Summary
Smut schimmels veroorzaken vele verwoestende landbouw ziekten. Zij worden verspreid als slapende teliospores die in antwoord op het milieu signalen ontkiemen. Duidelijk naar voren komt twee methoden voor het onderzoek naar moleculaire veranderingen tijdens kieming: meten van verhoging van de ademhaling voor het detecteren van metabole activering en beoordelen van moleculaire gebeurtenissen wijzigen door het isoleren van teliospores in verschillende morfologische stadia.
Abstract
Smut schimmels zijn de etiologische agenten van verschillende verwoestende landbouw ziekten. Ze worden gekenmerkt door de productie van teliospores, die verspreiding dikwandige agenten. Teliospores kunnen slapende blijven voor decennia. De rustperiode wordt gekenmerkt door lage stofwisseling, onderbroken macromoleculaire biosynthese en sterk verlagingen van de ademhaling. Na ontvangst vereist Milieusignalen, ontkiemen teliospores te produceren haploïde cellen, die dit leiden nieuwe rondes van infectie tot kunnen. Teliospore kiemkracht wordt gekenmerkt door de hervatting van de macromoleculaire biosynthese, verhoogde ademhaling en dramatische morfologische veranderingen. Om te precies meten veranderingen in cellulaire ademhaling tijdens de vroege stadia van kiemkracht, hebben we een eenvoudig protocol met een Clark-type respirometer ontwikkeld. De latere stadia van kiemkracht worden onderscheiden door specifieke morfologische veranderingen, maar kiemkracht asynchroon is. We ontwikkelden een techniek van de microdissection waarmee we kunnen verzamelen van teliospores in verschillende kiemkracht stadia.
Introduction
De vuiligheid schimmels (Ustilaginales) bestaan uit meer dan 1600 soorten die grassen met inbegrip van de belangrijke graan, maïs, gerst en tarwe infecteren, waardoor miljarden dollars in gewas verliezen jaarlijks1. Deze schimmels worden gekenmerkt door de productie van teliospores, die hebben darkly gepigmenteerde celwanden en de versnippering agenten. Teliospores functie voor het beschermen van genetisch materiaal tijdens de stress van verspreiding tussen waardplanten, en in een slapende toestand van jaar2kan aanhouden. Zo, zijn teliospores een essentieel onderdeel van de verspreiding van de ziekte.
Om te kunnen studeren teliospore biologie, ons laboratorium maakt gebruik van de model smut schimmel Ustilago maydis (U. maydis), oftewel het oorzakelijke agens van de ziekte 'gemeenschappelijk vuiligheid van maïs'. Oudere U. maydis teliospores worden gekenmerkt door groei arrestatie, verminderde cellulaire metabolisme en lage niveaus van cellulaire ademhaling3. In gunstige milieu-omstandigheden (bijv., de aanwezigheid van specifieke suikers), U. maydis teliospores ontkiemen en voltooien van meiose, produceren basidiospores, die dit leiden nieuwe rondes van infectie tot kunnen. Kieming wordt gekenmerkt door de verhoogde ademhaling, de terugkeer naar de metabole activiteit en de progressie door waarneembare morfologische stadia van kiemkracht4.
De eerste fase van kiemkracht omvat verhoogde ademhaling en metabole functie, er zijn echter geen morfologische aanwijzingen van verandering. De oorspronkelijke metingen van respiratoire verandering in U. maydis werden uitgevoerd meer dan 50 jaar geleden, meten van zuurstofverbruik manometrically met een Warburg kolf apparaat5. We hebben een nieuwe, eenvoudige methode voor het bestuderen van de precieze veranderingen in de ademhaling tijdens de kieming van het teliospore door het meten van zuurstofverbruik over een tijdsverloop van kieming met behulp van een Clark-type microrespirometer ontwikkeld. Wij eerder gebruikt deze methode bij het bestuderen van de veranderingen in respiratoire tarief tussen wild-type U. maydis haploïde cellen en mutanten met defecte mitochondriën6, en hebben het protocol hier aangepast om veranderingen in teliospore ademhaling tijdens studie kieming. Dit biedt een manier om de timing van ademhaling verandering nauwkeurig te identificeren zodat we teliospores op het juiste moment na de inleiding van kieming richten kunnen te onderzoeken van vroege moleculaire gebeurtenissen. De progressie van kieming kan microscopisch worden gevolgd, zodra de promycelia naar voren uit de teliospore komt, maar de asynchrone aard geremd het isolement van genoeg teliospores op een gegeven moment voor onderzoek. Wij ontwikkelden een microdissection techniek vergelijkbaar met die voor in vitro bevruchting gewend fysiek teliospores te verzamelen in verschillende morfologische stadia van kiemkracht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. corn Cob infectie
- Zea mays (cv. Golden Bantam) groeien totdat cobs worden gevormd en zijn begonnen met zijde (ongeveer 60 dagen).
- Cultuur compatibel haploïde U. maydis stammen gebruikt standaard protocollen zoals eerder beschreven7.
- Maïskolven met behulp van standaardprotocollen zoals eerder beschreven7infecteren.
2. teliospore oogsten
- Autoclaaf apparatuur (Büchner trechters, Büchner kolven, blenders, centrifuge flessen van 250 mL, platte spatels en water) met behulp van een standaard droge cyclus met ten minste 30 min sterilisatie bij 121 ° C (vloeibare standaardcyclus voor water).
- Verwijder besmette cobs van planten (ongeveer 28-35 dagen post infectie) met behulp van een scheermes en de cobs instellen op een dienblad bedekt met de beschermer van de Bank.
- Verwijder de tumoren uit kolven met een scheermesje en verzamelen in een bekerglas.
- Vul een 250 mL laboratorium blender beker met tumoren tot ongeveer 1/3 vol en voeg gesteriliseerde met autoclaaf dH2O totdat de blender beker ongeveer 3/4 is volledige. De tumoren verstoren door de blender aan lage, pulserende tot gehomogeniseerd.
- Sluit de vacuümpomp aan een val van water, en dan over in een maatkolf van 1 L Büchner.
- Plaats grote Büchner trechter in de kolf en lijn de bodem van de trechter Büchner met vier lagen voor kaasdoek.
- Zet de vacuümpomp aan.
- Giet een gedeelte van de gehomogeniseerde tumoren door de kaasdoek en schraap met een spatel.
- Giet wat dH2O in de kaasdoek om te spoelen van de teliospores door.
- Herhaal totdat de dH2O komen door de Kaasdoek is duidelijk.
- Wringen uit de kaasdoek met het gehomogeniseerde tumor materiaal in het filter om ervoor te zorgen maximale teliospore herstel.
- Wanneer de Büchner maatkolf van 1 L wordt steeds dicht bij volledige, leeg te maken in een grote erlenmeyer en zet het opzij.
- Een nieuw stuk kaasdoek gestoken in het filter en herhaalt u de stappen (2.7-2.12) totdat alle van de tumoren hebben verstoord en gefilterd.
- Giet de gefilterde teliospores in gesteriliseerde met autoclaaf 250 mL centrifuge flessen en centrifugeer bij 1.000 x g gedurende 5 min en decanteren van de bovendrijvende substantie.
- Herhaal stap 2.14 totdat alle van de gefilterde teliospores zijn Ingehuld door centrifugeren.
- Schorten de korrels in een kleine hoeveelheid water en overdracht aan 50 mL centrifuge buizen.
- Centrifugeer de buizen bij 1.000 x g gedurende 5 min en decanteren van de bovendrijvende substantie.
- Suspendeer de pellet in ongeveer 50 mL dH2O, centrifugeren van de buizen bij 1.000 x g gedurende 5 min en decanteren van de bovendrijvende substantie. Zachtjes Schraap de grijze bovenlaag met een spatel en de afzet daarvan. Herhaal totdat er niet langer een grijze laag bovenop is.
- Droog de monsters overnachting in een vacuüm exsiccator.
- Gedroogde teliospores bij 4 ° C bewaren tot gebruik.
-
Indien gewenst, behandelen de teliospores met kopersulfaat8 voordat inducerende te ontkiemen. Indien niet behandeld, voer dan grondige microscopische analyse van de teliospores om het monster vertegenwoordigt pure teliospores en is verstoken van bacteriële of andere verontreinigingen te bevestigen.
- Weeg ongeveer 50 mg teliospores in een tube van 1,5 mL microcentrifuge.
- Ongeveer 1,0 mL 0,75% CuSO4 aan de tube van de 1,5 mL-microcentrifuge met de teliospores toevoegen. Pipetteer omhoog en omlaag om op te schorten de teliospores in de CuSO4 oplossing gevolgd door schudden van het monster gedurende 3 uur.
- Centrifugeer het monster bij 2.500 x g gedurende 5 minuten en verwijder de bovendrijvende substantie. Resuspendeer de pellet teliospore met steriel water, herhaal het centrifugeren en verwijder de bovendrijvende substantie.
- Herhaal stap 2.21.3 twee meer tijden.
3. teliospore levensvatbaarheid en kiemkracht Test
- Weeg ongeveer 10 mg van U. maydis teliospores in een tube microcentrifuge 1,5 mL te beoordelen hun levensvatbaarheid en de timing van kiemkracht.
- Bereiden in een kabinet bioveiligheid, aardappel dextrose Bouillon (VOB, 24 g/L) aangevuld met streptomycine sulfaat (160 µg/mL).
- Opschorten van de teliospores in 500 µL van het VOB. Pipetteer zachtjes breken alle klontjes van teliospores te mengen.
- Spoel de suspensie van teliospore tot een gesteriliseerde met autoclaaf 250 mL conische kolf met 10 mL van het VOB.
- Incubeer de kolf bij 28 ° C schudden bij 90 t/min voor 12-16 h.
- Verwijder in een kabinet bioveiligheid, 20 µL eenmonstervan de teliospores geïnduceerde te ontkiemen en bereiden een microscoopglaasje.
-
Met behulp van een Microscoop, visueel beoordelen stadia van kiemkracht die aanwezig zijn en de aanwezigheid van bacteriële besmetting.
- Het aantal teliospores in stadia ik via V met behulp van een hemocytometer en het bepalen van het percentage dat zijn ontkiemd.
- Als enige fase I teliospores aanwezig zijn, blijven broeden de kolf voor een totaal van 24 h vóór teliospore kieming te beoordelen. Incubatie gedurende maximaal 48 uur voordat het monster niet-levensvatbare die blijven.
- Als bacteriële besmetting aanwezig is, vullen van het VOB met kanamycine sulfaat (50 µg/mL) en streptomycine sulfaat (160 µg/mL) en herhaalt u vervolgens stap 3.1 tot en met 3.7. Als bacteriële besmetting aanhoudt, teliospores met koper sulfaat te behandelen en herhaal stap 3.1 tot en met 3.7.
4. de inductie van kiemkracht voor de controle van de ademhaling
- Weeg gelijke hoeveelheid (bv., 50 mg) van de teliospores voor elke ademhaling-experiment.
- In een kabinet bioveiligheid, voegt u teliospores toe aan een gesteriliseerde met autoclaaf ademhaling kamer.
- Vul de zaal met VOB (24 g/L) aangevuld met streptomycine sulfaat (160 µg/mL) en kanamycine sulfaat (50 µg/mL).
- Pipetteer omhoog en omlaag als u wilt maken van de opschorting van een teliospore.
- Plaats het deksel van de kamer in de kamer maken luchtdicht zegel.
5. het verkrijgen van zuurstof verbruik tarief (OCR) metingen
- Plaats het Parlement in het zaal-rek in een waterbad (voorverwarmd tot 28 ° C).
- Plaats de O2 sonde binnen de opening van de kamer.
- Controleren van de gegevenspunten weergegeven in real time op het programma "SensorTrace Rate", en laat de sonde stabiliseren (~ 3 min nadat de sonde is geplaatst in de zaal).
- Klik op "Maatregel" voor het meten van O2 niveaus voortdurend voor 6 h met metingen opgenomen 2 s tussenpozen.
- Stoppen van de meting en herhaalt u stappen 4.1-5.4 voor elk monster te analyseren.
- De gegevens exporteren naar Microsoft Excel door te klikken op "bestand | Exporteren | Opslaan als xls".
6. de gegevensanalyse
-
Berekenen van OCR
- Opnemen in het geëxporteerde Excel-bestand onder het tabblad "Within_Rates", de "Rate" voor elke kamer meting (nmol/h).
- Voor elk experimenteel monster, aftrekken van de "Rate" van de lege kamer van de "Rate" van de experimentele monsterkamer om een gecorrigeerde OCR-waarde te verkrijgen, en neem de absolute waarde van dit nummer.
- Bereken de totale OCR per mg teliospores door de gecorrigeerde waarde voor absolute OCR te delen door de mobiele massa gebruikt.
- Gemiddelde repliceren "OCR per mg teliospores" waarden voor elke stam.
- Analyseren van de gegevens met behulp van geschikte statistische methode (bv., student t-test, variantie-analyse) met behulp van Microsoft Excel van andere statistische software.
- Grafiek van de ruwe gegevens te berekenen van het percentage zuurstof resterende voor elk tijdstip dat u wenst te grafiek. Verdelen van de eerste lezing door zelf en vermenigvuldig met 100 (100% zuurstof resterende), vervolgens elke latere lezing verdelen door de eerste lezing en vermenigvuldig met 100 om het percentage zuurstof in de kamer blijft.
7. de inductie van Teliospore kieming te isoleren van Teliospores in verschillende stadia van kiemkracht
- VOB (24 g/L) aangevuld met streptomycine sulfaat (160 µg/mL) in een kabinet bioveiligheid voor te bereiden.
- Plaats ongeveer 10 mg van U. maydis teliospores in een tube van 1,5 mL microcentrifuge.
- Opschorten van de teliospores in 500 µL van het VOB. Pipet zachtjes te mengen zolang er geen klontjes van teliospores in het medium niet zijn.
- Breng de teliospore een gesteriliseerde met autoclaaf 250 mL-kolf met VOB aangevuld met streptomycine sulfaat.
- Incubeer de kolf 's nachts bij 28 ° C schudden bij 90 t/min.
8. bereiding van de petrischaal en Micromanipulator
-
Voorbereiden op een petrischaal (57 cm2) door pipetting rijen van druppeltjes microcapillary voorbereiding en sample collectie.
- Pipetteer 5 µL (x 4) dH2O druppels aan de bovenkant van de petrischaal.
- Pipetteer 2 µL (x3) van RNA stabilisatie oplossing op de petrischaal voor sample collectie moet worden gebruikt.
- Pipetteer 5 µL (x 30) druppels met teliospores op de petrischaal ontkiemen.
- Voeg 15 mL minerale olie tot de petrischaal. Zorg ervoor dat alle druppels olie alvorens vallen.
- Bereid een microcapillary met een 15 µm inwendige diameter, 1 mm flens, 55 mm lengte en een hoek van 20° tip door plaatsen in de microcapillary houder en dompelen het in de minerale olie waar capillaire actie zorgt ervoor dat de minerale olie om in te voeren van de microcapillary. Laat de druk in de microcapillary alvorens het naar de druppel water. Gecombineerd om voor te bereiden van het microcapillary met water.
9. isolatie van fase-specifieke ontkiemen Teliospores
- Met behulp van de besturingselementen van de micromanipulator, de bereid microcapillary naar één van de kiemkracht druppels verplaatsen. Doordringen de druppel, verlaag de microcapillary en brengen van de monding van de microcapillary tot een kiemende teliospore het stadium van kieming van belang.
- Langzaam gecombineerd om vast te leggen van de ontkiemende teliospore. Stoppen met zuigen zodra de teliospore is de microcapillary. Herhaal totdat er ongeveer vijf teliospores in de microcapillary zijn.
- Verhogen van de microcapillary met de micromanipulator en breng het aan de collectie druppel van RNA stabilisatie oplossing. Doordringen van de druppel en injecteren van de teliospores in de druppel.
- Herhaal stap 8.1 naar 8.3 tot ongeveer 1000 teliospores zijn vastgelegd.
10. invordering van collectie druppel
- Pipetteer van de collectie druppel en het overbrengen naar het deksel van een tube RNase/DNase-gratis 2,0 mL microcentrifuge. Verwijder voorzichtig de minerale olie met een pipet zonder verstoring van de collectie druppel.
- Gebruik de teliospores voor downstream toepassingen zoals RNA isolatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van de Clark-type microrespirometer gebaseerde methode voor het meten van veranderingen in de ademhaling tijdens de rustperiode van de teliospore en de kiemkracht, bevestigd we dat slapende teliospores een lage niveau van de ademhaling (~ 1.075 µmol/h/mg vertonen) vergeleken met ontkiemen teliospores (~ 2.614 µmol/h/mg; Figuur 1A). Dit betekent een ~2.4-fold verandering in gemiddelde snelheid van de ademhaling tussen slapende teliospores en teliospores die hebben om te ontkiemen zijn geïnduceerd. Daarnaast hebben we vastgesteld dat teliospores die hebben om te ontkiemen zijn geïnduceerde een ~ 45 min vertraging in zuurstofopname (figuur 1B hebben). Dit wordt aangegeven door de ~ 30 min vertraging in zuurstofopname (figuur 1B) naast de ~ 15 min vertraging tussen de inductie van ontkieming en start van zuurstof metingen. Dit geeft een punt van de tijd om te beginnen met beoordelen van moleculaire veranderingen in het kiemende teliospores dat niet zichtbaar veranderen.
Latere wijzigingen tijdens kieming kunnen microscopisch worden waargenomen. Vijf stadia van kiemkracht werden vastgesteld. Fase I van kiemkracht vertegenwoordigt teliospores, die al veroorzaakte hebben te ontkiemen, maar blijven niet te onderscheiden van slapende teliospores. Fase II teliospores hebben een opkomende promycelium met een lengte die kleiner is dan of gelijk aan de diameter van de teliospore. Fase III teliospores hebben promycelia die groter zijn dan de diameter van de teliospore. Fase IV van de kieming is de eerste ontluikende van basidiospores van de promycelia en fase V zijn de resulterende haploïde basidiospores die verdelen door knopvorming (Figuur 2). Met behulp van de microdissection-techniek die we hebben ontwikkeld, hebben we met succes geïsoleerd 500 tot 1.000 kiemende teliospores voor downstream toepassingen zoals RNA isolatie voor RT-PCR of RNA-Seq (tabel 1). Figuur 3 toont de algemene set up van de Petri dish voor microdissection en de stappen voor microdissection met behulp van een micromanipulator.
Figuur 1: tijdsverloop van zuurstofverbruik tijdens teliospore kiemkracht. Slapende teliospores werden aangezet te ontkiemen, en zuurstofniveaus werden voortdurend geregistreerd gedurende 6 uur met behulp van een Clark-type microrespirometer. Un-geïnduceerde slapende teliospores werden gebruikt als een besturingselement, en alle metingen waren genormaliseerd naar een blancomonster. (A) gegevens weergegeven als gemiddelde OCR. (B) onbewerkte gegevens die zijn uitgezet te verkrijgen van de curven van de ademhaling, de detectie van veranderingen in OCR in de tijdsverloop het toelaat. Teliospores die hebben om te ontkiemen zijn geïnduceerde verbruiken zuurstof gemiddeld 2.4-fold sneller dan on-geïnduceerde slapende teliospores (p < 0,01; Van de student t-test). VARKEN: na inductie van kiemkracht. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: stadia van teliospore kiemkracht. Stadia I t/m V van teliospore kiemkracht worden geïllustreerd (A-E). Schaal bar = 20 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Microdissection te isoleren van verschillende morfologische stadia van ontkiemen teliospores. De algemene set-up van een Petri dish voor microdissection en de stappen voor het isoleren van teliospore stadium III van kiemkracht worden geïllustreerd. (A) afbeelding van een petrischaal instellen met rijen van druppels die hetzij steriel water, RNA stabilisatie oplossing, geheel of teliospores ontkiemen. Na kieming inductie werden teliospores geïsoleerd in specifieke stadia van kieming met behulp van microdissection. (B) een kiemkracht druppel met geïnduceerde teliospores ontkiemen in fasen I t/m III. (C) een bereid microcapillary werd opgevoed aan een fase III teliospore voor collectie door middel van aspiratie. (D) de fase III teliospore in een glas microcapillary is verwijderd uit de kiemkracht druppel en verhuisde naar een droplet collectie. (E) de microcapillary in de collectie druppel met RNA stabilisatie oplossing werd ingevoegd en de fase III teliospore werd geïnjecteerd in de druppel. (F) een verzameling van fase III teliospores in het RNA stabilisatie oplossing. Schaal bar = 20 µm (A-D, F) en 50 µm (E). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Kieming fase | Aantal kiemende teliospores geïsoleerd |
| Fase I | 1.000 |
| Fase II | 500 |
| Fase III | 650 |
Tabel 1: aantal kiemende teliospores met succes geïsoleerd voor elke fase van de ontkieming van een standaard isolatie-experiment. De tabel ziet u de gemiddelde aantallen van teliospores die zijn geïsoleerd met behulp van microdissection voor de fasen I t/m III voor collectie voor downstream toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lange biotrophic plant ziekteverwekkers worden jaarlijks miljarden dollars in gewas verliezen veroorzaken. De overgrote meerderheid van deze ziekteverwekkers produceren teliospores, die integraal deel van de schimmel versnippering en geslachtelijke voortplanting uitmaken. Verkrijgen van kennis van de ontwikkeling en de kiemkracht van teliospores is van cruciaal belang voor het begrip van de verspreiding van de verwoestende ziekten veroorzaakt door deze schimmels. Teneinde de moleculaire veranderingen op belangrijke controlepunten hebben we bedacht een methode om te identificeren van de timing van fysiologische verschuivingen en een andere om te isoleren van teliospores in verschillende stadia van kiemkracht. Seto et al. (niet gepubliceerde) bekende vijf stadia van teliospore kiemkracht door lichte microscopie (Figuur 2). Om te onderzoeken van fysiologische activering tijdens fase I en om te beoordelen ademhalingsfrequentie tijdens kieming, gebruikten we een Clark-type microrespirometer voor het juist meten van veranderingen in zuurstofverbruik. Onze voorbeeldgegevens aangeven dat onze methode nauwkeurig en zeer reproduceerbaar is. Onze bevindingen bevestigen dat ontkiemen U. maydis teliospores een drastische verhoging van cellulaire ademhaling in vergelijking met un-geïnduceerde slapende teliospores vertonen. Voor de eerste keer, hebben we vastgesteld dat U. maydis teliospores die hebben om te ontkiemen zijn geïnduceerde een ~ 45 min vertraging in de zuurstofopname vertonen. Dit suggereert dat U. maydis teliospores enige tijd voor het verwerken van kiemkracht signalen kunnen verlangen (bv., de aanwezigheid van suikers) voordat ik reageer, is dat verhoogde zuurstofopname niet onder de zeer directe reacties op kiemkracht signalen of dat onze test niet gevoelig genoeg is om te ontdekken de minimale verandering in eerste zuurstofopname was.
Vorige studies onderzoeken ademhaling tarieven van vuiligheid teliospores3 vertrouwd op een Warburg kolf apparaat voor het meten van zuurstof niveaus manometrically5. Kortom, deze methode meet zuurstofverbruik en CO2 productie door het opsporen van wijzigingen in druk in een gesloten kolf via de directe waarneming van vloeistof niveau veranderingen in de arm van de manometer. De experimenten kunnen moeilijk om in te stellen, en metingen kunnen onnauwkeurig. Het toestel moet gedurende de gehele meting worden bijgewoond, en uitgebreide berekeningen zijn verplicht te schatten OCR. Ons protocol maakt gebruik van technologische vooruitgang, afschaffing van de eis voor de gebruiker om te blijven door het apparaat voor de duur van het experiment, metingen te nemen met het blote oog, en uitgebreide wiskundige formules gebruiken. Andere vroege Clark-type respirometers voor maatregel OCR van Neurospora crassa9 en Botryodpilodia theobromae10 sporen heb gebruikt, echter, deze vroege instrumenten toegestaan continumetingen voor een maximum van 20 min. Deze beperking zou niet hebben toegestaan de identificatie van de ~ 45 min vertraging in zuurstofopname die we met de nieuwere model respirometer waargenomen. Ons protocol geboekt data interpretatie eenvoudiger, zoals de uitlezing is de concentratie van zuurstof in de kamer, die kan worden direct opgenomen in een grafiek zonder enige berekeningen of gegevens manipulatie blijft. Daarnaast is het mogelijk om de continumetingen (elke 2 s) voor een onbepaalde hoeveelheid tijd totdat beschikbare zuurstof is volledig is uitgeput. Hierdoor kan de identificatie van kleine veranderingen in de ademhaling gedurende een lange periode van tijd. Wij hebben daarom eerder technieken verbeterd en een eenvoudige, nauwkeurige en reproduceerbare methode ontwikkeld om het meten van zuurstofverbruik van schimmelsporen. Om onze kennis is dit de eerste studie te gebruiken een moderne Clark-type respirometer voor de analyse van de ademhaling van slapende versus ontkiemen teliospores van vuiligheid schimmels.
Ondanks het gemak en de eenvoud van dit protocol, optimalisatie is vereist en er zijn biologische realiteit die de analyse beperkt. Eerste, juiste steekproefomvang moeten worden geïdentificeerd om redelijke OCRs. Teveel monster kan leiden tot voortijdige crashen van zuurstofniveaus, en te weinig monster kan resulteren in het onvermogen om te observeren van zinvolle veranderingen in zuurstofverbruik. Ten tweede is het noodzakelijk dat de tijd van de sonde te stabiliseren (~ 3 min) om te zorgen voor nauwkeurige begingegevens. Tot slot, het is belangrijk om kieming medium te vullen met antibacteriële middelen (bijv., streptomycine sulfaat) om ervoor te zorgen dat bacteriële besmetting verandert niets OCR lezingen. De biologische beperkingen die we geconfronteerd werden een lage kiemkracht tarief in de tijdsverloop van de meting, (~ 1%) zoals bepaald door het observeren van visuele morfologische veranderingen. Bepaling van de levensvatbaarheid van de spore zou deze bepaling van het tarief worden geconverteerd naar een tarief per spore nummer en isoleren teliospores met hogere tarieven van kiemkracht zou leiden tot hogere OCRs. De asynchrone kieming van U. maydis teliospores11 is een realiteit die moet worden verwerkt en kan hebben bijgedragen tot een onvermogen om op te sporen zuurstofverbruik eerder in kiemkracht.
Ter verbetering van de nauwkeurigheid en precisie van de meting veranderingen in teliospore ademhaling, kunnen toekomstige aanpassingen aan deze methode omvat meting van OCR op een enkele cel-basis. Micromanipulation technieken kunnen worden gebruikt voor het isoleren van een enkele teliospore, die vervolgens kan worden opgewekt om te ontkiemen en de ademhalingsfrequentie kan worden gecontroleerd. Dit zou kunnen resolutie, tijdens de rustperiode-kiemkracht verschuiving per teliospore, in plaats van per mg teliospores informatie met betrekking tot de OCR verbeteren. Bovendien zou dit het storende probleem van asynchrone kiemkracht oplost.
Voor latere stadia van de kiemkracht ontwikkelden we een micromanipulation methode om teliospores isoleren in gemeenschappelijke stadia van kiemkracht. Hierdoor is de oprichting van relatief synchrone teliospore populaties voor analyse. Verschillende methoden voor het isoleren van één micro-organismen zijn beschreven en over het jaar12hebben verbeterd. Deze methoden omvatten de verdunning van spore schorsingen te verkrijgen van enkele van de micro-organismen, semi-mechanische methoden met het gebruik van de microcapillaries voor sporen die zijn overgebracht naar een medium voor het kweken en mechanische methoden die gebruik maken van micromanipulators . Vorige methoden die we gebruikt om het verkrijgen van teliospores in de dezelfde fase van kiemkracht omvatten tegenstroom centrifugaal elutriation en filteren van kiemende teliospores door een membraan van nylon met een specifieke poriegrootte. Met behulp van deze methoden die ons in staat gesteld om te verrijken voor het ontkiemen van de teliospores, echter bevatte onze voorbeelden nog teliospores in verschillende stadia van kiemkracht13. Huidige technologie voor micromanipulation van één micro-organismen is verbeterd met de invoering van hogere vergroting en instrumenten voor fijne controle van capillaire naalden, aspiratie en overdracht van micro-organismen. Vorige micromanipulation technieken hebben gericht op afzonderlijke cellen voor kweken of voor gebruik in eencellige PCR toepassingen14isoleren. Het gebruik van micromanipulators om te isoleren van één schimmelsporen heeft niet eerder vastgesteld. Een vorige methode voor het isoleren van één schimmelsporen betrokken het gebruik van fijne pincet of naalden te halen kleine stukjes van solide medium met kiemende sporen15. Micromanipulation met het gebruik van micromanipulators wordt wijd gebruikt in gist onderzoek waarin clusters van Ascosporen gescheiden volgende sporevorming in cultuur op de drager van de agar voor Meiotische genetische analyse16kunnen zijn. We hebben een methode die de techniek van de micromanipulation voor bacteriële cellen14 combineert en in vitro bevruchting methoden voor het isoleren van kiemende teliospores ontwikkeld. We hebben aangetoond dat gemeenschappelijke kiemkracht fase teliospores honderden met deze techniek kunnen worden verkregen. Deze steekproeven kunnen worden gebruikt voor downstream expressie studies met behulp van technieken zoals RT-qPCR of RNA-seq. verkrijgen van een bevolking van teliospores waarin de kiemkracht wordt gesynchroniseerd toestaat de analyse van specifieke wijzigingen in genexpressie dat tijdens optreedt vroeg, Midden en latere fasen van teliospore kiemkracht.
Microdissection van specifieke ontkiemen teliospores fase kan vereist ervaring in set up en herkennen de verschillende stadia van kiemkracht, echter deze ervaring kan worden verkregen snel via de praktijk. Er zijn verschillende stappen die moeten worden gevolgd voor succesvolle microdissection gevolgd door RNA isolatie. Eerst, kiemkracht medium moet worden aangevuld met antibiotica (bv., streptomycine sulfaat) te onderdrukken van de groei van bacteriële besmetting wanneer kiemkracht wordt geïnitieerd en tijdens de collectie voor het ontkiemen van teliospores. Ten tweede is het belangrijk met een stabilisatie-oplossing te stabiliseren en beschermen van RNA voor isolatie. Het RNA stabilisatie oplossing voorkomt bovendien dat verzamelde teliospores vooruit naar de volgende fase van de kiemkracht terwijl het verzamelen van aanvullende teliospores. Ten derde is het belangrijk om te verwijderen van de minerale olie, zodra de droplet collectie gerecupereerd zodat succesvolle RNA extractie. Tot slot, we hebben gemerkt wat kwaliteitsverlies RNA als geïsoleerde teliospores zijn opgeslagen in RNA stabilisatie oplossing voor een langere periode van tijd; Daarom is het aangeraden dat RNA geïsoleerd onmiddellijk na collectie van kiemkracht stadium specifieke teliospores is. Een beperking van de methode is dat het podium ik teliospores verzameld kunnen bevatten slapende, dode en geïnduceerde ontkiemen teliospores zoals deze drie fasen morfologisch te onderscheiden zijn. Bovendien, bij het verzamelen van fase III teliospores, een mengsel van teliospores in meiose I of meiose II kan worden verkregen. Unidirectioneel om te helpen bij het onderscheid te maken tussen echt slapende en dode teliospores kan worden om de levensvatbaarheid van het monster. Een methode voor het beoordelen van de levensvatbaarheid van de schimmel spore met behulp van live/dode cel levensvatbaarheid testen kan te kunnen beoordelen van percentage van levensvatbare teliospores waaruit zou meer informatieve kieming tarieven bepaald17. Bovendien, kan nucleus kleuring met DAPI, bijvoorbeeld worden gebruikt om te visualiseren van de gebeurtenissen van meiose die tijdens de fase III en de overgang naar fase IV voordoen zich om verder karakteriseren teliospores morfologisch op fase III. Dit zou de steun in de collectie van teliospores in slechts één fase van kiemkracht bij het gebruik van onze microdissection-methode.
Tot slot hebben wij een eenvoudige, nauwkeurige en reproduceerbare methode voor het meten van de veranderingen in de cellulaire ademhaling die tijdens de rustperiode-kiemkracht verschuiving van Ustilago maydis teliospores optreden ontwikkeld. Daarnaast hebben we een methode voor het verzamelen van specifieke stadia van teliospores die kunnen worden gebruikt voor downstream-toepassingen, zoals RNA-seq. ontkiemen Onze methoden kunnen worden aangepast aan verschillende celtypen en soorten. Wij verwachten dat de detectie van respiratoire veranderingen op een enkele spore niveau evenals verdere definiëren de gebeurtenissen die in de latere stadia van ontkieming voordoen zich zal bijdragen aan verbeteringen aan onze technieken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten bekend te maken.
Acknowledgments
We zouden graag bedanken Dr. Paul Frost voor gebruik van zijn microrespirometer, en Nicole Wagner en Alex Bell voor technische bijstand. Dit werk werd gefinancierd door een subsidie van NSERC naar B.J.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Streptomycin Sulfate | BioShop | STP101 | |
| Kanamycin Sulfate | BioShop | KAN201 | |
| Potato Dextrose Broth | BD Difco | 254920 | |
| 1 L Waring Laboratory blender | Waring | 7011S | |
| Cheesecloth | VWR | 470150-438 | |
| Nalgene Polypropylene Desiccator with Stopcock | ThermoFisher Scientific | 5310-0250 | |
| Unisense MicroRespiration system | |||
| MicroRespiration Sensor (O2) | Unisense | OX10 | |
| MicroOptode Meter Amplifier | Unisense | N/A | |
| MR-Ch Small | Unisense | MR-Ch | |
| SensorTrace Rate Software | Unisense | N/A | |
| MicroRespiration Rack | Unisense | MR2-Rack | |
| MicroRespiration Stirrer | Unisense | MR2-Co | |
| Microdissection system | |||
| Axio Vert.A1 Inverted Light Microscope | Zeiss | ||
| Coarse Manipulator | Narishige | MMN-1 | |
| Three-axis Hanging Joystick Oil Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MMO-202ND | |
| Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-11-2 | |
| TransferTip (ES) | Eppendorf | 5175107004 |
References
- Saville, B. J., Donaldson, M. E., Doyle, C. E. Meiosis - Molecular Mechanisms and Cytogenetic Diversity. Swan, A. , InTech. 411-460 (2012).
- Christensen, J. J. Monograph Number 2. , The American Phytopathological Society. Worcester, MA. (1963).
- Caltrider, P. D., Gottlieb, D. Respiratory activity and enzymes for glucose catabolism in fungal spores. Phytopathology. 53, 1021-1030 (1963).
- Allen, P. J. Metabolic aspects of spore germination in fungi. Ann. Rev. Phytopathol. 3, 313-342 (1965).
- Warburg, O. Metabolism of tumours. Biochemische Zeitschrift. 142, 317-333 (1923).
- Ostrowski, L. A., Saville, B. J. Natural antisense transcripts are linked to the modulation of mitochondrial function and teliospore dormancy in Ustilago maydis. Mol Microbiol. 103 (5), 745-763 (2017).
- Morrison, E. N., Donaldson, M. E., Saville, B. J. Identification and analysis of genes expressed in the Ustilago maydis dikaryon: uncovering a novel class of pathogenesis genes. Canadian Journal of Plant Pathology-Revue Canadienne De Phytopathologie. 34 (3), 417-435 (2012).
- Doyle, C. E., Cheung, H. Y. K., Spence, K. L., Saville, B. J. Unh1, an Ustilago maydis Ndt80-like protein, controls completion of tumor maturation, teliospore development, and meiosis. Fungal Genetics and Biology. 94, 54-68 (2016).
- Stade, S., Brambl, R. Mitochondrial biogenesis during fungal spore germination: respiration and cytochrome c oxidase in Neurospora crassa. J Bacteriol. 147 (3), 757-767 (1981).
- Brambl, R. Characteristics of developing mitochondrial genetic and respiratory functions in germinating fungal spores. Biochim Biophys Acta. 396 (2), 175-186 (1975).
- Sacadura, N. T., Saville, B. J. Gene expression and EST analyses of Ustilago maydis germinating teliospores. Fungal Genet Biol. 40 (1), 47-64 (2003).
- Hilderbrand, E. M. Techniques for the isolation of single microorganisms. Botanical Review. 4 (12), 38 (1938).
- Seto, A. M. Analysis of gene transcripts during Ustilago maydis teliospore dormancy and germination. , Trent University. M.Sc. thesis (2013).
- Fröhlich, J., König, H. Soil Biology - Intestinal Microorganisms of Termites and Other Invertebrates. König, H., Varma, A. , Springer. 425-437 (2006).
- Choi, Y., Hyde, K., Ho, W. Single spore isolation of fungi. Fungal Diversity. 3, 11 (1999).
- Sherman, F. Getting started with yeast. Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Pt B. 350, 3-41 (2002).
- Chen, Y., Seguin-Swartz, G. A rapid method for assessing the viability of fungal spores. Canadian Journal of Plant Pathology-Revue Canadienne De Phytopathologie. 24 (2), 230-232 (2002).
