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Biology

एक इन विट्रो मॉडल के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए 5-Aminolevulinic एसिड मध्यस्थता Photodynamic थेरेपी पर Staphylococcus aureus

Published: April 16, 2018 doi: 10.3791/57604
Automatic Translation
*1, *2, 2, 2, 2, 3, 1, 2
1Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Eye & ENT Hospital, Shanghai Key Clinical Disciplines of otorhinolaryngology, Fudan University, 2Key Laboratory of Medical Molecular Virology of Ministries of Education and Health, Department of Medical Microbiology and Parasitology, School of Basic Medical Science, Shanghai Medical College of Fudan University, 3Department of Dermatology, Huashan Hospital, Fudan University
* These authors contributed equally

Summary

इस पांडुलिपि एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए एक Staphylococcus aureus फिल्म पर 5-aminolevulinic एसिड की मध्यस्थता photodynamic थेरेपी (ाला-pst) के रोगाणुरोधी प्रभाव का अध्ययन. यह प्रोटोकॉल भविष्य में pst के साथ बैक्टीरियल फिल्म के उपचार का अध्ययन करने के लिए एक इन विट्रो मॉडल को विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Abstract

Staphylococcus aureus (एस aureus) एक आम मानव रोगज़नक़, जो pyogenic और प्रणालीगत संक्रमण का कारण बनता है । एस aureus संक्रमण एंटीबायोटिक प्रतिरोधी उपभेदों के उद्भव के कारण न केवल उंमूलन करने के लिए मुश्किल है लेकिन यह भी अपने को बनाने की क्षमता है । हाल ही में, photodynamic थेरेपी (pst) में एक संभावित उपचार के रूप में दर्शाया गया है कि फिल्म संक्रमण को नियंत्रित करने के लिए । हालांकि, आगे के अध्ययनों में बैक्टीरियल फिल्म पर इसके प्रभाव के बारे में हमारे ज्ञान में सुधार करने के लिए आवश्यक हैं, साथ ही अंतर्निहित तंत्र । इस पांडुलिपि 5-aminolevulinic एसिड (5-ाला), वास्तविक photosensitizer, protoporphyrin नौवीं (PpIX) के एक अग्रदूत साबित के साथ pst के इन विट्रो मॉडल में वर्णन करता है । संक्षेप में, परिपक्व एस aureus फिल्म अला के साथ मशीन और फिर प्रकाश को उजागर किया गया । इसके बाद, अला के जीवाणुरोधी प्रभाव-pst एस aureus पर फिल्म की गणना द्वारा quantified था कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFUs) और व्यवहार्यता के द्वारा visualized फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (CLSM) के माध्यम से धुंधला । प्रतिनिधि परिणाम एस aureus फिल्म पर अला-pst की एक मजबूत जीवाणुरोधी प्रभाव का प्रदर्शन किया । इस प्रोटोकॉल सरल है और एक इन विट्रो मॉडल को विकसित करने के लिए ाला-pst के साथ एस aureus के उपचार का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । भविष्य में, यह भी pst ंयूनतम समायोजन के साथ विभिंन जीवाणु उपभेदों के लिए अंय photosensitizers का उपयोग अध्ययन में संदर्भित किया जा सकता है ।

Introduction

एस aureus एक महत्वपूर्ण ग्राम-सकारात्मक रोगज़नक़ है कि मानव मेजबान की त्वचा और म्यूकोसा उपनिवेश करता है । इसकी क्षमता के रूप में फिल्म बनाने के लिए अपनी रोगजनन1का एक महत्वपूर्ण पहलू माना जाता है । बैक्टीरियल फिल्म एक स्वयं में एंबेडेड बैक्टीरिया का एक समुदाय है मैट्रिक्स का उत्पादन किया है, जो extracellular बहुलक पदार्थों से बना है, polysaccharide, डीएनए सहित, और प्रोटीन । इस मैट्रिक्स जीवाणु संक्रमण के हठ में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, मानव प्रतिरक्षा प्रणाली और वर्तमान विरोधी माइक्रोबियल चिकित्सा के लिए प्रतिरोध के एक उच्च डिग्री के लिए योगदान2। एंटीबायोटिक्स अभी भी जैविक फिल्म संक्रमण के लिए प्रमुख उपचार कर रहे हैं, हालांकि जैविक फिल्मों पर एंटीबायोटिक दवाओं के प्रभाव सीमित हैं । यह पहले से दिखाया गया है कि जैविक फिल्मों में कोशिकाओं को 10-१,००० बार और अधिक एंटीबायोटिक दवाओं के लिए अपने planktonic समकक्षों की तुलना में प्रतिरोधी रहे है3। इस प्रकार, वैकल्पिक रणनीतियों के लिए इस मुद्दे पर जीत की जरूरत है ।

pst, जीवाणु संक्रमण के लिए एक वैकल्पिक उपचार, photosensitizers को सक्रिय करने के लिए एक उपयुक्त तरंग दैर्ध्य के प्रकाश का उपयोग करता है । यह प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS), जो कोशिका दीवार में खलल डालने से कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए घातक हैं के उत्पादन की ओर जाता है, एंजाइमों को निष्क्रिय, और हानिकारक डीएनए4। इस बहु-लक्ष्य विशेषता यह मुश्किल जीवाणुओं के लिए pst उपचार के प्रतिरोध को विकसित करने के लिए बनाता है ।

जीवाणु और कवक पर pst के प्रभाव रोगाणुरोधी, कई photosensitizers, जैसे toluidine नीला, मैलाकाइट ग्रीन, methylene नीला, क्लोरीन e6, और porphyrins के साथ, की पिछली रिपोर्टों में अध्ययन किया गया है5,6, 7,8,9,10,11,12,13. 5-ाला, वास् तविक photosensitizer की एक दवा, PpIX, इसका छोटा आणविक भार और द्रुत ूमाणपऽ12,14की विशेषता है । ये फायदे एक चिकित्सीय आवेदन के रूप में ाला-pst प्रमुख क्षमता देते हैं । हालांकि planktonic जीवाणुओं पर ाला-pst का प्रभाव कई समूहों द्वारा अध्ययन किया गया है12, बैक्टीरियल फिल्म पर रोगाणुरोधी-pst के प्रभाव का अभी तक आविर्भाव नहीं हुआ है. इस बीच, पिछले अध्ययनों के बीच परिणामों की तुलना करना कठिन है । एक कारण यह है कि विविध समूहों द्वारा विभिंन प्रोटोकॉल का उपयोग किया जाता है । इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक इन विट्रो मॉडल के एक अला-pst हमारे पिछले काम15पर आधारित प्रणाली । इस मॉडल के प्रभाव CFU गणना और CLSM के साथ धुंधला की व्यवहार्यता की पुष्टि की थी ।

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Protocol

1. फिल्म गठन

  1. ९६ में फिल्म गठन-खैर microplates
    1. एस aureus तनाव USA300 और 3 से अधिक फिल्म बनाने नैदानिक उपभेदों (C1-C3)-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत पुनर्प्राप्त ।
      नोट: नैदानिक उपभेदों की क्षमता के लिए फार्म का microtiter प्लेट परख द्वारा निर्धारित किया गया था पहले15वर्णित है ।
    2. 5 मिलीलीटर tryptone सोया शोरबा (TSB) माध्यम में जीवाणु Inoculate, और स्थिर चरण के लिए रातोंरात ३७ डिग्री सेल्सियस पर झटकों के साथ एक मशीन में खेती ।
    3. 25 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ४,००० x g पर रातोंरात बैक्टीरियल संस्कृति केंद्रापसारक और फिर supernatant त्यागें । २.० x 109 CFU/एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए फास्फेट बफर खारा (पंजाब) में छर्रों reसस्पेंड.
      नोट: बैक्टीरिया की एकाग्रता ऑप्टिकल घनत्व को मापने के द्वारा अनुमानित और आगे थाली गिनती16द्वारा निर्धारित किया गया था, खुलासा है कि 1 आयुध डिपो६०० निलंबन के १.५ x 108 CFU/
    4. 1:200 (१.० x 107 CFU/एमएल) TSB मध्यम में ०.५% ग्लूकोज युक्त बैक्टीरियल सस्पेंशन को पतला । Inoculate २०० µ एल बैक्टीरियल सस्पेंशन की एक अच्छी तरह से एक कोशिका-संस्कृति के इलाज के polystyrene ९६-अच्छी तरह से microplate में ।
    5. microplate एक अच्छी तरह से oxygenated वातावरण के तहत 24 घंटे के लिए ३७ ° c पर स्थिर रूप से मशीन ।
      नोट: परिपक्व फिल्म गठन के लिए मशीन समय अलग बैक्टीरियल उपभेदों के लिए भिंन हो सकते हैं; यह pst experiment15से पहले निर्धारित किया जाना चाहिए ।
    6. वेल्स में मीडिया को त्यागें और microplate कुओं को तीन बार पंजाबियों से धो लें और फिर supernatant को त्याग दें ।
      नोट: कदम बहुत धीरे से बाहर किया जाना चाहिए गठित की गई फिल्म परेशान से बचने के लिए ।
  2. व्यंजन में फिल्म निर्माण
    1. Inoculate TSB मध्यम के 5 मिलीलीटर में एस aureus तनाव USA300, और स्थिर चरण के लिए रातोंरात ३७ डिग्री सेल्सियस पर मिलाते के साथ एक मशीन में खेती ।
    2. 25 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ४,००० x g पर रातोंरात बैक्टीरियल संस्कृति केंद्रापसारक और फिर supernatant त्यागें । २.० x 109 CFU/एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए पंजाब में छर्रों reसस्पेंड । फिर, बैक्टीरियल सस्पेंशन को 1:200 (१.० x 107 CFU/एमएल) को पतला कर TSB मीडियम में ०.५% ग्लूकोज । Inoculate एक ३५-mm ऑप्टिकल क्वालिटी ग्लास नीचे सेल कल्चर डिश में बैक्टीरियल सस्पेंशन के 2 मिलीलीटर, और स्थिर रूप से गर्मी में ३७ ° c 24 घंटे के लिए ।
      नोट: बैक्टीरिया की एकाग्रता ऑप्टिकल घनत्व को मापने के द्वारा अनुमान लगाया गया था ।
    3. एक पिपेट के साथ मीडिया महाप्राण, और फिर तीन बार पंजाबियों के साथ धीरे पकवान में इस फिल्म से कुल्ला और फिर, supernatant ध्यान से त्यागें ।
      नोट: डिश के नीचे से पिपेट टिप को छूने से बचें । कदम २.२ तुरंत इस कदम के बाद गठित की जाने वाली फिल्म के सूखने को रोकने के लिए किया जाना चाहिए ।

2. प्रकाश विकिरण

  1. 5 स्टोर-एक 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में ाला । प्रयोग से पहले, 5-10 मिमी के लिए पंजाबियों के साथ ाला पतला ।
    नोट: 5-ाला समाधान प्रयोग से पहले नए सिरे से तैयार किया जाना चाहिए ।
  2. प्रयोगात्मक समूह में, microplate या 2 मिलीलीटर की संस्कृति पकवान के लिए प्रत्येक कुआं के लिए 10 मिमी का ाला के २०० µ एल जोड़ें । कवर प्लेट/एल्यूमीनियम पंनी के साथ पकवान, और 1 एच के लिए मशीन । फिर, विकीर्ण एक प्रकाश उत्सर्जक डायोड के साथ प्लेट/१०० मेगावाट/cm2 की हल्की तीव्रता के साथ 1 h के लिए ३६० J/cm2 के एक प्रमुख तरंग दैर्ध्य पर ६३३ ± 10 एनएम17की एक हल्की खुराक प्राप्त करने के लिए ।
    नोट: आदेश में प्रकाश ऊर्जा को प्रभावी ढंग से और समान रूप से कुओं के सभी में फिल्म के लिए वितरित/६.० सेमी पर अच्छी तरह से प्रकाश स्रोत के शिखर से दूरी को ठीक/डिश, और केंद्रीय विकिरण क्षेत्र के लिए प्रयोगात्मक क्षेत्र सीमा (10 सेमी x 8 cm). यह सुनिश्चित करने के लिए कि परिणाम reproducible हैं, प्रयोग एक ही कमरे के तापमान पर किया जाना चाहिए ।
    एलईडी विकिरण कदम में, इस तरह सूरज की रोशनी, कमरे प्रकाश या लंप के रूप में अंय प्रकाश स्रोतों, थाली के प्रत्यक्ष जोखिम से बचने के लिए, एलईडी प्लेट ले जाने से पहले चालू किया गया था/विकिरण क्षेत्र के लिए पकवान, और प्रकाश काफी उज्ज्वल आपरेशन खत्म करने के लिए किया गया था ।
  3. नियंत्रण समूह सेट अप करें (हमारे प्रयोग में तीन नियंत्रण समूह स्थापित किए गए थे) ।
    1. पहले नियंत्रण समूह के लिए (ाला-LED-), microplate या कल्चरल डिश के लिए 2 मिलीलीटर के प्रत्येक चहेतों को पंजाबियों के २०० µ एल जोड़ें । कवर प्लेट/एल्यूमीनियम पंनी के साथ पकवान, और यह 2 एच के लिए मशीन ।
    2. दूसरा नियंत्रण समूह के लिए (अला + एलईडी-), microplate या संस्कृति डिश के लिए 2 मिलीलीटर की प्रत्येक अच्छी तरह से 10 मिमी के २०० µ एल जोड़ें । कवर प्लेट/एल्यूमीनियम पंनी के साथ पकवान, और यह 2 एच के लिए मशीन ।
    3. तीसरे नियंत्रण समूह के लिए (ाला-LED +), microplate या कल्चरल डिश के लिए 2 मिलीलीटर के प्रत्येक चहेतों को पंजाब के २०० µ एल जोड़ें । प्लेट कवर/एल्यूमीनियम पंनी के साथ पकवान, और यह 1 एच के लिए मशीन । फिर ६३३ ± 10 एनएम17की एक प्रमुख तरंग दैर्ध्य में ३६० J/cm2 प्रकाश विकिरण के साथ एलईडी को प्लेट बेनकाब ।
      नोट: एलईडी विकिरण कदम में, इस तरह धूप, कमरे प्रकाश, या लंप के रूप में अन्य प्रकाश स्रोतों के लिए थाली के प्रत्यक्ष जोखिम से बचें ।

3. pst उपचार की प्रभावशीलता का निर्धारण

नोट: एस aureus फिल्म पर अला-pst के प्रभाव की पुष्टि करने के लिए, के साथ या ाला-pst के बिना कोशिकाओं की व्यवहार्यता CFU गिनती के रूप में के रूप में अच्छी तरह से व्यवहार्यता धुंधला द्वारा मूल्यांकन किया गया था ।

  1. शेष व्यवहार्य बैक्टीरियल कोशिकाओं का निर्धारण
    1. ाला-pst उपचार के बाद, कुओं में मीडिया को छोड़ना और पंजाबियों के साथ कुओं को तीन बार प्रायोगिक और नियंत्रण दोनों समूहों के लिए सभी गैर-अनुयाई कोशिकाओं को हटाने के लिए धो लें ।
      नोट: यह कदम बहुत धीरे से किया जाना चाहिए ।
    2. अनुयाई जीवाणु कोशिकाओं पिपेट टिप के साथ कुओं से अच्छी तरह से परिमार्जन और शंकु ट्यूबों में कोशिकाओं को इकट्ठा ।
    3. 4 ° c में 10 मिनट के लिए ४,००० x g पर बैक्टीरियल सस्पेंशन केंद्रापसारक, तो supernatant त्यागें ।
    4. पंजाब में ०.२५% pancreatin एंजाइम के 1 मिलीलीटर में बैक्टीरिया reसस्पेंड और १.५ एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
    5. 10 मिनट के लिए ४,००० x g पर केंद्रापसारक; supernatant को त्यागें, फिर २०० में गोली स्थगित कर पंजाब के µ एल.
    6. पंजाब के साथ सेल समाधान के 1:10 सीरियल कमजोरियां बनाओ; फिर, tryptone सोया आगर (TSA) प्लेट पर प्रत्येक धारावाहिक कमजोर पड़ने के नमूने के 5 µ एल जोड़ें । 16 ज के लिए ३७ ° c पर TSA थाली मशीन; फिर, गिनती (नग्न आंखों से) बैक्टीरियल कालोनियों की संख्या (CFU/एमएल) ।
  2. एस aureus का अवलोकन CLSM द्वारा फिल्म
    1. प्रकाश विकिरण के बाद, तीन बार पंजाबियों के साथ संस्कृति डिश में इस फिल्म को धो लें ।
      नोट: यह कदम बहुत धीरे से किया जाना चाहिए ।
    2. 1 µ एम ग्रीन-फ्लोरोसेंट परमाणु और गुणसूत्र दाग है कि prokaryotic कोशिका झिल्ली (उदा, SYTO9) और 1 µ एम propidium आयोडाइड (PI) 20 मिनट के लिए के लिए पारगंय है की 1 मिलीलीटर जोड़ें के साथ ही मृत कोशिकाओं दाग ।
    3. एक 63X १.४-NA तेल विसर्जन उद्देश्य लेंस के साथ एक CLSM के तहत व्यवहार्य कोशिकाओं (ग्रीन प्रतिदीप्ति, पूर्व/४८५ एनएम/530 एनएम) और मृत कोशिकाओं (लाल प्रतिदीप्ति, पूर्व/
    4. माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवियों को उत्पन्न.

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Representative Results

दोनों USA300 और तीन नैदानिक उपभेदों (चित्रा 1) में (ाला-एलईडी-, ाला + led-, और ाला-led +) के नियंत्रण की तुलना में जब इस जीवाणुओं की व्यवहार्यता को ाला-pst उपचार के बाद कम किया गया ।

CFU परख से परिणामों की पुष्टि करें और सीटू में एस aureus फिल्म पर ाला-pst की जीवाणुरोधी प्रभाव का पालन करने के लिए, USA300 के साथ CLSM द्वारा visualized थे । व्यवहार्य और मृत कोशिकाओं हरे और लाल प्रतिदीप्ति के साथ दाग, क्रमशः थे । छवि से पता चला है कि इस फिल्म में बैक्टीरिया की सबसे अला-pst, जो CFU परख (चित्रा 2) के परिणामों के अनुरूप था द्वारा मारे गए थे ।

Figure 1
चित्रा 1: के प्रभाव पर अला-pst पर फिल्म । CFU/एमएल लॉग-बदल गया था और USA300 में मतलब ± मानक विचलन और तीन नैदानिक उपभेदों (C1-C3) ाला-pst (ाला + एलईडी +) के साथ या नियंत्रण शर्तों के तहत के रूप में दिखाया (ाला-led-, ाला + led-, ाला-led +). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: प्रतिनिधि CLSM लाइव/ aureus के साथ फिल्म के चित्र के साथ/ USA300 बैक्टीरिया द्वारा गठित की गई फिल्म के साथ या ाला-pst (पैनल ए के बिना इलाज किया गया: ाला-led-, पैनल B: ाला + led-, पैनल C: ाला-led +, पैनल D: ाला + led +), और फिर SYTO9 (green प्रतिदीप्ति) और PI (red प्रतिदीप्ति) के साथ सना हुआ लाइव और डेड बैक्टीरिया का प्रतिनिधित्व करने के लिए स्वतंत्र. एक 63X १.४-ना तेल विसर्जन उद्देश्य का इस्तेमाल किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

pst कैंसर के उपचार के लिए एक अच्छी तरह से अध्ययन चिकित्सा गया है क्योंकि यह अधिक से अधिक १०० साल पहले18का आविष्कार किया गया था । पिछले दशक में, pst एक रोगाणुरोधी रणनीति के रूप में लागू किया गया है और कुछ एंटीबायोटिक प्रतिरोधी रोगजनक बैक्टीरिया के खिलाफ प्रभावशीलता को दिखाया गया है12। planktonic राज्य की तुलना में, बैक्टीरियल फिल्म एंटीबायोटिक उपचार के लिए अधिक प्रतिरोधी होना दिखाई देते हैं3, जबकि इस पर ाला-pst के प्रभाव को अभी तक पूरी तरह से जांच नहीं की गई है ।

इस अनुच्छेद में, एक इन विट्रो ाला-pst सिस्टम का वर्णन किया गया था, और एस aureus पर इस मॉडल के जीवाणुरोधी प्रभाव का प्रदर्शन किया गया । दो तरीकों को अला-pst के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए इस प्रोटोकॉल में एस aureus फिल्म पर इस्तेमाल किया गया । जबकि CFU परीक्षण उपचार के बाद व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना द्वारा रोगाणुरोधी प्रभाव का प्रदर्शन, CLSM के साथ फ्लोरोसेंट व्यवहार्यता धुंधला न केवल CFU परीक्षण के परिणामों की पुष्टि की है लेकिन यह भी जीवित और मृत के रूपात्मक चरित्र का पता लगाया सीटू मेंबैक्टीरिया । दोनों विश्लेषणात्मक तकनीकों का प्रयोग एक साथ एक आदर्श दृष्टिकोण को ाला-pst के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए है । CLSM परिणामों के आधार पर, मृत जीवाणु कोशिकाओं को मुख्य रूप से ऊपरी परत में वितरित किया गया, जबकि नीचे की परत में बैक्टीरिया के कुछ जीवित15रहे । बाद CFU परख में बैक्टीरियल कालोनियों का स्रोत हो सकता है । एक समान परिणाम ओ ' नील एट अलद्वारा किए गए एक अध्ययन में मनाया गया है, जो भीतरी परत या प्रकाश की अक्षमता में photosensitizers के कम संचय से समझाया गया था कि इन क्षेत्रों में घुसना19।

इस प्रोटोकॉल में, परिपक्व फिल्म pst के लिए जोखिम से पहले 1 घंटे के लिए अला के 10 मिमी के साथ मशीन था । इन मापदंडों को दो पूर्व प्रयोगों के परिणामों के आधार पर चुना गया था. पहला, ाला के रोगाणुरोधी प्रभाव को प्रकाश विकिरण के बिना परीक्षण किया गया था अला के विभिन्न सांद्रता और एस aureus के साथ मशीन के लिए समय की विभिन्न मात्रा का उपयोग कर. बिना किसी जीवाणुनाशक प्रभाव के समूहों को उम्मीदवारों के रूप में चुना गया । दूसरे, pst प्रभाव इन उंमीदवार समूहों में पाया गया था, और सबसे शक्तिशाली जीवाणुनाशक प्रभाव के साथ समूह अंत में इस प्रोटोकॉल में चुना गया था । इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त मापदंडों यह सुनिश्चित किया कि वहां अकेले अला का कोई जीवाणुनाशक प्रभाव था । एक 1-एच मशीन समय पिछले अध्ययन17,20में इस्तेमाल किया, यह इन विट्रो अध्ययन के लिए सुविधाजनक बनाने और भविष्य नैदानिक उपचार में संभावित आवेदन के लिए उन से काफी कम है ।

इस मॉडल के सफल उपयोग के लिए कई महत्वपूर्ण बिंदु हैं । सबसे पहले, पूरे अला इलाज बैक्टीरिया के हेरफेर शामिल प्रक्रिया अंधेरे में प्रदर्शन किया जाना चाहिए । दूसरा, परिपक्व फिल्म के हेरफेर के लिए गठित की गई फिल्म परेशान से बचने के कोमल होना चाहिए । तीसरा, CFU टेस्ट में, प्लेटों के नीचे से बैक्टीरिया को स्क्रैप करना पूरी तरह से होना चाहिए । अंत में, नए सिरे से तैयार ाला का प्रयोग किया जाना चाहिए; इसलिए, यह प्रयोग से पहले ाला सही तैयार करने के लिए बेहतर है ।

हालांकि इस प्रोटोकॉल एस aureus पर ाला-pst के प्रभाव का परीक्षण किया जा सकता है इन विट्रो में, यह अभी भी vivo मेंनैदानिक स्थिति से अलग है । उदाहरण के लिए, मानव शरीर में आम तौर पर कई जीवाणु उपभेदों21,22द्वारा बनाई गई हैं, और vivo में पर्यावरण से अधिक जटिल है कि इन विट्रो में, जो pst के प्रभाव को प्रभावित कर सकता है । इसलिए, vivo प्रयोगों में भविष्य एस aureus पर ाला-pst के जीवाणुरोधी प्रभाव का एक पूर्ण मूल्यांकन के लिए की जरूरत है । हालांकि, सुविधा के अपने फायदे और vivo अध्ययनों में आयोजित करने के नैतिक मुद्दों की वजह से, इस इन विट्रो मंच उपयोगी और एस aureus पर ाला-pst के प्रभाव के अध्ययन में सुधार करने के लिए व्यावहारिक हो जाएगा । यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि हालांकि ाला, photosensitizer PpIX के अग्रदूत साबित, तेजी से मंजूरी, कम और छोटे-टिकाऊ त्वचा के photosensitivity, सीमित प्रकाश पैठ सतही घावों को प्रतिबंधित सहित अनुकूल विशेषताओं, है और विशेष रूप से अपनी गैर-संचई विषाक्तता14, प्रकाश खुराक और photosensitizer एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए आवश्यक बैक्टीरिया की हत्या अभी भी मेजबान सेल व्यवहार्यता पर एक गैरा प्रभाव हो सकता है । इस प्रकार, एस aureus की तरह चयनित रोगजनक जीवाणु उपभेदों के लक्षित चिकित्सा के लिए अला23 के संशोधन का अध्ययन भविष्य रोगाणुरोधी थेरेपी के लिए मूल्यवान है ।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग न केवल ाला-pst के प्रभाव के अध्ययन के लिए किया जा सकता है एस aureus उपभेदों पर भविष्य में, लेकिन यह भी अंय बैक्टीरिया द्वारा गठित की गई फिल्म पर इसके प्रभाव का अध्ययन संदर्भित किया जा सकता है । इस तरह की एकाग्रता के रूप में पैरामीटर, अला और ाला के साथ बैक्टीरिया की गर्मी की अवधि, विभिन्न जीवाणु उपभेदों के बीच भिन्न हो सकते हैं, लेकिन ऊपर चर्चा सिद्धांतों सामांयतः साझा कर रहे हैं.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है

Acknowledgments

इस काम के युवा विद्वानों के लिए चीन के राष्ट्रीय प्रकृति विज्ञान फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित किया गया (no. ८१३००८१०), शंघाई युवा डॉक्टर प्रशिक्षण कार्यक्रम (सं. २०१४१०५७), और चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (८१६७१९८२, ८१२७१७९१ और ८१५७१९५५) । हम इस पांडुलिपि की तैयारी के दौरान भाषायी सहायता प्रदान करने के लिए LetPub (www.letpub.com) का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptone Soya Broth (TSB) OXOID CM0129B
Tryptone Soya Agar (TSA) OXOID CM0131
SYTO9 Thermo Fisher Scientific L7012 The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits 
Propidium iodide (PI) Thermo Fisher Scientific L7012 The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits 
Pancreatin Sigma-Aldrich P3292
5-aminolevulinic acid (ALA) Fudan Zhangjiang Bio-Pharm 3.1
Staphylococcus aureus strain USA300 / / The source of USA 300 references “Tenover FC, Goering RV. J Antimicrob Chemother. 2009 Sep; 64(3):441-6”.
Staphylococcus aureus clinical strains (C1-C3) / / All clinical strains were isolated from patients with chronic rhinosinusitis in the Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Eye and ENT Hospital of Fudan University [Zhang QZ, Zhao KQ, Wu Y, et al. PLoS One. 2017 Mar; 12(3): e0174627].
96-well microplate Corning Inc 3599 Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile
Fluorodish NEST Biotechnology 801001 Glass bottom, Non-pyrogenic
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL Eppendorf 0030120086
Eppendorf microcentrifuge 5417 Eppendorf Z365998 | SIGMA
Incubator Thermo Fisher Scientific SHKE4000 MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shakers
Light emitting diode (LED) Wuhan Yage Optic and Electronic Technique CO LED-IB
Leica TCS SP8 confocal laser-scanning microscope Leica Microsystems
Leica LAS AF software Leica Microsystems
IMARIS software Bitplane

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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जीव विज्ञान अंक १३४ Photodynamic थेरेपी 5-aminolevulinic एसिड जैव फिल्म Staphylococcus aureus प्रोटोकॉल मॉडल इन विट्रो
एक <em>इन विट्रो</em> मॉडल के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए 5-Aminolevulinic एसिड मध्यस्थता Photodynamic थेरेपी पर <em>Staphylococcus aureus</em>
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Zhao, K. Q., Wu, Y., Yi, Y. X.,… More

Zhao, K. Q., Wu, Y., Yi, Y. X., Feng, S. J., Wei, R. Y., Ma, Y., Zheng, C. Q., Qu, D. An In Vitro Model to Study the Effect of 5-Aminolevulinic Acid-mediated Photodynamic Therapy on Staphylococcus aureus Biofilm. J. Vis. Exp. (134), e57604, doi:10.3791/57604 (2018).

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