Summary
Detta manuskript beskriver ett protokoll för att studera den antimikrobiella effekten av 5-aminolevulinsyra syra-medierad fotodynamisk terapi (ALA-PDT) på en Staphylococcus aureus biofilm. Detta protokoll kan användas för att utveckla en in vitro- modell för att studera behandling av bakteriell biofilm med PDT i framtiden.
Abstract
Staphylococcus aureus (S. aureus) är en gemensam mänsklig patogen, som orsakar pyogena och systemiska infektioner. S. aureus -infektioner är svåra att utrota inte bara på grund av uppkomsten av antibiotikaresistenta stammar utan också dess förmåga att bilda biofilmer. Nyligen, fotodynamisk terapi (PDT) har angivits som en av de potentiella behandlingarna för styrning av biofilm infektioner. Dock ytterligare krävs studier för att förbättra vår kunskap om dess effekt på bakteriell biofilm, liksom de bakomliggande mekanismerna. Detta manuskript beskriver en in vitro modell av PDT med 5-aminolevulinsyra (5-ALA), en föregångare till den faktiska photosensitizer, protoporfyrin IX (PpIX). Kort, Mogen S. aureus biofilmer var inkuberas med ALA och sedan utsätts för ljus. Därefter, var den antibakteriella effekten av ALA-PDT på S. aureus biofilm kvantifieras genom att beräkna den kolonibildande enheter (CFUs) och visualiseras av livskraft fluorescerande färgning via confocal laserscanning mikroskopi (CLSM). Representativa resultat visade en stark antibakteriell effekt av ALA-PDT på S. aureus biofilmer. Detta protokoll är enkel och kan användas för att utveckla en in vitro- modell för att studera behandling av S. aureus biofilmer med ALA-PDT. I framtiden kan det också refereras i PDT studier utnyttjar andra photosensitizers för olika bakteriestammar med minimala justeringar.
Introduction
S. aureus är en viktig grampositiva patogener som colonizes hud och slemhinnor av mänskliga värdar. Dess förmåga att bilda biofilmer anses vara en viktig aspekt av dess patogenes1. Bakteriell biofilm är en gemenskap av bakterier inbäddade i en egenproducerad matris, som består av extracellulära polymera substanser, inklusive polysackarid, DNA och protein. Denna matris har en betydande roll i fortsatta bakteriella infektioner, bidrar till en hög grad av motstånd mot människans immunsystem och nuvarande antimikrobiella behandlingar2. Antibiotika är fortfarande den viktigaste behandlingen för biofilm infektioner, även om effekterna av antibiotika på biofilmer är begränsade. Det har tidigare visat att celler i biofilmer är 10 - 1000 gånger mer resistent mot antibiotika jämfört med deras plankton motsvarigheter3. Således behövs alternativa strategier för att erövra denna fråga.
PDT, en alternativ behandling för bakteriella infektioner, använder ljuset från en lämplig våglängd för att aktivera photosensitizers. Detta leder till produktion av reaktiva syreradikaler (ROS), som är dödliga för målceller av hormonstörande cellväggen, inactivating enzymer, och skadar DNA4. Detta flera mål kännetecken gör det svårt för bakterier att utveckla resistens mot PDT behandling.
Den antimikrobiella effekten av PDT om bakteriell och fungal biofilmer, med flera photosensitizers, såsom toluidin blå, malakit green, metylenblått, klor e6 och porfyriner, har studerats i tidigare rapporter5,6, 7,8,9,10,11,12,13. 5-ALA, en prodrug till den faktiska photosensitizer, PpIX, kännetecknas av dess små molekylvikt och snabb clearance12,14. Dessa fördelar ger ALA-PDT stor potential som en terapeutisk applikation. Även om effekten av ALA-PDT på plankton bakterier har studerats av många grupper12, klarlagd antimikrobiella effekten av ALA-PDT på bakteriell biofilm ännu inte. Samtidigt är det svårt att jämföra resultaten mellan tidigare studier. En av anledningarna är att de olika protokoll som används av olika grupper. Alltså beskriver det här protokollet en in vitro- modell av ett ALA-PDT baserat på våra tidigare arbete15. Effekten av denna modell bekräftades av CFU beräkning och livskraft färgning med CLSM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Biofilm bildning
-
Biofilm bildning i 96 brunnar mikroplattor
- Hämta den S. aureus -stammen USA300 och 3 biofilm-bilda klinisk stammar (C1 - C3) lagras vid-80 ° C.
Obs: Förmågan hos de kliniska stammarna att bilda biofilmer bestämdes av mikrotiter plattan analysen beskrivs tidigare15. - Inokulera bakterien i 5 mL trypton soja buljong (TSB) medium och odla i en inkubator med skakningar vid 37 ° C natten till den stationära fasen.
- Centrifugera övernattning bakteriella kulturen vid 4000 x g i 10 minuter vid 25 ° C och sedan Kassera supernatanten. Återsuspendera pellets i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till en slutkoncentration 2.0 x 109 CFU/mL.
Obs: Koncentrationen av bakterier var beräknad genom att mäta optisk densitet och ytterligare bestäms av plattan räknas16, avslöjar att 1 OD600 suspension innehöll 1,5 x 108 CFU/mL. - Späd bakteriesuspensionen till 1: 200 (1,0 x 107 CFU/mL) i TSB medium innehållande 0,5% glukos. Inokulera 200 µL av bakteriesuspensionen till varje brunn av en cell-kultur-behandlade polystyren 96 brunnar mikroplattan.
- Inkubera mikroplattan statiskt vid 37 ° C under 24 h under en väl syresatt miljö.
Obs: Inkubationstiden för mogna biofilm bildning kan variera för olika bakteriestammar; Detta bör fastställas innan PDT experimentera15. - Ignorera media i brunnarna och tvätta mikroplattan brunnarna försiktigt med PBS tre gånger och sedan Kassera supernatanten.
Obs: Steget bör utföras mycket försiktigt för att undvika att störa den bildade biofilmen.
- Hämta den S. aureus -stammen USA300 och 3 biofilm-bilda klinisk stammar (C1 - C3) lagras vid-80 ° C.
-
Biofilm bildning i rätter
- Inokulera S. aureus stammen USA300 i 5 mL TSB medium och odla i en inkubator med skakningar vid 37 ° C natten till den stationära fasen.
- Centrifugera övernattning bakteriella kulturen vid 4000 x g i 10 minuter vid 25 ° C och sedan Kassera supernatanten. Återsuspendera pellets i PBS till en slutlig koncentration av 2.0 x 109 CFU/mL. Späd sedan, bakteriesuspensionen till 1: 200 (1,0 x 107 CFU/mL) i TSB medium innehållande 0,5% glukos. Inokulera 2 mL av bakteriesuspensionen i en 35 mm optisk kvalitet glas botten cell kultur skålen och inkubera statiskt vid 37 ° C under 24 h.
Obs: Koncentrationen av bakterier beräknades genom att mäta optisk densitet. - Aspirera media med en pipett, och skölj sedan av biofilmer i skålen försiktigt med PBS tre gånger och sedan Kassera supernatanten noggrant.
Obs: Undvik att vidröra pipettspetsen till botten av skålen. Steget 2.2 bör utföras omedelbart efter detta steg för att förhindra uttorkning av den bildade biofilmen.
2. ljus bestrålning
- Lagra 5-ALA i kylskåp 4 ° C. Innan experimentet, späd 5-ALA med PBS till 10 mM.
Obs: 5-ALA lösning bör vara nyberedd innan experimentet. - I den experimentella gruppen, tillsätt 200 µL 10 mM ALA till varje brunn mikroplattan eller 2 mL till kultur skålen. Täcka plattan/skålen med aluminiumfolie och inkubera i 1 h. Sedan bestråla plattan/skålen med en lysdiod (LED) med en ljusintensitet 100 mW/cm2 för 1 h att uppnå en ljusdos 360 J/cm2 på en större våglängd av 633 ± 10 nm17.
Obs: För att låta ljuset energi levereras lika och effektivt till biofilmen i alla brunnar/rätter, fixa avståndet från toppen av ljuskällan till brunn/skålen på 6,0 cm och begränsa experimentella regionen till området centrala bestrålning (10 cm x 8 cm). att säkerställa att resultaten är reproducerbara, experiment ska utföras vid samma temperatur.
Undvik direkt exponering av plattan för andra ljuskällor, såsom solljus, belysning eller lamplight, LED var aktiverat innan du flyttar plattan/skålen till området bestrålning i steget LED bestrålning och ljuset var tillräckligt ljust för att avsluta operationen. - Ställa in kontrollgrupperna (tre kontrollgrupper sattes upp i vårt experiment).
- För den första kontrollen gruppen (ALA - LED-), tillsätt 200 µL av PBS till varje brunn mikroplattan eller 2 mL till kultur skålen. Täcka plattan/skålen med aluminiumfolie och inkubera det i 2 h.
- För andra kontrollgruppen (ALA + LED-), tillsätt 200 µL 10 mM ALA till varje brunn mikroplattan eller 2 mL till kultur skålen. Täcka plattan/skålen med aluminiumfolie och inkubera det i 2 h.
- För den tredje gruppen (ALA-LED +), tillsätt 200 µL av PBS till varje brunn mikroplattan eller 2 mL till kultur skålen. Täcka plattan/skålen med aluminiumfolie och inkubera det i 1 h. Sedan utsätta plattan till LED med 360 J/cm2 ljus bestrålning vid en större våglängd av 633 ± 10 nm17.
Obs: I LED bestrålning steg, undvika direkt exponering av plattan för andra ljuskällor, som solljus eller rumsbelysning lamplight.
3. bestämning av effektiviteten av PDT behandling
Obs: För att bekräfta effekten av ALA-PDT på det S. aureus biofilmer, livskraften hos cellerna med eller utan ALA-PDT utvärderades av CFU räknar samt bärkraft färgning.
-
Bestämning av de återstående livskraftig bakteriecellerna
- Efter ALA-PDT behandling, ignorera media i brunnarna och Tvätta brunnarna med PBS tre gånger att ta bort alla icke-anhängare celler för både experimentell och kontrollerar grupper.
Obs: Detta steg bör genomföras mycket försiktigt. - Skrapa de vidhäftande bakterieceller noggrant från brunnarna med pipettspetsen och samla cellerna i koniska rör.
- Centrifugera bakteriesuspensionen vid 4000 x g i 10 minuter vid 4 ° C och sedan Kassera supernatanten.
- Omsuspendera bakterierna i 1 mL av 0,25% pankreatin enzym i PBS och inkubera vid 37 ° C i 1,5 h.
- Centrifugera vid 4000 x g i 10 min. avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 200 µL av PBS.
- Gör 1:10 seriespädningar av cell lösning med PBS; sedan, tillsätt 5 µL av varje seriell utspädning prov på trypton soja agar (TSA) plattan. Inkubera TSA plattan vid 37 ° C i 16 h; sedan räkna (för blotta ögat) antalet bakteriekolonier (CFU/mL).
- Efter ALA-PDT behandling, ignorera media i brunnarna och Tvätta brunnarna med PBS tre gånger att ta bort alla icke-anhängare celler för både experimentell och kontrollerar grupper.
-
Observation av S. aureus biofilmer av CLSM
- Efter ljus bestrålning, tvätta biofilmer i kultur skålen med PBS tre gånger.
Obs: Detta steg bör genomföras mycket försiktigt. - Tillsätt 1 mL 1 µM grön fluorescerande kärnkraft och kromosom fläcken som är genomsläpplig för prokaryota cellmembranen (t.ex., SYTO9) och 1 mL 1 µM propidium jodid (PI) för 20 min att färga den biofilm samt döda celler.
- Iaktta viabla celler (grön fluorescens, Ex / Em 485 nm/530 nm) och döda celler (röd fluorescens, Ex / Em 485 nm/630nm) under en CLSM med en 63 X 1.4-NA Oljeimmer objektiv.
- Generera bilder med mikroskopi programvara.
- Efter ljus bestrålning, tvätta biofilmer i kultur skålen med PBS tre gånger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lönsamheten för bakterierna i biofilmer minskade efter ALA-PDT behandling jämfört med kontroller (ALA - LED-, ALA + LED- och ALA-LED +) i både USA300 och de tre kliniska stammarna (figur 1).
För att bekräfta resultaten från CFU assay och observera antibakteriellt effekten av ALA-PDT på det S. aureus biofilm i situ, den USA300 biofilmer var visualiseras av CLSM med livskraft färgning. De livskraftiga och döda cellerna var målat med grön och röd fluorescens, respektive. Bilden visade att de flesta av bakterier i biofilmer dödades av ALA-PDT, vilket överensstämde med resultaten av CFU analysen (figur 2).
Figur 1: effekten av ALA-PDT på biofilmer. CFU/mL var logg-omvandlad och visas som medelvärde ± standardavvikelsen i USA300 och tre kliniska stammar (C1 - C3) behandlade med ALA-PDT (ALA + LED +) eller enligt villkor som kontroll (ALA - LED-, ALA + LED-, ALA-LED +). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representant CLSM bilder av S. aureus biofilmer med LIVE/DEAD färgning. Biofilmer som bildas av USA300 bakterier behandlades med eller utan ALA-PDT (panel A: ALA - LED-, panel B: ALA + LED-, panel C: ALA-LED +, panelen D: ALA + LED +), och sedan målat med SYTO9 (grön fluorescens) och PI (röd fluorescens) att representera de levande och döda bakterierna självständigt. En 63 X 1.4-NA oljeimmersionsobjektivet användes. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PDT har varit en väl studerat terapi för behandling av cancer eftersom det uppfanns mer än 100 år sedan18. Under det senaste decenniet, PDT har tillämpats som en antimikrobiell strategi och har visat effektiviteten mot vissa antibiotikaresistenta patogena bakterier12. Jämfört med tillståndet plankton, verkar bakteriell biofilm vara mer resistent mot behandling med antibiotika3, medan effekten av ALA-PDT på biofilmer inte har fullt utretts ännu.
I denna artikel, ett in vitro -ALA-PDT system beskrivs, och den antibakteriella effekten av denna modell på S. aureus biofilmer visades. Två metoder användes för att testa effekten av ALA-PDT på S. aureus biofilmer i detta protokoll. Medan CFU testet visat den antimikrobiella effekten genom att beräkna de viabla cellerna efter behandling, fluorescerande livskraft färgning med CLSM inte bara bekräftade resultaten av testet CFU men också upptäckt det morfologiska teckenet av levande och döda bakterier i situ. Använda både analytiska tekniker tillsammans är en perfekt metod för att fastställa effekten av ALA-PDT på biofilmer. Baserat på resultaten CLSM, distribuerades döda bakteriecellerna huvudsakligen i det övre skiktet, medan några av bakterier i bottenlagret förblev vid liv15. Det senare kan vara en källa av bakteriekolonier i CFU-analysen. Liknande resultat har observerats i en studie utförd av O'Neill et al., vilket förklaras av den låga ackumuleringen av photosensitizers i det inre lagret eller oförmåga av ljuset att tränga igenom dessa regioner19.
I detta protokoll, var den mogna biofilmen inkuberas med 10 mM av ALA för 1 h före exponering för PDT. Dessa parametrar har valts ut baserat på resultaten av två före experiment. Först testades den antimikrobiella effekten av ALA mot biofilmer utan ljus bestrålning med olika koncentrationer av ALA och olika lång tid för inkubation med S. aureus biofilmer. Grupper utan bakteriedödande effekt valdes som kandidater. Andra PDT effekten upptäcktes i dessa grupperingar, och gruppen med de mest potenta bakteriedödande effekten valdes slutligen i detta protokoll. Således säkerställt de parametrar som används i detta protokoll, att det inte fanns någon bakteriedödande effekt av ALA ensam. En 1-h inkubationstiden är betydligt kortare än de som används i tidigare studier17,20, vilket gör det bekvämt för in vitro- studier och potentiella tillämpning i framtida kliniska behandlingar.
I området i närheten finns det flera kritiska punkter för framgångsrik användning av denna modell. Första bör hela processen involverar manipulering av ALA behandlas bakterier utföras i mörker. Andra bör manipulering av den mogna biofilmer vara skonsam att undvika att störa den bildade biofilmen. Tredje i CFU test, bör skrapning bakterierna från botten av plattorna vara grundlig. Slutligen bör den nylagade ALA användas; Därför är det bättre att förbereda ALA precis innan experimentet.
Trots detta protokoll kan användas för att testa effekten av ALA-PDT på S. aureus biofilmer in vitro-, är det fortfarande skiljer sig från den kliniska situationen i vivo. Exempelvis biofilmer i kroppen bildas oftast genom flera bakteriestammar21,22, och miljön i vivo är mer komplex än att in vitro-, som kan påverka effekten av PDT. Därför behövs framtida i vivo experiment för en fullständig utvärdering av de antibakteriella effekterna av ALA-PDT på S. aureus biofilmer. Dock på grund av dess fördelar av bekvämlighet och de etiska frågorna om in-vivo studier, kommer att in vitro- plattformen vara användbart och praktiskt att förbättra studien av effekterna av ALA-PDT på S. aureus biofilmer. Det bör också noteras att även om ALA, en föregångare till photosensitizer PpIX, har goda egenskaper, inklusive snabb clearance, mindre och kortare livslängd kutan ljuskänslighet, begränsat ljus penetration begränsas till ytliga lesioner och särskilt dess icke-kumulativ toxicitet14, ljusdos och photosensitizer koncentration krävs för att uppnå bakterier döda kan fortfarande ha en åskådare effekt på mottagande cellernas viabilitet. Således är att studera ändring av ALA23 målinriktad terapi av valda patogena bakteriestammar som S. aureus värdefull för framtida antimikrobiell terapi.
Detta protokoll kan inte bara användas för att studera effekten av ALA-PDT på S. aureus -stammar i framtiden men kan också refereras för att studera dess effekt på biofilmer som bildas av andra bakterier. Parametrarna, såsom en koncentration av ALA och varaktigheten av bakterier inkubering med ALA, kan variera mellan olika bakteriestammar, men de principer som diskuterats ovan delas vanligen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av nationell natur Science Foundation i Kina för unga forskare (nr 81300810), Shanghai ung läkare träningsprogram (nr 20141057) och National Natural Science Foundation Kina (81671982, 81271791 och 81571955). Vi vill tacka LetPub (www.letpub.com) för att tillhandahålla språkligt stöd under utarbetandet av detta manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone Soya Broth (TSB) | OXOID | CM0129B | |
| Tryptone Soya Agar (TSA) | OXOID | CM0131 | |
| SYTO9 | Thermo Fisher Scientific | L7012 | The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits |
| Propidium iodide (PI) | Thermo Fisher Scientific | L7012 | The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | P3292 | |
| 5-aminolevulinic acid (ALA) | Fudan Zhangjiang Bio-Pharm | 3.1 | |
| Staphylococcus aureus strain USA300 | / | / | The source of USA 300 references “Tenover FC, Goering RV. J Antimicrob Chemother. 2009 Sep; 64(3):441-6”. |
| Staphylococcus aureus clinical strains (C1-C3) | / | / | All clinical strains were isolated from patients with chronic rhinosinusitis in the Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Eye and ENT Hospital of Fudan University [Zhang QZ, Zhao KQ, Wu Y, et al. PLoS One. 2017 Mar; 12(3): e0174627]. |
| 96-well microplate | Corning Inc | 3599 | Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile |
| Fluorodish | NEST Biotechnology | 801001 | Glass bottom, Non-pyrogenic |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Eppendorf microcentrifuge 5417 | Eppendorf | Z365998 | SIGMA | |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | SHKE4000 | MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shakers |
| Light emitting diode (LED) | Wuhan Yage Optic and Electronic Technique CO | LED-IB | |
| Leica TCS SP8 confocal laser-scanning microscope | Leica Microsystems | ||
| Leica LAS AF software | Leica Microsystems | ||
| IMARIS software | Bitplane |
References
- Lewis, K. Riddle of biofilm resistance. Antimicrob Agents Chemother. 45 (4), 999-1007 (2001).
- Rabin, N., et al. Biofilm formation mechanisms and targets for developing antibiofilm agents. Future Med Chem. 7 (4), 493-512 (2015).
- Mah, T. F., O'Toole, G. A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends Microbiol. 9 (1), 34-39 (2001).
- Sharma, M., et al. Toluidine blue-mediated photodynamic effects on staphylococcal biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 52 (1), 299-305 (2008).
- Rosa, L. P., da Silva, F. C., Nader, S. A., Meira, G. A., Viana, M. S. In vitro effectiveness of antimicrobial photodynamic therapy (APDT) using a 660 nm laser and malachite green dye in Staphylococcus aureus biofilms arranged on compact and cancellous bone specimens. Lasers Med Sci. 29 (6), 1959-1965 (2014).
- Rosa, L. P., Silva, F. C., Nader, S. A., Meira, G. A., Viana, M. S. Effectiveness of antimicrobial photodynamic therapy using a 660 nm laser and methyline blue dye for inactivating Staphylococcus aureus biofilms in compact and cancellous bones: An in vitro study. Photodiagnosis Photodyn Ther. 12 (2), 276-281 (2015).
- Mai, B., et al. The antibacterial effect of sinoporphyrin sodium photodynamic therapy on Staphylococcus aureus planktonic and biofilm cultures. Lasers Surg Med. 48 (4), 400-408 (2016).
- Gandara, L., Mamone, L., Bohm, G. C., Buzzola, F., Casas, A. Enhancement of photodynamic inactivation of Staphylococcus aureus biofilms by disruptive strategies. Lasers Med Sci. 32 (8), 1757-1767 (2017).
- Baltazar, L. M., et al. Antimicrobial photodynamic therapy: an effective alternative approach to control fungal infections. Front Microbiol. 6, 202 (2015).
- Fernandes, T., Bhavsar, C., Sawarkar, S., D'Souza, A. Current and novel approaches for control of dental biofilm. Int J Pharm. 536 (1), 199-210 (2017).
- De Sordi, L., et al. Development of Photodynamic Antimicrobial Chemotherapy (PACT) for Clostridium difficile. PLoS One. 10 (8), e0135039 (2015).
- Harris, F., Pierpoint, L. Photodynamic therapy based on 5-aminolevulinic acid and its use as an antimicrobial agent. Med Res Rev. 32 (6), 1292-1327 (2012).
- Donnelly, R. F., McCarron, P. A., Tunney, M. M.
- Shi, H., Li, J., Zhang, H., Zhang, J., Sun, H. Effect of 5-aminolevulinic acid photodynamic therapy on Candida albicans biofilms: An in vitro study. Photodiagnosis Photodyn Ther. 15, 40-45 (2016).
- Zhang, Q. Z., et al. 5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy and its strain-dependent combined effect with antibiotics on Staphylococcus aureus biofilm. PLoS One. 12 (3), 0174627 (2017).
- Chang, Y. C., et al. Rapid single cell detection of Staphylococcus aureus by aptamer-conjugated gold nanoparticles. Sci Rep. 3, 1863 (2013).
- Barra, F., et al. Photodynamic and Antibiotic Therapy in Combination to Fight Biofilms and Resistant Surface Bacterial Infections. Int J Mol Sci. 16 (9), 20417-20430 (2015).
- St Denis, T. G., et al. All you need is light: antimicrobial photoinactivation as an evolving and emerging discovery strategy against infectious disease. Virulence. 2 (6), 509-520 (2011).
- O'Neill, J. F., Hope, C. K., Wilson, M. Oral bacteria in multi-species biofilms can be killed by red light in the presence of toluidine blue. Lasers Surg Med. 31 (2), 86-90 (2002).
- Li, X., et al. Effects of 5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy on antibiotic-resistant staphylococcal biofilm: an in vitro study. J Surg Res. 184 (2), 1013-1021 (2013).
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).
- Elias, S., Banin, E. Multi-species biofilms: living with friendly neighbors. FEMS Microbiol Rev. 36 (5), 990-1004 (2012).
- Wu, J., et al. Design and Proof of Programmed 5-Aminolevulinic Acid Prodrug Nanocarriers for Targeted Photodynamic Cancer Therapy. ACS Appl Mater Interfaces. 9 (17), 14596-14605 (2017).
