Summary
Эта рукопись описывает протокол для изучения Антимикробный эффект 5-аминолевулиновой кислоты опосредованной фотодинамической терапии (ALA-PDT) на золотистый стафилококк биопленки. Этот протокол может использоваться для разработки в vitro модель для изучения в будущем лечении бактериальных биопленок с PDT.
Abstract
Золотистый стафилококк (S. aureus) является общей человеческой возбудителя, который вызывает гноеродной и системных инфекций. S. aureus инфекции трудно искоренить не только из-за появления устойчивых к антибиотикам штаммов, но и ее способность формы биопленки. Недавно фотодинамическая терапия (PDT) указан как один из потенциальных методов лечения для контроля инфекции биопленки. Однако чтобы улучшить наши знания о его влиянии на бактериальных биопленок, а также основных механизмов необходимы дальнейшие исследования. Эта рукопись описывает модель в vitro ФДТ с 5-аминолевулиновой кислоты (5-ALA), предшественник фактической фотосенсибилизатора, протопорфирин IX (PpIX). Вкратце, Зрелые S. aureus биоплёнки были инкубировали с Ала и затем подвергаются света. Впоследствии антибактериальный эффект ALA-PDT на S. aureus биопленки был количественно путем расчета колонии, образуя единиц (CFUs) и визуализированное жизнеспособности флуоресцентные окрашивание через Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (CLSM). Представитель результаты показали сильный антибактериальный эффект ALA-PDT на S. aureus биопленки. Этот протокол является простой и могут быть использованы для разработки в vitro модель для изучения обращения S. aureus биоплёнки с ALA-PDT. В будущем она может также ссылаться на PDT исследований с использованием других фотосенсибилизаторов для различных штаммов бактерий с минимальными изменениями.
Introduction
S. aureus является важным грамположительных возбудителя, который колонизирует кожу и слизистую оболочку человека хостов. Его способность формы биоплёнки считается важным аспектом его патогенез1. Бактериальные биопленки – сообщество бактерий, внедренные в матрицу собственного производства, которая состоит из внеклеточного полимерных веществ, включая полисахарид, ДНК и белка. Эта матрица играет значительную роль в сохранении бактериальных инфекций, способствует высокая степень сопротивления для иммунной системы человека и текущих антимикробной терапии2. Антибиотики являются по-прежнему основных лечения для инфекции биопленки, хотя влияние антибиотиков на биоплёнки ограничены. Ранее показано, что клетки в биопленки 10 - 1000 раз более устойчивы к антибиотикам, по сравнению с их планктонных коллегами3. Таким образом чтобы завоевать этот вопрос необходимы альтернативные стратегии.
PDT, альтернативное лечение для лечения бактериальных инфекций, использует свет соответствующей длины волны для того чтобы активировать фотосенсибилизаторов. Это приводит к производству реактивнооксигенных видов (ров), которые являются смертельным для клеток-мишеней, нарушения клеточной стенки, инактивируют ферменты и повреждения ДНК4. Эта характеристика многолетних целевых делает его трудным для бактерий развивается устойчивость к лечению PDT.
Антимикробный эффект PDT на бактериальных и грибковых биопленки, с несколькими фотосенсибилизаторов, например толуидиновый синий, зеленый малахит, метиленовый синий, хлора e6 и порфиринов, был изучен в предыдущих докладах5,6, 7,8,9,10,11,12,13. 5-ALA, пролекарство фактической фотосенсибилизатора, PpIX, характеризуется своей небольшой молекулярной массой и быстрое разминирование12,14. Эти преимущества дают ALA-PDT огромный потенциал в качестве терапевтического применения. Хотя многие группы12исследовано влияние ALA-PDT на планктонные бактерий, Антимикробный эффект ALA-PDT на бактериальных биопленок еще не выяснены. Между тем трудно сравнить результаты предыдущих исследований. Одной из причин является, что различные протоколы используются различными группами. Таким образом этот протокол описывает в vitro модель ALA-PDT системы, основанной на нашей предыдущей работы15. Влияние этой модели была подтверждена CFU расчет и жизнеспособности, окрашивание с CLSM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. биопленки
-
Биопленки в 96-луночных планшетов
- Получения штамма S. aureus USA300 и 3 биопленки формирование клинических штаммов (C1 - C3) хранятся при температуре-80 ° C.
Примечание: Способность клинических штаммов к форме, которую биоплёнки определяется микротитровальных пластина пробирного описано ранее15. - Прививок бактерии в 5 мл Триптон соевый бульон (TSB) среде и культивировать в инкубаторе с тряску при 37 ° C ночь с неподвижной фазой.
- Центрифуга ночи бактериальной культуры на 4000 x g 10 мин при 25 ° C и затем удалить супернатант. Ресуспензируйте гранулы в фосфатный буфер (PBS) до конечной концентрации 2.0 x 109 кое/мл.
Примечание: Концентрация бактерий был оценен измерения оптической плотности и далее определяется пластины рассчитывать16, показывая что OD 1600 суспензии содержит 1,5 х 108 кое/мл. - Разбавить бактериальных подвеска до 1: 200 (1,0 x 107 кое/мл) в БСЭ носитель, содержащий 0,5% раствор глюкозы. В каждой скважине клетки Культура лечение полистирола 96-луночных микропланшетов инокуляции 200 мкл бактериальной подвески.
- Инкубируйте микроплиты статически при 37 ° C для 24 h под хорошо кислородом среде.
Примечание: Время инкубации для зрелой биопленки может различаться для разных штаммов бактерий; Это должны быть определены до того, как PDT эксперимент15. - Отказаться от средств массовой информации в скважинах и мыть Гонав скважин нежно с PBS три раза и затем удалить супернатант.
Примечание: Шаг должно осуществляться очень осторожно чтобы не мешать сформированных биопленки.
- Получения штамма S. aureus USA300 и 3 биопленки формирование клинических штаммов (C1 - C3) хранятся при температуре-80 ° C.
-
Биопленки в блюда
- Прививок штамма S. aureus USA300 в 5 мл среды TSB и культивировать в инкубаторе с тряску при 37 ° C ночь с неподвижной фазой.
- Центрифуга ночи бактериальной культуры на 4000 x g 10 мин при 25 ° C и затем удалить супернатант. Ресуспензируйте гранулы в PBS в конечной концентрации 2.0 x 109 кое/мл. Затем разбавить бактериальных подвеска до 1: 200 (1,0 x 107 кое/мл) в БСЭ носитель, содержащий 0,5% раствор глюкозы. Прививок 2 мл бактериальной подвеска в 35-мм оптическое качество стекла дно клетки культуры блюдо и инкубировать статически при 37 ° C в течение 24 ч.
Примечание: Концентрация бактерий оценивалась путем измерения оптической плотности. - Аспирационная СМИ с пипеткой и затем смойте биопленки в блюдо нежно с PBS три раза и затем, тщательно удалить супернатант.
Примечание: Не дотрагивайтесь до кончика пипетки на дно посуды. Шаг 2.2 следует выполнять сразу же после этого шага для предотвращения высыхания сформированных биопленки.
2. свет облучения
- Хранить в холодильнике 4 ° C 5-Ала. Перед эксперимент разбавляют 5-ALA с PBS до 10 мм.
Примечание: решение 5-ALA должно быть свежеприготовленный до эксперимента. - В экспериментальной группе добавьте 200 мкл 10 мм Ала в каждой скважине Гонав или 2 мл для культуры блюдо. Покрытие плиты/блюдо с алюминиевой фольгой и инкубировать в течение 1 ч. Затем облучать пластины/блюдо с светоизлучающих диодов (СИД) с интенсивностью освещения 100 МВт/см2 за 1 ч до достижения свет дозы 360 Дж/см2 основных длины волны 633 нм ± 1017.
Примечание: Для того, чтобы позволить световой энергии эффективно и равноправно доставлен биопленки во всех блюд скважин, исправить расстояние от вершины источника света до хорошо/блюдо на 6,0 см и ограничить экспериментальной региона в области Центральной облучения (10 см х 8 cm). для обеспечения воспроизводимые результаты, эксперименты должны выполняться в том же комнатной температуре.
В Светодиодные облучения шаг чтобы избежать прямого воздействия пластины других источников света, таких, как солнечный свет, освещение в комнате или Ламплайт, Сид был включен перед перемещением блюдо пластины в зоне облучения, и свет был достаточно ярким, чтобы завершить операцию. - Настроить группы управления (три контрольные группы были созданы в нашем эксперименте).
- Для первого элемента управления группа (Ала - LED-), добавить 200 мкл PBS в каждой скважине микроплиты или 2 мл для культуры блюдо. Покрытие плиты/блюдо с алюминиевой фольгой и проинкубируйте 2 ч.
- Для второй группы управления (Ала + LED-), 200 мкл 10 мм Ала для каждой скважины микроплиты или 2 мл для культуры блюдо. Покрытие плиты/блюдо с алюминиевой фольгой и проинкубируйте 2 ч.
- Для третьей группы управления (Ала-LED +), 200 мкл PBS для каждой скважины микроплиты или 2 мл для культуры блюдо. Покрытие плиты/блюдо с алюминиевой фольгой и проинкубируйте 1 ч. Затем подвергайте пластину к LED с 360 Дж/см2 легких облучения на основных длины волны 633 нм ± 1017.
Примечание: В шаге облучения LED, Избегайте прямого воздействия на других источников света, например, Солнечный свет, освещение в комнате или Ламплайт пластины.
3. определение эффективности лечения PDT
Примечание: Для подтверждения эффект ALA-PDT на биоплёнки S. aureus , жизнеспособность клеток с или без ALA-PDT оценивалась CFU подсчета, а также жизнеспособность пятнать.
-
Определение оставшихся жизнеспособных бактериальных клеток
- После ALA-PDT лечения отказаться от средств массовой информации в скважинах и мыть скважин с PBS три раза, чтобы удалить все non сторонник клетки для обеих экспериментальных и контрольных групп.
Примечание: Этот шаг должно осуществляться очень осторожно. - Тщательно очистите бактерии адэрентных клеток из скважин с кончиком пипетки и собирать клетки в конические трубы.
- Центрифуга для бактериальных подвеска на 4000 x g 10 мин при температуре 4 ° C, а затем удалить супернатант.
- Ресуспензируйте бактерий в 1 мл 0,25% Панкреатин фермента в PBS и инкубировать при 37 ° C для 1,5 ч.
- Центрифуга на 4000 x g 10 мин; отбросить супернатанта, а затем Ресуспензируйте гранулы в 200 мкл PBS.
- Сделать 1:10 серийных разведений мобильные решения с PBS; затем 5 мкл каждого последовательного разбавления образца на пластину Триптон соевый агар (TSA). Инкубировать TSA пластины при 37 ° C для 16 h; затем граф (по невооруженным глазом) количество бактериальных колоний (кое/мл).
- После ALA-PDT лечения отказаться от средств массовой информации в скважинах и мыть скважин с PBS три раза, чтобы удалить все non сторонник клетки для обеих экспериментальных и контрольных групп.
-
Наблюдение за биоплёнки S. aureus , CLSM
- После легких облучения мыть биопленки в культуре блюдо с PBS три раза.
Примечание: Этот шаг должно осуществляться очень осторожно. - Добавьте 1 mL 1 мкм Грин люминесцентные ядерных и хромосомы пятно, что проницаема прокариот клеточных мембран (например, SYTO9) и 1 мл раствора 1 мкм пропидий йодидом (PI) за 20 мин до пятно биопленки, а также мертвых клеток.
- Соблюдать жизнеспособных клеток (зеленое флуоресцирование, Ex / Em 485 Нм/530 Нм) и мертвые клетки (красное флуоресцирование, Ex / Em 485 Нм/630nm) под CLSM с 63 X 1.4-NA нефти погружение объектива.
- Создание изображения с помощью микроскопии программного обеспечения.
- После легких облучения мыть биопленки в культуре блюдо с PBS три раза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Жизнеспособность бактерий в биопленке уменьшилась после ALA-PDT лечения по сравнению с элементами управления (Ала - LED-, Ала + LED - и Ала-LED +) в USA300 и три клинических штаммов (рис. 1).
Подтвердить результаты кое пробирного и наблюдать антибактериальный эффект ALA-PDT на S. aureus биопленки в situ, USA300 биопленке были визуализированное CLSM с жизнеспособность пятнать. Жизнеспособные и мертвые клетки окрашивали с зеленой и красной флуоресценцией, соответственно. Изображения показали, что большинство бактерий в биопленке были убиты ALA-PDT, который согласуется с результатами анализа CFU (рис. 2).
Рисунок 1: влияние ALA-PDT на биопленки. КОЕ/мл был преобразован журнала и отображается как среднее ± стандартное отклонение в USA300 и три клинических штаммов (C1 - C3) относились с ALA-PDT (Ала + LED +) или в условиях управления (Ала - LED-, Ала + LED-, Ала-LED +). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: представитель CLSM изображения S. aureus биоплёнки с LIVE/мертвые пятнать. Биопленки, образованный USA300 бактерии относились с или без ALA-PDT (A: Ала - LED-, Группа B: Ала + LED - панели, панели C: Ала-LED +, Группа D: Ала + LED +) и затем витражи с SYTO9 (зеленое флуоресцирование) и PI (красной флуоресценцией) представлять живые и Мертвые бактерии самостоятельно. 63 X 1.4-NA масло погружения цели было использовано. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PDT был хорошо изученных терапии для лечения рака, поскольку он был изобретен более чем 100 лет назад18. За последнее десятилетие PDT применялся в качестве антимикробного стратегии и показал эффективность против некоторых устойчивых к антибиотикам болезнетворных бактерий12. По сравнению с планктонных государства, бактериальных биопленок представляется более устойчивы к антибиотикам лечения3, в то время как эффект ALA-PDT на биопленок не исследовано полностью еще.
В этой статье было описано в vitro системы ALA-PDT, и антибактериальный эффект этой модели на S. aureus биопленок было продемонстрировано. Два методы были использованы для тестирования влияния ALA-PDT на S. aureus биопленки в настоящем Протоколе. Хотя кое испытания продемонстрировали Антимикробный эффект путем расчета жизнеспособных клеток после лечения, флуоресцентный жизнеспособности, окрашивание с CLSM не только подтвердили результаты теста кое, но также обнаружен морфологических характер живых и мертвых бактерии в situ. Совместное использование обоих аналитических методов является идеальный подход для определения влияния ALA-PDT на биопленки. Основываясь на результатах CLSM, мертвый бактериальные клетки преимущественно распространялись в верхнем слое, в то время как некоторые из бактерий в нижнем слое остались живы15. Последний может быть источником бактериальных колоний в assay кое. В исследовании, проведенном O'Neill et al., который объясняется низкой накопление фотосенсибилизаторов в внутренний слой или свет неспособность проникнуть в эти регионы19наблюдается аналогичный результат.
В этом протоколе Зрелые биопленки был инкубировали с 10 мм АЛК за 1 ч до подверженности PDT. Эти параметры были выбраны на основе результатов двух предварительных экспериментов. Во-первых Антимикробный эффект ALA был протестирован против биоплёнки без света облучения, с использованием различных концентраций Ала и различное количество времени для инкубации с S. aureus биопленки. Группы без каких-либо бактерицидного эффекта были выбраны в качестве кандидатов. Во-вторых PDT эффект был обнаружен в этих группах кандидата, и группа с самым мощным бактерицидным эффектом окончательно был выбран в этом протоколе. Таким образом параметры, используемые в настоящем протоколе обеспечивает, что было только не бактерицидное действие Ала. Время инкубации 1-h значительно короче, чем те, которые используются в предыдущих исследованиях17,20, что делает его удобным для в vitro исследования и возможного применения в будущих клинических процедур.
Есть несколько критических точек для успешного использования этой модели. Во-первых весь процесс с участием манипуляции ALA лечение бактерии должны выполняться в темноте. Во-вторых манипуляции Зрелые биоплёнки должно быть мягкий, чтобы не мешать сформированных биопленки. В-третьих в тесте, ГРУ, соскоб бактерии из нижней части пластины должно быть тщательно. Наконец следует использовать свежеприготовленные Ала; Таким образом это лучше подготовить Ала прямо перед эксперимент.
Хотя этот протокол может использоваться для проверки эффекта ALA-PDT на S. aureus биопленки в vitro, он по-прежнему отличается от клинической ситуации в vivo. К примеру биоплёнки в человеческом организме обычно формируются несколькими бактериальных штаммов21,22, и окружающей среды в vivo является более сложным, чем это в пробирке, который может повлиять на эффект PDT. Таким образом будущее в vivo эксперименты необходимы для полной оценки антибактериальное воздействие ALA-PDT на S. aureus биопленки. Однако из-за ее преимущества удобства и этические вопросы проведения в vivo исследований, эта платформа в vitro будет полезным и практичным для улучшения деятельности по изучению воздействия ALA-PDT на S. aureus биопленки. Следует также отметить, что хотя Ала, предшественник фотосенсибилизатора PpIX, имеет благоприятные характеристики, включая быстрое разминирование, меньше и короче lasting кожный фоточувствительность, ограниченные свет проникновения ограничена поверхностных поражений и особенно его не кумулятивной токсичности14, свет дозы и концентрации фотосенсибилизатора, необходимых для достижения убивает бактерии все еще может иметь случайный прохожий воздействие на жизнеспособность клеток хост. Таким образом изучая модификации ALA23 для целенаправленной терапии отдельных патогенных бактериальных штаммов S. aureus как ценность для будущих антибактериальной терапии.
Этот протокол может использоваться не только для изучения влияния ALA-PDT на штаммов S. aureus в будущем, но может ссылаться также изучить ее влияние на биопленки, образованной другими бактериями. Параметры, такие как концентрация Ала и Длительность инкубации бактерий с Ала, могут различаться среди различных штаммов бактерий, но обычно распределяются принципов, обсуждавшихся выше.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать
Acknowledgments
Эта работа финансировалась национальный характер науки фонд Китая для молодых ученых (№ 81300810), Шанхай молодой доктор учебной программы (№ 20141057) и национальные естественные науки фонд Китая (81671982, 81271791 и 81571955). Мы хотели бы поблагодарить LetPub (www.letpub.com) для обеспечения языковой помощи в ходе подготовки этой рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone Soya Broth (TSB) | OXOID | CM0129B | |
| Tryptone Soya Agar (TSA) | OXOID | CM0131 | |
| SYTO9 | Thermo Fisher Scientific | L7012 | The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits |
| Propidium iodide (PI) | Thermo Fisher Scientific | L7012 | The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | P3292 | |
| 5-aminolevulinic acid (ALA) | Fudan Zhangjiang Bio-Pharm | 3.1 | |
| Staphylococcus aureus strain USA300 | / | / | The source of USA 300 references “Tenover FC, Goering RV. J Antimicrob Chemother. 2009 Sep; 64(3):441-6”. |
| Staphylococcus aureus clinical strains (C1-C3) | / | / | All clinical strains were isolated from patients with chronic rhinosinusitis in the Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Eye and ENT Hospital of Fudan University [Zhang QZ, Zhao KQ, Wu Y, et al. PLoS One. 2017 Mar; 12(3): e0174627]. |
| 96-well microplate | Corning Inc | 3599 | Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile |
| Fluorodish | NEST Biotechnology | 801001 | Glass bottom, Non-pyrogenic |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Eppendorf microcentrifuge 5417 | Eppendorf | Z365998 | SIGMA | |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | SHKE4000 | MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shakers |
| Light emitting diode (LED) | Wuhan Yage Optic and Electronic Technique CO | LED-IB | |
| Leica TCS SP8 confocal laser-scanning microscope | Leica Microsystems | ||
| Leica LAS AF software | Leica Microsystems | ||
| IMARIS software | Bitplane |
References
- Lewis, K. Riddle of biofilm resistance. Antimicrob Agents Chemother. 45 (4), 999-1007 (2001).
- Rabin, N., et al. Biofilm formation mechanisms and targets for developing antibiofilm agents. Future Med Chem. 7 (4), 493-512 (2015).
- Mah, T. F., O'Toole, G. A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends Microbiol. 9 (1), 34-39 (2001).
- Sharma, M., et al. Toluidine blue-mediated photodynamic effects on staphylococcal biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 52 (1), 299-305 (2008).
- Rosa, L. P., da Silva, F. C., Nader, S. A., Meira, G. A., Viana, M. S. In vitro effectiveness of antimicrobial photodynamic therapy (APDT) using a 660 nm laser and malachite green dye in Staphylococcus aureus biofilms arranged on compact and cancellous bone specimens. Lasers Med Sci. 29 (6), 1959-1965 (2014).
- Rosa, L. P., Silva, F. C., Nader, S. A., Meira, G. A., Viana, M. S. Effectiveness of antimicrobial photodynamic therapy using a 660 nm laser and methyline blue dye for inactivating Staphylococcus aureus biofilms in compact and cancellous bones: An in vitro study. Photodiagnosis Photodyn Ther. 12 (2), 276-281 (2015).
- Mai, B., et al. The antibacterial effect of sinoporphyrin sodium photodynamic therapy on Staphylococcus aureus planktonic and biofilm cultures. Lasers Surg Med. 48 (4), 400-408 (2016).
- Gandara, L., Mamone, L., Bohm, G. C., Buzzola, F., Casas, A. Enhancement of photodynamic inactivation of Staphylococcus aureus biofilms by disruptive strategies. Lasers Med Sci. 32 (8), 1757-1767 (2017).
- Baltazar, L. M., et al. Antimicrobial photodynamic therapy: an effective alternative approach to control fungal infections. Front Microbiol. 6, 202 (2015).
- Fernandes, T., Bhavsar, C., Sawarkar, S., D'Souza, A. Current and novel approaches for control of dental biofilm. Int J Pharm. 536 (1), 199-210 (2017).
- De Sordi, L., et al. Development of Photodynamic Antimicrobial Chemotherapy (PACT) for Clostridium difficile. PLoS One. 10 (8), e0135039 (2015).
- Harris, F., Pierpoint, L. Photodynamic therapy based on 5-aminolevulinic acid and its use as an antimicrobial agent. Med Res Rev. 32 (6), 1292-1327 (2012).
- Donnelly, R. F., McCarron, P. A., Tunney, M. M.
- Shi, H., Li, J., Zhang, H., Zhang, J., Sun, H. Effect of 5-aminolevulinic acid photodynamic therapy on Candida albicans biofilms: An in vitro study. Photodiagnosis Photodyn Ther. 15, 40-45 (2016).
- Zhang, Q. Z., et al. 5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy and its strain-dependent combined effect with antibiotics on Staphylococcus aureus biofilm. PLoS One. 12 (3), 0174627 (2017).
- Chang, Y. C., et al. Rapid single cell detection of Staphylococcus aureus by aptamer-conjugated gold nanoparticles. Sci Rep. 3, 1863 (2013).
- Barra, F., et al. Photodynamic and Antibiotic Therapy in Combination to Fight Biofilms and Resistant Surface Bacterial Infections. Int J Mol Sci. 16 (9), 20417-20430 (2015).
- St Denis, T. G., et al. All you need is light: antimicrobial photoinactivation as an evolving and emerging discovery strategy against infectious disease. Virulence. 2 (6), 509-520 (2011).
- O'Neill, J. F., Hope, C. K., Wilson, M. Oral bacteria in multi-species biofilms can be killed by red light in the presence of toluidine blue. Lasers Surg Med. 31 (2), 86-90 (2002).
- Li, X., et al. Effects of 5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy on antibiotic-resistant staphylococcal biofilm: an in vitro study. J Surg Res. 184 (2), 1013-1021 (2013).
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).
- Elias, S., Banin, E. Multi-species biofilms: living with friendly neighbors. FEMS Microbiol Rev. 36 (5), 990-1004 (2012).
- Wu, J., et al. Design and Proof of Programmed 5-Aminolevulinic Acid Prodrug Nanocarriers for Targeted Photodynamic Cancer Therapy. ACS Appl Mater Interfaces. 9 (17), 14596-14605 (2017).
