وهنا يصف لنا عزل الخلايا المعوية الدبقية من الأمعاء سوبموكوسا استخدام متسلسلة يدتا إينكوبيشنز يخلب الكاتيونات ديفالينت والحضانة في الخلية غير الانزيمية حل الاسترداد ثم. تصفيح تعليق الخلية الناتجة في بولي-د-يسين و laminin النتائج في ثقافة مخصب بدرجة عالية من الخلايا الدبقية سوبموكوسال للتحليل الوظيفي.
الجهاز العصبي المعوي (ENS) يتكون من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية المعوي (اجكس) الموجودة داخل الجدار العضلات الملساء وسوبموكوسا وبروبريا الصفيحة. اجكس تلعب أدواراً هامة في التوازن الغريزي عن طريق الإفراج عن مختلف العوامل التغذوية، ويسهم في سلامة الحاجز الظهارية. معظم الدراسات الأولية الثقافات الدبقية المعوي استخدام الخلايا المعزولة من الضفيرة myenteric بعد الانفصال الانزيمية. هنا، يتم وصف أسلوب غير الانزيمية لعزل والثقافة اجكس من سوبموكوسا المعوية والصفيحة بروبريا. بعد الإزالة اليدوية لطبقة العضلات الطولية، تم تحرير اجكس من الصفيحة بروبريا وسوبموكوسا باستخدام إينكوبيشنز يدتا مخزنة حبيس متسلسلة تليها الحضانة في حل الاسترداد المتوفرة تجارياً الخلية غير الانزيمية. إينكوبيشنز يدتا كانت كافية لتجريد معظم المخاطية الظهارية من بروبريا الصفيحة، مما يتيح حل الاسترداد خلية لتحرير اجكس submucosal. تم تجاهل أي بقايا الصفيحة بروبريا والعضلات الملساء جنبا إلى جنب مع إطلاق مينتيريك. وحددت اجكس بسهولة بقدرتها على التعبير عن البروتين حمضية فيبريلاري الدبقية (توصيني). فقط حوالي 50% تعليق خلية الواردة توصيني + الخلايا بعد إكمال إينكوبيشنز الأنسجة وقبل الطلاء على الركازة بولي-د-يسين/لامينين. ومع ذلك، بعد 3 أيام من استزراع الخلايا في معامل نيوروتروفيك المستمدة من الخلايا الدبقية (جدنف)-التي تحتوي على وسائط الثقافة، السكان خلية التمسك بلوحات المغلفة بالركيزة تتألف من > إطلاق المعوي 95%. قمنا بإنشاء خط الفأر هجين بتربية ماوس هجفاب-لجنة المساواة العرقية إلى خط مراسل تدتوماتو روزا لتعقب النسبة المئوية توصيني + الخلايا باستخدام صف الخلية الذاتية. وهكذا، يمكن عزلة بواسطة أساليب غير الانزيمية إطلاق المعوية غير مينتيريك ومثقف لمدة 5 أيام على الأقل.
الفائدة في وظيفة الخلايا الدبقية المعوي (اجكس) يزداد باطراد بسبب أدوارها المعترف بها في القناة الهضمية النزاهة والتوازن1،2. وباﻹضافة إلى ذلك، اجكس تختلف باختلاف مواقعها على طول غي المسالك3،4. اجكس الإفراج عن مختلف العوامل التغذوية، بما في ذلك عامل نيوروتروفيك المستمدة من الخلايا الدبقية (جدنف)، والمساهمة في القناة الهضمية حركية1،5 والرد على تركات الميكروبية6،7. وقد بينت الدراسات أن السكان الغانية غير متجانسة وأن وظيفتها تختلف تبعاً لما إذا كانت هي سوبموكوسال أو الموجودة ضمن ال1،الضفيرة مينتيريك7. على سبيل المثال، تسهم اجكس داخل سوبموكوسا تقاطعات ضيق8. وربطت التفاضلية التعبير توصيني والفسفره في اجكس لمرض باركنسون، مما يوحي باحتمال وجود صلة للنمط الظاهري القناة الهضمية من هذا الاضطراب9. في الآونة الأخيرة، لوحظ أن فقدان مينين البروتين النووي في ثقافات منعزلة من اجكس من سوبموكوسا المعوية الدانية كافية للحث على التعبير عن هرمون جاسترين10. كنتيجة لذلك، اقترح أن اجكس قد يكون منشأ الإثناعشرية gastrinomas، نوع من ورم الغدد الصم العصبية10. جماعياً، وهذه الأمثلة تؤكد أهمية دراسة السلوك ووظيفة اجكس معزولة في اضطرابات الأعصاب والسرطان11.
ويظل التحدي هو في المجال كيفية عزل ودراسة أحد أو كلا الغانية السكان في المختبر. النسب تتبع التجارب أثبتت أن اجكس في سوبموكوسا والصفيحة بروبريا تنشأ من خلايا السلف في ضفيرة مينتيريك7. على الرغم من أن هناك عدة بروتوكولات العزلة المنشورة المتاحة لتوليد ثقافات myenteric اجكس12،13،،من1415،،من1617، 18،19، لا تستهدف على وجه التحديد عزلة السكان الغانية بروبريا submucosal/الصفيحة. على وجه التحديد استخدام البروتوكولات القائمة لعزل الغانية مزيجاً من فصل الميكانيكية أو ميكروديسيكشن للعضلات الملساء جنبا إلى جنب مع تفكك الانزيمية، في نهاية المطاف التخلص من طبقة الخلايا المخاطية.
والهدف من هذه المخطوطة إظهار الخطوات لعزل غير انزيماتيكالي اجكس الأولية من بروبريا الصفيحة للدراسات في المختبر . نظراً لوجود لا علامات على وجه التحديد التمييز بين اجكس myenteric من تلك الموجودة في سوبموكوسا، استغلت الفصل المكاني بين المخاطية الظهارية من العضلات الملساء لعزل اجكس submucosal. وبالإضافة إلى ذلك، عن طريق الجمع بين أدتا استخلاب مع الانفصال غير الانزيمية، عزلت اجكس عن submucosa خلافا للعضلات الملساء، قد تم تجاهلها جنبا إلى جنب مع اجكس myenteric جملة المرتبطة بها. حدث آخر فصل سوبموكوسا واجكس بروبريا الصفيحة باستزراع الخلايا على ركائز الصديقة للخلية الدبقية، مثلاً، بولي-د-يسين ولامينين.
اجكس تلعب أدواراً هامة في التوازن القناة الهضمية، ومن الضروري أن عزل ودراستها في المختبر. في هذا البروتوكول، قدم طريقة بسيطة لعزل اجكس من بروبريا الصفيحة الأمعاء الماوس الكبار لدراسة وظيفة الدبقية المعوي.
إزالة مساريق ملتصقة ولممب مع مسحه القطن يزيل بعض من إطلاق إنتر-…
The authors have nothing to disclose.
الكتاب أتمنى أن نعترف بدعم من DK045729 R37 (إلى جلم)، AR060837 R01 (إلى HX) وجامعة ميشيغان الجهاز الهضمي بحوث مركز الجزيئية الأساسية P30 DK034933.
Poly-D lysine (1 mg/ml stock) | Sigma | A-003-E | Dilute 1:10 |
Laminin (0.5 mg/ml stock) | Sigma | L4544 | Dilute to 10 µg/mL on ICE |
EDTA (0.5M) | Lonza | 51201 | Dilute 1:100 in DPBS |
HEPES (1 M) | Corning | 36216004 | Dilute 1:100 in DPBS |
Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | HyClone | SH30028.02 | |
DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
Penicillin-Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140-122 | |
Gentamicin (50mg/mL stock) | Life Technologies | 15750060 | |
GDNF (10 µg stock) | Sigma | SRP3200 | |
L-Glutamine (200 mM stock) | Life Technologies | 25030-081 | |
Chicken anti-GFAP | Thermo Fisher Scientific | PA1-10004 | |
Goat anti-a-Smooth Muscle Actin | Abcam | ab112022 | |
Mouse anti-Pgp9.5 | Novus Biologicals | NB600-1160 | |
Goat anti-E-cadherin | R&D Systems | AF748 | |
Rabbit S100 | Abcam | ab34686 | |
Mouse p75 NTR | Millipore | MAB5592 | |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Chicken IgY | Invitrogen | A-11039 | |
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG | Invitrogen | A-11055 | |
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11004 | |
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | R-37119 | |
Prolong Gold antifade Reagent with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
Fungizone (Amphotericin B) 250 µg/ml | Life Technologies | 15290-018 | |
L-Fura-2-AM | Invitrogen | F-14201 | |
CCK peptide | Anaspec, Fremont, CA | AS-20741 | |
Gastrin peptide (Gastrin-17) | Abbiotec, Bloomington, IN | 350188 | |
Nylon Mesh Celll Strainer (100 µm) | Fisher Scientific | 22363549 | |
Nylon Mesh Celll Strainer (40 µm) | Fisher Scientific | 22363547 | |
Disposable Serologic Pipet 5 ml | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Life Technologies | 25200-056 |