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Biology

Microrespiration विश्लेषण और Microdissection का उपयोग कर Teliospore अंकुरण की जांच

doi: 10.3791/57628 Published: May 13, 2018
* These authors contributed equally

Summary

मैल कवक कई विनाशकारी कृषि रोगों के कारण । वे निष्क्रिय teliospores के रूप में फैलाया जाता है कि पर्यावरण cues के जवाब में उगना । हम दो विधियों अंकुरण के दौरान आणविक परिवर्तन की जांच करने के लिए रूपरेखा: चयापचय सक्रियण का पता लगाने और अलग रूपात्मक चरणों में teliospores अलग करके आणविक घटनाओं को बदलने का आकलन करने के लिए श्वसन वृद्धि को मापने.

Abstract

मैल कवक कई विनाशकारी कृषि रोगों के etiological एजेंट हैं । वे teliospores के उत्पादन की विशेषता है, जो मोटी दीवारों dispersing एजेंटों रहे हैं । Teliospores दशकों के लिए निष्क्रिय रह सकते हैं । निद्रा कम चयापचय दर की विशेषता है, रुका हुआ macromolecular का संश्लेषण और श्वसन के बहुत कम स्तर. आवश्यक पर्यावरणीय संकेतों को प्राप्त करने पर, teliospores अगुणित कोशिकाओं का उत्पादन करने के लिए उगना, जो संक्रमण के नए दौर शुरू कर सकते हैं । Teliospore अंकुरण macromolecular की बहाली की विशेषता है-संश्लेषण, वृद्धि की संवेदनाएं और नाटकीय रूपात्मक परिवर्तन । आदेश में ठीक अंकुरण के प्रारंभिक दौर के दौरान सेलुलर श्वसन में परिवर्तन को मापने के लिए, हम एक सरल एक क्लार्क-प्रकार आत्मशोधन रोजगार प्रोटोकॉल विकसित किया है । अंकुरण के बाद के चरणों विशिष्ट रूपात्मक परिवर्तन द्वारा प्रतिष्ठित हैं, लेकिन अंकुरण एसिंक्रोनस है । हम एक microdissection तकनीक है कि हमें अलग अंकुरण चरणों में teliospores इकट्ठा करने में सक्षम बनाता है विकसित की है ।

Introduction

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मैल कवक (Ustilaginales) पर १,६०० प्रजातियों से मिलकर बनता है कि मकई, जौ, और गेहूं की महत्वपूर्ण अनाज फसलों सहित घास को संक्रमित, फसल घाटे में अरबों डॉलर प्रतिवर्ष के कारण1। इन कवक teliospores, जो अंधेरे pigmented सेल दीवारों है और dispersing एजेंटों के उत्पादन की विशेषता है । Teliospores समारोह मेजबान संयंत्रों के बीच dispersing के तनाव के दौरान आनुवंशिक सामग्री को ढाल, और साल के लिए एक निष्क्रिय राज्य में बनी रह सकते है2। जैसे, teliospores रोग प्रसार का एक आवश्यक घटक हैं ।

आदेश में teliospore जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए, हमारी प्रयोगशाला मॉडल मैल कवक Ustilago मेडिस (यू. मेडिस) है, जो ' मकई के आम मैल ' रोग के कारण एजेंट है का उपयोग करता है । परिपक्व U. मेडिस teliospores विकास की गिरफ्तारी की विशेषता है, कम सेलुलर चयापचय, और सेलुलर श्वसन3के निंन स्तर । अनुकूल पर्यावरणीय परिस्थितियों में (उदा., विशिष्ट शर्करा की उपस्थिति), मेडिस teliospores उगना और पूर्ण अर्धसूत्रीविभाजन, basidiospores उत्पादन जो संक्रमण के नए दौर शुरू कर सकते हैं । अंकुरण वृद्धि श्वसन, चयापचय गतिविधि के लिए वापसी, और अंकुरण की चौकसी रूपात्मक चरणों के माध्यम से प्रगति4की विशेषता है ।

अंकुरण के आरंभिक चरण में वृद्धि श्वसन और चयापचय समारोह भी शामिल है, हालांकि, वहां परिवर्तन के कोई रूपात्मक संकेत हैं । मेडिस में श्वसन परिवर्तन के मूल माप ५० साल पहले से अधिक किए गए थे, एक Warburg कुप्पी उपकरण5के साथ ऑक्सीजन की खपत manometrically को मापने । हम एक क्लार्क प्रकार microrespirometer का उपयोग कर अंकुरण के एक समय पाठ्यक्रम पर ऑक्सीजन की खपत को मापने के द्वारा teliospore अंकुरण के दौरान श्वसन में सटीक परिवर्तन का अध्ययन करने की एक नई, सरल विधि विकसित की है । हम पहले इस पद्धति का इस्तेमाल किया जंगली प्रकार के बीच श्वसन दर में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए मेडिस अगुणित कोशिकाओं और दोषपूर्ण mitochondria के साथ म्यूटेंट6, और प्रोटोकॉल यहां अनुकूलित किया है के दौरान teliospore श्वसन में परिवर्तन अध्ययन करने के लिए अंकुरण. यह श्वसन परिवर्तन के समय को सही ढंग से पहचानने का एक साधन प्रदान करता है ताकि हम शीघ्र आणविक घटनाओं की जाँच के लिए अंकुरण की दीक्षा के बाद उपयुक्त समय पर teliospores को लक्षित कर सकें. अंकुरण की प्रगति teliospore से promycelia उभर एक बार microscopically का पालन किया जा सकता है, लेकिन अतुल्यकालिक प्रकृति जांच के लिए एक दिया मंच पर पर्याप्त teliospores के अलगाव बाधा । हम एक microdissection तकनीक विकसित उन विट्रो में निषेचन के लिए शारीरिक रूप से अंकुरण के अलग रूपात्मक चरणों में teliospores इकट्ठा करने के लिए इसी तरह के लिए इस्तेमाल किया ।

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Protocol

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1. मकई सिल संक्रमण

  1. बढे Zea mays (cv. Golden Bantam) जब तक दानों का गठन कर रहे है और रेशम (लगभग ६० दिन) शुरू कर दिया है ।
  2. संस्कृति संगत अगुणित U. मेडिस उपभेदों मानक प्रोटोकॉल का उपयोग कर के रूप में पहले7वर्णित है ।
  3. पहले वर्णित7के रूप में मानक प्रोटोकॉल का उपयोग कर संक्रमित मकई दानों ।

2. Teliospore संचयन

  1. आटोक्लेव उपकरण (Büchner कीप, Büchner कुप्पी, ब्लेंडर, २५० मिलीलीटर केंद्रापसारक बोतलें, फ्लैट spatulas, और पानी) के साथ एक मानक शुष्क चक्र का उपयोग करने के लिए १२१ डिग्री सेल्सियस (पानी के लिए मानक तरल चक्र) में कम से 30 ंयूनतम नसबंदी ।
  2. पौधों से संक्रमित दानों निकालें (लगभग 28-35 दिनों के बाद संक्रमण) एक उस्तरा का उपयोग और एक बेंच रक्षक में शामिल ट्रे पर दानों सेट ।
  3. एक उस्तरा ब्लेड के साथ दानों से ट्यूमर निकालें और एक चोंच में इकट्ठा ।
  4. लगभग 1/3 पूर्ण जब तक ट्यूमर के साथ एक २५० मिलीलीटर प्रयोगशाला ब्लेंडर कप भरें और autoclaved डीएच2हे जोड़ें जब तक ब्लेंडर कप लगभग 3/4 भरा है । कम पर ब्लेंडर स्पंदन द्वारा ट्यूमर को बाधित, homogenized तक ।
  5. एक पानी के जाल के लिए वैक्यूम पंप कनेक्ट और फिर एक 1 एल Büchner कुप्पी के लिए ।
  6. कुप्पी और रेखा में बड़े Büchner कीप डालें Büchner कीप के जाली के चार परतों के साथ नीचे ।
  7. वैक्यूम पंप चालू करें ।
  8. जाली के माध्यम से homogenized ट्यूमर के एक हिस्से डालो और एक रंग के साथ परिमार्जन ।
  9. जाली में कुछ डीएच2हे डालो आदेश में teliospores फ्लश के माध्यम से ।
  10. दोहराएं जब तक डीएच2O जाली के माध्यम से आ रहा है स्पष्ट है ।
  11. फिल्टर में homogenized ट्यूमर सामग्री युक्त जाली बाहर मरोड़ अधिकतम teliospore वसूली सुनिश्चित करने के लिए ।
  12. जब 1 एल Büchner कुप्पी पूर्ण के करीब हो रही है, यह एक बड़ी Erlenmeyer कुप्पी में खाली है और यह एक तरफ सेट ।
  13. फ़िल्टर में जाली का एक नया टुकड़ा रखो और कदम (2.7-2.12) दोहराने जब तक ट्यूमर के सभी बाधित और फ़िल्टर किया गया है ।
  14. autoclaved २५० मिलीलीटर में फ़िल्टर्ड teliospores डालो बोतलें और 5 मिनट के लिए १,००० x g पर केंद्रापसारक, और supernatant नहीं कर सकते ।
  15. दोहराएं चरण २.१४ तक सभी फ़िल्टर्ड teliospores के केंद्रापसारक द्वारा गोली मारी हैं ।
  16. पानी की एक छोटी राशि और ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूबों के हस्तांतरण में छर्रों निलंबित ।
  17. 5 मिनट के लिए १,००० x g पर ट्यूबों केंद्रापसारक, और supernatant खिचड़ी भाषा ।
  18. डीएच के लगभग ५० मिलीलीटर में गोली निलंबित2O, 5 मिनट के लिए १,००० x g पर ट्यूबों, और supernatant नहीं कर सकते । धीरे से एक रंग और इसके निपटान के साथ भूरे रंग के शीर्ष परत परिमार्जन । दोहराएं जब तक वहां अब शीर्ष पर एक भूरे रंग की परत है ।
  19. एक वैक्यूम desiccator में रातोंरात नमूने सूखी ।
  20. उपयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर सूखे teliospores स्टोर ।
  21. यदि वांछित, अंकुरित करने के लिए प्रेरित करने से पहले तांबे सल्फेट8 के साथ teliospores का इलाज । यदि इलाज नहीं है, तो नमूना की पुष्टि करने के लिए teliospores की पूरी तरह से सूक्ष्म विश्लेषण प्रदर्शन शुद्ध teliospores का प्रतिनिधित्व करता है और बैक्टीरियल या अन्य संदूषणों से रहित है.
    1. एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में teliospores के लगभग ५० मिलीग्राम बाहर वजन ।
    2. teliospores युक्त १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब के लिए ०.७५% CuSO4 के लगभग १.० मिलीलीटर जोड़ें । पिपेट ऊपर और नीचे CuSO में teliospores को निलंबित करने के लिए4 3 एच के लिए नमूना आंदोलन के बाद समाधान ।
    3. 5 मिनट के लिए २,५०० x g पर नमूना केंद्रापसारक और supernatant निकालें । बाँझ पानी के साथ teliospore गोली reसस्पेंड, केंद्रापसारक को दोहराने, और supernatant को हटा दें ।
    4. दोहराएं चरण 2.21.3 दो बार ।

3. Teliospore व्यवहार्यता और अंकुरण परीक्षण

  1. उनकी व्यवहार्यता और अंकुरण के समय का आकलन करने के लिए १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में लगभग 10 मिलीग्राम मेडिस teliospores का वजन ।
  2. एक सुरक्षा कैबिनेट में, आलू डेक्सट्रोज शोरबा (PDB, 24 जी/एल) streptomycin सल्फेट के साथ पूरक तैयार (१६० µ g/एमएल) ।
  3. PDB के ५०० µ l में teliospores को सस्पेंड कर दीजिये. धीरे पिपेट मिश्रण और teliospores के सभी झुरमुट को तोड़ने के लिए ।
  4. teliospore निलंबन एक autoclaved २५० एमएल Erlenmeyer PDB के 10 मिलीलीटर युक्त कुप्पी के लिए स्थानांतरण ।
  5. 12 के लिए ९० rpm पर मिलाते 28 ° c में कुप्पी की मशीन-16 एच ।
  6. एक सुरक्षा कैबिनेट में, अंकुरित और एक खुर्दबीन स्लाइड तैयार करने के लिए प्रेरित teliospores के एक 20 µ एल नमूना निकालें ।
  7. एक खुर्दबीन का उपयोग, नेत्रहीन अंकुरण कि मौजूद हैं और जीवाणु संक्रमण की उपस्थिति के चरणों का आकलन.
    1. चरणों में teliospores की संख्या गिनती मैं वी के माध्यम से एक hemocytometer का उपयोग और निर्धारित प्रतिशत है कि अंकुरित है ।
    2. अगर केवल मंच मैं teliospores मौजूद हैं, teliospore अंकुरण का आकलन करने से पहले 24 एच की कुल के लिए कुप्पी मशीन जारी रखें । नमूना गैर-व्यवहार्य समझे से पहले ४८ ज की एक अधिकतम के लिए जारी रखने की मशीन ।
    3. बैक्टीरियल संदूषण मौजूद है, तो कनमीसिन सल्फेट (५० µ g/एमएल) के साथ ही streptomycin सल्फेट (१६० µ g/एमएल) के साथ PDB के पूरक और उसके बाद चरण ३.१ के लिए ३.७ दोहराएं । यदि जीवाणु संक्रमण बनी रहती है, तांबे सल्फेट के साथ teliospores का इलाज और ३.१ कदम दोहराने के लिए ३.७ ।

4. श्वसन की निगरानी के लिए अंकुरण की प्रेरण

  1. प्रत्येक श्वसन प्रयोग के लिए teliospores के बराबर राशि (उदा., ५० मिलीग्राम) तौलना ।
  2. एक सुरक्षा कैबिनेट में, एक autoclaved श्वसन कक्ष में teliospores जोड़ें ।
  3. streptomycin सल्फेट (१६० µ जी/एमएल) और कनमीसिन सल्फेट (५० µ g/एमएल) के साथ पूरक PDB (24 जी/एल) के साथ चैंबर भरें ।
  4. पिपेट ऊपर और नीचे एक teliospore निलंबन बनाने के लिए ।
  5. चैंबर में चेंबर के ढक्कन को एयर टाइट सील बनाने के लिए रखें ।

5. ऑक्सीजन की खपत दर (ओसीआर) माप प्राप्त करना

  1. चैंबर रैक में एक पानी के स्नान के अंदर चैंबर प्लेस (28 डिग्री सेल्सियस के लिए पहले से गरम) ।
  2. चैंबर के खुलने के अंदर ओ2 जांच की जगह ।
  3. डेटा "SensorTrace दर" कार्यक्रम पर वास्तविक समय में प्रदर्शित होने के अंक की निगरानी, और जांच को स्थिर (~ 3 मिनट के बाद जांच चैंबर में रखा जाता है) ।
  4. 2 एस अंतराल पर दर्ज माप के साथ 6 एच के लिए लगातार ओ2 स्तरों को मापने के लिए "उपाय" पर क्लिक करें ।
  5. माप बंद करो, और दोहराएं प्रत्येक नमूने के लिए 4.1-5.4 कदम विश्लेषण किया जाना है ।
  6. क्लिक करके डेटा को Microsoft Excel में निर्यात करें "फ़ाइल | निर्यात । . xls के रूप में सहेजें ।

6. डेटा विश्लेषण

  1. ओसीआर की गणना
    1. "Within_Rates" टैब के अंतर्गत निर्यात की गई Excel फ़ाइल में, प्रत्येक कक्ष माप (nmol/h) के लिए "दर" रिकॉर्ड करें ।
    2. प्रत्येक प्रयोगात्मक नमूना के लिए, एक सही ओसीआर मूल्य प्राप्त करने के लिए प्रयोगात्मक नमूना चैंबर के "दर" से खाली चैंबर के "दर" घटाना, और इस संख्या का निरपेक्ष मूल्य ले.
    3. teliospores की मिलीग्राम प्रति कुल ओसीआर द्वारा सही निरपेक्ष ओसीआर मूल्य विभाजित द्वारा प्रयुक्त सेलुलर द्रव्यमान की गणना ।
    4. औसत दोहराने "teliospores के एमजी प्रति ओसीआर" प्रत्येक तनाव के लिए मूल्यों ।
  2. उपयुक्त सांख्यिकीय विधि (उदा., छात्र का t-परीक्षण, प्रसरण का विश्लेषण) का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण Microsoft Excel के अंय सांख्यिकीय सॉफ़्टवेयर का उपयोग कर रहा है ।
  3. कच्चे डेटा ग्राफ करने के लिए, प्रत्येक समय के लिए शेष ऑक्सीजन का प्रतिशत-बिंदु आप ग्राफ के लिए इच्छा की गणना । विभाजित पहले ही द्वारा पढ़ना और १०० द्वारा गुणा (१००% शेष ऑक्सीजन), तो पहले पढ़ने के द्वारा प्रत्येक बाद पढ़ने के विभाजन, और १०० से गुणा करने के लिए चैंबर में शेष ऑक्सीजन का प्रतिशत प्राप्त करते हैं ।

7. अंकुरण के विभिंन चरणों में Teliospores को अलग करने के लिए Teliospore अंकुरण की प्रेरण

  1. PDB (24 जी/एल) streptomycin सल्फेट के साथ पूरक तैयार (१६० µ जी/एमएल) एक सुरक्षा कैबिनेट में ।
  2. प्लेस लगभग 10 U. मेडिस teliospores के मिलीग्राम एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में ।
  3. PDB के ५०० µ l में teliospores को सस्पेंड कर दीजिये. धीरे पिपेट मिश्रण करने के लिए जब तक वहां मध्यम में teliospores के कोई झुरमुट हैं ।
  4. teliospore निलंबन एक autoclaved २५० एमएल Erlenmeyer कुप्पी युक्त PDB streptomycin सल्फेट के साथ पूरक के लिए स्थानांतरण ।
  5. ९० rpm पर मिलाते हुए 28 ° c में रातोंरात कुप्पी की मशीन ।

8. पेट्री डिश और Micromanipulator की तैयारी

  1. microcapillary तैयारी, और नमूना संग्रह के लिए बूंदों की पंक्तियों pipetting द्वारा एक पेट्री डिश (५७ cm2) तैयार करें ।
    1. पिपेट 5 µ l (x4) डीएच2O बूंदें पेट्री डिश के ऊपर भर में ।
    2. पिपेट 2 µ एल (x3) पेट्री डिश पर आरएनए स्थिरीकरण समाधान नमूना संग्रह के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए ।
    3. पिपेट 5 µ l (x30) पेट्री डिश पर अंकुरण teliospores की बूंदें ।
  2. पेट्री डिश के लिए 15 मिलीलीटर खनिज तेल जोड़ें । यह सुनिश्चित करें कि आगे बढ़ने से पहले सभी बूंदें तेल से आच्छादित हों ।
  3. एक 15 µm भीतरी व्यास के साथ एक microcapillary तैयार, 1 मिमी निकला हुआ किनारा, ५५ मिमी लंबाई, और यह microcapillary धारक में रखने और खनिज तेल में यह विलय जहां केशिका कार्रवाई खनिज तेल microcapillary में प्रवेश करने की अनुमति देगा द्वारा एक 20 ° टिप कोण । पानी की छोटी बूंद के लिए लाने से पहले microcapillary में दबाव जारी । महाप्राण को पानी से microcapillary तैयार करना ।

9. चरण-विशिष्ट अंकुरण Teliospores का अलगाव

  1. micromanipulator के नियंत्रणों का उपयोग करके, तैयार microcapillary को अंकुरित बूंदों में से एक पर ले जाएं । छोटी बूंद घुसना, microcapillary कम है, और ब्याज की अंकुरण के स्तर पर एक अंकुरण teliospore के लिए microcapillary के मुंह लाने के लिए ।
  2. धीरे से अंकुरण teliospore को पकड़ने के लिए महाप्राण । Stop aspirating एक बार teliospore ने microcapillary में प्रवेश किया है । दोहराएं जब तक वहां microcapillary में लगभग पांच teliospores हैं ।
  3. micromanipulator के साथ microcapillary उठाएं और आरएनए स्थिरीकरण समाधान के संग्रह छोटी बूंद के लिए इसे लाने के लिए । छोटी बूंद घुसना और छोटी बूंद में teliospores सुई ।
  4. लगभग १,००० teliospores कैप्चर किए गए हैं जब तक चरण ८.१ ८.३ करने के लिए दोहराएँ ।

10. संग्रह छोटी बूंद की वसूली

  1. संग्रह छोटी बूंद ऊपर पिपेट और यह एक RNase/DNase-मुक्त २.० एमएल microcentrifuge ट्यूब के ढक्कन करने के लिए स्थानांतरण । ध्यान से एक पिपेट के साथ खनिज तेल निकालें संग्रह छोटी बूंद परेशान बिना ।
  2. ऐसी आरएनए अलगाव के रूप में बहाव अनुप्रयोगों के लिए teliospores का प्रयोग करें ।

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Representative Results

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क्लार्क प्रकार microrespirometer-teliospore निद्रा और अंकुरण के दौरान श्वसन में परिवर्तन को मापने के आधार पर विधि का उपयोग करना, हम पुष्टि की है कि निष्क्रिय teliospores श्वसन के एक निंन स्तर प्रदर्शन (~ १,०७५ µmol/ teliospores (~ २,६१४ µmol/ चित्र 1a) । यह एक ~ २.४-सुप्त teliospores और teliospores है कि अंकुरित करने के लिए प्रेरित किया गया है के बीच श्वसन की औसत दर में परिवर्तन गुना का प्रतिनिधित्व करता है । इसके अलावा, हम है कि teliospores है कि अंकुरित करने के लिए प्रेरित किया गया है की पहचान की है ऑक्सीजन के रूप में एक ~ ४५ मिनट देरी (चित्र 1b) । इस से संकेत मिलता है ~ 30 मिनट ऑक्सीजन में वृद्धि (आंकड़ा 1b) के अलावा में ~ 15 न्यूनतम अंकुरण की प्रेरण और ऑक्सीजन माप की शुरुआत के बीच देरी. यह एक समय बिंदु की पहचान करता है अंकुरण teliospores कि दिख नहीं बदल रहे है में आणविक परिवर्तन का आकलन शुरू करते हैं ।

अंकुरण के दौरान क्रमिक परिवर्तन microscopically मनाया जा सकता है । अंकुरण के पांच चरण निर्धारित किए गए । मैं अंकुरण के चरण teliospores का प्रतिनिधित्व करता है कि अंकुरित करने के लिए प्रेरित किया गया है, लेकिन सुप्त teliospores से अलग रहना । स्टेज द्वितीय teliospores teliospore के व्यास से कम या बराबर है कि एक लंबाई के साथ एक उभरते promycelium है । स्टेज III teliospores promycelia है कि teliospore व्यास से अधिक कर रहे हैं । अंकुरण का चरण चतुर्थ promycelia से basidiospores का आरंभिक नवोदित है, और स्टेज वी इसके परिणामस्वरूप अगुणित basidiospores हैं जो नवोदित (चित्र 2) द्वारा विभाजित होते हैं । हम विकसित किया है कि microdissection तकनीक का उपयोग करना, हम सफलतापूर्वक आर सी-पीसीआर या आरएनए-Seq (तालिका 1) के लिए शाही सेना अलगाव के रूप में बहाव अनुप्रयोगों के लिए ५०० से १,००० अंकुरण teliospores को अलग किया है. चित्रा 3 microdissection के लिए पेट्री डिश और एक micromanipulator का उपयोग microdissection के लिए कदम के सामांय सेट से पता चलता है ।

Figure 1
चित्रा 1: teliospore अंकुरण के दौरान ऑक्सीजन की खपत का समय पाठ्यक्रम । सुप् teliospores अंकुरित करने के लिए प्रेरित किया गया, और ऑक्सीजन का स्तर लगातार 6 एच के लिए दर्ज किया गया एक क्लार्क प्रकार microrespirometer का उपयोग कर । संयुक्त राष्ट्र प्रेरित निष्क्रिय teliospores एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया है, और सभी माप एक खाली नमूना के लिए सामान्यीकृत थे । (A) डेटा को औसत ओसीआर के रूप में दर्शाया गया । (ख) कच्चा डेटा श्वसन curves प्राप्त करने के लिए साजिश रची, समय पाठ्यक्रम के दौरान ओसीआर में परिवर्तन का पता लगाने की अनुमति । Teliospores है कि अंकुरित करने के लिए प्रेरित किया गया है एक औसत दर २.४-गुना तेजी से संयुक्त राष्ट्र प्रेरित निष्क्रिय Teliospores (पी < 0.01 की तुलना में ऑक्सीजन का उपभोग; छात्र का t-परीक्षण) । सुअर: अंकुरण के बाद प्रेरण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: teliospore अंकुरण के चरण. teliospore अंकुरण के वी के माध्यम से मैं चरणों सचित्र है (ए-ई)। स्केल बार = 20 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: Microdissection के अंकुरण teliospores के विभिंन रूपात्मक चरणों को अलग करने के लिए सामान्य microdissection के लिए एक पेट्री डिश की स्थापना की और चरण III पर teliospore को अलग करने के लिए कदम अंकुरण के सचित्र हैं । (क) या तो बाँझ पानी, आरएनए स्थिरीकरण समाधान, या अंकुरण teliospores युक्त बूंदों की पंक्तियों के साथ स्थापित एक पेट्री पकवान का चित्रण । अंकुरण प्रेरण के बाद, teliospores microdissection का उपयोग करते हुए अंकुरण के विशिष्ट चरणों में पृथक किए गए थे । (ख) मैं III के माध्यम से चरणों में teliospores अंकुरित करने के लिए प्रेरित युक्त एक अंकुरण छोटी बूंद । (ग) एक तैयार microcapillary को आकांक्षा के माध्यम से संग्रह के लिए एक चरण III teliospore तक लाया गया था. (D) एक ग् microcapillary में स् टेज III teliospore को अंकुरण की छोटी बूंद से निकाला जाता है और एक संग्रह छोटी बूंद में ले जाया जाता है । (ङ) microcapillary आरएनए स्थिरीकरण समाधान युक्त संग्रह छोटी बूंद में डाला गया था और चरण III teliospore छोटी बूंद में इंजेक्ट किया गया था । (च) आरएनए स्थिरीकरण समाधान में चरण III teliospores का एक संग्रह. स्केल बार = 20 µm (A-D, F) और ५० µm (E) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

अंकुरण अवस्था अलग teliospores अंकुरण की संख्या
स्टेज मैं १,०००
द्वितीय चरण ५००
स्टेज III ६५०

तालिका 1: किसी मानक आइसोलेशन प्रयोग में प्रत्येक अंकुरण चरण के लिए सफलतापूर्वक पृथक की गई teliospores की संख्या. तालिका teliospores की औसत संख्या है कि अलग किया गया है चरणों के लिए microdissection का उपयोग कर मैं बहाव अनुप्रयोगों के लिए संग्रह से पहले III के माध्यम से दिखाता है ।

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Discussion

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Basidiomycete biotrophic संयंत्र रोगजनकों प्रतिवर्ष फसल नुकसान में अरबों डॉलर का कारण है । इन रोगजनकों के विशाल बहुमत teliospores है कि कवक dispersing और यौन प्रजनन के लिए अभिंन अंग है उत्पादन । विकास और teliospores के अंकुरण का ज्ञान प्राप्त विनाशकारी इन कवक के कारण रोगों के प्रसार को समझने के लिए महत्वपूर्ण है । आदेश में महत्वपूर्ण नियंत्रण बिंदुओं पर आणविक परिवर्तन की पहचान करने के लिए हम एक विधि के लिए शारीरिक बदलाव के समय की पहचान और दूसरे को अंकुरण के विभिंन चरणों में teliospores अलग तैयार की है । सेतो एट अल. (अप्रकाशित) प्रकाश माइक्रोस्कोपी (चित्रा 2) द्वारा teliospore अंकुरण की पांच चरणों का उल्लेख किया. मैं चरण के दौरान शारीरिक सक्रियण की जांच करने के लिए और अंकुरण के दौरान श्वसन दर का आकलन करने के लिए, हम ठीक ऑक्सीजन की खपत में परिवर्तन को मापने के लिए एक क्लार्क प्रकार microrespirometer इस्तेमाल किया । हमारे नमूना डेटा संकेत मिलता है कि हमारी विधि सटीक और अत्यधिक reproducible है । हमारे निष्कर्षों की पुष्टि करें कि अंकुरण यू मेडिस teliospores संयुक्त राष्ट्र प्रेरित निष्क्रिय teliospores की तुलना में सेलुलर श्वसन में एक भारी वृद्धि का प्रदर्शन । पहली बार के लिए, हम की पहचान की है कि U. मेडिस teliospores कि प्रदर्शन अंकुरित करने के लिए प्रेरित किया गया है ~ ऑक्सीजन में ४५ मिनट की देरी । यह पता चलता है कि U. मेडिस teliospores कुछ समय के लिए अंकुरण संकेतों को संसाधित करने की आवश्यकता हो सकती है (उदा., उत्तर देने से पहले शर्करा की उपस्थिति), कि वृद्धि की ऑक्सीजन के लिए बहुत तत्काल प्रतिक्रियाओं में अंकुरण संकेतों के बीच नहीं है या कि हमारी परख के लिए पर्याप्त संवेदनशील प्रारंभिक ऑक्सीजन में परिवर्तन का पता लगाने के ंयूनतम नहीं था ।

पिछले मैल teliospores के श्वसन दर की जांच अध्ययन3 एक Warburg कुप्पी उपकरण पर भरोसा करने के लिए ऑक्सीजन के स्तर को मापने के लिए5manometrically । संक्षेप में, इस विधि manometer हाथ में द्रव स्तर परिवर्तन के प्रत्यक्ष अवलोकन के माध्यम से एक संलग्न कुप्पी में दबाव में परिवर्तन का पता लगाने के द्वारा ऑक्सीजन की खपत और सह2 उत्पादन के उपाय । प्रयोगों को स्थापित करने के लिए मुश्किल हो सकता है, और माप गलत हो सकता है । उपकरण माप की अवधि के दौरान भाग लिया जाना चाहिए और, व्यापक गणना ओसीआर अनुमान करने के लिए आवश्यक हैं. हमारे प्रोटोकॉल तकनीकी विकास का उपयोग करता है, उपयोगकर्ता के लिए आवश्यकता को नष्ट करने के प्रयोग की अवधि के लिए उपकरण द्वारा रहने के लिए, आंख से माप ले, और व्यापक गणितीय फार्मूले का उपयोग करें । दूसरों को जल्दी क्लार्क का इस्तेमाल किया है-प्रकार respirometers Neurospora crassaके ओसीआर को मापने के लिए9 और Botryodpilodia theobromae10 बीजाणु, तथापि, इन प्रारंभिक उपकरणों की एक अधिकतम के लिए सतत माप की अनुमति दी 20 मिनट । इस सीमा की पहचान की अनुमति नहीं होगी ~ ४५ ंयूनतम ऑक्सीजन में देरी हम नए मॉडल आत्मशोधन के साथ मनाया । हमारे प्रोटोकॉल डेटा व्याख्या सरल बना दिया है, के रूप में readout चैंबर, जो सीधे किसी भी गणना या डेटा हेरफेर के बिना रेखांकन किया जा सकता है में शेष ऑक्सीजन की एकाग्रता है । इसके अलावा, यह समय की एक अनिश्चित राशि के लिए निरंतर माप (हर 2 एस) लेने के लिए संभव है जब तक उपलब्ध ऑक्सीजन पूरी तरह से समाप्त हो गया है । यह समय की एक लंबी अवधि में श्वसन में छोटे परिवर्तन की पहचान की अनुमति देता है । इसलिए, हम पहले तकनीकों पर सुधार हुआ है और कवक बीजाणुओं की ऑक्सीजन की खपत को मापने के लिए एक सरल, सटीक और reproducible विधि विकसित की है । हमारे ज्ञान के लिए, यह पहला अध्ययन करने के लिए एक आधुनिक क्लार्क-प्रकार आत्मशोधन का उपयोग करने के लिए मैल कवक के अंकुरित teliospores बनाम निष्क्रियता के श्वसन अध्ययन है ।

इस प्रोटोकॉल की आसानी और सादगी के बावजूद, अनुकूलन की आवश्यकता है और वहां जैविक वास्तविकताओं है कि विश्लेषण सीमित हैं । सबसे पहले, उचित नमूना आकार उचित OCRs प्राप्त करने के लिए पहचाना जाना चाहिए । बहुत अधिक नमूना ऑक्सीजन के स्तर के समय से पहले दुर्घटनाग्रस्त करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, और बहुत कम नमूना ऑक्सीजन की खपत में सार्थक परिवर्तन का पालन करने में असमर्थता में परिणाम कर सकते हैं । दूसरा, यह जांच समय (~ 3 मिनट) को स्थिर करने के लिए सटीक प्रारंभिक डेटा प्रदान करने की अनुमति अनिवार्य है । अंत में, यह जीवाणुरोधी एजेंटों के साथ अंकुरण मध्यम पूरक करने के लिए महत्वपूर्ण है (उदा, streptomycin सल्फेट) जीवाणु संक्रमण सुनिश्चित करने के लिए ओसीआर रीडिंग बदल नहीं करता है. हम का सामना करना पड़ा जैविक सीमाओं माप के समय पाठ्यक्रम पर एक कम अंकुरण दर थे, (~ 1%) के रूप में दृश्य रूपात्मक परिवर्तन देख कर निर्धारित किया है । बीजाणु व्यवहार्यता का निर्धारण इस दर निर्धारण बीजाणु संख्या प्रति एक दर में परिवर्तित और अंकुरण की उच्च दर के साथ अलग teliospores उच्च OCRs के लिए नेतृत्व करेंगे की अनुमति होगी । U. मेडिस teliospores11 के एसिंक्रोनस अंकुरण एक वास्तविकता है जो के लिए जवाबदेह होना चाहिए और अंकुरण में पहले ऑक्सीजन की खपत का पता लगाने के लिए अक्षमता के लिए योगदान कर सकते हैं ।

आदेश में सटीकता और teliospore श्वसन में परिवर्तन को मापने की परिशुद्धता में सुधार करने के लिए, इस पद्धति के लिए भविष्य के रूपांतरों एक एकल सेल आधार पर ओसीआर को मापने शामिल हो सकता है । Micromanipulation तकनीक एक एकल teliospore, जो तब अंकुरित करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और अपनी श्वसन दर पर नजर रखी जा सकता है । यह संकल्प सुधार सकता है, निद्रा के दौरान ओसीआर के बारे में जानकारी प्रदान-अंकुरण पाली प्रति teliospore, बजाय teliospores के प्रति मिलीग्राम. इसके अलावा, यह अतुल्यकालिक अंकुरण की समस्या को हल करेगा ।

अंकुरण के बाद के चरणों के लिए, हम अंकुरण के सामान्य चरणों में teliospores को अलग करने के लिए एक micromanipulation विधि विकसित की है । यह विश्लेषण के लिए अपेक्षाकृत तुल्यकालिक teliospore आबादी के निर्माण की अनुमति दी । एकल सूक्ष्मजीवों को अलग करने के लिए विभिंन तरीकों का वर्णन किया गया है और पर वर्षों में सुधार किया गया है12। इन विधियों में से एक सूक्ष्मजीवों, अर्द्ध यांत्रिक तरीके बीजाणुओं कि संवर्धन के लिए मध्यम करने के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं, और यांत्रिक तरीकों जो micromanipulators का उपयोग प्राप्त करने के लिए microcapillaries के उपयोग के साथ प्राप्त करने के लिए बीजाणु निलंबन के कमजोर पड़ने शामिल . पिछले तरीकों कि हम अंकुरण के एक ही चरण में teliospores प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया counterflow केंद्रापसारक elutriation और एक विशिष्ट ताकना आकार के साथ एक नायलॉन झिल्ली के माध्यम से teliospores उगना फ़िल्टरिंग शामिल हैं । इन तरीकों का उपयोग हमें अंकुरण teliospores के लिए समृद्ध करने की अनुमति दी, तथापि, हमारे नमूनों अभी भी अंकुरण के विभिन्न चरणों में teliospores निहित13. एकल सूक्ष्मजीवों के micromanipulation के लिए वर्तमान प्रौद्योगिकी केशिका सुई, आकांक्षा, और सूक्ष्मजीवों के हस्तांतरण के ठीक नियंत्रण के लिए उच्च आवर्धन और उपकरणों की शुरूआत के साथ सुधार हुआ है । पिछले micromanipulation तकनीक संवर्धन के लिए या एकल सेल पीसीआर आवेदन14में उपयोग के लिए एकल कोशिकाओं को अलग करने पर ध्यान केंद्रित किया है । एकल कवक बीजाणुओं को अलग करने के लिए micromanipulators का उपयोग पहले से स्थापित नहीं किया गया है । एकल कवक बीजाणुओं को अलग करने के लिए पिछली विधि में ठीक संदंश या सुइयों के प्रयोग को शामिल कर ठोस माध्यम के छोटे टुकड़ों को चुनना होता है जिसमें अंकुरित जीवाणु15होते हैं । micromanipulators के उपयोग के साथ Micromanipulation व्यापक रूप से खमीर अध्ययन में प्रयोग किया जाता है जहां ascospores के समूहों meiotic आनुवंशिक विश्लेषण के लिए आगर माध्यम पर संस्कृति में sporulation के बाद अलग किया जा सकता है16। हम एक विधि है जो बैक्टीरियल कोशिकाओं के लिए micromanipulation तकनीक को जोड़ती है14 विकसित की है और इन विट्रो में अंकुरण teliospores अलग करने के लिए निषेचन विधियों । हमें पता चला है कि सैकड़ों आम अंकुरण चरण teliospores इस तकनीक के साथ प्राप्त किया जा सकता है । इन नमूनों को अनुप्रवाह अभिव्यक्ति अध्ययनों के लिए उपयोग किया जा सकता है जैसे RT-qPCR या आरएनए-seq जैसी तकनीकों का उपयोग करना. teliospores की जनसंख्या प्राप्त करना जिसमें अंकुरण सिंक्रनाइज़ किया जाता है, उस दौरान घटित होने वाले जीन व्यंजक में विशिष्ट परिवर्तनों के विश्लेषण की अनुमति देता है teliospore अंकुरण के प्रारंभिक, मध्य और बाद के चरणों ।

Microdissection की अवस्था विशिष्ट अंकुरण teliospores की स्थापना और अंकुरण के विभिन्न चरणों को पहचानने में अनुभव की आवश्यकता हो सकती है, तथापि, इस अनुभव को शीघ्रता से अभ्यास के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है । वहां कई कदम है कि सफल आरएनए अलगाव के बाद microdissection के लिए पीछा किया जाना चाहिए रहे हैं । अंकुरण teliospores के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उगना के संग्रह के दौरान शुरू किया जाता है जब जीवाणु संक्रमण के विकास को दबाने के लिए सबसे पहले, अंकुरण मध्यम एंटीबायोटिक दवाओं (eg, streptomycin सल्फेट) के साथ पूरक होना चाहिए । दूसरा, यह स्थिर और अलगाव के लिए आरएनए की रक्षा के लिए एक स्थिरीकरण समाधान का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है । आरएनए स्थिरीकरण समाधान अतिरिक्त teliospores एकत्रित करते समय अगले अंकुरण चरण में प्रगति करने से एकत्र teliospores को भी रोकता है । तीसरा, यह महत्वपूर्ण है खनिज तेल निकालने के लिए एक बार संग्रह छोटी बूंद को सफल आरएनए निष्कर्षण सुनिश्चित करने के लिए बरामद किया गया है । अंत में, हम आरएनए गुणवत्ता के कुछ नुकसान देखा है अगर अलग teliospores समय की एक विस्तारित अवधि के लिए आरएनए स्थिरीकरण समाधान में जमा हो जाती है; इसलिए, यह आरएनए तुरंत अंकुरण मंच विशिष्ट teliospores के बाद संग्रह अलग है कि सिफारिश की है । विधि की एक सीमा है कि मैं मंच एकत्र teliospores निष्क्रिय हो सकता है, मृत, और teliospores अंकुरित करने के रूप में इन तीन चरणों आकृति विज्ञान है । इसके अलावा, जब चरण III teliospores, अर्धसूत्रीविभाजन मैं या अर्धसूत्रीविभाजन द्वितीय में teliospores का एक मिश्रण का संग्रह प्राप्त किया जा सकता है । एक तरह से वास्तव में निष्क्रिय और मृत teliospores के बीच भेद में सहायता के लिए नमूना की व्यवहार्यता निर्धारित हो सकता है । कवक बीजाणु व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए एक विधि लाइव/मृत कोशिका व्यवहार्यता परख का उपयोग करने के लिए व्यवहार्य teliospores के प्रतिशत का आकलन करने में सक्षम हो सकता है जिसमें से अधिक जानकारीपूर्ण अंकुरण दर17निर्धारित किया जा सकता है । इसके अलावा, नाभिक DAPI के साथ धुंधला, उदाहरण के लिए, अर्धसूत्रीविभाजन की घटनाओं कल्पना है कि चरण iii के दौरान हो रही है और चरण चतुर्थ में संक्रमण के क्रम में आगे चरण iii में teliospores आकृति विज्ञान विशेषताएं करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यह अंकुरण के केवल एक चरण में teliospores के संग्रह में सहायता जब हमारे microdissection विधि का उपयोग करेंगे ।

अंत में, हमने सेलुलर श्वसन में परिवर्तन को मापने का एक सरल, सटीक और reproducible विधि विकसित की है जो कि Ustilago मेडिस teliospores के निद्रा-अंकुरण बदलाव के दौरान होती है । इसके अतिरिक्त, हमने अंकुरण teliospores के विशिष्ट चरणों को एकत्रित करने के लिए एक विधि विकसित की है जिसका उपयोग नीचे के अनुप्रयोगों, जैसे आरएनए-seq के लिए किया जा सकता है । हमारे तरीकों को विभिंन कोशिका प्रकार और प्रजातियों को समायोजित अनुकूलित किया जा सकता है । हमें आशा है कि हमारी तकनीक में सुधार एक एकल बीजाणु स्तर पर श्वसन परिवर्तन का पता लगाने के साथ ही आगे की घटनाओं है कि अंकुरण के बाद के चरणों में होने वाली है परिभाषित करने की सुविधा होगी ।

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Disclosures

लेखकों कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों या हित के अंय संघर्ष का खुलासा किया है ।

Acknowledgments

हम अपने microrespirometer के उपयोग के लिए डॉ पॉल फ्रॉस्ट शुक्रिया अदा करना चाहूंगा, और निकोल Wagner और एलेक्स बेल तकनीकी सहायता के लिए । यह काम एक NSERC अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था B.J.S.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Streptomycin Sulfate BioShop STP101
Kanamycin Sulfate BioShop KAN201
Potato Dextrose Broth BD Difco 254920
1 L Waring Laboratory blender Waring 7011S
Cheesecloth VWR 470150-438
Nalgene Polypropylene Desiccator with Stopcock ThermoFisher Scientific 5310-0250
Unisense MicroRespiration system
MicroRespiration Sensor (O2) Unisense OX10
MicroOptode Meter Amplifier Unisense N/A
MR-Ch Small Unisense MR-Ch
SensorTrace Rate Software Unisense N/A
MicroRespiration Rack Unisense MR2-Rack
MicroRespiration Stirrer Unisense MR2-Co
Microdissection system
Axio Vert.A1 Inverted Light Microscope Zeiss
Coarse Manipulator Narishige MMN-1
Three-axis Hanging Joystick Oil Hydraulic Micromanipulator Narishige MMO-202ND
Pneumatic Microinjector Narishige IM-11-2
TransferTip (ES) Eppendorf 5175107004

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References

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Microrespiration विश्लेषण और Microdissection का उपयोग कर Teliospore अंकुरण की जांच
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Cite this Article

Ostrowski, L. A., Seto, A. M., Saville, B. Investigating Teliospore Germination Using Microrespiration Analysis and Microdissection. J. Vis. Exp. (135), e57628, doi:10.3791/57628 (2018).More

Ostrowski, L. A., Seto, A. M., Saville, B. Investigating Teliospore Germination Using Microrespiration Analysis and Microdissection. J. Vis. Exp. (135), e57628, doi:10.3791/57628 (2018).

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