Summary
פטריות הזימה לגרום למחלות רבות החקלאי הרסנית. הם מופצים כמו teliospores רדום זה לנבוט בתגובה לאותות סביבתיים. אנו מכינים שתי שיטות כדי לחקור את השינויים המולקולריים במהלך הנביטה: מדידת נשימה עלייה כדי לזהות מטבולית הפעלה והערכה שינוי האירועים המולקולריים המתרחשים על-ידי בידוד teliospores בשלבים מורפולוגיים ברורים.
Abstract
פטריות הזימה הסוכנים etiological של מספר מחלות החקלאי הרסנית. הם מאופיינים על ידי הייצור של teliospores, אשר פיזור בעובי דופן סוכנים. Teliospores יכולים להישאר רדום במשך עשרות שנים. תרדמה מאופיין על-ידי קצב חילוף החומרים שיש נמוך, עצר ביוסינטזה macromolecular, הקטנו רמות של הנשימה. עם קבלת אותות סביבתי הנדרש, teliospores לנבוט לייצר הפלואידי תאים, אשר יכולים ליזום סיבובים החדש של זיהום. נביטה teliospore מאופיין על ידי חידוש ביוסינטזה macromolecular, נשימה מוגברת, שינויים מורפולוגיים דרמטי. על מנת למדוד בדיוק לשינויים נשימה תאית כבר בשלבים המוקדמים של נביטה, פיתחנו פרוטוקול פשוט העסקת respirometer קלארק-סוג. בשלבים מאוחרים יותר של נביטה נבדלים על ידי שינויים מורפולוגיים ספציפיים, אבל נביטה אסינכרוני. פיתחנו טכניקה microdissection המאפשרת לנו לאסוף teliospores בשלבי נביטה ברורים.
Introduction
הפטריות הזימה (Ustilaginales) מורכב מינים יותר מ- 1,600 להדביק עשבי כולל את גידולי גריסים חשוב של תירס, שעורה, חיטה, גרימת מיליארדי דולרים בפיצויי אובדן יבול מדי שנה1. פטריות אלה מאופיינים על ידי הייצור של teliospores, אשר יש פיגמנט כהה קירות התא הסוכנים פיזור. Teliospores לפעול כדי לחסום. את החומר הגנטי במהלך הלחצים של פיזור בין צמחים פונדקאים, יכולות להימשך במצב רדום שנים2. בתור שכזה, teliospores הם מרכיב חיוני של התפשטות המחלה.
על מנת ללמוד ביולוגיה teliospore, המעבדה שלנו מנצל הפטריה הזימה דגם זקן התירס פחמון (U. זקן התירס), אשר הוא סוכן סיבתי של המחלה 'נפוצות הזימה של תירס'. בוגר זקן התירס U. teliospores מאופיינים על ידי צמיחה מעצר, חילוף החומרים הסלולר מופחתת, רמות נמוכות של נשימה תאית3. בתנאים סביבתיים חיובית (למשל., הנוכחות של סוכרים מסוימים), זקן התירס U. teliospores לנבוט ולהשלים מיוזה, הפקת basidiospores אשר יכולים ליזום סיבובים החדש של זיהום. נביטה מאופיין על ידי נשימה מוגברת הפעילות לחזור מטבולית, את התקדמות בשלבים מורפולוגי הנצפה של נביטה4.
השלב ההתחלתי של נביטה כולל נשימה מוגברת ותפקוד מטבולית, עם זאת, ישנם אין סימנים מורפולוגיים של שינוי. המידות המקוריים של שינוי בדרכי הנשימה U. זקן התירס בוצעו מעל 50 שנים, מדידת צריכת החמצן manometrically עם מכשיר את הבקבוק ורבורג5. . פיתחנו שיטה חדשה, פשוטה של הלומדים מדויק שינויים בנשימה במהלך הנביטה teliospore על ידי מדידת צריכת החמצן במהלך הזמן מספר נביטה באמצעות microrespirometer קלארק-סוג של... בעבר השתמשנו בשיטה זו ללמוד שינוי בקצב הנשימה בין פראי-סוג מוטציות עם המיטוכונדריה פגומים6, והתאים הפלואידי זקן התירס בארצות הברית , יש להתאים את פרוטוקול כאן ללמוד שינויים בנשימה teliospore במהלך נביטה. זה מספק אמצעי זיהוי במדויק את התזמון של נשימה שינוי כך אנחנו יכולים לירות teliospores בזמן המתאים לאחר אתחול של נביטה לחקור בתחילת האירועים המולקולריים. ההתקדמות של נביטה ניתן בעקבות ברמה המיקרוסקופית, ברגע promycelia מגיח teliospore, אבל הטבע אסינכרוני עכבות בידודו של teliospores מספיק בשלב הנתון לחקירה. פיתחנו שיטה microdissection דומים לאלה המשמש עבור הפריה במבחנה לאיסוף פיזית teliospores בשלבים מורפולוגיים ברורים של נביטה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. זיהום קלח תירס
- לגדול זיה מייז (cv. הזהב בנטם) עד קלחי נוצרים החלו משי (כ 60 ימים).
- תרבות הפלואידי תואם U. זקן התירס זנים באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים כאמור תיאר7.
- להדביק באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים כמו שתואר לעיל7קלחי תירס.
2. teliospore קציר
- ציוד autoclave (ביכנר funnels, מבחנות ביכנר, בלנדרים, 250 מ ל צנטריפוגה בקבוקים, שפכטלים שטוח ומים) באמצעות תקן יבש מחזור עם סטריליזציה לפחות 30 דקות ב 121 מעלות צלזיוס (תקן מחזור נוזל מים).
- הסרת נגוע קלחי מצמחים (כ 28-35 ימים שלאחר זיהום) באמצעות תער ולהגדיר את קלחי על מגש מכוסה ספסל מגן.
- הסרת הגידולים קלחי עם סכין גילוח ולאסוף בתוך.
- ממלאים כוס בלנדר מעבדה 250 מ עם גידולים עד כ 1/3 מלא ולהוסיף dH בלוק2O עד כ 3/4 כוס בלנדר מלא. לשבש את הגידול על ידי הפועמים בבלנדר-נמוך, ובודקים.
- לחבר את משאבת ואקום מלכודת מים ולאחר מכן בקבוקון ביכנר 1 ליטר.
- משפך ביכנר גדול להכניס הבקבוק וקו החלק התחתון של משפך ביכנר עם ארבע שכבות של גזה.
- הפעל את משאבת ואקום.
- יוצקים על חלק גידולים homogenized דרך גזה מגרדים עם מרית.
- שופכים קצת dH2O לתוך בכותנה בכדי לנקות את teliospores דרך.
- חזור עד ה-dH2O עובר בכותנה. ברור.
- לסחוט בכותנה המכיל חומר הומוגני הגידול לתוך המסנן כדי להבטיח teliospore מקסימלית התאוששות.
- כאשר הבקבוק ביכנר 1 ליטר עולה קרוב מלא, לרוקן אותו לתוך בקבוקון Erlenmeyer גדול והנח אותו בצד.
- להכניס פיסת גזה חדש המסנן, חזור על השלבים (2.7-2.12) עד כל הגידולים יש כבר משובשות, מסוננים.
- שופכים את teliospores מסוננים לתוך בקבוקים צנטריפוגה בלוק 250 מ ל, צנטריפוגה ב 1,000 x g למשך 5 דקות ולאחר decant את תגובת שיקוע.
- חזור על שלב 2.14 עד כל teliospores מסוננים הם מגורען על ידי צנטריפוגה.
- להשעות את כדורי בכמות קטנה של מים, העברת צינורות צנטריפוגה 50 מ.
- Centrifuge הצינורות-1000 g x עבור 5 דקות, decant את תגובת שיקוע.
- להשעות את צניפה כ- 50 מ של dH2O centrifuge הצינורות-1000 g x עבור 5 דקות, decant את תגובת שיקוע. בעדינות לגרד את השכבה העליונה אפור עם מרית, השלך אותו. חזור עד לא קיימת עוד שכבה אפורה למעלה.
- יבש הדגימות לינה desiccator ואקום.
- חנות teliospores יבשים ב 4 ° C עד השימוש.
-
אם רצונך בכך, לפנק את teliospores עם אבקת נחושת8 לפני גרימת כדי לנבוט. אם אינו מטופל, לאחר מכן לבצע ניתוח מעמיק מיקרוסקופיים של teliospores כדי לאשר המדגם מייצג teliospores טהור, והוא חף בקטריאלי או מציג אחרים.
- שוקלים לצאת כ 50 מ ג של teliospores בשפופרת 1.5 mL microcentrifuge.
- להוסיף כ- 1.0 מ"ל של 0.75% CuSO4 הצינור microcentrifuge 1.5 mL המכיל את teliospores. פיפטה למעלה ולמטה כדי להשעות את teliospores בפתרון4 CuSO ואחריו לזעזע את הדגימה במשך 3 שעות.
- Centrifuge המדגם-2,500 g x עבור 5 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע. Resuspend בגדר teliospore במים סטריליים, חוזר צנטריפוגה, ולהסיר את תגובת שיקוע.
- חזור על שלב 2.21.3 עוד פעמיים.
3. teliospore הכדאיות ובדיקה נביטה
- שוקלים כ 10 מ ג של teliospores U. זקן התירס בצינור microcentrifuge 1.5 mL כדי להעריך את הכדאיות שלהם ואת העיתוי של נביטה.
- באבטחה הקבינט, להכין תפוחי אדמה דקסטרוז מרק (PDB, 24 g/L) בתוספת סטרפטומיצין גופרתי (µg 160/mL).
- להשעות את teliospores ב µL 500 של PDB. פיפטה בעדינות כדי לערבב לשבור את כל הגושים של teliospores.
- להעביר את המתלים teliospore 250מל בלוק הבקבוק Erlenmeyer המכיל 10 מ ל ה-pdb.
- דגירה. הבקבוק ב 28 ° C רועדת-90 סל ד עבור h 12-16.
- באבטחה הקבינט, הסר 20 דוגמאות µL teliospores המושרה כדי לנבוט ולהכין שקופית מיקרוסקופ.
-
באופן חזותי באמצעות מיקרוסקופ, להעריך בשלבי נביטה הקיימים ואת נוכחותם של זיהום חיידקי.
- לספור את מספר teliospores-שלבים אני דרך V באמצעות hemocytometer ולקבוע את אחוז יש מונבטים.
- אם רק שלב I teliospores קיימים, להמשיך דגירה. הבקבוק בסך 24 שעות לפני הערכת הנביטה teliospore. המשך הדגירה לתקופה מקסימלית של 48 שעות לפני שתתעב המדגם כלכלית.
- אם קיים זיהום חיידקי, תוספת ה-PDB עם kanamycin גופרתי (µg 50/mL) כמו גם סטרפטומיצין גופרתי (µg 160/mL) ולאחר מכן חזור על שלבים 3.1 ל 3.7. אם זיהום בקטריאלי נמשכת, להתייחס teliospores עם נחושת גופרתית וחזור על שלבים 3.1 ל 3.7.
4. אינדוקציה של נביטה ניטור נשימה
- שוקלים שווה (למשל., 50 מ"ג) של teliospores לניסוי בכל נשימה.
- באבטחה הקבינט, להוסיף teliospores תא נשימה בלוק.
- למלא החדר עם PDB (24 g/L) בתוספת סטרפטומיצין גופרתי (µg 160/mL) ו kanamycin סולפט (50 µg/mL).
- פיפטה למעלה ולמטה כדי ליצור השעיה teliospore.
- הנח את מכסה תא בחדר כדי ליצור חותם אוויר חזק.
5. הוצאת את מדידת קצב (OCR) של צריכת חמצן
- מניחים את התא בארון חדר בתוך אמבט מים (טרופה עד 28 מעלות צלזיוס).
- מניחים את המכשיר2 O בתוך הפתח של החדר.
- לנטר את נקודות הנתונים המופיעים בזמן אמת על התוכנית "SensorTrace קצב", והנח את החללית לייצב (~ 3 דקות אחרי החללית ממוקם בבית הבליעה).
- לחץ על "מדד" כדי למדוד רמות2 O ברציפות במשך 6 שעות עם מדידות הקליט במרווחי s 2.
- לעצור את המדידה, וחזור על הצעדים 4.1 – 5.4 עבור כל דגימה להיות מנותח.
- ייצוא הנתונים ל- Microsoft Excel על-ידי לחיצה על "קובץ | ייצוא | שמירה של. xls.
6. ניתוח נתונים
-
לחשב OCR
- בקובץ המיוצא Excel תחת הלשונית "Within_Rates", להקליט את "קצב" עבור כל אחת מהמידות קאמרית (nmol/h).
- עבור כל מדגם ניסיוני, להפחית את "קצב" החדר ריק "במחיר" של התא מדגם ניסיוני כדי לקבל ערך OCR המתוקן, ולקחת את הערך המוחלט של מספר זה.
- לחשב OCR הכולל לכל מ"ג של teliospores על-ידי חלוקת הערך המתוקן OCR המוחלט על ידי הטלפון הסלולרי בשימוש המוני.
- ממוצע לשכפל "OCR לכל מ"ג של teliospores"ערכים עבור כל זן.
- לנתח את הנתונים באמצעות השיטה הסטטיסטית המתאימה (למשל., הסטודנט t-test, השונות) באמצעות Microsoft Excel של תוכנות סטטיסטיות אחרות.
- גרף נתונים גולמיים, לחשב את אחוז החמצן הנותר עבור כל הזמן-נקודה שאתה רוצה גרף. לחלק את הקריאה הראשונה על ידי עצמו להכפיל ב- 100 (חמצן 100% הנותרים), מתחלק כל הקריאה הבאים הקריאה הראשונה, ואז להכפיל ב- 100 כדי לקבל את אחוז החמצן שנותרו בבית הבליעה.
7. אינדוקציה של נביטה Teliospore כדי לבודד Teliospores בשלבים שונים של נביטה
- להכין PDB (24 g/L) בתוספת סטרפטומיצין גופרתי (µg 160/מ"ל) באבטחה ארון.
- מניחים כ 10 מ ג של teliospores U. זקן התירס לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL.
- להשעות את teliospores ב µL 500 של PDB. פיפטה בעדינות לערבב עד אין גושים של teliospores בטווח הבינוני.
- להעביר את המתלים teliospore את הבקבוק Erlenmeyer בלוק 250 מ ל, המכיל PDB בתוספת סטרפטומיצין סולפט.
- דגירה. הבקבוק בן לילה ב 28 ° C רועדת במהירות של 90 סל ד.
8. הכנת צלחת פטרי, Micromanipulator
-
להכין צלחת פטרי (57 ס מ2) על-ידי שורות pipetting של טיפות microcapillary הכנה ולאחר איסוף הדגימה.
- פיפטה 5 µL (x 4) dH2O טיפות לרוחב החלק העליון של הפטרי.
- פיפטה 2 µL (x3) של RNA פתרון מייצב על הפטרי כדי לשמש לאיסוף הדגימה.
- פיפטה 5 µL (x 30) טיפות הנבטת teliospores על הפטרי.
- להוסיף 15 מ של שמן מינרלי הפטרי. ודא כי כל טיפות מכוסים על ידי שמן לפני שתמשיך.
- הכן של microcapillary עם קוטר פנימי 15 מיקרומטר, 1 מ מ מקורבות, 55 מ"מ אורך, זווית עצה 20° על ידי הצבת זה בעל microcapillary, השוקע אותו בשמן מינרלי איפה נימיות יאפשר את שמן מינרלי להזין את microcapillary. לשחרר את הלחץ microcapillary לפני הבאתו לתקן ה-droplet מים. וביופסיה להכין את microcapillary עם מים.
9. בידוד של שלב ספציפי הנבטת Teliospores
- באמצעות הפקדים של micromanipulator, להעביר את microcapillary מוכנים לאחד טיפות נביטה. לחדור ה-droplet, הנמך את microcapillary ולהביא הפה של microcapillary עד teliospore germinating בשלב של נביטה של עניין.
- ריקון נוזלים באיטיות כדי ללכוד את teliospore germinating. תפסיק כ רפה בעברית, ברגע teliospore הזין את microcapillary. חזור עד ישנם כ חמש teliospores microcapillary.
- הרימו את microcapillary עם micromanipulator ולהביא אותו ה-droplet אוסף של RNA מייצב פתרון. ה-droplet ולחבר להזריק את teliospores לתוך ה-droplet.
- חזור על שלבים 8.1 ל 8.3 עד teliospores כ-1,000 נתפסו.
10. שחזור של אוסף רביב
- פיפטה את ה-droplet אוסף, להעביר אותו המכסה של צינור microcentrifuge RNase/DNase ללא 2.0 mL. הסר בזהירות את שמן מינרלי עם פיפטה מבלי להפריע אוסף ה-droplet.
- השתמש את teliospores עבור יישומים במורד הזרם כגון בידוד ה-RNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות השיטה מבוססת microrespirometer קלארק-סוג של מדידת שינויים בנשימה במהלך teliospore תרדמה, נביטה, אישרנו זאת teliospores רדום להפגין רמה נמוכה של הנשימה (~ 1,075 µmol/h/mg) לעומת הנבטת teliospores (~ 2,614 µmol/h/מ ג; איור 1 א'). זה מייצג שינוי ~2.4-fold קצב ממוצע של נשימה בין teliospores רדום teliospores אשר נגרמו. כדי לנבוט. בנוסף, זיהינו כי teliospores אשר נגרמו. כדי לנבוט יש עיכוב ~ 45 דקות בצריכת חמצן (איור 1B). זה מציינים את העיכוב ~ 30 דקות ספיגת חמצן (איור 1B) בנוסף העיכוב ~ 15 דקות בין התחלה של חמצן מדידות של אינדוקציה של נביטה. זה מזהה נקודת זמן להתחיל הערכת שינויים מולקולרית teliospores germinating לא משנה בעליל.
יכול להיות שנצפו שינויים שיבוצעו מאוחר יותר במהלך הנביטה ברמה המיקרוסקופית. חמישה שלבים של נביטה היו נחושים. שלב I של נביטה מייצג teliospores אשר נגרמו. כדי לנבוט אך נשארים להבחין מגניחותיה רדום teliospores. שלב II teliospores יש של promycelium באורך קטן או שווה לקוטר של teliospore המתעוררים. שלב III teliospores יש promycelia מהערך הקוטר teliospore. שלב IV של נביטה הוא ההצצה הראשונית של basidiospores של promycelia, ועל הבמה V הם basidiospores הפלואידי וכתוצאה מכך זה מתחלק ניצני (איור 2). באמצעות הטכניקה microdissection שרכשנו, לנו יש בהצלחה מבודדים 500 עד 1,000 הנבטת teliospores עבור יישומים במורד הזרם כגון RNA לבידוד RT-PCR או RNA-Seq (טבלה 1). איור 3 מראה את הערכה כללית של Petri dish עבור microdissection והשלבים microdissection באמצעות micromanipulator.
איור 1: מסלול הזמן של צריכת החמצן במהלך הנביטה teliospore. Teliospores רדום היו המושרה כדי לנבוט, רמות החמצן הוקלטו ללא הרף 6-אייץ ' באמצעות microrespirometer קלארק-סוג. Teliospores רדום המושרה לא שימשו פקד ולאחר כל המדידות היו מנורמל מדגם ריק. (א) הנתונים המיוצגות OCR הממוצע. (B) להתוות נתונים גולמיים להשיג. את עקומות נשימה, יאפשר זיהוי שינויים ב- OCR במהלך הזמן. Teliospores זה נגרמו. כדי לנבוט צורכים חמצן בשיעור ממוצע 2.4-fold מהר יותר teliospores רדום בלתי מושרה (p < 0.01; הסטודנט t-מבחן). חזיר: פוסט-אינדוקציה של נביטה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: שלבים של נביטה teliospore. שלבים בתוך V של נביטה teliospore מומחשים (A–E). סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: Microdissection כדי לבודד שלבים מורפולוגי של הנבטת teliospores. הגדרת כללי של Petri dish עבור microdissection והשלבים לבידוד teliospore בשלב III של נביטה מומחשים. (א) איור של צלחת פטרי להגדיר עם שורות של טיפות המכילות גם במים סטריליים, פתרון מייצב RNA, או הנבטת teliospores. בעקבות אינדוקציה נביטה, teliospores היו מבודדים בשלבים מסוימים של נביטה באמצעות microdissection. (B) המכיל droplet נביטה המושרה כדי לנבוט teliospores בשלבים I עד III. (ג) microcapillary מוכן הובא teliospore שלב III עבור אוסף דרך שאיפה. (ד) teliospore השלב השלישי ב- microcapillary זכוכית הוא הסרת ה-droplet נביטה ועבר droplet אוסף. (ה) microcapillary הוכנס לתוך אוסף droplet המכיל RNA מייצב הפתרון, teliospore השלב השלישי היה מוזרק לתוך ה-droplet. (נ) אוסף של שלב III teliospores בתמיסה מייצב ה-RNA. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר (A-D, F) ו- 50 מיקרומטר (E). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| בשלב הנביטה | מספר הנבטת teliospores מבודדים |
| שלב I | 1,000 |
| שלב II | 500 |
| בשלב השלישי | 650 |
טבלה 1: מספר teliospores הנבטת מבודד בהצלחה עבור כל שלב הנביטה בניסוי בידוד רגיל. הטבלה מציגה מספר ממוצע של teliospores שהיו מבודדים באמצעות microdissection לשלבים I עד III לפני אוסף עבור יישומים במורד הזרם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פתוגנים צמח biotrophic basidiomycete לגרום מיליארדי דולרים של הפסדים חיתוך מדי שנה. הרוב המכריע של פתוגנים אלה מייצרים teliospores המהווים חלק בלתי נפרד פיזור פטרייתי, רבייה מינית. צובר ידע של פיתוח, נביטה של teliospores היא קריטית להבנת את התפשטות המחלות ההרסניות הנגרמת על ידי אלה פטריות. על מנת לזהות את השינויים המולקולריים בנקודות הבקרה מפתח אנחנו המציאו שיטה כדי לזהות את העיתוי של משמרות פיזיולוגיים ועוד כדי לבודד teliospores בשלבים שונים של נביטה. הפנימי סטו. et al. (שלא פורסמו) ציין חמישה שלבים של נביטה teliospore על ידי מיקרוסקופ אור (איור 2). על מנת לחקור את הפעלת פיזיולוגיים במהלך שלב I, כדי להעריך את קצב הנשימה במהלך הנביטה, השתמשנו microrespirometer קלארק-סוג למדוד בדיוק שינויים בצריכת החמצן. הנתונים לדוגמה שלנו מציינים כי השיטה שלנו היא מדויקת מאוד לשחזור. הממצאים שלנו מאשרים כי הנבטת זקן התירס U. teliospores שהפגינו עלייה דרסטית בנשימה תאית בהשוואה teliospores רדום האו ם המושרה. בפעם הראשונה, זיהינו כי teliospores U. זקן התירס אשר נגרמו. כדי לנבוט התערוכה ~ 45 דקות עיכוב ספיגת חמצן. זה מרמז כי זקן התירס U. teliospores עשויים לדרוש זמן לעיבוד אותות נביטה (למשל., הנוכחות של סוכרים) לפני שתגיב, צריכת חמצן מוגברת הזה הוא לא בין התגובות מאוד מיידית לאותות נביטה או כי assay שלנו לא היה רגיש מספיק כדי לזהות את השינוי מינימלי ספיגת החמצן ההתחלתי.
הקודם מחקרים שיעורי נשימה של הפורנו teliospores3 הסתמכה על מנגנון הבקבוק ורבורג למדידת חמצן רמות manometrically5. בקצרה, שיטה זו מודדת צריכת החמצן ואת ייצור CO2 על ידי גילוי שינויים בלחץ ב הבקבוק סגור דרך בהתבוננות ישירה של נוזל שינויים ברמת בזרוע manometer. הניסויים יכול להיות קשה להגדיר, מדידות יכול להיות מדויק. המנגנון חייב להיות נוכחת לאורך כל תקופת המדידה, חישובים נרחב נדרשים להעריך OCR. פרוטוקול שלנו עושה שימוש בשיפורים טכנולוגיים, ביטול הדרישה עבור המשתמש להישאר על-ידי המנגנון משך זמן הניסוי, לקחת מידות לפי העין, ולהשתמש נרחב נוסחאות מתמטיות. אחרים השתמשו respirometers קלארק-סוג המוקדמים מודדים OCR Neurospora crassa9 , Botryodpilodia theobromae10 נבגים, אולם, אלה הכלים המוקדמים מותר מדידות רציפה לכל היותר 20 דקות. מגבלה זו לא היה מרשה הזיהוי של העיכוב ~ 45 דקות בספיגת החמצן שהבחנו עם respirometer דגם חדש יותר. פרוטוקול שלנו הפך פרשנות הנתונים פשוט יותר, כמו המדידה הוא ריכוז החמצן שנותרו בבית הבליעה, אשר יכול להיות בגרף ישירות בלי כל מניפולציה חישובים או נתונים. בנוסף, זה אפשרי לקחת מדידות רציפה (כל 2 s) בסכום מוגבל של זמן עד. חמצן זמין לחלוטין תיגמר. זה מאפשר זיהוי שינויים קטנים בנשימה על פני תקופה ארוכה של זמן. לכן, יש שיפור שיטות קודמות ואנו פיתח שיטה פשוטה, מדויק, לשחזור כדי למדוד את צריכת החמצן של נבגי פטריות. לידע שלנו, זהו המחקר הראשון להשתמש respirometer מודרני של קלארק-סוג ללמוד נשימה של רדום לעומת הנבטת teliospores של פטריות הזימה.
למרות הקלות והפשטות של פרוטוקול זה, אופטימיזציה נדרש, יש מציאות ביולוגית המוגבלת הניתוח. חייב להיות מזוהה גודל מדגם הראשון, המתאימה להשגת OCRs סביר. לדוגמה מדי יכול להוביל להתרסק מוקדמת של רמות החמצן, דוגמת מעט מדי עלולה לגרום חוסר היכולת לצפות שינויים משמעותיים בצריכת החמצן. שנית, זה הכרחי כדי לאפשר את הזמן בדיקה כדי לייצב (~ 3 דקות) כדי לספק נתונים ראשוניים מדויק. לבסוף, חשוב להשלמת נביטה בינוני עם סוכנים אנטיבקטריאלי (למשל., סטרפטומיצין סולפט) על מנת להבטיח זיהום בקטריאלי אינו משנה OCR קריאות. מגבלות ביולוגיות בפנינו היו שיעור הנביטה נמוך במרוצת הזמן המדידה, (~ 1%) כפי שנקבע על ידי התבוננות שינויים מורפולוגיים חזותי. קביעת נבג הכדאיות היה לאפשר קביעה זו קצב יומרו ל תעריף מספר נבג, בידוד teliospores עם שיעור גבוה יותר של נביטה יוביל OCRs גבוהה יותר. הנביטה אסינכרוני של זקן התירס U. teliospores11 הוא מציאות חייב להיות אחראים, ייתכן תרמו לחוסר יכולת לזהות את צריכת החמצן בתחילת נביטה.
על מנת לשפר את דיוק ואמינות של מדידת שינויים בנשימה teliospore, עיבודים בעתיד לשיטה זו עשוי לכלול מדידה OCR על בסיס-תא יחיד. ניתן להשתמש בטכניקות המיקרומניפולציה לבודד teliospore יחיד, אשר יכולה להיגרם לאחר מכן כדי לנבוט, קצב הנשימה שלה ניתן לנטר. הדבר יכול לשפר ברזולוציה, מתן מידע לגבי OCR במהלך משמרת תרדמה-נביטה לכל teliospore, ולא לכל מ"ג של teliospores. בנוסף, זה לפתור את סוגיית מבלבלים נביטה אסינכרוני.
עבור בשלבים מאוחרים יותר של נביטה, פיתחנו שיטת המיקרומניפולציה לבודד teliospores בשלבים נפוצים של נביטה. פעולה זו מותרת היצירה של אוכלוסיות teliospore יחסית סינכרונית לניתוח. שיטות שונות עבור בידוד מיקרואורגניזמים יחיד תוארו, שופרו עם מעל12שנים. שיטות אלה כוללות הדילול של המתלים נבג להשיג מיקרואורגניזמים יחיד, שיטות מכניות למחצה עם השימוש microcapillaries כדי להשיג נבגים מועברים לבינוני עבור שיטות culturing, ועל מכניים אשר השתמש micromanipulators . שיטות קודמות שבהן השתמשנו כדי לקבל teliospores בשלב זהה של נביטה כוללים elutriation צנטריפוגלי counterflow וסינון teliospores הנבטת דרך קרום ניילון עם גודל הנקבוביות ספציפיים. באמצעות שיטות אלה אפשרה לנו להעשיר עבור הנבטת teliospores, עם זאת, הדגימות שלנו עדיין הכיל teliospores בשלבים שונים של נביטה13. הטכנולוגיה הנוכחית עבור המיקרומניפולציה מיקרואורגניזמים יחיד השתפרה עם כניסתה של הגדלה גבוהה יותר, מכשירים שליטה טובה של מחטים נימי, השאיפה העברה של מיקרואורגניזמים. בטכניקות המיקרומניפולציה קודמים התמקדו לבודד תאים בודדים culturing או לשימוש תא בודד-PCR-יישומים-14. השימוש micromanipulators כדי לבודד נבגי פטריות יחיד בעבר לא הוקם. שיטה קודמת לבידוד נבגי פטריות יחיד מעורב שימוש בסדר מלקחיים או מחטים לבחור חתיכות קטנות של בינוני מוצק המכיל נבגי. הנבטת15. מיקרומניפולציה השימוש micromanipulators נעשה שימוש נרחב במחקרים שמרים שבו אשכולות של ascospores יכול להיות מופרדים הנבגה הבאים בתרבות באמצעי אגר עבור ניתוח גנטי meiotic16. פיתחנו שיטה המשלבת בשיטת המיקרומניפולציה תאים חיידקיים14 ו- in vitro לקשרי שיטות דישון לבידוד הנבטת teliospores. אנחנו הראו כי ניתן להשיג מאות נפוץ teliospores שלב הנביטה בטכניקה זו. דגימות אלה יכול לשמש עבור הביטוי במורד הזרם מחקרים באמצעות טכניקות כגון RT-qPCR או RNA-תת סעיף קבלת אוכלוסייה של teliospores שבו נביטה מסונכרן מאפשר הניתוח של שינויים ספציפיים בביטוי הגנים המתרחשת במהלך . מוקדם, אמצע, ומאוחר יותר בשלבי נביטה teliospore.
Microdissection של שלב מסוים הנבטת teliospores עשויים לדרוש ניסיון להגדיר את, הכרה בשלבים שונים של נביטה, עם זאת, החוויה הזו ניתן להשיג במהירות באמצעות תרגול. ישנן מספר פעולות שיש לבצע עבור microdissection המוצלח ואחריו בידוד ה-RNA. ראשית, נביטה בינוני חייב להיות בתוספת אנטיביוטיקה (למשל., סטרפטומיצין סולפט) כדי לדכא את הצמיחה לזיהום חיידקי כאשר תופעל נביטה, כמו גם אוסף של הנבטת teliospores. שנית, חשוב להשתמש פתרון מייצב לייצב ולהגן RNA לבידוד. הפתרון מייצב RNA גם מונעת teliospores שנאספו מתקדם לשלב הבא הנביטה תוך איסוף teliospores נוספים. שלישית, חשוב להסיר את שמן מינרלי לאחר ה-droplet אוסף נמצאה כדי להבטיח מיצוי ה-RNA מוצלחת. לבסוף, שמנו לב איזה אובדן איכות RNA אם teliospores מבודדים מאוחסנים RNA מייצב פתרון לתקופה ממושכת של זמן; לכן, מומלץ כי ה-RNA הוא מבודד מייד לאחר אוסף של נביטה בשלב מסוים teliospores. מגבלה של השיטה היא לבמה אני teliospores שנאספו עלולים להכיל רדום, מת, המושרה כדי לנבוט teliospores כמו שלושה שלבים אלה הם נבדלים מורפולוגית. בנוסף, בעת איסוף שלב III teliospores, תערובת של teliospores של מיוזה I או מיוזה II יכולה להיות מושגת. דרך אחת כדי לסייע בהבחנה שבין teliospores רדום, מת יכול להיות כדי לקבוע את הכדאיות של המדגם. שיטה להערכת הכדאיות נבג פטרייתי באמצעות מבחני יכולת הקיום של תא חי/מת יוכל להעריך את אחוז teliospores קיימא שממנו יותר אינפורמטיבי נביטה המחירים יכול להיות נחוש17. בנוסף, גרעין מכתים עם דאפי, לדוגמה, יכול לשמש כדי להמחיש את האירועים של מיוזה המתרחשות במהלך השלב השלישי, המעבר בשלב הרביעי על מנת לאפיין עוד יותר teliospores מורפולוגית-שלב III. זה הסיוע באוסף של teliospores בשלב אחד בלבד של נביטה בעת שימוש בשיטה microdissection שלנו.
לסיכום, פיתחנו שיטה פשוטה, מדויק, לשחזור של מדידת השינויים נשימה תאית להתרחש במהלך משמרת תרדמה-נביטה של זקן התירס פחמון teliospores. בנוסף, פיתחנו שיטה לאיסוף שלבי ספציפי הנבטת teliospores שיכול לשמש ליישומים במורד הזרם, כגון ה-RNA-תת סעיף. השיטות שלנו ניתן להתאים כדי להכיל את תא-סוגים ומינים שונים. אנו צופים כי שיפורים טכניקות שלנו יקל על זיהוי שינויים בדרכי הנשימה נבג יחיד ברמה, כמו גם רחוק הגדרת האירועים המתרחשות בשלבים מאוחרים יותר של נביטה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים יש אין מתחרים אינטרסים כלכליים או אחרים ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות ד ר פרוסט פול עבור השימוש שלו microrespirometer, ו וגנר ניקול אלכס בל לקבלת סיוע טכני. עבודה זו מומן על ידי מענק NSERC B.J.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Streptomycin Sulfate | BioShop | STP101 | |
| Kanamycin Sulfate | BioShop | KAN201 | |
| Potato Dextrose Broth | BD Difco | 254920 | |
| 1 L Waring Laboratory blender | Waring | 7011S | |
| Cheesecloth | VWR | 470150-438 | |
| Nalgene Polypropylene Desiccator with Stopcock | ThermoFisher Scientific | 5310-0250 | |
| Unisense MicroRespiration system | |||
| MicroRespiration Sensor (O2) | Unisense | OX10 | |
| MicroOptode Meter Amplifier | Unisense | N/A | |
| MR-Ch Small | Unisense | MR-Ch | |
| SensorTrace Rate Software | Unisense | N/A | |
| MicroRespiration Rack | Unisense | MR2-Rack | |
| MicroRespiration Stirrer | Unisense | MR2-Co | |
| Microdissection system | |||
| Axio Vert.A1 Inverted Light Microscope | Zeiss | ||
| Coarse Manipulator | Narishige | MMN-1 | |
| Three-axis Hanging Joystick Oil Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MMO-202ND | |
| Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-11-2 | |
| TransferTip (ES) | Eppendorf | 5175107004 |
References
- Saville, B. J., Donaldson, M. E., Doyle, C. E. Meiosis - Molecular Mechanisms and Cytogenetic Diversity. Swan, A. , InTech. 411-460 (2012).
- Christensen, J. J. Monograph Number 2. , The American Phytopathological Society. Worcester, MA. (1963).
- Caltrider, P. D., Gottlieb, D. Respiratory activity and enzymes for glucose catabolism in fungal spores. Phytopathology. 53, 1021-1030 (1963).
- Allen, P. J. Metabolic aspects of spore germination in fungi. Ann. Rev. Phytopathol. 3, 313-342 (1965).
- Warburg, O. Metabolism of tumours. Biochemische Zeitschrift. 142, 317-333 (1923).
- Ostrowski, L. A., Saville, B. J. Natural antisense transcripts are linked to the modulation of mitochondrial function and teliospore dormancy in Ustilago maydis. Mol Microbiol. 103 (5), 745-763 (2017).
- Morrison, E. N., Donaldson, M. E., Saville, B. J. Identification and analysis of genes expressed in the Ustilago maydis dikaryon: uncovering a novel class of pathogenesis genes. Canadian Journal of Plant Pathology-Revue Canadienne De Phytopathologie. 34 (3), 417-435 (2012).
- Doyle, C. E., Cheung, H. Y. K., Spence, K. L., Saville, B. J. Unh1, an Ustilago maydis Ndt80-like protein, controls completion of tumor maturation, teliospore development, and meiosis. Fungal Genetics and Biology. 94, 54-68 (2016).
- Stade, S., Brambl, R. Mitochondrial biogenesis during fungal spore germination: respiration and cytochrome c oxidase in Neurospora crassa. J Bacteriol. 147 (3), 757-767 (1981).
- Brambl, R. Characteristics of developing mitochondrial genetic and respiratory functions in germinating fungal spores. Biochim Biophys Acta. 396 (2), 175-186 (1975).
- Sacadura, N. T., Saville, B. J. Gene expression and EST analyses of Ustilago maydis germinating teliospores. Fungal Genet Biol. 40 (1), 47-64 (2003).
- Hilderbrand, E. M. Techniques for the isolation of single microorganisms. Botanical Review. 4 (12), 38 (1938).
- Seto, A. M. Analysis of gene transcripts during Ustilago maydis teliospore dormancy and germination. , Trent University. M.Sc. thesis (2013).
- Fröhlich, J., König, H. Soil Biology - Intestinal Microorganisms of Termites and Other Invertebrates. König, H., Varma, A. , Springer. 425-437 (2006).
- Choi, Y., Hyde, K., Ho, W. Single spore isolation of fungi. Fungal Diversity. 3, 11 (1999).
- Sherman, F. Getting started with yeast. Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Pt B. 350, 3-41 (2002).
- Chen, Y., Seguin-Swartz, G. A rapid method for assessing the viability of fungal spores. Canadian Journal of Plant Pathology-Revue Canadienne De Phytopathologie. 24 (2), 230-232 (2002).
