질 이며 화학 후드 처리 해야 합니다. - 취재 갓된 4 %PFA 솔루션으로 조직 하 여 조직 문화 삽입에서 제거 하지 않고 교양된 난소를 수정. 플라스틱 접착제 ()을 피하기 위해 증발 접시의 가장자리를 밀봉 및 샘플 4 ° C에서 밤새 껏 두기 위하여.
참고: 처리 및 조직의 무결성을 촉진 하기 위하여 하지 마십시오 전체 절차를 통해 셀 문화 삽입에서 난소 생기 죠. 삽입의 표면에 부착 된 교양된 난소는 처리에 대 한 유리 손상 또는 기관 잃고 없이. - 3 조직 린스 x 70 %EtOH 고 4.1 또는 섬광 튜브에 가득한 게 단계로 진행 70 %EtOH 4 ° C에서 추가 처리.
참고: 조직 endogenously 사용 하는 경우 70% 샘플을 저장 하는 형광 단백질을 표현 EtOH 크게 줄일 수 신호. 또는 조직 씻어 서 하 고 0.2% 나트륨 아 지 드 (NaN3)와 함께 PBS에 저장 될 수 있습니다. 그러나 NaN3 는,, 매우 독성과 심각한 흡입 위험이. 증기 두건에서 재고 솔루션을 만들고 처리 실험실 코트와 니트 릴 장갑 같은 적절 한 개인 보호 장비를 착용.
4. 전체 산 면역 형광
- Permeabilization 단계 4.3 이전 4 h의 최소 고정된 조직 RT에 1 x PBS에 놓습니다.
- Permeabilization 솔루션 및 차단 솔루션을 준비 합니다.
- 설명 된 대로 permeabilization 솔루션을 준비 합니다. 1 x PBS를 0.2% 폴 리 비닐 알코올 (PVA), 0.1% 나트륨 borohydride (NaBH4) 솔루션 (12 wt.% 14 M 수산화 나트륨 (NaOH) 해결책에서), 및 1.5% 폴 리 에틸렌 글리콜 tert-octylphenyl 에테르 (비 이온 계면 활성 제 세제)를 추가 합니다. 50 mL 원뿔 튜브에서 PBS x 10의 5 mL, PVA, NaBH4, 50 µ L 및 비 이온 계면 활성 제 세제 750 µ L의 0.1 g 추가 다음 초순 추가 최대 50 mL를 물과 혼합 솔루션에서 완전히 될 때까지 실 온에서 잘 선동.
- 설명한 대로 차단 솔루션을 준비 합니다. 1 x PBS, 2.5 M 글리신 pH 7.4의 세제, 0.15% 0.1% 비 이온 계면 활성 제를 추가, 10% 정상 염소 혈 청, 3% 소 혈 청 알 부 민 (BSA), 0.2% 할머니3, 100 단위/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스, 및 0.25 µ g/mL 암포 B. 준비의 재고 솔루션 2.5 500 mL 마지막 볼륨 (pH 7.4)에 초순에 글리신의 93.8 g와 10% 할머니3 의 재고 솔루션 초순; 50 mL에 5 g을 용 해 하 여 용 해 하 여 M 글리신 그런 다음 50 mL 원뿔 튜브에서 10 x PBS, 비 이온 계면 활성 제 세제, 글리신 재고 솔루션, 염소 혈 청, 1.5 g, BSA의 NaN3 재고 솔루션의 1 mL의 5 mL의 750 µ L의 50 µ L의 5 mL을 추가 하 여 차단 솔루션 준비 100 x 재고 페니실린, 스, 암포 B의 0.5 ml. 50 mL 주사기 필터의 마지막 볼륨까지 초순 최종 솔루션을 추가 합니다.
- 제거 및 유리병에서 1 x PBS를 삭제 하 고 완전히 난소 잠수함 충분 한 permeabilization 솔루션을 추가 합니다. 궤도 셰이 커 (예: nutator) 실 온에서 4 시간에 permeabilization 솔루션에서 샘플을 놓습니다.
참고: 보육 시간 기관 두께 따라 달라질 수 있습니다. - Permeabilization 솔루션을 완전히 난소 잠수함 충분 한 차단 솔루션 바꿉니다. 플라스틱 접착제로 유리병을 밀봉 하 고 조직 궤도 셰이 커에 실 온에서 12 h의 최소 잠복기를 둡니다.
- 제조업체의 데이터 시트에 의하여 차단 솔루션에서 기본 항 체 희석을 준비 합니다.
참고: Note 모든 항 체 개간 에이전트와 호환 됩니다. 샘플 당 필요한 평균 볼륨은 약 750 µ L.- Oocyte 정량화 사용 TAp63 (핵 oocyte 마커)과 MVH (세포질 세균 셀 표식).
참고: 면역 형광 이미지에 사용 되는 항 체는 마우스 안티-p63, 토끼 안티-MVH). 1 차적인 항 체 솔루션 재사용된 2 수 x 이상의 프로토콜을 얼룩이 지 사이 4 ° C에 저장 하 고 박테리아의 성장을 방지를 제대로 처리 하는 경우.
- Oocyte 정량화 사용 TAp63 (핵 oocyte 마커)과 MVH (세포질 세균 셀 표식).
- 24-잘 접시에 조직을 포함 하는 삽입 놓고 1 차적인 항 체 솔루션의 약 750 µ L를 추가 합니다. 난소는 완전히 빠져들 확인 합니다. 증발을 최소화 하 고 조직 궤도 셰이 커에 실 온에서 4 일 동안 잠복기를 두고 플라스틱 접착제로 접시를 봉인.
- 세척 솔루션을 준비 합니다.
- 설명 된 대로 세척 솔루션을 준비 합니다. 1 x PBS, 하 게 0.2 %PVA 0.15% 비 이온 계면 활성 제 세제를 추가 합니다. 50 mL 원뿔 튜브에서 PBS x 10의 5 mL, PVA의 0.1 g, 비 이온 계면 활성 제 세제와 50 mL의 최종 볼륨까지 초순 75 µ L를 추가 합니다.
- 1 차적인 항 체 희석 제거 하 고 세척 솔루션의 관대 한 금액을 추가. 항상 잠수함 난소를 확인 하십시오. 궤도 셰이 커에 실 온에 하룻밤 솔루션에 담가 난소를 허용 합니다.
- 세척 솔루션을 장착 하 고 2 시간 이상 궤도 셰이 커에 품 어.
- 4.9 단계 반복 하 여 하나의 추가 시간.
- 솔루션을 차단에 이차 항 체 희석을 준비 합니다.
참고: 사용 하는 2 차 항 체는 반대로 마우스 488 형광 염료 염소와 염소에서 안티 토끼 594 형광 염료에서. 4.5 단계를 참조 하십시오. 평균 볼륨에 대 한 샘플 당 필요합니다. - 난소에서 세척 솔루션을 제거 하 고 이차 항 체 해결책을 추가 하십시오. 빛 (알루미늄 호 일 포장 판)에서 샘플을 보호 하 고 증발을 최소화 하기 위해 플라스틱 접착제로 접시를 봉인. 2 일 동안 실 온에서 궤도 셰이 커에 샘플을 품 어.
참고: 샘플을 보호 하는 알루미늄 호 일을 사용 하 여 모든 후속 인큐베이션 단계에서 계속 합니다. - 이차 항 체 솔루션 샘플에서 제거 하 고 세척 해결책을 추가 하십시오. 8 h는 궤도 흔드는에 품 어.
참고: 4, 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) 얼룩은 원하는 경우, 첫 번째 세척 단계 (~ 8 h 외피)에 DAPI의 50 ng/mL를 추가 합니다. - 하룻밤 세척을 위한 세척 솔루션을 교체 합니다.
- 준비 하는 동안 개간 솔루션 (섹션 5 참조), 신선한 솔루션으로 솔루션을 세척 하는 하룻밤을 장착 하 고 실 온에서 궤도 셰이 커에 샘플을 계속.
5입니다. 난소 지우기 및 이미징
- ScaleS(0) 솔루션을 청소 준비 합니다.
- ScaleS(0) 주어진된 비율에 시 약을 추가 하 여 솔루션10 삭제 준비: 40 %D-(-) 톨 (w/v), 10% 글리세롤, 4.3 M 요소, 및 20% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO), pH 8.1 (예: 50 mL 원뿔 튜브에 추가 글리세롤, sorbitol의 10 g의 2.5 mL DMSO의 5 mL 및 9 M 우 레 아 25 mL의 총 볼륨의 12 mL. 30 분 동안 50 ° C에서 반전 하 여 솔루션을 믹스와 사용 전에 드.)
- 세척 솔루션을 제거 하 고 솔루션을 지우기에 샘플 잠수함. 더 나은 결과 위해 궤도 셰이 커에 샘플을 유지 합니다.
- 2 청소 솔루션을 대체 조직을 투명 하 게 (약 2 일) 될 때까지 매일 x.
- 조직에는 선택이 취소 되어, 일단 준비 샘플 영상에 대 한 신중 하 게 벌금 교양된 난소를 포함 하는 삽입 멤브레인을 제거 하 여 메스 고 유리 슬라이드에 샘플 배치 팁.
- 영상 현미경 광학 단면 수에 샘플으로 이동 합니다.
6. oocyte 정량화
참고: 셀을 정할 수 있는 많은 다른 컴퓨터 프로그램 있습니다. 아래 설명 된 oocyte 정량화 피지 ImageJ14비 상업적 이미지 처리 패키지를 사용 하는 프로토콜이입니다.
- 이미지 이미지 드롭-다운에서 형식 에서 흑인과 백인 8 비트 이미지로 변환 (DAPI 채널) 없이 관심의 특정 세포 표식에 대 한 Z-스택 이미지 시리즈의 병합된 최대 강도 투영을 사용 하 여, 메뉴입니다.
- 이미지 메뉴에서 조정 탭을 강조 표시 하 고 임계값을 선택 합니다.
- 수동으로 가장 각 개별 oocyte 식별 수준 임계값을 조정. 수준이 결정 되 면 흑백 이미지를 생성 하려면 적용 을 클릭 합니다. 완료 되 면, 타원형 또는 Freehand 아이콘을 사용 하 여 묘사 하 여 샘플을 계량.
참고: 피지 ImageJ는 미세 입자 정량화에 사용 될 이미지를 조정 하려면 다른 옵션이 있습니다. 예를 들어, 과정에에서 | 바이너리 탭, 계산 될 것입니다 무슨의 탐지를 향상 하는 데 사용할 수 있는 다른 옵션이 있다. 그림 4에서는 더 낭을 개별화 하는 데 사용 하는 옵션 Erode, 구멍 채우기, 및 마지막으로 유역이었다. - 분석 메뉴에서 분석 입자를 선택 합니다. 원하는 해상도 따라 매개 변수를 설정 합니다.
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Representative Results
6 주요 단계를 포함 하는이 프로토콜 난소의 절 개를 그림 1에 설명 된 대로 다음. 그림 2 , 그림 3 , 그림 4 조직 난소와 피지 ImageJ를 사용 하 여 전체 조직 oocyte 정량화에 대 한 삭제의 최적화를 포함 하는이 프로토콜의 가장 새로운 기능을 강조. 그림 2A 는 난소에 추가 청소 솔루션 (오른쪽) 후 요 5 일 출생 후 고정된 난소 (왼쪽) 전에 1 h의 이미지를 보여줍니다. 난소는 솔루션을 지우기에 침수 되 고 분 이내 반투명 될 시작 됩니다. 들어가면, 그림 2A 에서 몇 군데 같은 작은 난소 손상 없이 처리 하기 어려운 된다. 따라서, 교양된 explanted 난소 작업 들은 교양 있는 삽입 막의 다공성 표면에 부착 되 고 그들은 때문에 유리 하다. 삽입 막에 난소의 첨부 파일 자체 (그림 2B 및 그림 3) 난소 보다는 오히려 막 삽입 처리 하는 실험을 수 있습니다. 또한, 가까이에 경작 하는 난소 융합 것입니다 그리고 그림 2B 쇼 (왼쪽) 전에 융합된 난소를 연결 (오른쪽) hematoxylin에 지운 후 샘플 스테인드.
개간 가능; 없이 교양된 난소의 광학 단면 수행 그러나, 세포 조직 내의 깊은 배경에서 차별화 하기 어려운 신호 있고 명확한 신호의이 부족 막아 적절 한 oocyte 정량화 (그림 3A). 그림 3A, 달리 그림 3B 는 전체 기관에 걸쳐 oocyte 정량화 가능한 허가 샘플의 대표적인 이미지입니다. 그림 3B 쉽게 측정할 수 수 한 표시 (그림 3B)와 같은 선택된 교양된 난소의 전체 기관 영상 신호 깊은 조직 및 이미지 내에서 상당한 손실 없이 수행할 수 있습니다 보여 줍니다. 이러한 샘플에 oocytes를 측정 하는 한 가지 방법은 최대 강도 프로젝션 광학 섹션의 Z-스택 시리즈 변환 후 이미지 처리 패키지와 파일 처리입니다. 그림 4 및 그림 1 보충 피지 ImageJ를 사용 하 여 그림 3B 에 oocytes의 수를 측정 하는 단계를 강조 표시 합니다. 추가 표 1 피지-ImageJ의 입자 (oocyte) 부 량 포함 되어 있습니다. 또한이 메서드를 사용 하 여 입자의 부 량 때문에 입자의 수를 모두 각 입자의 해당 영역에 대 한 정보는 소프트웨어에 의해 계산 및 제공 oocyte 크기에 따라 다른 낭의 분석에 대 한 수는 사용자입니다.
그림 1: 전체 프로토콜의 도식 대표. (1) 난소의 해 부와 프로토콜 시작의 시각적 요약 다음 난소 문화 (2), 4% 조직 고정 PFA (3) 특정 항 체 (4), 딥 (5) 영상, 광학 섹션 사용 하 여 얻는 조직 삭제를 사용 하 여 immunostaining confocal 현미경 (6) 그리고 결말 oocyte 정량화 (7). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 삭제 취소 및 허가 난소 조직 불투명도 차이. (A) 5 pup 지우기 (왼쪽)와 약 1 시간 (오른쪽)의 가벼운 개간 후 출생 후 하루에서 난소. (B) 여러 난소 7 일 동안 서로 게 가까운 근접에서 경작. 각 샘플의 2 개의 다른 배율 표시 됩니다. 왼쪽 이미지는 청소 하 고 오른쪽 이미지는 개간 하지 않고 있다. 난소 문화 삽입의 막에 첨부 것입니다 하 고 프로토콜을 통해 연결 된 보관 하는 경우 더 나은 처리 될 수 있습니다. 개선 하기 위해 조직의 하얀 빛을 사용 하 여 이미징에 대 한 대비, 난소 고정 후 5 분 동안 hematoxylin에 침수 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 삭제 취소 및 허가 난소의 면역 형광 이미징. 출생 후 하루 5 새끼에서 난소 7 일에 대 한 교양 했다 고 설명 하는 프로토콜을 얼룩이 지는 전체 산 면역 형광 검사에 따르면 스테인드. 빨간색으로 표시 마우스 바사 체 (MVH) 생식 세포를 식별 하 고 녹색으로 표시 하는 세포는 세포 핵 oocyte 특정 마커, p63 표시 있습니다. DAPI, 파란색, 모든 세포의 핵을 사용 되었다. (A) 개간 없이 난소의 면역 형광 이미지. 개간으로 난소의 (B) 면역 형광 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: oocytes 피지 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 계량 하는 방법에 대 한 시각적 워크플로. 데이터 분석을 촉진 하기 위하여 3D 이미지 대신 최대 강도 투영 confocal 비행기에서 파생 된 이미지를 줄일 수 있습니다. 최대 강도 프로젝션와 사용자는 대상 입자 분명 되는 방식으로 이미지 임계값 매개 변수를 정의할 수 있습니다. 단순화 된 이미지를 얻은 소프트웨어는 oocytes를 계산 하는 데 사용 됩니다. 매개 변수를 설정 하는 동안 이미지를 비판적으로 검토 하는 것이 중요 합니다. 이 그림에 입자/oocyte 임계값을 설정할 수 있습니다 방법의 예입니다. 각 이미지 위에 텍스트 피지 ImageJ에 그 이미지를 가져오는 데 사용 하는 매개 변수를 강조 표시 합니다. 소프트웨어 ( 보충 표 1참조) 입자의 영역 측정으로 테이블을 생성 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 그림 1: oocytes 피지 ImageJ 소프트웨어 (낮은 배율)를 사용 하 여 계량 하는 방법에 대 한 시각적 워크플로. 이 그림 가까이에 두 개의 난소를 위한 oocyte 정량화. 수행 하는 단계는 그림 4와 동일 합니다. 2,436 입자/낭 소프트웨어에 의해 계산 되었다. 부 량 데이터는 소프트웨어에서 얻은 보충 표 1에서 찾을 수 있습니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 표 1: 여 포 부 량 계산 피지 ImageJ. 이 테이블 계산된 낭과 해당 지역 보충 그림1에서 이미지에서 생성 된 목록을 포함 합니다. 정량화에 대 한 사용 되는 입자 크기는 10 µ m2에서 설정 했다-무한대. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
포유류 복제의 연구를 사용 하 여 정기적으로 세포 배양에 의무가 있지 않은 특수 셀을 측정 해야 합니다. 그러나, 문화 시스템 비보 전 난소 및 여 포 생존1,15유지에 효과적입니다. 난소 문화 중 조직 확산을 통해 영양분의 교환에 대 한 더 큰 표면 영역을 필요합니다. 따라서, 5 일 오래 된 마우스 난소 크기에 이상적입니다 및 장기 문화에 대 한 모양. 이 프로토콜은 문화에서 7 일 동안 유지 하는 난소에 대 한 최적화 된 하지만 난소 문화 길이 특정 과학적인 질문1,4에 따라 조정 될 수 있습니다. 비교 결과 난소 10 일 (데이터 표시 되지 않음), 3 일에 대 한 교양 있고 하지만 10 일 큰 문화 효과적, 따라서 프로토콜의 한계를 강조 하지 않을 수 있습니다 보다 더 오래 된 동물에서 난소에 달성 되었습니다.
비보 전 난소의 배양이 필요 하지 않습니다, 경우를 수정 하 고 수정 큰 조직 크기9,16에 조정 해야 할 수 있습니다 비록, 프로토콜 이전 난소를 얼룩 가능 하다. 그것은 더 큰 난소 중 더 이상 항 체 외피 단계 또는 조직 할 수 있는 몇 가지 작은 조각으로 분할 하 여 얼룩 수 있습니다 나타내는 기관으로 항 체의 수동 확산에 따라 얼룩 프로토콜 설명 영상 후 개축 될. 요소와 그것 보다 짧은 잠복기 때문에 신생아 교양된 난소에 대 한 효과가 입증 하는 에이전트를 삭제 하는 ScaleS(0)에 톨을 사용 하 여 요소와 글리세롤 개간 에이전트에 대 한 보고 (ScaleA2)8,10 . 또한, 나트륨 borohydride (NaBH4) permeabilization 솔루션에서의 낮은 농도 사용 하 여 배경 잡음을 감소 하 고, 1 차 및 이차 항 체와 샘플의 더 이상 외피, 함께 촉진 조직 내의 깊은 얼룩. 또한,는 permeabilization 및 세척 솔루션에 PVA 사용 하 여 조직17,18에 집착 스 퓨 리 어스 입자를 방지 합니다.
이 프로토콜에서 교양된 건강 한 난소는 건강에 해로운 난소 고정 및 처리에 그것에서 분리 수 있습니다 하는 동안 삽입 막에 연결 됩니다. 집게와 느슨한 조직 처리 하는 것은 난소 및 가능성이 타협 이미징 손상 됩니다. 또는, 느슨한 조직 5 %agarose 플러그에 포함 된 수 또는 여 팁 충분 하지 그것을 손상 하는으로 전송 펫으로 처리. Immunostaining에 관해서는이 프로토콜에 사용 되는 것 이외의 기본 항 체 다르게 수행할 수 있습니다 그리고 permeabilization 및 인큐베이션 단계에서 최적화를 해야 할 수도 있습니다.
마지막으로, 포함 하는 전통적인 파라핀 직렬 섹션에 비해 젊은 난소에서 난 포를 측정으로 대체 접근 프로토콜에 설명 합니다 또는 다른 이전 낭 전체 마운트 이미지에서의 체적 정량화 기술 5 , 9 , 16. follicular 개발19의 특성과 다른 단계 사용 연구자의 요구 사항, 절차에 따라 oocyte 정량화 프로토콜에서 설명 또한 될 수 있습니다. 소프트웨어에 의해 생성 된 입자 영역 셀 직경을 결정 하 고 따라서 소 낭 모양 단계 유추를 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리 유용한 제안 및 기술 지원에 대 한 레 베 카 윌리엄스와 코넬 BRC 이미징에서 요한 나 델라 크루스와 앤드류 Recknagel 감사합니다. 이 작품 건강 그랜트의 국가 학회에 지원 되었다 S10-OD018516 (코넬의 이미징 시설)에, J.C.B.에 T32HD057854와 J.C.S. R01-GM45415
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro dissecting scissor 4.5", straight, sharp points | Roboz | RS-5912 | Micro dissecting scissor |
| Jewelers style forceps 4-3/8", style 5 | Integra Miltex | 17-305X | Fine tip forceps |
| Micro Iris Scissors 4", straight, sharp points | Integra Miltex | 18-1618 | Micro dissecting iris scissor or micro dissecting spring scissor |
| 1X Minimal Essential Media (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11090-081 | |
| Fetal Bovine Serium | Corning | 35011CV | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | Used in Step 1.3.1 |
| 35mm Tissue Culture Treated Dish | Corning | 430165 | |
| Nunc™ 24-Well Carrier Plate for Cell Culture Inserts | ThermoFisher Scientific | 141006 | Pore size: 8μm |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% solution |
| 1X Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
| Nutator mixer GyroTwister™ | Labnet | S1000-A-B | three dimensional shaker |
| Normal Goat Serum | VWR | 103219-578 | |
| Bovine Serum Albumen (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002-25G | |
| Sodium borohydride solution (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452904-25ML | Use the solution, rather than the tablet or powder form |
| Polyvinyl Alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136-250G | Cold water soluble |
| Triton™ X-100 | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | polyethylene glycol tert-octylphenyl ether |
| Syringe filters | ThermoFisher Scientific | 725-2520 | 25mm |
| 10mL Syringes | BD | 309695 | |
| Mouse anti-p63 antibody (4A4) | Biocare Medical | CM 163A | Dilution 1:500 |
| Rabbit anti-MVH antibody | Abcam | ab13840 | Dilution 1:600 |
| Alexa Fluor® goat anti-mouse 594 | ThermoFisher Scientific | A-11032 | Dilution 1:1000 |
| Alexa Fluor® goat anti-rabbit 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | Dilution 1:1000 |
| 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| D-(-)sorbitol | Sigma-Aldrich | 240850-100G | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012-100ML | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-5X10ML | |
| FIJI-ImageJ | Image processing software | ||
| Disposable plastic transfer pipettes | VWR | 414044-034 |
References
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