חוקרים נביטה Teliospore באמצעות ניתוח Microrespiration ו- Microdissection
Summary
פטריות הזימה לגרום למחלות רבות החקלאי הרסנית. הם מופצים כמו teliospores רדום זה לנבוט בתגובה לאותות סביבתיים. אנו מכינים שתי שיטות כדי לחקור את השינויים המולקולריים במהלך הנביטה: מדידת נשימה עלייה כדי לזהות מטבולית הפעלה והערכה שינוי האירועים המולקולריים המתרחשים על-ידי בידוד teliospores בשלבים מורפולוגיים ברורים.
Abstract
פטריות הזימה הסוכנים etiological של מספר מחלות החקלאי הרסנית. הם מאופיינים על ידי הייצור של teliospores, אשר פיזור בעובי דופן סוכנים. Teliospores יכולים להישאר רדום במשך עשרות שנים. תרדמה מאופיין על-ידי קצב חילוף החומרים שיש נמוך, עצר ביוסינטזה macromolecular, הקטנו רמות של הנשימה. עם קבלת אותות סביבתי הנדרש, teliospores לנבוט לייצר הפלואידי תאים, אשר יכולים ליזום סיבובים החדש של זיהום. נביטה teliospore מאופיין על ידי חידוש ביוסינטזה macromolecular, נשימה מוגברת, שינויים מורפולוגיים דרמטי. על מנת למדוד בדיוק לשינויים נשימה תאית כבר בשלבים המוקדמים של נביטה, פיתחנו פרוטוקול פשוט העסקת respirometer קלארק-סוג. בשלבים מאוחרים יותר של נביטה נבדלים על ידי שינויים מורפולוגיים ספציפיים, אבל נביטה אסינכרוני. פיתחנו טכניקה microdissection המאפשרת לנו לאסוף teliospores בשלבי נביטה ברורים.
Introduction
הפטריות הזימה (Ustilaginales) מורכב מינים יותר מ- 1,600 להדביק עשבי כולל את גידולי גריסים חשוב של תירס, שעורה, חיטה, גרימת מיליארדי דולרים בפיצויי אובדן יבול מדי שנה1. פטריות אלה מאופיינים על ידי הייצור של teliospores, אשר יש פיגמנט כהה קירות התא הסוכנים פיזור. Teliospores לפעול כדי לחסום. את החומר הגנטי במהלך הלחצים של פיזור בין צמחים פונדקאים, יכולות להימשך במצב רדום שנים2. בתור שכזה, teliospores הם מרכיב חיוני של התפשטות המחלה.
על מנת ללמוד ביולוגיה teliospore, המעבדה שלנו מנצל הפטריה הזימה דגם זקן התירס פחמון (U. זקן התירס), אשר הוא סוכן סיבתי של המחלה ‘נפוצות הזימה של תירס’. בוגר זקן התירס U. teliospores מאופיינים על ידי צמיחה מעצר, חילוף החומרים הסלולר מופחתת, רמות נמוכות של נשימה תאית3. בתנאים סביבתיים חיובית (למשל., הנוכחות של סוכרים מסוימים), זקן התירס U. teliospores לנבוט ולהשלים מיוזה, הפקת basidiospores אשר יכולים ליזום סיבובים החדש של זיהום. נביטה מאופיין על ידי נשימה מוגברת הפעילות לחזור מטבולית, את התקדמות בשלבים מורפולוגי הנצפה של נביטה4.
השלב ההתחלתי של נביטה כולל נשימה מוגברת ותפקוד מטבולית, עם זאת, ישנם אין סימנים מורפולוגיים של שינוי. המידות המקוריים של שינוי בדרכי הנשימה U. זקן התירס בוצעו מעל 50 שנים, מדידת צריכת החמצן manometrically עם מכשיר את הבקבוק ורבורג5. . פיתחנו שיטה חדשה, פשוטה של הלומדים מדויק שינויים בנשימה במהלך הנביטה teliospore על ידי מדידת צריכת החמצן במהלך הזמן מספר נביטה באמצעות microrespirometer קלארק-סוג של… בעבר השתמשנו בשיטה זו ללמוד שינוי בקצב הנשימה בין פראי-סוג מוטציות עם המיטוכונדריה פגומים6, והתאים הפלואידי זקן התירס בארצות הברית , יש להתאים את פרוטוקול כאן ללמוד שינויים בנשימה teliospore במהלך נביטה. זה מספק אמצעי זיהוי במדויק את התזמון של נשימה שינוי כך אנחנו יכולים לירות teliospores בזמן המתאים לאחר אתחול של נביטה לחקור בתחילת האירועים המולקולריים. ההתקדמות של נביטה ניתן בעקבות ברמה המיקרוסקופית, ברגע promycelia מגיח teliospore, אבל הטבע אסינכרוני עכבות בידודו של teliospores מספיק בשלב הנתון לחקירה. פיתחנו שיטה microdissection דומים לאלה המשמש עבור הפריה במבחנה לאיסוף פיזית teliospores בשלבים מורפולוגיים ברורים של נביטה.
Protocol
Representative Results
Discussion
פתוגנים צמח biotrophic basidiomycete לגרום מיליארדי דולרים של הפסדים חיתוך מדי שנה. הרוב המכריע של פתוגנים אלה מייצרים teliospores המהווים חלק בלתי נפרד פיזור פטרייתי, רבייה מינית. צובר ידע של פיתוח, נביטה של teliospores היא קריטית להבנת את התפשטות המחלות ההרסניות הנגרמת על ידי אלה פטריות. על מנת לזהות את השינוי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות ד ר פרוסט פול עבור השימוש שלו microrespirometer, ו וגנר ניקול אלכס בל לקבלת סיוע טכני. עבודה זו מומן על ידי מענק NSERC B.J.S.
Materials
| Streptomycin Sulfate | BioShop | STP101 | |
| Kanamycin Sulfate | BioShop | KAN201 | |
| Potato Dextrose Broth | BD Difco | 254920 | |
| 1 L Waring Laboratory blender | Waring | 7011S | |
| Cheesecloth | VWR | 470150-438 | |
| Nalgene Polypropylene Desiccator with Stopcock | ThermoFisher Scientific | 5310-0250 | |
| Unisense MicroRespiration system | |||
| MicroRespiration Sensor (O2) | Unisense | OX10 | |
| MicroOptode Meter Amplifier | Unisense | N/A | |
| MR-Ch Small | Unisense | MR-Ch | |
| SensorTrace Rate Software | Unisense | N/A | |
| MicroRespiration Rack | Unisense | MR2-Rack | |
| MicroRespiration Stirrer | Unisense | MR2-Co | |
| Microdissection system | |||
| Axio Vert.A1 Inverted Light Microscope | Zeiss | ||
| Coarse Manipulator | Narishige | MMN-1 | |
| Three-axis Hanging Joystick Oil Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MMO-202ND | |
| Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-11-2 | |
| TransferTip (ES) | Eppendorf | 5175107004 |
References
- Saville, B. J., Donaldson, M. E., Doyle, C. E., Swan, A. . Meiosis – Molecular Mechanisms and Cytogenetic Diversity. , 411-460 (2012).
- Christensen, J. J. . Monograph Number 2. , (1963).
- Caltrider, P. D., Gottlieb, D. Respiratory activity and enzymes for glucose catabolism in fungal spores. Phytopathology. 53, 1021-1030 (1963).
- Allen, P. J. Metabolic aspects of spore germination in fungi. Ann. Rev. Phytopathol. 3, 313-342 (1965).
- Warburg, O. Metabolism of tumours. Biochemische Zeitschrift. 142, 317-333 (1923).
- Ostrowski, L. A., Saville, B. J. Natural antisense transcripts are linked to the modulation of mitochondrial function and teliospore dormancy in Ustilago maydis. Mol Microbiol. 103 (5), 745-763 (2017).
- Morrison, E. N., Donaldson, M. E., Saville, B. J. Identification and analysis of genes expressed in the Ustilago maydis dikaryon: uncovering a novel class of pathogenesis genes. Canadian Journal of Plant Pathology-Revue Canadienne De Phytopathologie. 34 (3), 417-435 (2012).
- Doyle, C. E., Cheung, H. Y. K., Spence, K. L., Saville, B. J. Unh1, an Ustilago maydis Ndt80-like protein, controls completion of tumor maturation, teliospore development, and meiosis. Fungal Genetics and Biology. 94, 54-68 (2016).
- Stade, S., Brambl, R. Mitochondrial biogenesis during fungal spore germination: respiration and cytochrome c oxidase in Neurospora crassa. J Bacteriol. 147 (3), 757-767 (1981).
- Brambl, R. Characteristics of developing mitochondrial genetic and respiratory functions in germinating fungal spores. Biochim Biophys Acta. 396 (2), 175-186 (1975).
- Sacadura, N. T., Saville, B. J. Gene expression and EST analyses of Ustilago maydis germinating teliospores. Fungal Genet Biol. 40 (1), 47-64 (2003).
- Hilderbrand, E. M. Techniques for the isolation of single microorganisms. Botanical Review. 4 (12), 38 (1938).
- Seto, A. M. . Analysis of gene transcripts during Ustilago maydis teliospore dormancy and germination. , (2013).
- Fröhlich, J., König, H., König, H., Varma, A. . Soil Biology – Intestinal Microorganisms of Termites and Other Invertebrates. , 425-437 (2006).
- Choi, Y., Hyde, K., Ho, W. Single spore isolation of fungi. Fungal Diversity. 3, 11 (1999).
- Sherman, F. Getting started with yeast. Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Pt B. 350, 3-41 (2002).
- Chen, Y., Seguin-Swartz, G. A rapid method for assessing the viability of fungal spores. Canadian Journal of Plant Pathology-Revue Canadienne De Phytopathologie. 24 (2), 230-232 (2002).
