Microrespiration विश्लेषण और Microdissection का उपयोग कर Teliospore अंकुरण की जांच
Summary
मैल कवक कई विनाशकारी कृषि रोगों के कारण । वे निष्क्रिय teliospores के रूप में फैलाया जाता है कि पर्यावरण cues के जवाब में उगना । हम दो विधियों अंकुरण के दौरान आणविक परिवर्तन की जांच करने के लिए रूपरेखा: चयापचय सक्रियण का पता लगाने और अलग रूपात्मक चरणों में teliospores अलग करके आणविक घटनाओं को बदलने का आकलन करने के लिए श्वसन वृद्धि को मापने.
Abstract
मैल कवक कई विनाशकारी कृषि रोगों के etiological एजेंट हैं । वे teliospores के उत्पादन की विशेषता है, जो मोटी दीवारों dispersing एजेंटों रहे हैं । Teliospores दशकों के लिए निष्क्रिय रह सकते हैं । निद्रा कम चयापचय दर की विशेषता है, रुका हुआ macromolecular का संश्लेषण और श्वसन के बहुत कम स्तर. आवश्यक पर्यावरणीय संकेतों को प्राप्त करने पर, teliospores अगुणित कोशिकाओं का उत्पादन करने के लिए उगना, जो संक्रमण के नए दौर शुरू कर सकते हैं । Teliospore अंकुरण macromolecular की बहाली की विशेषता है-संश्लेषण, वृद्धि की संवेदनाएं और नाटकीय रूपात्मक परिवर्तन । आदेश में ठीक अंकुरण के प्रारंभिक दौर के दौरान सेलुलर श्वसन में परिवर्तन को मापने के लिए, हम एक सरल एक क्लार्क-प्रकार आत्मशोधन रोजगार प्रोटोकॉल विकसित किया है । अंकुरण के बाद के चरणों विशिष्ट रूपात्मक परिवर्तन द्वारा प्रतिष्ठित हैं, लेकिन अंकुरण एसिंक्रोनस है । हम एक microdissection तकनीक है कि हमें अलग अंकुरण चरणों में teliospores इकट्ठा करने में सक्षम बनाता है विकसित की है ।
Introduction
मैल कवक (Ustilaginales) पर १,६०० प्रजातियों से मिलकर बनता है कि मकई, जौ, और गेहूं की महत्वपूर्ण अनाज फसलों सहित घास को संक्रमित, फसल घाटे में अरबों डॉलर प्रतिवर्ष के कारण1। इन कवक teliospores, जो अंधेरे pigmented सेल दीवारों है और dispersing एजेंटों के उत्पादन की विशेषता है । Teliospores समारोह मेजबान संयंत्रों के बीच dispersing के तनाव के दौरान आनुवंशिक सामग्री को ढाल, और साल के लिए एक निष्क्रिय राज्य में बनी रह सकते है2। जैसे, teliospores रोग प्रसार का एक आवश्यक घटक हैं ।
आदेश में teliospore जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए, हमारी प्रयोगशाला मॉडल मैल कवक Ustilago मेडिस (यू. मेडिस) है, जो ‘ मकई के आम मैल ‘ रोग के कारण एजेंट है का उपयोग करता है । परिपक्व U. मेडिस teliospores विकास की गिरफ्तारी की विशेषता है, कम सेलुलर चयापचय, और सेलुलर श्वसन3के निंन स्तर । अनुकूल पर्यावरणीय परिस्थितियों में (उदा., विशिष्ट शर्करा की उपस्थिति), मेडिस teliospores उगना और पूर्ण अर्धसूत्रीविभाजन, basidiospores उत्पादन जो संक्रमण के नए दौर शुरू कर सकते हैं । अंकुरण वृद्धि श्वसन, चयापचय गतिविधि के लिए वापसी, और अंकुरण की चौकसी रूपात्मक चरणों के माध्यम से प्रगति4की विशेषता है ।
अंकुरण के आरंभिक चरण में वृद्धि श्वसन और चयापचय समारोह भी शामिल है, हालांकि, वहां परिवर्तन के कोई रूपात्मक संकेत हैं । मेडिस में श्वसन परिवर्तन के मूल माप ५० साल पहले से अधिक किए गए थे, एक Warburg कुप्पी उपकरण5के साथ ऑक्सीजन की खपत manometrically को मापने । हम एक क्लार्क प्रकार microrespirometer का उपयोग कर अंकुरण के एक समय पाठ्यक्रम पर ऑक्सीजन की खपत को मापने के द्वारा teliospore अंकुरण के दौरान श्वसन में सटीक परिवर्तन का अध्ययन करने की एक नई, सरल विधि विकसित की है । हम पहले इस पद्धति का इस्तेमाल किया जंगली प्रकार के बीच श्वसन दर में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए मेडिस अगुणित कोशिकाओं और दोषपूर्ण mitochondria के साथ म्यूटेंट6, और प्रोटोकॉल यहां अनुकूलित किया है के दौरान teliospore श्वसन में परिवर्तन अध्ययन करने के लिए अंकुरण. यह श्वसन परिवर्तन के समय को सही ढंग से पहचानने का एक साधन प्रदान करता है ताकि हम शीघ्र आणविक घटनाओं की जाँच के लिए अंकुरण की दीक्षा के बाद उपयुक्त समय पर teliospores को लक्षित कर सकें. अंकुरण की प्रगति teliospore से promycelia उभर एक बार microscopically का पालन किया जा सकता है, लेकिन अतुल्यकालिक प्रकृति जांच के लिए एक दिया मंच पर पर्याप्त teliospores के अलगाव बाधा । हम एक microdissection तकनीक विकसित उन विट्रो में निषेचन के लिए शारीरिक रूप से अंकुरण के अलग रूपात्मक चरणों में teliospores इकट्ठा करने के लिए इसी तरह के लिए इस्तेमाल किया ।
Protocol
Representative Results
Discussion
Basidiomycete biotrophic संयंत्र रोगजनकों प्रतिवर्ष फसल नुकसान में अरबों डॉलर का कारण है । इन रोगजनकों के विशाल बहुमत teliospores है कि कवक dispersing और यौन प्रजनन के लिए अभिंन अंग है उत्पादन । विकास और teliospores के अंकुरण का ज्ञान प्रा?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम अपने microrespirometer के उपयोग के लिए डॉ पॉल फ्रॉस्ट शुक्रिया अदा करना चाहूंगा, और निकोल Wagner और एलेक्स बेल तकनीकी सहायता के लिए । यह काम एक NSERC अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था B.J.S.
Materials
| Streptomycin Sulfate | BioShop | STP101 | |
| Kanamycin Sulfate | BioShop | KAN201 | |
| Potato Dextrose Broth | BD Difco | 254920 | |
| 1 L Waring Laboratory blender | Waring | 7011S | |
| Cheesecloth | VWR | 470150-438 | |
| Nalgene Polypropylene Desiccator with Stopcock | ThermoFisher Scientific | 5310-0250 | |
| Unisense MicroRespiration system | |||
| MicroRespiration Sensor (O2) | Unisense | OX10 | |
| MicroOptode Meter Amplifier | Unisense | N/A | |
| MR-Ch Small | Unisense | MR-Ch | |
| SensorTrace Rate Software | Unisense | N/A | |
| MicroRespiration Rack | Unisense | MR2-Rack | |
| MicroRespiration Stirrer | Unisense | MR2-Co | |
| Microdissection system | |||
| Axio Vert.A1 Inverted Light Microscope | Zeiss | ||
| Coarse Manipulator | Narishige | MMN-1 | |
| Three-axis Hanging Joystick Oil Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MMO-202ND | |
| Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-11-2 | |
| TransferTip (ES) | Eppendorf | 5175107004 |
References
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