Summary
Головне грибки вызывают много разрушительных сельскохозяйственных болезней. Они разбросаны как неактивных teliospores, которые прорастают в ответ на экологические сигналы. Мы приводим два метода для изучения молекулярных изменений во время проращивания: увеличение дыхание для выявления метаболических активации и оценки изменения молекулярные события, изолируя teliospores на различных этапах морфологических.
Abstract
Головне грибы являются этиологические агенты нескольких разрушительных сельскохозяйственных болезней. Они характеризуются производства teliospores, которые являются агентами толстостенные разгон. Teliospores может оставаться покоя на протяжении десятилетий. Покоя характеризуется низким метаболизма, приостановлена макромолекулярных биосинтез и значительно сократить уровни дыхания. После получения необходимых экологических сигналов, teliospores прорастают производить haploid клетки, которые могут инициировать новых раундов инфекции. Teliospore всхожесть характеризуется возобновление макромолекулярных биосинтез, увеличение дыхания и драматические морфологические изменения. Для того, чтобы точно измерить изменения в клеточное дыхание на ранних этапах всхожесть, мы разработали простой протокол, используя Кларк тип респирометра. На более поздних этапах прорастания отличаются конкретные морфологические изменения, но всхожесть является асинхронным. Мы разработали microdissection технику, которая позволяет нам собирать teliospores на прорастание отдельных этапах.
Introduction
Головне грибов (Ustilaginales) состоят из более 1600 видов, которые заражают трав, включая важные зерновых, кукурузы, ячменя и пшеницы, вызывая миллиарды долларов потерь урожая ежегодно1. Эти грибы характеризуются производства teliospores, которые загадочно пигментированные клеточной стенки и рассеивания агентов. Teliospores функция, чтобы оградить генетический материал во время стрессов разгон между растений-хозяев и могут сохраняться в неактивное состояние на2лет. Таким образом teliospores являются важным компонентом распространения болезни.
С целью изучения биологии teliospore, наша лаборатория использует модель головне гриб пузырчатая maydis (U. maydis), который является возбудителя болезни «общие головня кукурузы». Зрелые U. maydis teliospores характеризуются арест роста, сокращение клеточный метаболизм и низкий уровень клеточного дыхания3. В благоприятные экологические условия (например., наличие конкретных сахаров), U. maydis teliospores прорастают и полное мейоз, производство basidiospores, которые могут инициировать новых раундов инфекции. Всхожесть характеризуется повышенной дыхания, возвращение к метаболической активности и прогрессии через наблюдаемых морфологической стадии прорастания4.
На начальном этапе прорастания включает в себя увеличение дыхание и метаболические функции, однако, есть нет морфологических признаков перемен. Оригинальные измерения дыхания изменения в U. maydis были проведены более 50 лет назад, измерение потребления кислорода manometrically с Варбург колбу аппарат5. Мы разработали новый, простой метод изучения точные изменения дыхания при прорастании teliospore путем измерения потребления кислорода в течение времени прорастания с помощью Кларк типа microrespirometer. Ранее мы использовали этот метод для изучения изменения частоты дыхания между одичал типа U. maydis haploid клетки и мутанты с дефектных митохондрий6и адаптировали протокол здесь изучить изменения в teliospore дыхания во время всхожесть. Это обеспечивает средства точного определения сроков изменения дыхания, так что мы можем целевых teliospores в соответствующее время после начала прорастания расследовать раннего молекулярных событий. Прогрессирование прорастания может следовать микроскопически после promycelia вытекает из teliospore, но асинхронной природы тормозится изоляции достаточно teliospores на данном этапе расследования. Мы разработали технику microdissection, аналогичные тем, которые используются для оплодотворения в пробирке собрать физически teliospores в различные морфологические стадии прорастания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. кукурузного початка инфекции
- Расти Zea mays (cv. Золотой петух) до тех пор, пока початков формируются и начали шелка (приблизительно 60 дней).
- Культура совместимый гаплоидным U. maydis штаммов, используя стандартные протоколы, как ранее описанных7.
- Заразить початков кукурузы, используя стандартные протоколы, как описано выше7.
2. teliospore уборки
- Автоклав оборудование (воронки Бюхнера, колбы Бюхнера, блендеры, 250 мл бутылки центрифуги, плоские лопатки и воды) с использованием стандарта сухой цикл с по крайней мере 30 минут стерилизации при температуре 121 ° C (стандартные жидкости цикл для воды).
- Удаление зараженных початков от растений (приблизительно 28-35 дней поста инфекции) с помощью бритвы и задайте початков на подносе в скамейке протектор.
- Удаление опухолей из початки с лезвием бритвы и собирать в стакан.
- Заполнить 250 мл чашка Лаборатория блендер с опухолями до приблизительно 1/3 полного и добавить газобетона dH2O до тех пор, пока блендер Кубок составляет примерно 3/4 полной. Срывать опухолей, пульсирующий блендер на низком уровне, до гомогенизированный.
- Подключение вакуумного насоса вода ловушку, а затем колбу Бюхнера 1 Л.
- Вставка большого воронка Бюхнера в колбу и линии нижней воронка Бюхнера с четырьмя слоями Марли.
- Включите вакуумный насос.
- Залейте часть гомогенизированные опухоли через марлю и скрести шпателем.
- Залейте некоторые dH2O в марлю для того, чтобы очистить teliospores через.
- Повторите, пока dH2O сквозь марлю ясно.
- Отжимают марлю, содержащие материал гомогенизированные опухоли в фильтр для обеспечения максимальной teliospore восстановления.
- Когда настой Бюхнера 1 Л становится ближе к полный, вылейте его в большой колбу Эрленмейера и отложите его в сторону.
- Поставьте новый кусок Марли в фильтр и повторите шаги (2.7-2.12) пока не нарушается и фильтруют все опухолей.
- Налить отфильтрованной teliospores в газобетона 250 мл бутылки центрифуги и центрифуги на 1000 x g 5 минут и сцеживаться супернатант.
- Повторите шаг 2.14 до тех пор, пока все отфильтрованные teliospores гранулированных центрифугированием.
- Приостановите гранулы в небольшом количестве воды и передачи 50 мл пробирок.
- Центрифуга трубы на 1000 x g 5 минут и сцеживаться супернатант.
- Приостановить гранулы в приблизительно 50 мл dH2O, центрифуга трубы на 1000 x g 5 мин и сцеживаться супернатант. Аккуратно соскребите серый верхний слой с помощью шпателя и распоряжаться им. Повторяйте до тех пор, пока существует больше не серый слой сверху.
- Сухой образцы ночь в вакуумный сушильный шкаф.
- Храните сушеные teliospores при температуре 4 ° C до использования.
-
При желании, лечить teliospores с медного купороса8 перед склонение к прорастанию. Если не лечить, то выполните тщательный анализ микроскопических teliospores для подтверждения образец представляет собой чисто teliospores и лишена бактериального или других загрязнений.
- Весят из примерно 50 мг teliospores в пробки microcentrifuge 1,5 мл.
- Добавьте примерно 1,0 мл 0,75% CuSO4 пробки microcentrifuge 1,5 мл, содержащие teliospores. Пипетка вверх и вниз, чтобы приостановить teliospores в растворе4 CuSO, следуют агитацию в образце для 3 h.
- Центрифуга для образца на 2500 x g 5 мин и удалить супернатант. Ресуспензируйте teliospore Пелле стерильной водой, повторить центрифугирования и удалить супернатант.
- Повторите шаг 2.21.3 еще два раза.
3. teliospore жизнеспособность и всхожесть теста
- Весят около 10 мг U. maydis teliospores в 1,5 мл microcentrifuge трубки для оценки их жизнеспособность и времени прорастания.
- В области биобезопасности кабинета Подготовьте картофеля декстроза бульон (PDB, 24 г/Л) дополнены Стрептомицина сульфат (160 мкг/мл).
- Приостановите teliospores в 500 мкл PDB. Аккуратно Пипетка смешивать и разрушить все кусты teliospores.
- Передача teliospore подвеска для газобетона 250 мл колбу Эрленмейера, содержащие 10 мл PDB.
- Инкубируйте колбу на 28 ° C, тряски на 90 об/мин для 12 – 16 ч.
- В области биобезопасности кабинета удалите 20 мкл пример teliospores, индуцированной прорастают и подготовить микроскопа.
-
С помощью микроскопа, визуально оценить стадии прорастания, которые присутствуют и наличие бактериального загрязнения.
- Подсчитать количество teliospores на этапов I-V с помощью Горяева и определить процент, проросшие.
- Если только этап I teliospores присутствуют, продолжать инкубировать Фляга для в общей сложности 24 ч до оценки всхожести teliospore. Продолжать инкубации максимум 48 часов перед учитывание образца нежизнеспособным.
- Если присутствует бактериального загрязнения, дополнение PDB с сульфатом канамицин (50 мкг/мл), а также Стрептомицина сульфат (160 мкг/мл), а затем повторите шаги 3.1 до 3,7. Если сохраняется бактериального загрязнения, лечить teliospores с медного купороса и повторите шаги 3.1 до 3,7.
4. индукция Проращивание для контроля дыхания
- Вешу столько же (например., 50 мг) в teliospores для каждого эксперимента дыхания.
- В области биобезопасности кабинета добавьте teliospores камеру газобетона дыхания.
- Заполните в камеру с PDB (24 г/Л) дополнены Стрептомицина сульфат (160 мкг/мл) и канамицин сульфат (50 мкг/мл).
- Пипетка вверх и вниз, чтобы создать teliospore подвеска.
- Поместите крышку камеры в камере для создания герметичность уплотнения.
5. получение измерений скорость (OCR) потребление кислорода
- Место в палате в стойки камеры внутри на водяной бане (разогретую до 28 ° C).
- Место зонд2 O внутри открытия камеры.
- Мониторинг точки данных, появляются в режиме реального времени на программе «SensorTrace курс» и пусть зонд стабилизации (~ 3 мин после того, как зонд находится в камере).
- Нажмите кнопку «Мера» для измерения уровней2 O непрерывно в течение 6 ч с измерениями, записанная интервалом 2 s.
- Остановить измерение и повторить шаги 4.1 – 5.4 для каждой выборки для анализа.
- Экспортировать данные в Microsoft Excel, нажав кнопку «файл | Экспорт | Сохранить как .xls».
6. анализ данных
-
Расчет оптического распознавания текста
- В экспортированном файле Excel на вкладке «Within_Rates» запись «Тариф» для каждой камеры измерения (нмоль/ч).
- Для каждого экспериментального образца вычесть «Тариф» пустой камеры от «Тариф» экспериментальный образец камеры для получения исправленное значение OCR и принять абсолютное значение этого числа.
- Вычислить общее OCR на мг teliospores путем деления исправленное значение абсолютного OCR сотовых массы используется.
- В среднем реплицировать значения «OCR на мг teliospores» для каждого штамма.
- Анализировать данные с помощью соответствующего статистического метода (например., студента t-тест, дисперсионный анализ) с помощью Microsoft Excel из других статистического программного обеспечения.
- Граф необработанных данных, чтобы вычислить процент кислорода, оставаясь на каждый момент времени вы хотите, чтобы график. Разделить первое чтение само по себе и умножить на 100 (остальные 100% кислорода), затем разделить каждого последующего чтения в первом чтении и умножить на 100, чтобы получить процент кислорода, оставаясь в камере.
7. индукция Teliospore всхожесть изолировать Teliospores на различных стадиях всхожесть
- Подготовьте PDB (24 г/Л), дополнены Стрептомицина сульфат (160 мкг/мл) в области биобезопасности кабинета.
- Место около 10 мг U. maydis teliospores в трубку microcentrifuge 1,5 мл.
- Приостановите teliospores в 500 мкл PDB. Пипетка осторожно перемешать до тех пор, пока есть нет сгустки teliospores в среде.
- Передача teliospore подвеска на колбу Эрленмейера газобетона 250 мл, содержащие PDB, дополнена Стрептомицина сульфат.
- Инкубируйте колбу на ночь на 28 ° C, тряски на 90 об/мин.
8. Подготовка Петри и микроманипулятор
-
Подготовьте чашку Петри (57 см2) дозирования рядами капель для микрокапиллярной подготовки и сбора проб.
- Пипетка 5 мкл (x 4) dH2O капельки в верхней части Петри.
- Пипетка 2 мкл (x3) РНК стабилизации раствора на Петри блюдо, чтобы быть использованы для сбора проб.
- Пипетка 5 мкл (x 30) капельки прорастать teliospores на Петри блюдо.
- Добавьте 15 мл минерального масла на Петри блюдо. Убедитесь, что все капельки покрыты маслом перед продолжением.
- Подготовьте микрокапиллярной с внутренний диаметр 15 мкм, фланец 1 мм, 55 мм Длина и угол кончика в 20°, поместив его в держатель микрокапиллярной и погружаясь в минеральном масле, где капиллярность позволит минеральное масло для ввода микрокапиллярной. Сбросьте давление в микрокапиллярной до приведения его в капли воды. Аспирационная подготовить микрокапиллярной с водой.
9. изоляция прорастать стадии конкретных Teliospores
- С помощью элементов управления микроманипулятор, переместите подготовленный микрокапиллярной к одному из капель прорастания. Проникают капли, Нижняя микрокапиллярной и принести в устье микрокапиллярной до прорастания teliospore на стадии прорастания интерес.
- Медленно аспирационная захватить Прорастающий teliospore. Остановите аспирационных вступлении микрокапиллярной teliospore. Повторяйте до тех пор, пока существует примерно пять teliospores в микрокапиллярной.
- Поднять микрокапиллярной с микроманипулятор и привести его к коллекции капелька РНК стабилизация решения. Проникать капли и вставляют teliospores капли.
- Повторите шаги 8.1 до 8,3 до приблизительно 1000 teliospores были захвачены в плен.
10. Восстановление коллекции капелька
- Пипетка вверх коллекции капли и перенести его на крышке пробки microcentrifuge 2.0 мл РНКазы/DNase бесплатно. Осторожно удалите минеральное масло с пипетки не нарушая капелька коллекции.
- Используйте teliospores для таких РНК изоляции приложений, ниже по течению.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
С помощью метода на основе microrespirometer Кларк тип измерения изменений в дыхания во время teliospore покоя и прорастание, мы подтвердили, что спящие teliospores exhibit низкий уровень дыхания (~ 1,075 мкмоль/h/мг) по сравнению с прорастать teliospores (~ 2 614 стерлингов мкмоль/h/мг; Рисунок 1A). Это представляет собой ~2.4-fold изменение в среднем дыхания между спящие teliospores и teliospores, которые побудили к прорастанию. Кроме того мы определили, что teliospores, которые побудили к прорастанию имеют задержкой ~ 45 мин потребления кислорода (рис. 1B). Это обозначается ~ 30 мин задержки поглощения кислорода (Рисунок 1B) Помимо ~ 15 минут задержки между индукции всхожесть и начать измерения кислорода. Это определяет момент времени приступить к оценке молекулярные изменения в прорастающих teliospores, которые явно не меняются.
Последующие изменения во время прорастания может наблюдаться микроскопически. Были определены пять этапов прорастания. Стадия I всхожесть представляет teliospores, которые были вынуждены прорастать, но остаются неотличима от неактивных teliospores. Этап II teliospores имеют новые promycelium с длиной, который меньше или равен диаметру teliospore. Этап III teliospores у promycelia, что больше, чем диаметр teliospore. IV этап прорастания первоначальный многообещающий basidiospores от promycelia, и этап V результате гаплоидным basidiospores, разделяющих путем отпочковываться (рис. 2). Используя технику microdissection, которую мы разработали, мы успешно изолированных Прорастающий teliospores 500-1000 для вниз по течению приложений, таких как РНК изоляции для RT-PCR или РНК-Seq (Таблица 1). Рисунок 3 показывает общий набор Petri dish для microdissection и шаги с помощью микроманипулятор microdissection.
Рисунок 1: время курс потребления кислорода при прорастании teliospore. Спящие teliospores были вынуждены прорастать, и уровень кислорода были записаны постоянно для 6 h, с помощью microrespirometer Кларк типа. ООН индуцированных спящие teliospores были использованы в качестве элемента управления, и все измерения были нормализованы по пустой выборке. (A) данные представлены как средние OCR. (B) необработанных данных составили заговор, чтобы получить дыхание кривых, позволяя обнаружения изменений в OCR во время курса. Teliospores, которые побудили к прорастанию потребляют кислород в среднем 2.4-fold быстрее, чем ООН индуцированных спящие teliospores (p < 0,01; Студента t-тест). Свиньи: после индукции прорастания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: этапы прорастания teliospore. Этапов I-V teliospore прорастания проиллюстрированы (A–E). Шкалы бар = 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Microdissection изолировать различные морфологические стадии прорастания teliospores. Общая Настройка Petri dish для microdissection и шаги для изоляции teliospore на этапе III прорастания проиллюстрированы. (A) Иллюстрация чашку Петри создан с рядами капель, содержащих либо стерильную воду, РНК стабилизации решение, или прорастать teliospores. После проращивания индукции teliospores были изолированы на определенных стадиях с помощью microdissection прорастания. (B) прорастание капелька содержащие индуцированной прорастать teliospores на этапах I-III. (C) подготовлен микрокапиллярной был доведен до этапа III teliospore для коллекции путем аспирации. (D) teliospore Stage III в стеклянных микрокапиллярной удаляется из капелька всхожесть и переехал в коллекции дроплета. (E) микрокапиллярной был вставлен в коллекции капелька содержащие РНК стабилизации решение и teliospore Stage III было впрыснуто в капли. (F) коллекция III стадии teliospores в растворе стабилизации РНК. Шкалы бар = 20 мкм (A-D, F) и 50 мкм (E). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Всхожесть этап | Количество Прорастающий teliospores изоляции |
| Этап I | 1,000 |
| Этап II | 500 |
| Стадия III | 650 |
Таблица 1: количество Прорастающий teliospores успешно изоляции для каждой стадии прорастания в эксперименте Стандартная изоляция. В таблице показано среднее количество teliospores, которые были изолированы с помощью microdissection для этапов I-III до коллекции для нисходящие приложения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Патогенов растений biotrophic базидиомицета ежегодно вызывают миллиарды долларов в потери урожая. Подавляющее большинство этих патогенов производят teliospores, которые являются неотъемлемой частью грибковых разгон и половое размножение. Получение знаний о развитии и прорастание teliospores имеет решающее значение для понимания распространения смертоносных заболеваний, вызванных этими грибами. Для того, чтобы выявить молекулярные изменения в ключевые контрольные точки мы разработали метод, чтобы определить сроки физиологические сдвиги и другой, чтобы изолировать teliospores на различных стадиях прорастания. Сэто и др. (неопубликованные) отметил пять этапов teliospore всхожесть, световой микроскопии (рис. 2). Для того чтобы расследовать физиологической активации во время этапа и для оценки частоты дыхания во время прорастания, мы использовали microrespirometer Кларк тип точно измерить изменения в потреблении кислорода. Наш образец данных указывают, что наш метод точных и высокую воспроизводимость. Наши выводы подтверждают, что проростать U. maydis teliospores демонстрируют резкое увеличение клеточного дыхания, по сравнению с ООН индуцированных спящие teliospores. В первый раз мы определили, что U. maydis teliospores, которые побудили к прорастанию exhibit ~ 45 мин задержки поглощения кислорода. Это свидетельствует о том, что U. maydis teliospores может потребоваться некоторое время для обработки сигналов прорастания (например., наличие сахара) прежде чем отвечать, что поглощение кислорода более не относится к числу весьма немедленной реакции на всхожесть сигналы или что наша проба не был достаточно чувствительным, чтобы обнаружить минимальные изменения в первоначальный кислорода.
Предыдущие исследования, изучение дыхания ставки головне teliospores3 полагались на Варбург колбу аппарат для измерения кислорода уровнях manometrically5. Вкратце этот метод меры CO2 производства и потребления кислорода, обнаружения изменений давления в закрытых колбу путем прямого наблюдения жидкости уровень изменений в руку манометр. Экспериментов может быть трудно установить, и измерений может быть неточным. Аппарат должен присутствовать на протяжении всего периода измерения, и обширные вычисления требуются для оценки OCR. Наш протокол делает использование технологических достижений, устраняя требование для пользователя, чтобы оставаться аппаратом в течение эксперимента, возьмите измерения на глаз и использовать обширные математические формулы. Другие использовали ранние Кларк тип respirometers меру OCR Нейроспора густая9 и10 спор Botryodpilodia theobromae, однако, эти ранние инструменты допускается непрерывных измерений для максимум 20 мин. Это ограничение не позволили бы выявление задержкой ~ 45 мин в поглощение кислорода, который мы наблюдали с более новой модели респирометра. Наш протокол сделал интерпретации данных проще, как индикация является концентрация кислорода в камеру, которая может быть непосредственно графике без каких-либо вычислений или данных манипуляций. Кроме того, можно взять непрерывных измерений (каждые 2 s) для неопределенного количества времени до тех пор, пока полностью исчерпан кислорода. Это позволяет выявить небольшие изменения в дыхания в течение длительного периода времени. Таким образом мы улучшены ранее методы и разработали простые, точные и воспроизводимые метод измерения потребления кислорода грибковых спор. Насколько нам известно это первое исследование использовать современные респирометра Кларк типа для изучения дыхания спящих против прорастания teliospores головне грибов.
Несмотря на легкость и простота этого протокола оптимизация не требуется, и есть биологические реалии, которые ограниченный анализ. Во-первых, соответствующие выборки должны быть определены для достижения разумного OCRs. Слишком много выборки может привести к преждевременной сбой уровня кислорода, и слишком мало выборки может привести к неспособности соблюдать значимые изменения в потреблении кислорода. Во-вторых важно, чтобы дать время зонд для стабилизации (~ 3 мин) для предоставления точных исходных данных. И наконец, важно дополнить всхожесть среднего антибактериальных агентов (например., Стрептомицина сульфат) для обеспечения бактериального загрязнения не меняет OCR чтений. Биологические ограничения, которыми мы столкнулись были низкий всхожесть в течение времени измерения, (~ 1%), как определено наблюдений визуальных морфологические изменения. Определение жизнеспособности spore позволит этот уровень решимости быть преобразован к ставке за номер в споро и изолирующие teliospores с более высокими ставками прорастания приведет к более высокой OCRs. Асинхронные всхожесть U. maydis teliospores11 — это реальность, что должны быть учтены и может способствовать к невозможности обнаружить потребление кислорода ранее в прорастания.
В целях повышения точности и точности измерения изменений в teliospore дыхания, будущие варианты адаптации к этому методу может включать измерения распознавания на основе одной ячейки. Микроманипуляции методы могут использоваться для изоляции одного teliospore, который затем может быть наведено прорастать и его частота дыхания может контролироваться. Это может улучшить резолюции, предоставляя информацию о OCR во время покоя всхожесть сдвиг в teliospore, а не на мг teliospores. Кроме того это бы проблемы смешанных асинхронных прорастания.
Для более поздних стадиях всхожесть мы разработали метод микроманипуляции изолировать teliospores на общих этапов прорастания. Это позволило создание населения относительно синхронных teliospore для анализа. Различные методы для изоляции одного микроорганизмы были описаны и улучшали на протяжении лет12. Эти методы включают в себя разбавления суспензии спор для получения единого микроорганизмов, полу механические методы с использованием microcapillaries для получения споры, которые передаются средой для культивирования и механические методы, которые используют микроманипуляторов . Предыдущие методы, которые мы использовали для получения teliospores на той же стадии прорастания включают противоточные центробежные сцеживания и фильтрации Прорастающий teliospores через мембраны нейлона с конкретным поры. С помощью этих методов, которые позволили нам обогатить для прорастания teliospores, однако, наши образцы по-прежнему содержит teliospores в различных стадиях всхожесть13. Современная технология для микроманипуляции одного микроорганизмов улучшилось с введением выше увеличение и инструменты для точного управления капиллярного иглы, аспирации и передачи микроорганизмов. Предыдущие методы микроманипуляции были сосредоточены на изоляции единичных клеток для культивирования или для использования в Одноячеистый PCR приложения14. Использование микроманипуляторов изолировать одно грибковых спор ранее не было создано. Предыдущий метод для изоляции одного грибковых спор вовлечены использование тонкой щипцами или иглы, чтобы выбрать небольшие кусочки твердый носитель, содержащий прорастающих спор15. Микроманипуляции с помощью микроманипуляторов широко используется в дрожжи исследования, где кластеры ascospores может быть разлученным следующие заспорение в культуре на носителе агар для meiotic генетический анализ16. Мы разработали метод, который сочетает в себе техника микроманипуляции для бактериальной клетки14 и в пробирке оплодотворение методы для изоляции Прорастающий teliospores. Мы показали, что сотни общих teliospores стадии прорастания может быть получено с этой техникой. Эти образцы могут быть использованы для исследования течению выражение, с помощью таких методов, как RT-ПЦР или РНК след получения населением teliospores, в которых синхронизируется всхожесть позволяет анализ конкретных изменений в выражении гена, которое происходит во время в начале середине и более поздних стадиях teliospore всхожесть.
Microdissection стадии конкретных прорастать teliospores может потребоваться опыт в наборе вверх, и признавая различные стадии прорастания, однако, этот опыт можно получить быстро через практику. Есть несколько шагов, которые должны соблюдаться для успешной microdissection следуют РНК изоляции. Во-первых, прорастание среднего должны быть дополнены с помощью антибиотиков (например., Стрептомицина сульфат) для подавления роста бактериального загрязнения при прорастании инициируется, а также в ходе набор прорастающего teliospores. Во-вторых важно использовать стабилизации решение для стабилизации и защиты РНК для изоляции. РНК стабилизации решение также предотвращает сбор teliospores продвигается на следующий этап прорастания во время сбора дополнительных teliospores. В-третьих важно удалить минеральное масло после сбора капель был восстановлен обеспечить успешное извлечение RNA. И наконец мы заметили некоторые потери качества РНК, если изолированное teliospores хранятся в РНК стабилизации решение для длительного периода времени; Поэтому рекомендуется, что РНК изолированных сразу же после сбора конкретных teliospores стадии прорастания. Ограничения метода является то, что этап я teliospores собраны могут содержать спящие, мертвых и индуцированных прорастать teliospores, как эти три этапа морфологически неразличимы. Кроме того при сборе этап III teliospores, смесь teliospores в мейоз я или мейоз II могут быть получены. Чтобы определить жизнеспособность образца может быть одним из способов помощи различие между действительно спящие и мертвых teliospores. Метод оценки жизнеспособности грибковых спор с помощью анализов жизнеспособности жить/мертвые клетки могут быть способны оценить процент жизнеспособных teliospores, из которых более информативным всхожесть ставки могут быть определены17. Кроме того ядро, окрашивание с DAPI, например, может использоваться для визуализации событий мейоз, которые происходят во время этапа III и переход к стадии IV для дальнейшей характеризации teliospores морфологически на этап III. Это поможет в коллекции teliospores в только одной стадии прорастания, при использовании наших microdissection метода.
В заключение мы разработали простые, точные и воспроизводимые метод измерения изменений в клеточное дыхание, которые происходят во время покоя всхожесть сдвиг пузырчатая maydis teliospores. Кроме того мы разработали способ для сбора конкретных этапов прорастать teliospores, которые могут быть использованы для нисходящие приложения, например, РНК seq. Наши методы могут быть адаптированы для размещения различных типов клеток и видов. Мы ожидаем, что совершенствование наших методов облегчит обнаружение дыхания изменения на один спор уровня, а также дальнейшее определение событий, которые происходят на более поздних этапах прорастания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы могут не конкурирующих финансовых интересов или другие конфликты интересов раскрыть.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить д-р Пол Фрост для использования его microrespirometer и Николь Вагнер и Алекс Белл для оказания технической помощи. Эта работа финансировалась Сенти Грант для B.J.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Streptomycin Sulfate | BioShop | STP101 | |
| Kanamycin Sulfate | BioShop | KAN201 | |
| Potato Dextrose Broth | BD Difco | 254920 | |
| 1 L Waring Laboratory blender | Waring | 7011S | |
| Cheesecloth | VWR | 470150-438 | |
| Nalgene Polypropylene Desiccator with Stopcock | ThermoFisher Scientific | 5310-0250 | |
| Unisense MicroRespiration system | |||
| MicroRespiration Sensor (O2) | Unisense | OX10 | |
| MicroOptode Meter Amplifier | Unisense | N/A | |
| MR-Ch Small | Unisense | MR-Ch | |
| SensorTrace Rate Software | Unisense | N/A | |
| MicroRespiration Rack | Unisense | MR2-Rack | |
| MicroRespiration Stirrer | Unisense | MR2-Co | |
| Microdissection system | |||
| Axio Vert.A1 Inverted Light Microscope | Zeiss | ||
| Coarse Manipulator | Narishige | MMN-1 | |
| Three-axis Hanging Joystick Oil Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MMO-202ND | |
| Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-11-2 | |
| TransferTip (ES) | Eppendorf | 5175107004 |
References
- Saville, B. J., Donaldson, M. E., Doyle, C. E. Meiosis - Molecular Mechanisms and Cytogenetic Diversity. Swan, A. , InTech. 411-460 (2012).
- Christensen, J. J. Monograph Number 2. , The American Phytopathological Society. Worcester, MA. (1963).
- Caltrider, P. D., Gottlieb, D. Respiratory activity and enzymes for glucose catabolism in fungal spores. Phytopathology. 53, 1021-1030 (1963).
- Allen, P. J. Metabolic aspects of spore germination in fungi. Ann. Rev. Phytopathol. 3, 313-342 (1965).
- Warburg, O. Metabolism of tumours. Biochemische Zeitschrift. 142, 317-333 (1923).
- Ostrowski, L. A., Saville, B. J. Natural antisense transcripts are linked to the modulation of mitochondrial function and teliospore dormancy in Ustilago maydis. Mol Microbiol. 103 (5), 745-763 (2017).
- Morrison, E. N., Donaldson, M. E., Saville, B. J. Identification and analysis of genes expressed in the Ustilago maydis dikaryon: uncovering a novel class of pathogenesis genes. Canadian Journal of Plant Pathology-Revue Canadienne De Phytopathologie. 34 (3), 417-435 (2012).
- Doyle, C. E., Cheung, H. Y. K., Spence, K. L., Saville, B. J. Unh1, an Ustilago maydis Ndt80-like protein, controls completion of tumor maturation, teliospore development, and meiosis. Fungal Genetics and Biology. 94, 54-68 (2016).
- Stade, S., Brambl, R. Mitochondrial biogenesis during fungal spore germination: respiration and cytochrome c oxidase in Neurospora crassa. J Bacteriol. 147 (3), 757-767 (1981).
- Brambl, R. Characteristics of developing mitochondrial genetic and respiratory functions in germinating fungal spores. Biochim Biophys Acta. 396 (2), 175-186 (1975).
- Sacadura, N. T., Saville, B. J. Gene expression and EST analyses of Ustilago maydis germinating teliospores. Fungal Genet Biol. 40 (1), 47-64 (2003).
- Hilderbrand, E. M. Techniques for the isolation of single microorganisms. Botanical Review. 4 (12), 38 (1938).
- Seto, A. M. Analysis of gene transcripts during Ustilago maydis teliospore dormancy and germination. , Trent University. M.Sc. thesis (2013).
- Fröhlich, J., König, H. Soil Biology - Intestinal Microorganisms of Termites and Other Invertebrates. König, H., Varma, A. , Springer. 425-437 (2006).
- Choi, Y., Hyde, K., Ho, W. Single spore isolation of fungi. Fungal Diversity. 3, 11 (1999).
- Sherman, F. Getting started with yeast. Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Pt B. 350, 3-41 (2002).
- Chen, Y., Seguin-Swartz, G. A rapid method for assessing the viability of fungal spores. Canadian Journal of Plant Pathology-Revue Canadienne De Phytopathologie. 24 (2), 230-232 (2002).
