Summary
Murine distale kolostomi giver en murine model for menneskelig omledning colitis, en overvejende lymfatisk colitis i kolon segment udelukket fra fecal strøm.
Abstract
Omledning colitis (DC) er en hyppig kliniske tilstand forekommer hos patienter med tarmkræft segmenter udelukket fra fecal strøm som følge af en omdirigere enterostomy. Ætiologien af denne sygdom er stadig uklare, men synes at adskiller sig fra klassisk inflammatoriske tarmsygdomme som Crohns sygdom og colitis ulcerosa. Forskning har til formål at dechifrere de patofysiologiske mekanismer fører til udviklingen af denne sygdom er blevet alvorligt hæmmet af manglen på en passende murine model. Denne protokol genererer en murine model af DC, der letter studiet af immunsystemets rolle og dens samspil med microbiome i udviklingen af DC. I denne model ved hjælp af C57BL/6 dyr, er distale dele af tyktarmen udelukket fra den fecal strøm ved at oprette en distal kolostomi, udløser udviklingen af mild til moderat betændelse i de udelukkede tarm segmenter og gengive hallmark læsioner af menneskelige DC med en moderat systemisk inflammatorisk respons. I modsætning til den rotte model er et stort antal genetisk modificerede murine modeller på C57BL/6 baggrunden tilgængelige. Kombinationen af disse dyr med vores model giver de potentielle roller enkelte cytokiner, kemokiner eller receptorer af bioaktive molekyler (fx, interleukin (IL) -17; Il-10, chemokine CXCL13, chemokine receptorer CXCR5 og CCR7 og sphingosine-1-fosfat receptor 4) skal vurderes i patogenesen af DC. Tilgængeligheden af congenic musen stammer på C57BL/6 baggrund letter i høj grad overførsel eksperimenter for at etablere forskellige celletyper involveret i ætiologien af DC roller. Endelig, modellen giver mulighed for at vurdere indflydelsen fra lokale interventioner (fx, ændring af den lokale microbiome eller lokal anti-inflammatorisk terapi) på mucosal immunitet i berørte og ikke-berørt tarm segmenter og på systemisk immun homøostase.
Introduction
I de seneste år, et betydeligt antal ikke-infektiøs tarmbetændelse enheder forskellig fra klassisk inflammatoriske tarmsygdomme (IBDs; dvs., Crohns sygdom eller colitis ulcerosa) har været klinisk og histopathologically karakteriseret i mennesker. De patofysiologiske mekanismer fører til udviklingen af disse colitis former er ikke helt forstået delvist fordi passende dyremodeller er knappe. Omledning colitis er en af disse for nylig beskrevet enheder. Selv om begrebet blev opfundet i 1980 af Glotzer1, fik den første beskrivelse af en lignende fænotype i 1972 af Morson2. Sygdommen udvikler sig i 50% til 91% af patienter med fornøjelige enterostomy, og dens kliniske intensitet varierer3,4. I betragtning af den årlige incidens af omkring 120.000 kolostomi patienter i Amerikas Forenede Stater, udgør denne sygdom enhed et vigtigt sundhedsproblem.
Det overordnede mål om at udvikle denne protokol var at give en murine DC model, bygger på en colitis udløser svarende til den, set i menneskelige DC og som gengiver de primære histopatologiske funktioner i den menneskelige sygdom. I modsætning til andre murine colitis modeller, kræver colitis induktion i vores model ikke genetisk modificerede dyr (f.eks., IL-7 Transgene mus, N-cadherin dominerende negativ mus eller TGFβ- / - mus), anvendelsen af kemisk irriterende stoffer (fx, dextran sulfat natrium (DSS) - induceret colitis eller trinitrobenzene ethylbenzthiazolinsulfonsyre syre (TNBS) - induceret colitis) eller overførsel af specifikke cellepopulationer i immun mangelfuld mus (som i CD45RBhøj overførselshastighed model af colitis) (for en anmeldelse, se5). I modsætning til andre modeller tillader intakt immunsystemet af vores DC modellen vurdering af de immunologiske mekanisme involveret i DC udvikling. Begrænsning af slimhindeinflammation udelukkede tarm målgruppen giver mulighed for vurdering af dets konsekvenser på mucosal immunitet i andre dele af mave-tarmkanalen, på den immun homøostase i andre immun rum af tarmkanalen (f.eks. , Peyer's patches og mesenteriale lymfeknuder), og på den immun homøostase i hele organismen. Endelig, vores model udgør et egnet redskab til at undersøge de mekanismer, der styrer lokale inflammatoriske stimuli med oprindelse fra ændringer i den normale lokale miljø for både lokale microbiome samt husstands antigener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af den veterinærmedicinske regeringsmyndighed (Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg-Vorpommern, (LALLF M-V)).
1. Præoperative pleje og forberedelse af dyret
- Ved ankomsten i det animalske facilitet, opdele dyr (C57Bl/6) i grupper af lignende størrelse, bur hver gruppe sammen og holde grupper konstant i hele eksperimenterne.
Bemærk: Brug dyr af samme køn. Resultater beskrevet blev opnået med mandlige mus.
Bemærk: Hvis handyr anvendes, bur grupper sammen starter når de er 7 uger gammel, så der kan etableres et hierarki, hvilket minimerer risikoen for aggressiv adfærd under eksperimenter. - Mindst en uge før operationen, skifte til en høj energi (> 14 MJ/kg) og højt proteinindhold (> 20%) foder, der indeholder alle de vigtige sporstoffer og vitaminer (for detaljer, se listen over materialer).
Bemærk: Forsikre alle mus vejer mindst 25 g når operationen udføres. - Fremkalde anæstesi og analgesi ved intraperitoneal injektion af ketamin (87 mg/kg i.p.) og xylazinhydrochlorid (13 mg/kg i.p.). Vent, indtil musen tåler mekanisk stimulation, fx tå banen, uden motor respons.
- Sikre narcotized musen med bånd i en liggende stilling på en varme underlag placeret udflugtsskranken drift, sikre stabil placering under drift og undgå en overvældende tab af kropsvarme.
Bemærk: Varme underlag skal have en overflade temperatur på 36 ° C til 40 ° C; operationsstuen temperatur skal være 21 ° C.
2. distale kolostomi drift
- Barbere abdominal hår. Før du starter kirurgi, desinficere feltet operation tre gange ved hjælp af alkohol 70% og en iodophor. Drapere feltet operation at garantere for aseptiske forhold.
- Udføre en 15-mm median laparotomi ved incising mavemusklerne og bughinde langs linea alba, hvilket minimerer blodtab.
- Bruge to DeBakey atraumatisk pincet, træk forsigtigt coecum, terminal ileum, og stigende og tværgående tyktarm fra bughulen.
Bemærk: Vær forsigtig til strengt begrænse mekaniske manipulation af tarmen til at forhindre skade mesenteriallymfeknuderne strukturer. - Identificere de cecal pole, opstigende kolon og tyndtarmen (tal 1a og 1b).
Bemærk: Korrekt identifikation af de opstigende kolon er afgørende for korrekt placering af kolostomi. I tilfælde hvor ileocecal region anatomi er tvetydige, tilstedeværelsen af Peyerske identificerer tyndtarmen, og tilstedeværelsen af dannede taburet karakteriserer tyktarmen. - Bruge en lineal til at bestemme placeringen af de fremtidige kolostomi. Det bør være placeret 20 mm distalt for ileocecal ventil for en distal kolostomi.
- Gøre en anden 3-mm snit i bugvæggen i øvre højre kvadrant. Træk den tidligere identificerede kolon segment gennem dette snit til at danne en løkke, være omhyggelig med ikke at fordreje løkken.
- Omhyggeligt passere en 22-gauge fleksible i.v. kanyle gennem mesocolon. Passe på ikke for at beskadige mesenteriallymfeknuderne vaskulære strukturer.
- Returnere tarmen til bughulen.
- Lave begge ender af det fleksible rør til huden ved hjælp af enkle Sting og en resorberbare sutur (fx, polyglactin 910 eller polyfil 4-0 1/2 c).
- Før du lukker laparotomi, udføre væske genoplivning ved hjælp af en intraperitoneal injektion af 0,5 mL 0,9% saltvand.
- Luk bughinden og muskel lag med en fortløbende sutur ved hjælp af en resorberbare sutur (f.eks. polyglactin 910 eller polyfil 4-0 1/2 c). Lukke huden med en fortløbende sutur ved hjælp af en resorberbare sutur (f.eks. polyglactin 910 eller polyfil 4-0 1 / 2c).
- Åbn exteriorized colon løkken ved at udføre en subtotal transection ved hjælp af et fin saks. Undgå alle skade mesenterium. Ikke Transekttællinger tyktarmen helt.
- Løse hver kolostomi åbning ved hjælp af tre enkelt fuld-tykkelse sting til bughinden og hud ved hjælp af en monofil, resorberbare sutur (f.eks.polydioxanone eller monofil 6-0 3/8 ' ere). De afferente løkke, som er en funktionel ende-kolostomi, og den efferente løkke, som er en SLIM fistel, adskilles klart på dette punkt (figur 1 c).
Bemærk: Drift tid skal være mindre end 20 minutter at begrænse tab af væske og termisk. - Efter endt kirurgi, desinficere instrumenter ved hjælp af en aldehyd-fri desinfektion løsning i et ultralydsbad efter instrukser fra fabrikanten.
3. sham Operation (Colotomy)
- Udfør trin 1.1. gennem 2.4.
- Bruge en lineal til at bestemme den fremtidige colotomy placering. Colotomy skal placeres i samme afstand fra ileocecal ventil som kolostomi i den eksperimentelle gruppe.
- Åbn kolonet mindst to-tredjedele sin omkreds ved hjælp af fine sakse.
- Luk colotomy med et enkelt lag, fuld-tykkelse afbrudt sutur ved hjælp af en monofil, resorberbare sutur (f.eks. polydioxanone, monofil 6-0 3/8 ' ere).
Bemærk: Drift tid skal være mindre end 20 minutter til en eksperimenterede kirurg, begrænse tab af væske og termisk. - Udfør trin 2.10. , 2.11. og 2.14.
4. postoperativ pleje
- Vende dyr til deres bure. Giver en godt hærdet atmosfære ved 37 ° C (f.eks.med en infrarød lampe) indtil mus er helt vågen. Derefter holde mus i en temperatur og luftfugtighed reguleret miljø (21 ° C, relativ luftfugtighed 30% ± 10%). Give gratis adgang til fødevarer og drikkevand. For at lette væske optagelse, give ekstra vand-gennemblødt dyrefoder.
- Start postoperative analgesi ved at indsprøjte 0,1 mg/kg krop vægt buprenorphin s.c. når dyr Vis svar på mekaniske stimulation. Vær omhyggelig med at undgå respiratorisk depression.
- Supplere vand med 1 mg/mL tramadol for fortsatte analgesi under den første postoperative uge.
- For at kompensere for nedsat væskeindtag skyldes nedsat mobilitet, levere en Solid drikke Pad i buret i den første postoperative uge.
- Vejes dyrene og score dyreadfærd dagligt i løbet af den første uge, hver anden dag i resten af den første måned, og hver tredje dag i den anden måned ved hjælp af sygdom sværhedsgraden score beskrevet i Kleinwort et al. 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kirurgi er veltolereret både i eksperimentelle (kolostomi) og humbug (colotomy). Perioperative dødelighed bør ikke overstige 10%, når kirurgi og perioperative forvaltning udføres korrekt. I den første postoperative uge ses betydelige vægttab i både de eksperimentelle og forlorne grupper. Dyr af gruppen sham nå deres vægt nadir normalt mod den fjerde postoperative dag, men det sker en dag senere i den eksperimentelle gruppe. Vægttab er mere udtalt i den eksperimentelle gruppe, nå 21,7% af oprindelige kropsvægt. Derimod mister sham dyr 10,8% af deres oprindelige organ vægt (figur 2)6. Efter vægt nadir i den første postoperative uge stiger kropsvægt kontinuerligt i begge eksperimentelle grupper, men med en langsommere skråning i den eksperimentelle gruppe. Tegn og symptomer på alvorlig tarmbetændelse (dvs., blodig udledning eller flydende afføring opstår hverken i den eksperimentelle heller sham gruppe6). Samlede dødelighed i de første 60 dage er efter operationen omkring 40% i gruppen kolostomi og omkring 10% i gruppen colotomy. De fleste dødsfald i den første postoperative uge (61% i den eksperimentelle gruppe, 66% i gruppen sham). Dødsårsager er vist i figur 3.
Distale kolostomi i mus resultater i udviklingen af overvejende lymfatisk colitis gengive hallmark histologiske funktioner af menneskelige DC. Disse ændringer stiger med varigheden af intestinal udstødelse. Krypten længde forkortes betydeligt i udelukkede tarm segmenter. Denne afkortning når Statistisk signifikans efter 14 dage af fækal omlægning (figur 3a). Bæger celle-bærende krypt længde reduceres efter 30 dage i udelukkede tarm segmenter (figur 3b). Absolut bæger celle numre er også væsentligt reduceret i Krypter i udelukkede tarm segment efter 14 postoperative dage (figur 3 c). Hallmark læsion af DC, udvikling af lymfoide follikler i slimhinden, kræver en længere varighed af afføring afvigelse. Selv om et øget antal lymfoide follikler kan ses så tidligt som i to uger, blive forskelle betydeligt efter to måneder (tal 5a-c). Alle histopatologiske forandringer beskrevet før er mere udtalt i distal end proksimal regioner af de udelukkede tarm segmenter. En typisk neutrophilic infiltrere som et tegn på akut inflammation er normalt ikke observeret (tal 5 d-e).
Som et tegn på et systemisk eftervirkning af lokale tarmbetændelse, er neutrofile tæller steget betydeligt i kolostomi dyr så tidligt som 14 dage efter operationen. Denne forskel er opretholdt indtil udgangen af observationsperioden (60 dage). Trombocyttal tæller øges lidt i dyr med Colon omledning efter 60 dage (figur 6). Hæmoglobinniveau og hæmatokrit reduceres 14 dage efter operation i gruppen kolostomi i forhold til gruppen humbug.
Det har vist sig at vitaminmangel i gnavere årsager reduceret gennemsnitlig corpuscular volumen (MCH) og betyder corpuscular hæmoglobin (MCV) værdier7. I vores model ser vi første stigninger i begge disse parametre efter 14 og 30 dage. Både MCV og MCH tilbagevenden til normale værdier efter længere opfølgning (figur 7). Dette viser, at distale kolostomi ikke resulterer i klinisk signifikant vitaminmangel under langsigtet opfølgning.
Figur 1: anatomi cecal-regionen og den kirurgiske procedure. a en grafisk repræsentation af postoperative anatomi. b topografi cecal pol og anatomiske landemærker. (c) grafisk repræsentation af kolostomi åbningerne. Figur 1a er blevet ændret fra Kleinwort et al.6. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Body vægt udvikling. Kropsvægt er vist som procentdel af den præoperative kropsvægt. Kroppen Vægtkurve af kolostomi og humbug (colotomy) dyr viser, at den første postoperative vægttab var betydeligt højere i gruppen kolostomi i forhold til gruppen fingeret (p < 0,001). Værdierne er middel ± standardfejl af middelværdien på tværs af 21-26 dyr pr. gruppe (21 dyr modtaget kolostomi; 26 dyr var i gruppen sham). Dette tal er blevet ændret fra Kleinwort et al.6. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: dødsårsager. Komplikationer er repræsenteret som procenter af all-dødelighed og er illustreret i et cirkeldiagram (a kolostomi gruppe, b sham). Postoperative komplikationer var bestemt af obduktion. Wasting syndrome blev defineret som kontinuerlig vægttab større end 33% af den oprindelige kropsvægt og ingen andre fund ved obduktion. Ileus og Anastomotiske lækage blev diagnosticeret ved obduktion. Stomien komplikationer var defineret som peristomal abscesser og mucokutan separationer. Andre komplikationer består sår opspringning af laparotomi, iskæmi af coecum, og tilfælde klart ikke ved obduktion. Betydelige forskelle i fordelingen af postoperative komplikationer blev set mellem grupperne (p = 0.021, analyseret ved hjælp af Fisher eksakt test for to-sidet analyse af op til 6 × 6 kontingenstabeller). Der var 39 dyr i gruppen kolostomi og 29 i gruppen humbug. Dette tal er blevet ændret fra Kleinwort et al.6. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: krypt længde og bæger celle befolkning. Krypten længde og bæger celle numre var fedtfrie paraffinsnit af endetarmen efter periodiske syre-Schiff farvning. a en krypt længde var faldt betydeligt i rektum fra dyr med omledning colitis (DC). b længden af regionen bæger celle-bærende i krypten blev målt og Angiv som forholdet til den fulde krypt længde. Tredive og tres dage efter operationen, var procentdelen af krypt-længde-bærende bæger celler faldet i gruppen DC. c bæger celle tal blev reduceret betydeligt i DC dyr i forhold til gruppen humbug. Grafer i (a) gennem (c) Vis betyder, og standardafvigelser på tværs 5 til 9 dyr pr. gruppe (kolostomi 14 og 30 dage, humbug 14 dage: n = 8; kolostomi 60 dage: n = 5; humbug 30 og 60 dage: n = 9); ∗p < 0,05; ∗∗p < 0,01. Dette tal er blevet ændret fra Kleinwort et al.6. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: lymfoide follikler og inflammatoriske infiltrater. a lymfoide follikler Omkørselsafstanden koloner og sham dyr blev talt på paraffinsnit af endetarmen farves med hæmatoxylin og eosin. Grafen viser betyder, og standardafvigelser på tværs 5 til 9 dyr pr. gruppe (kolostomi 14 og 30 dage, humbug 14 dage: n = 8; kolostomi 60 dage: n = 5; styre 30 og 60 dage: n = 9), ∗p < 0,05; ∗∗p < 0,01. (b) og (c) repræsentative eksempler på dele af endetarmen kolostomi (b) og humbug (c) dyr 60 dage efter operationen farves med hæmatoxylin og eosin. En fremtrædende lymfoide follikel (∗) var til stede i slimhinden i en kolostomi mus. Skala søjler repræsenterer 100 µm. (d) og (e) farvning med chloroacetate esterase reaktion på paraffinsnit blev udført for at opdage neutrofile granulocytter. Tværsnit af Omkørselsafstanden endetarmen, blev en akut inflammatorisk neutrophilic infiltrere observeret i gruppen kolostomi (d) heller ikke i sham dyr (e) op til 60 dage efter operationen. Skala søjler repræsenterer 100 µm. Dette tal er blevet ændret fra Kleinwort et al.6. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: neutrofile og trombocyttal tæller. Blodtal venøse blodprøver blev bestemt af en veterinær hæmatologi analyzer. (a) neutrofile tæller var steget betydeligt i gruppen kolostomi sammenlignet med fingeret dyr op til 60 dage efter operationen. b trombocyt tæller var lidt forhøjet i gruppen kolostomi 60 dage efter operationen. Grafen viser betyder, og standardafvigelser på tværs 5 til 9 dyr pr. gruppe (kolostomi 14 og 30 dage, humbug 14 dage: n = 8; kolostomi 60 dage: n = 5; humbug 30 og 60 dage: n = 9), ∗p < 0,05; ∗∗p < 0,01. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: røde blodlegemer parametre. Blodtal venøse blodprøver blev bestemt af en veterinær hæmatologi analyzer. a hæmoglobin og b hæmatokrit var faldt betydeligt i gruppen kolostomi sammenlignet med fingeret gruppe. (c) gennemsnitlig corpuscular volumen (MCH) var væsentligt forhøjede 14 og 30 dage efter operationen i gruppen kolostomi i forhold til gruppen sham, men vendte tilbage til normal efter 60 dage. (d) gennemsnitlig corpuscular hæmoglobin (MCV) værdier blev forhøjet efter 30 dage, men ikke længere efter 60 dage efter operationen i gruppen kolostomi sammenlignet med humbug dyr. Grafen viser betyder, og standardafvigelser på tværs 5 til 9 dyr pr. gruppe (kolostomi 14 og 30 dage, humbug 14 dage: n = 8; kolostomi 60 dage: n = 5; humbug 30 og 60 dage: n = 9), ∗p < 0,05; ∗∗p < 0,01. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den murine model af DC præsenteret i denne protokol pålideligt gengiver de histopatologiske funktioner af menneskelige DC (fx, de novo udvikling af lymfoide follikler i submucosa af betændte tarm segmenter, krypt afkortning og reduktioner i bæger celle numre). Bortset fra denne fordel, denne model er foranlediget af en meget lignende udløsende faktor og præsenterer med en klinisk kursus af moderat til mild sværhedsgraden, som er tilfældet i de hårdest ramte mennesker.
At opnå reproducerbare resultater og acceptable perioperative dødelighed, nogle praksis i microsurgical metoder er nødvendige. Men både kolostomi og sham operation (colotomy) kan udføres med meget lav perioperative MORTALITET (< 10%). Nogle operationstrin er af stor betydning: 1) identificere kolon og terminal ileum. I tilfælde hvor anatomi af regionen ileocecal ikke klart, kan tyktarmen identificeres ved tilstedeværelsen af dannede afføring og terminal ileum ved tilstedeværelsen af Peyerske plaques. 2) når exteriorizing kolostomi loop, forsikre mesenterium ikke er vrider, således at man undgår mesenteriallymfeknuderne iskæmi og mekanisk ileus. 3) når punktering mesenterium med den fleksible rør, forsikre et fartøj-fri sektor er valgt, dermed forhindre blødning og mesenteriallymfeknuderne iskæmi. 4) når du opretter den lille snit i maveskindet, kontrollere, om tilstrækkelig hæmostase. Hvis det er nødvendigt, skal du bruge thermo-koagulation til at stoppe blødninger fra muskel fartøjer. 5) forsikre Colon loop er åben i det mindste på to tredjedele af sin omkreds og at den bageste væg tilstrækkeligt exteriorized, dermed garantere fuldstændig blokering af afføring passage til distale tarm segmenter. 6) forsikre at begge kolostomi ender godt fast på huden til at undgå en åben passage til bughulen resulterer i højere infektion risici eller en mekanisk ileus, fordi den fecal strøm ikke kan afslutte. Normalt, kan alle kirurgiske procedurer udføres uden Forstørrelsesglas eller kirurgiske mikroskoper. Generelt, kræver udnyttelse af disse enheder yderligere uddannelse.
Selv når kompleksiteten af de kirurgiske procedurer er kun moderat, er der mange væsentlige operative og perioperative problemer skal betragtes med held opsige eksperiment med reproducerbare resultater.
Det er afgørende for langsigtet overlevelse med en permanent kolostomi, at mus har en intakt coecum. En eksperimentel musikgruppe med proksimale kolostomi støder op til ileocecal ventilen viste en dødelighed på 100% i den første postoperative uge på grund af uoprettelige vægttab (data ikke vist). Derfor er det af største vigtighed at vælge kolostomi websted mindst 20 mm distale fra den Bauhin ventil. Denne bemærkning kan skyldes fysiologi af gnaver fordøjelsen. Retrograd transport fra den proksimale kolon til coecum forekommer i disse arter. Coecum er hvor syntesen af næringsstoffer ved bakteriel mikroflora occurs8. Normal MCV og MCH værdier under langvarig opfølgning angiver, at dyr med distale kolostomi ikke lider af betydelige vitaminmangel. Desuden er coprophagy en væsentlig del af den ernæringsmæssige opførsel af gnavere i deres naturlige omgivelser. Ved fastlæggelsen af modellen, var vi meget bekymret, at forstyrrende coprophagy som følge af tilstedeværelsen af en permanent kolostomi kan føre til ernæringsmæssige mangler, (f.eks., B-vitamin). Men selv om det er et problem på betingelser, hvor adgangen til næringsstoffer er begrænset, det har tidligere vist sig at coprophagy mister sin ernæringsmæssige betydning under forsøgsbetingelser med gratis overskydende vand og ernæringsmæssigt afbalanceret mad9 . Under vores forsøgsbetingelser er det vigtigt at optimere vilkårene for postoperative ernæringsmæssige indtag. Vi anvendte dyrefoder, der havde et højt proteinindhold, optimeret protein kvalitet og øget energi tæthed. Dyrene blev akklimatiseret til denne diæt på mindst to uger før operationen. Efter operationen, blev vand-gennemblødt foder tilbudt ad libidum til lette mad og væskeindtagelse.
Det er afgørende at udnytte mus af samme køn i både de eksperimentelle og forlorne grupper. Sex har vist at betydeligt påvirke løbet af systemisk inflammation, men også af intestinal inflammation i forskellige kemisk induceret colitis modeller10,11,12. I almindelighed, vil handyr udvikle mere udtalt sygdom med større betændelse, mere krypt skade, mindre regenerering, højere niveauer af pro-inflammatoriske cytokiner og langsommere tilbagebetalinger fra vægt tab10. En yderligere fordel ved at bruge handyr er bedre alder-matchede præoperativ krop vægte, fører til bedre erstatning til perioden første postoperative vægt tab. Ikke desto mindre hunmus kan bruges i protokollen, hvis specifikke spørgsmål (f.eks., påvirkning af sex hormoner på manifestation af DC er at blive behandlet. Ved hjælp af mandlige mus kræver mere indsats i at opretholde stabile boligforhold. Mandlige mus er mere tilbøjelige til aggressive interaktioner fører til skader og dødsfald. Mandlige mus lever i etablerede hierarkier med én dominerende mand. Når hierarkiet i gruppen er etableret, er fortsatte kampe mindre almindelige13,14. Af denne grund, vi dannede de eksperimentelle grupper ved ankomsten af musene i vores Dyrefacilitet mindst to uger før operationen og vedligeholdes disse grupper indtil forsøg endte. I almindelighed, blev eksperimentelle grupper af 5 til 7 dyr holdt i en bur. Vedligeholdelse af stabile sociale og boligforhold var yderst vigtigt ikke kun at minimere aggressiv adfærd af forsøgsdyr. Bolig forhold har vist sig at påvirke vægtøgning samt immunologiske parametre15,16,17.
Modtagelighed for kemisk induceret og genetisk modificerede colitis modeller varierer betydeligt mellem mus stammer18,19,20. Denne protokol blev etableret i C57Bl/6 mus, musen stamme med en veldefineret genetiske baggrund og en vel karakteriseret immunsystemet21,22,23 , viser mellemliggende til stærk inflammatoriske svar i dextran sulfat natrium-induceret colitis model20 og betragtes som en prototypiske Th1 stamme23. Brug af andre mus stammer kan betragtes som når mere alvorlig sygdom aktiviteter eller en Th2 miljø er påkrævet.
I Resumé udgør vores protokol et værdifuldt redskab til vurdering af forskellige immun celletyper, cytokiner, kemokiner og andre signalsystemer molekyler i patogenesen af DC rolle. Et stort antal af genmodificerede mus modeller fås med C57BL/6 baggrund og kan kombineres med vores model (fx, mus mangelfuld for IL-17, IL-10, chemokine CXCL13, chemokine-receptorer CXCR5 og CCR7, og sphingosine-1-fosfat receptor 4). Tilgængeligheden af congenic musen stammer på C57BL/6 baggrund i høj grad lette overførsel eksperimenter til at etablere forskellige celletyper involveret i ætiologien af DC rolle. Endelig, modellen giver mulighed for at vurdere indflydelsen fra lokale tiltag (f.eks.ændring af den lokale microbiome og lokal anti-inflammatorisk terapi) på mucosal immunitet i berørte og ikke-berørt tarm segmenter og systemiske immun homøostase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Ingen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Operation material | |||
| heat underlay, 6 watt | ThermoLux, Witte + Sutor GmbH | 461265 | |
| Ethanol 70% (with methylethylketon) | Pharmacie of the University Hospital Greifswald | ||
| Wooden applicators, small cotton head onesided, wooden stick, 150 mm length | Centramed GmbH, Germany | 8308370 | for disinfection of operation field |
| Scissor | Aesculap (BRAUN) | BC064R | |
| Atraumatic DeBakey forceps | Aesculap (BRAUN) | OC021R | |
| Needle holder | Aesculap (BRAUN) | BM012R | |
| Vasofix Safety i.v. cannula 22G | Braun Melsungen AG, Germany | 4268091S-01 | |
| VICRYL Plus 4-0 violet braided; V-5 17 m 1/2c; 70 cm | ETHICON, Inc. | VCP994H | |
| PDS II 6-0 monofil; V-18 13 mm 3/8c; 70 cm | ETHICON, Inc. | Z991H | |
| BD Plastipak 1 mL (Syringes with needle with sterile interior) | BD Medical | 305501 | |
| Triacid-N (N-Dodecylpropan-1,3-diamin) | ANTISEPTICA, Germany | 18824-01 | disinfection of surgical instruments in ultrasonic bath |
| Medications | |||
| ketamine 10%, 100 mg/mL (ketamine hydrochloride) | selectavet, Dr. Otto Fischer GmbH | 9089.01.00 | 87 mg/kg i.p. |
| Xylasel, 20 mg/mL (xylazine hydrochloride) | selectavet, Dr. Otto Fischer GmbH | 400300.00.00 | 13 mg/kg i.p. |
| NaCl 0.9% | Braun Melsungen AG, Germany | 6697366.00.00 | |
| Buprenovet 0.3 mg/mL (buprenorphine) | Bayer, Germany | PZN: 01498870 | 0.1 mg/kg s.c. |
| Tramal Drops, 100 mg/mL (tramadol hydrochloride) | Grünenthal GmbH, Germany | 10116838 | 1 mg/mL drinking water |
| Ceftriaxon-saar 2 g (ceftriaxone) | Cephasaar GmbH, Germany | PZN: 08844252 | 25 mg/kg body weight i.p. |
| metronidazole 5 mg/mL | Braun Melsungen AG, Germany | PZN: 05543515 | 12.5 mg/kg body weight i.p. |
| Food | |||
| ssniff M-Z Ereich | ssniff, Germany | V1184-3 | |
| Solid Drink Dehyprev Vit BIO, pouches | TripleATrading, the Netherlands | SDSHPV-75 | |
| Equipment | |||
| Nikon Eclipse Ci-L | Nikon Instruments Europe BV, Germany | light microscopy | |
| VetScan HM 5 | Abaxis, USA | 770-9000 | Veterinary hematology analyzer of 50 µl venous EDTA-blood |
| Bandelin SONOREX (Ultrasonic bath) | Bandelin electronics, Germany | RK 100 H | disinfection of surgical instruments |
| Software | |||
| NIS-Element BR4 software | Nikon Instruments Europe BV, Germany | ||
| GraphPad Prism Version 6 | GraphPad Software, Inc. |
References
- Glotzer, D. J., Glick, M. E., Goldman, H. Proctitis and colitis following diversion of the fecal stream. Gastroenterology. 80, 438-441 (1981).
- Morson, B., Dawson, I. Gastrointestinal Pathology. , Blackwell Scientific Publications. London. (1972).
- Whelan, R. L., Abramson, D., Kim, D. S., Hashmi, H. F. Diversion colitis. A prospective study. Surg Endosc. 8, 19-24 (1994).
- Haas, P. A., Fox, T. A., Szilagy, E. J. Endoscopic examination of the colon and rectum distal to a colostomy. Am J Gastroenterol. 85, 850-854 (1990).
- Valatas, V., Bamias, G., Kolios, G. Experimental colitis models: Insights into the pathogenesis of inflammatory bowel disease and translational issues. Eur J Pharmacol. 759, 253-264 (2015).
- Kleinwort, A., Döring, P., Hackbarth, C., Heidecke, C. D., Schulze, T. Deviation of the Fecal Stream in Colonic Bowel Segments Results in Increased Numbers of Isolated Lymphoid Follicles in the Submucosal Compartment in a Novel Murine Model of Diversion Colitis. Biomed Res Int. 2017, 13 (2017).
- Tangjarukij, C., Navasumrit, P., Zelikoff, J. T., Ruchirawat, M. The effects of pyridoxine deficiency and supplementation on hematological profiles, lymphocyte function, and hepatic cytochrome P450 in B6C3F1 mice. J Immunotoxicol. 6, 147-160 (2009).
- Soave, O., Brand, C. D. Coprophagy in animals: a review. Cornell Vet. 81, 357-364 (1991).
- Ebino, K. Y., Yoshinaga, K., Suwa, T., Kuwabara, Y., Takahashi, K. W. Effects of prevention of coprophagy on pregnant mice--is coprophagy beneficial on a balanced diet. Jikken Dobutsu. 38, 245-252 (1989).
- Babickova, J., Tothova, L., Lengyelova, E., Bartonova, A., Hodosy, J., Gardlik, R., Celec, P. Sex Differences in Experimentally Induced Colitis in Mice: a Role for Estrogens. Inflammation. 38, 1996-2006 (2015).
- Lee, S. M., Kim, N., Son, H. J., Park, J. H., Nam, R. H., Ham, M. H., Choi, D., Sohn, S. H., Shin, E., Hwang, Y. J., et al. The Effect of Sex on the Azoxymethane/Dextran Sulfate Sodium-treated Mice Model of Colon Cancer. J Cancer Prev. 21, 271-278 (2016).
- Angele, M. K., Pratschke, S., Hubbard, W. J., Chaudry, I. H. Gender differences in sepsis: cardiovascular and immunological aspects. Virulence. 5, 12-19 (2013).
- Brown, R. Z. Social Behaviour, reproduction, and population changes in the house mouse (Mus musculus L). Eccological Monographs. 23, 788-795 (1953).
- Poole, T. B., Morgan, H. D. R. Differences in aggressive behaviour betweeen male mice (Mus musculus L.) in colonies of different sizes. Animal Behaviour. 21, 788-795 (1973).
- Pasquarelli, N., Voehringer, P., Henke, J., Ferger, B. Effect of a change in housing conditions on body weight, behavior and brain neurotransmitters in male C57BL/6J mice. Behav Brain Res. 333, 35-42 (2017).
- Langgartner, D., Foertsch, S., Fuchsl, A. M., Reber, S. O. Light and water are not simple conditions: fine tuning of animal housing in male C57BL/6 mice. Stress. 20, 10-18 (2017).
- Nicholson, A., Malcolm, R. D., Russ, P. L., Cough, K., Touma, C., Palme, R., Wiles, M. V. The response of C57BL/6J and BALB/cJ mice to increased housing density. J Am Assoc Lab Anim Sci. 48, 740-753 (2009).
- Buchler, G., Wos-Oxley, M. L., Smoczek, A., Zschemisch, N. H., Neumann, D., Pieper, D. H., Hedrich, H. J., Bleich, A. Strain-specific colitis susceptibility in IL10-deficient mice depends on complex gut microbiota-host interactions. Inflamm Bowel Dis. 18, 943-954 (2012).
- Nakanishi, M., Tazawa, H., Tsuchiya, N., Sugimura, T., Tanaka, T., Nakagama, H. Mouse strain differences in inflammatory responses of colonic mucosa induced by dextran sulfate sodium cause differential susceptibility to PhIP-induced large bowel carcinogenesis. Cancer Sci. 98, 1157-1163 (2007).
- Mahler, M., Bristol, I. J., Leiter, E. H., Workman, A. E., Birkenmeier, E. H., Elson, C. O., Sundberg, J. P. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am J Physiol. 274, 544-551 (1998).
- Mekada, K., Abe, K., Murakami, A., Nakamura, S., Nakata, H., Moriwaki, K., Obata, Y., Yoshiki, A. Genetic differences among C57BL/6 substrains. Exp Anim. 58, 141-149 (2009).
- Sellers, R. S., Clifford, C. B., Treuting, P. M., Brayton, C. Immunological variation between inbred laboratory mouse strains: points to consider in phenotyping genetically immunomodified mice. Vet Pathol. 49, 32-43 (2012).
- Mills, C. D., Kincaid, K., Alt, J. M., Heilman, M. J., Hill, A. M. M-1/M-2 macrophages and the Th1/Th2 paradigm. J Immunol. 164, 6166-6173 (2000).
