Summary
ここでは、2価し、非酵素的細胞回復ソリューションのインキュベーションをキレート化するため逐次 EDTA 孵化を使用して腸の粘膜から腸溶性グリア細胞の分離について述べる。粘膜下のグリア細胞機能解析のための高濃縮培養結果ポリ-D-リジンおよびラミニンの結果細胞懸濁液をメッキします。
Abstract
腸神経系 (ENS) はニューロンと滑らかな筋肉壁、粘膜下層、粘膜固有層内に存在する腸溶性グリア細胞 (EGCs) から成っています。EGCs は様々 な栄養因子のリリースを通して腸内の恒常性に重要な役割を果たすし、上皮バリア性に貢献。プライマリ腸溶性グリア文化のほとんどの研究は、酵素分解後筋間神経叢から分離した細胞を使用します。ここでは、非酵素的メソッドを特定し、腸粘膜と粘膜から EGCs を文化を説明します。縦筋層を手動で削除後、EGCs は粘膜固有層と粘膜下組織シーケンシャル HEPES バッファー EDTA 孵化で市販の非酵素的細胞回復ソリューションを使用してから解放されました。EDTA の孵化した上皮粘膜から粘膜、粘膜下 EGCs を解放するためにセル回復ソリューションのほとんどを除去するのに十分です。残留粘膜と平滑筋は腸管グリアと共に破棄されます。EGCs はグリア線維性酸性蛋白 (GFAP) を表現する能力によって簡単に識別されました。細胞懸濁液の約 50% には、ティッシュの孵化を完了した後、ポリ-D-リジン/ラミニン基板上のめっき前に GFAP 陽性細胞が含まれています。ただし、グリア細胞由来神経栄養因子 (GDNF) で細胞を培養 3 日後-文化メディアを含む、基板コーティング プレートに付着した細胞集団から成る > 95% 腸溶性グリア。内因性細胞蛍光を用いた GFAP 陽性細胞の割合を記録するローザ ・ tdTomato 記者の行に hGFAP Cre マウスの繁殖によってハイブリッド マウス ラインを作った。したがって、非腸管腸溶性グリアを非酵素法によって分離、少なくとも 5 日間培養することができます。
Introduction
腸溶性グリア細胞 (EGCs) の機能に興味が腸の整合性と恒常性1,2で認識されている役割も増加します。また、EGCs は GI 管3,4の長さに沿っての場所によって異なります。EGCs グリア細胞由来神経栄養因子 (GDNF) を含む様々 な栄養因子をリリースでは、腸の運動1、5と微生物副産物6,7対応に貢献します。EGC 人口は異種とその機能は異なりますが粘膜または腸管神経叢1,7内に存在するかどうか、研究が示されています。たとえば、粘膜下組織内 EGCs はタイトジャンクショ8に貢献します。差分の GFAP 発現とリン酸化 EGCs では、パーキンソン病、この障害9腸形質への可能なリンクを示唆しているにリンクされています。最近では、近位小腸粘膜から EGCs の孤立した文化の核蛋白メニンの損失だったホルモン ガストリン10の発現を誘導するために十分なが観察されました。その結果、それは EGCs を十二指腸温存、神経内分泌腫瘍10種類の起源ことを提案しました。総称して、これらの例は、行動と神経因性疾患や癌の11分離 EGCs の機能研究の関連性を強調します。
フィールドでの挑戦を分離し、どちらかまたは両方 EGC 集団の in vitro研究方法のままです。リネージュ トレース実験は EGCs 粘膜と粘膜が腸管神経叢7の前駆細胞から起きることを示した。腸管 EGCs12,13,14,15,16,17の文化を生成可能ないくつかの公開された隔離のプロトコルがあるがあります 18,19, 粘膜下/板粘膜固有層 EGC 人口の分離を対象となし。EGC の分離のための既存のプロトコルは、機械分離の組み合わせや酵素分解、粘膜細胞層を最終的に破棄することと組み合わせる平滑筋のレーザーマイクロダイ セクションに具体的に使用します。
本稿の目的は、非酵素の in vitro研究粘膜からプライマリ EGCs を分離するための手順を示すことです。具体的には粘膜下組織から腸管 EGCs を区別するマーカーがないので平滑筋から上皮粘膜の空間的な分離は粘膜下 EGCs を分離する悪用されました。さらに、非酵素的解離と EDTA のキレート化を組み合わせることで、EGCs は関連付けられて間腸管 EGCs とともに破棄された平滑筋とは対照的粘膜下層から分離された.粘膜と粘膜 EGCs のそれ以上の分離は、グリア細胞向け基板、例えばポリ-D-リジンおよびラミニンの細胞を培養によって発生しました。
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Protocol
記載されているすべての動物実験は、使用とケアの動物のミシガン州大学の委員会によって承認されました。
1. 滅菌ポリ D リジン (PDL) およびラミニンのソリューションの準備
- 細胞分離する前に、少なくとも 1 日は、ポリ-D-リジン (PDL) とラミニン コート プレートを準備します。
注: 6 ウェルと 12 ウェル プレートは、実験の目的に応じて準備されました。通常、12 ウェル プレートは西部のしみを用いた定量的解析に使用されました。一方、6 ウェル プレートは、免疫組織化学用オートクレーブ (滅菌) coverslips を保持するために使用されました。24 ウェル プレートを用いて培養 EGCs Ca2 +イメージングをフラックスします。 - 超純水の組織培養グレード、DNase 自由と HEPA フィルターの空気とティッシュ文化フードの RNase フリー水と原液を希釈します。
-
滅菌ガラス coverslips
- 滅菌ピンセットで、coverslip を押し、ビーカーの中 15 分ティッシュ文化フードで蒸発し、6 ウェル プレートに許可するエタノール 100% エタノールの coverslips に没頭します。
- また、プラスチック製の容器とし、オートクレーブ 2 mm 厚いあぶらとり紙の上個別にいくつか coverslips を配置します。
2. コーティング プレート
注: は、無菌培養層流フードの下でこれらの手順を実行します。
- 1 mg/mL PDL 株式を解凍し、1:10 滅菌、組織培養グレードの水を希釈して最終濃度が 100 μ g/mL。6 ウェル プレート、12 ウェル プレートの 1 つの井戸をカバーするのに 1 mL、24 ウェル プレートで 1 つも 0.5 mL をコートによくあたり 2 mL を使用します。-20 ° C で 12 mL 因数で残りの希釈の PDL を保存します。
- 少なくとも 1 h の井戸をコートする PDL を可能にした後、滅菌ピペットと PDL を削除します。組織培養層流フードの下で完全に乾燥空気にプレートを許可します。
注: 滅菌ピペットと PDL ソリューションを削除した後ことができます 0.22 μ m のフィルターを通過し、4 ° C で保存後 1 週間以内に詳細を 2 回使用 - ゲルの形成を避けるために氷の上ラミニン株式を解凍します。
注: 原液ラミニンは 8 ° C 以上に温められると固体になります。 - 希釈、ラミニン株式 (0.5 mg/mL) 1:50 と滅菌ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) 最終濃度 10 μ G/ml を取得します。-20 ° C で 12 mL 因数で希釈ラミニンを保存します。
- 井戸を含む希薄ラミニン乾燥 PDL に追加します。6 ウェル表面とカバー 12 ウェルのプレートの下に 0.5 mL を 1 mL を使用します。Coverslips、表面被覆率を達成するために coverslips に希薄ラミニンの 400 μ L を追加します。
- プレートが同じ日 (クイック コーティング) を使用される場合は、2 h の 37 ° C でコーティング プレートを孵化させなさい。そうでない場合は、プラスチック製のラップ プレートをシールし、4 ° C (遅いコーティング) で一晩保管します。
注: シーリング乾燥や汚染を避けるために重要です。 - 表面を傷つけないようにピペットで注意深くラミニン ソリューションを削除します。3 回滅菌 DPBS と井戸を優しく洗います。
- それぞれに完全なグリア成長媒体もし、EGC の懸濁液を追加する準備ができるまで 37 ° C でプレートを維持追加します。
注: ポリ D リジンとラミニン コート プレートは 4 ° C で 3 日間保存できます。コート プレート数日前、4 ° C で保存し、3 回滅菌 DPBS でプレートを洗浄します。各ウェルに最終的な洗浄後滅菌 DPBS 2 mL を追加します。パラフィルムと 4 ° C でストアを持つプレートをシールします。ラミニンが乾かないことを確保することが不可欠です。
3. 分離溶液の調製
- EDTA/HEPES/DPBS 解離ソリューションを準備します。溶液 500 mL、滅菌 DPBS (カルシウムとマグネシウム) なしを使用して 10 mM HEPES と 5 mM EDTA の最終的な解決を加えること。490 mL の DPBS、HEPES 緩衝液 1 M の 5 mL と 0.5 M EDTA 原液 5 mL を追加します。使用するまで 4 ° C で保存します。
- 表 1に記載されている試薬を用いるグリア細胞の再懸濁のメディアを準備します。
- 表 2に記載されている試薬を用いるグリア成長媒体を準備します。
注: GDNF を含むグリア成長メディアが 4 ° C で 1 週間保存できます。
4. 腸内のセグメントの削除
注: マウスは、イソフルラン ドロップし、重要な臓器の除去食品と euthanization 前に水への無料アクセスを許可されました。C57bl/6 マウスの 8 週齢以上に使用されました。両方の性別は、準備の顕著な違いされずに使われました。
- イソフルランの過剰摂取とマウスを安楽死させるし、解離のトレイに臥位を配置します。四肢をピン留めし、70% エタノールで腹部を消毒します。皮膚を鉗子でテント、ハサミで腹部を開きます。
- 肝臓を持ち上げ、遠位胃・幽門を識別します。近位小腸の 7 cm を削除します。腸を破らないように注意してください。
-
腸間膜を切り取るしながら鉗子で幽門を保持します。
- 離れて付着性膵臓をこすり、はさみの背で鈍的切離を使用します。
- 冷たい DPBS Ca2 +や Mg2 + (図 1 a) せずに腸内のセグメントを配置します。
注: 小腸や大腸の他のセグメントも削除できます同じテクニックを使用しています。
- 氷で糞便の内容をフラッシュする鈍い端 20 G 針に接続されている 5 または 10 mL シリンジ使用冷たい DPBS (図 1 b)。
- 腸を 3 cm 縦筋最初スミスらで説明する手法を使用してを削除するセグメントに分割します。12 Sundaresanらに変更10。
メモ: HEPES/EDTA/DPBS 分離溶液 30 mL あたり 2 台までのマウスから腸内のセグメントを使用します。 - 綿の先端から別の木の棒に約 4 cm を中断します。DPBS (図 1) に木製の棒を浸してください。
- スリップ (図 2 a-C) の接液部のスティック上にスムーズに腸の区分の 1 つ。
- 付着性腸間膜まだ針鼻鉗子 (図 2 D) を使用して接続を削除します。
-
きれいなかみそりの刃を使用して、または腸間膜のところ腸に沿って 2 つの縦ニックネームをするメス接続 (図 2 e)。
- DPBS と綿棒を濡れています。縦筋/腸管神経叢 (LMMP) を緩め筋肉に沿って縦方向接液綿棒をこする。LMMP の削除時に、腸管の長さに沿って輪状筋から LMMP をいじめるに水平方向に綿棒を移動します。
- 中間および第 4 指 (図 2 f) でセグメントを安定化しながら親指と人差し指でスティックの先端を保持します。完了したら、腸内のセグメントを剥離容易に、LMMP されます。
- 破棄、LMMP 腸チューブから削除され、腸管神経叢から EGCs を収穫場合を除き、綿棒に添付が必要。
- かみそりの刃を使用して、縦木の棒から削除する腸管の開いて皮をはぐ。
- 氷の上の DPBS 剥奪の腸組織 (主に粘膜と粘膜下組織プラス走筋) に格納します。4.4-4.11 の手順を繰り返して腸内のすべてのセグメントを用意しています。
5. 上皮粘膜の除去
- 高級ハサミ ~0.5 cm の小さな部分に腸をカットします。
- 冷たい EDTA/HEPES/DPBS 溶液 30 mL を含む滅菌 50 mL 円錐形遠心管に組織を配置します。
- 毎分 60 〜 傾斜で 10 分の 4 ° C で組織を含むソリューションをロックします。
- あらかじめ 1 回上下 EDTA/HEPES/DPBS バッファーをピペットで 5 mL プラスチック ピペットを湿らせ、事前に湿らせたピペット ピペットの組織と 20 回上下に (および trituration) 懸濁液をバッファーを使用して上皮粘膜を取り除くため。
- EDTA のインキュベーションから 100 μ m ナイロン携帯こし器を通して混合物を注ぐことによって組織を収集します。濁った粘液で満たされたフロー ・ スルー (図 3) を破棄します。
- 氷の 30 mL を含む新しい 50 mL の円錐形遠心管にこし器に保持組織を置いて冷たい EDTA/HEPES/DPBS 針鼻鉗子を使用して。
- 追加上皮粘膜をはがすに毎分 60 〜 傾斜で 10 分の 4 ° C で組織をロッキングして EDTA/HEPES/DPBS 潜伏 2 回を繰り返します。
- あらかじめバッファーに 5 mL のピペットを湿らせ、粘液細胞を取り除くため 20 回上下組織懸濁液をピペットします。
注: 組織は上皮の多くが削除されると、ピペットの中に固執する傾向があります。 - 100 μ m ナイロン携帯こし器を通して混合物を注ぐことによって 2 番目のインキュベーション後、組織を収集し、流れを破棄します。2 番目のフロースルー必要があります (図 3) の最初のものより著しくより少なく濁り。
- 10 分 EDTA 孵化ソリューションがほぼまでクリア (組織の量と、製粉の効果によって孵化 3 に 4) を繰り返します (図 3)。
6. 粘膜固有層と粘膜下組織から腸管のグリア細胞のコレクション
- 5 mL の市販の細胞回復ソリューションの 4 ° C で 25-30 分のための石を含む 15 mL コニカル遠心管にナイロン ストレーナーから組織を転送します。
-
粘膜から腸のグリア細胞を分離するに軽く 10 倍をカップ刻んだ。
- 40 μ m のフィルターをフィルター処理し、きれいな 50 mL のチューブで濾液を収集します。
- 1 ml の DPBS のナイロン フィルターにティッシュをすすいでください。
- 組織を破棄し、転送 ~ 5-6 濾液 15 mL のきれいな円錐形遠心分離機管の mL。
- 4 ° C で 5 分間スイング バケツ遠心分離機で 2,000 x gで濾液をスピンします。
- 再再懸濁バッファーの少なくとも 1 mL で優しく上下 500 μ L ピペット チップとペレットをピペッティングによるグリア細胞を含むペレットを中断します。気泡を導入することは避けてください。
注: は、井戸やプレートの数に応じて巻き上がりボリュームを調整します。たとえば、1 つ 6 ウェル プレート 1.2 mL2 つの 6 ウェル プレート; 2.4 mL1 つ 12 ウェル プレート 2.4 mL。 - グリア成長媒体を含む 12 ウェル PDL ラミニン コート プレート 6 ウェルまたは 100 μ L の各ウェルに、細胞懸濁液 200 μ L をピペットします。
- プレートにセルを追加し、付着するセルの最大数を許可するように 37 ° C の定温器の配置後、料理が不可でした。
注: セルの健康な準備に 6-8 時間以内に接続が非付着性のセルとともにメディアから軽くピペッティングしてメディアを変更する前に、少なくとも 24 時間待ちます。 - 細胞実験のために使用すると、3-4 日後文化 (図 4) に配置されます。特定の蛋白質のマーカー (表 3) に興味の抗体を用いた免疫蛍光分析を実行します。たとえば、GFAP、S100b と p75ntr シグナルまたは Sox10 ここで使用されました。E-カドヘリンや α 平滑筋アクチン抗体は、他の細胞型からの汚染の程度を評価するために使用されました。
7. 免疫蛍光染色
- 文化からメディアを吸引し、PBS で 2 回すすいでください。
- 4% パラホルムアルデヒドで室温で 20 分間文化を固定します。
- 固定を外し、PBS ですすぎ 3 回。
- 0.2% を含む PBS のセルを permeabilize 室温でトリトン X-100。
- 反鶏 IgY 抗家兎または室温で 2 時間抗マウス IgG から成るブロッキング剤とグリセリンの細胞を孵化させなさい。
-
一次抗体一晩は、例えばGFAP (1:1, 000) で細胞を孵化させなさい。
- 3 回 PBS のセルをすすいでください。場合の共存を実行するステップ 7.7 に進みます。
- 少なくとも 2 時間、室温で一次抗体の次のセットを孵化させなさいが、好ましくは 4 ° C で一晩1: 1000 希釈ウサギ抗 s-100 のまたはマウス抗 p75ntr シグナルの 1: 500 希釈を使用します。
注: すべての抗体は PBS で希釈しました。 - 3 回一次抗体を削除する PBS のセルをすすいでください。その後、室温 (表 3) で 2 時間適切な蛍光標識二次抗体とリンスの細胞を孵化させなさい。
- 二次抗体を削除する PBS で 3 回を洗い流してください。
- DAPI でメディアをマウントを 1-2 滴を使用してスライド上に coverslips をマウントし、蛍光顕微鏡下で細胞を見る。
8. フローサイトメトリー
- 一度 DPBS とセルを洗浄によってフローサイトメトリー用付着性グリア細胞を削除し、製造元のプロトコルごとの 0.25% トリプシン-EDTA を追加します。完全なグリア細胞成長媒体にセルを集めることによって 3 分終了消化の 37 ° C でトリプシン EDTA 溶液中の細胞を孵化させなさい。
- 5 分 400 × gで遠心分離によって細胞を収集し、再停止する PBS のセル。
- 10 分 4% パラホルムアルデヒドとセルを修復して、permeabilize 0.2% で PBS でトリトン X-100 ステップ 7.4 で説明されているようです。
- 1 %bsa と 20 分、例えばロバ反鶏 IgY (IgG) (H + L) (1:1, 000) またはロバの反やぎ IgG (H + L) (1:1, 000) のティッシュ特定の免疫グロブリンを含む PBS のセルをブロックします。
- 一次抗体 GFAP (1:2, 000)、細胞を孵化させなさい E-カドヘリン (1: 400)、α-平滑筋アクチン (1: 500) または 4 ° C で一晩 Pgp9.5 (1: 500)
-
PBS で抗体を洗い流します。
- 30 分間室温でインキュベート蛍光標識二次抗体で抗原・抗体複合体を孵化させなさい。
- アイソタイプ コントロールとして使用する二次抗体とインキュベート細胞の別の因数を使用します。セルの両方の人口が洗浄され、cytometry 流れ前に PBS で再停止されます。
- 生きているセルのゲートによって流れの cytometer 細胞の 2 つの集団を分析します。
9、hGFAP からマウス組織の準備-Cre:tdTomato マウス
注: Lox 停止-Lox tdTomato cDNA ローザ軌跡22,23 (ジャクソン研究所、#007914) から表現し、内因性蛍光 (hGFAP-Cre) Cre リコンビナーゼを発現マウスを飼育するときを生成します。凍結するティッシュ セクションを生成することによってその場で解析が実行されます。
- 1 h の 4% パラホルムアルデヒドで腸組織を修正し、PBS で 1 M ショ糖で一晩脱水します。
- 市販購入最適な切削組織 (OCT) 化合物 10% ポリビニル アルコールから成る組織を埋め込み、4.2% ポリエチレング リコールと、スナップを液体窒素で凍結します。
- 5 μ m の凍結切片を作成し、マウント DAPI でメディアをマウント、antifade を使用してください。
- フローサイトメトリー、EGCs を準備、hGFAP から-Cre:tdTomato+ マウス手順 4.1-6.5 で説明されているようです。
- ステップ 8.1 のように文化の 3 日後、プレートから細胞を trypsinize し、4% パラホルムアルデヒドで 10 分間を修正します。
- HGFAP から分離した細胞と並行して Cre 負マウスから分離した細胞を分析-流れの cytometer で Cre:tdTomato+ マウス。
注: ゲートは、死んだ細胞や破片を避けるために建設されました。
10 Ca2 +イメージングをフラックス
- 3 μ m 24 ウェル プレートにメッキ EGCs を孵化させなさい蛍光 4時 30 分の 37 ° C で。
- イメージの回転のディスク共焦点顕微鏡と 480 の励起波長を使用して商業的に購入したタイロード液の Ca2 +シグナル nm (F480) CCK やガストリンのペプチドを追加した後。Sundaresanらの報告された画像解析10 。
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Representative Results
プレップは GFAP 陽性細胞いない付着し、24 h (図 4 a) 内で広がる場合失敗したと考えられました。グリア細胞の数細胞付着し、フラット集計 (図 4 b) への拡散の証拠を示したときを 24 時間後までできませんでした。クラスターのエッジで細胞は長いプロセスを拡張する傾向があったし、古典的なグリア細胞マーカー、例えばGFAP、S100b と p75NTR (図 4、4 D)10,16を表明しました。2nd日によってグリア細胞は、しっかりと離れて PBS で洗浄する非付着人口を許可する表面に付着しました。浮遊細胞のほとんどは上皮と粘膜細胞細胞の残骸と共に。これらの浮遊細胞塊の存在フロー ・ スルーがほぼクリア、上皮細胞が板から削除されていることが通知されるまでは、EDTA の孵化を実行することの重要性を強調する付着性グリア細胞の収率は減少しました。粘膜固有層のコア。さらに、1,500 × gより低い速度で細胞の回復ソリューションのインキュベート後遠心分離効果的にたまらないすべての実行可能なセルにペレットの還元利回りに 。通常、40,000 に 100,000 細胞形態学的 EGCs で一貫性のある付着培養 3 日目にしっかりと。
グリア関連抗体を用いた免疫組織化学的解析 (図 5 a) ソックス 10、S100b、GFAP の肯定的な10,16の 3 日目にそのまま付着がセルでクラスターを示されています。現在の研究では、純度のこの同じ程度は構造のセルおよびフローサイトメトリー (図 5B-F) による分析で観測されました。粘膜下/板粘膜固有層のグリア細胞を分離、直後後フローサイトメトリーが、約 51% の細胞が GFAP + (図 5 b)、例えば、上皮、造血、GFAP 負セルタイプの存在を示唆するいると明らかにしました。内皮細胞、神経細胞、上皮と粘膜固有層に存在する知られている芽。3 日間培養後 GFAP 陽性細胞数 95% を占める以上、オリジナル メディアを削除した後分析セル人口の優しく PBS で洗浄し、新鮮なメディア (図 5) を追加します。興味深いことに、流動解析はハイとロー GFAP 蛋白質を表現する集団 (図 5) 明らかにしました。確かに、細胞の免疫蛍光分析クラスターの周辺が GFAP (図 4、4 D) のより高いレベルを表現する傾向があることを明らかにしました。一緒に取られて、分析の 2 つのタイプは EGC の成熟度や分化の状態の違いを示す可能性があります。総称して、α の割合-SMA + (myofibroblast 細胞マーカー)、E-カドヘリン + (上皮細胞マーカー)、および Pgp 9.5 + 細胞 (神経細胞マーカー) は 5% 未満 (図 5F)。これらの結果は先行研究と一致した10の約 93% を示す EGCs の蛍光標識を用いて GFAP + 細胞します。フロー解析は汚染細胞集団文化の約 5% を構成するの削除できますので、プレートに付着する細胞の重要性を強調します。
本研究の目的は、さらなる分析のための細胞のフローサイトメトリーを容易にして内因性蛍光マーカー (図 6) を使用して EGC 濃縮の度合いを比較する GFAP アクティブのレポーターを使用するでした。HGFAP Cre マウス線メッシングと同僚の20によって記述されていた。簡単に言えば、Cre リコンビナーゼが 2.2 kb ヒトのグリア線維性酸性タンパク質 (hGFAP) プロモーターの制御下に置かれました。したがって、任意のセルは、この hGFAP のプロモーターの転写は、赤い蛍光レポーター tdTomato を表明しました。TdTomato レポーターの付いたセル人口可視化あったその場で上記 EGC 分離のプロシージャを実行する前に小腸と大腸 (図 6 a、 6 b) 凍結切片を用いたします。EDTA/電池回復隔離を実行する、3 日間の細胞を培養後これらのマウスから EGCs は簡単にその内因性蛍光 (図 6) によって識別されました。間違いなく、GFAP 陽性細胞は近位小腸4,21のより多くが tdTomato + EGCs においてもコロン (図 6 b)。HGFAP Cre によって活性化される tdTomato+蛍光レポーターを使用しても hGFAP のバイモーダル人口を明らかにした-tdTomato + 細胞 (図 6)、GFAP の免疫蛍光分析を用いて観察蛋白質 (図 5)。すべて EGCs エクスプレス GFAP 蛋白質4であることが報告されている、この時点で可能性があります GFAP 発現のレベルの違いが反映されます。平均して、分析細胞の約 66% は tdTomato 蛍光性の最高レベルを展示しました。したがって、EGCs の小腸と大腸の遺伝子発現の違いを調べる記者によってラベル付けされた全体のサブセットを分離 EDTA/セルの回復プロトコルを使用可能性があります。
このプロトコルは、生化学的研究および西部のしみの分析のための比較的純粋な GFAP + グリア細胞の十分な番号を生成10. グリア細胞応答性を示すためには、3 日間グリア細胞の準備はホルモンのコレシストキニン (CCK) や Ca2 +フラックスを誘発するガストリンと扱われた (図 7A-7 b)10。これらの GFAP + 付着性細胞が知られている腸溶性グリア機能を展示する能力を示す細胞作動薬に対応することがわかった。
図 1: 設定とマウスの腸の準備。(A) 画像の分離抽出した腸を含む氷の上を設定します。(B) 写真 5 mL 注射器 20 G 鈍い端針に接続されている糞便の内容をフラッシュします。(C) 改変の末 DPBS バッファーに浸漬木製綿棒 (〜 4 cm)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 腸をきれいにし縦筋/腸管神経叢 (LMMP) を削除する手順を使用します。(A ~ C)接液部の木の棒に腸管をスライディングします。(D) 付着性腸間膜の除去。(E) 腸かみそりの刃に刻み目をつける人します。(F) 湿った綿棒で LMMP を削除します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: EDTA の孵化後のシーケンシャル フロー スルー 。示すように、4 連続孵化孵化 5 mm EDTA/10 mM HEPES DPBS で摩砕し、10 分間 20 回 3 つの 7 cm 腸内セグメントを使用してから流れスルーの例です。100 μ m のナイロン メッシュのストレーナを注いで後代表流れスルーが表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: EGC は、めっき後 24 h を画像します。めっき後の再懸濁細胞 24 h の光顕所見。(A) 表示はフローティングの上皮細胞塊 (矢印) と破片を示す悪い準備の代表的な例。24 時間後の付着 EGCs は認められなかった(B) 電池隔離および EGCs のパッチが PDL/ラミニンへ付着した巻き上がりコーティング プレート後、表示は優秀な予備校 24 h の代表的な例。画像は倒立蛍光顕微鏡にデジタル カメラで捕獲されました。スケール バー 500 μ m (A ・ B) を =。 (C) ハイパワー観早期胃癌細胞のパッチ染色 GFAP 抗体 (緑) ラベルの高い強度の周囲にセルを表示します。細胞のいくつかは 2 つの核 (矢印、DAPI、青) を示した。(D) の共存の GFAP (緑) (赤) S100 と p75ntr シグナル (赤)。スケール バー = 20 μ m (C ・ D)。セル antifade 試薬および DAPI (青い核) 付きでマウントされました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 大人のマウスの十二指腸粘膜から分離した腸管のグリア細胞のフローサイトメトリーします。(A) GFAP 免疫組織、S100B Sox10 EGC 培養 3 日後。矢印は、ソックス 10 肯定的な核を示します。スケール バー = 20 μ m (Sundaresanらから許可を得て使用10). (B) 割合の GFAP 陽性細胞 (蛍光強度 (または前方散乱、x 軸) 側方散乱 (y 軸) 対コーティング プレートにメッキ前に、.(C) GFAP 陽性 (D) α SMA 正 (E) E-カドヘリン正 (F) および Pgp 9.5 陽性細胞 3 受け取ってめっきの割合。ゲートは、死んだ細胞や破片を避けるために建設されました。(側方散乱) のセル数を基準にして蛍光灯の人口の平均割合は、示されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: hGFAP Cre+の十二指腸粘膜から分離した腸管のグリア細胞の同定: tdTomato+アダルト マウスします。内因性 tdTomato 蛍光 (赤色) のイメージは (A) 腸内デジタル カメラで位相差の蛍光顕微鏡で捕獲されました。(インセット)除く A と同じは DAPI イメージ (青い核) と合併。(B) コロンは、DAPI と合併。(C) 腸溶性グリア細胞 (レッド) hGFAP から分離された-Cre:dtTomato+マウスと PDL/ラミニン基板 3 日間培養。スケール バー = 50 μ m。 (D) フローサイトメトリー解析 tdTomato 細胞の。GFAP + セル ± SEM の 3 つの準備 (準備ごと 3 マウス) % の意味は、示されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: Ca2 +のビデオは、ホルモン治療後フラックスします。EGCs 24 ウェル PDL とラミニン被覆メッキ プレートは 3 日間のグリア成長媒体で培養しました。セルは、37 ° C で 20 分間 Fura 2 AM の 3 μ M を搭載したにされ処理 (A) 100 nM コレシストキニン (CCK) または (B) 100 nM ガストリン。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
| コンポーネント | 追加するボリューム | 最終濃度 |
| DMEM/F12 | 44.5 mL | _ |
| ウシ胎児血清 (FBS) | 5 mL | 10% |
| ペニシリン-ストレプトマイシン | 500 Μ L | 100 IU/mL ペン |
| ストレプトマイシン | 100 μ g/mL 連鎖球菌 | |
| ゲンタマイシン (50 mg/mL 在庫) | 20 Μ L | 20 μ G/ml |
表 1: グリア細胞の再懸濁のメディアの成分。
| コンポーネント | 追加するボリューム | 最終濃度 |
| DMEM/F12 | 44 mL | _ |
| ウシ胎児血清 (FBS) | 5 mL | 10% |
| ペニシリン-ストレプトマイシン (100 倍) | 500ΜL | 100 IU/mL (ペン) |
| 100 μ g/mL (連鎖球菌) | ||
| ゲンタマイシン (50 mg/mL 在庫) | 20 Μ L | 20 μ G/ml |
| GDNF (10 μ G/ml 株式) | 50 Μ L | 10 ng/mL |
| L-グルタミン (200 mM 在庫) | 500ΜL | 2 mM |
表 2: グリア細胞成長媒体の組成物。
| コンポーネント | 螢光抗体希釈 | 流れの Cytometry の希釈 |
| 鶏抗 GFAP | 1 に 500 | 2000 年に 1 |
| ウサギ抗 s-100 | 1 に 500 | 1 に 500 |
| マウス抗 p75 NTR | 1 に 500 | 1 に 500 |
| ヤギ抗 E-カドヘリン | 1 に 400 | |
| マウス抗 Pgp9.5 | 1 に 500 | |
| ヤギ抗は平滑筋アクチン | 1 に 500 | |
| Alexa Fluor 488 ヤギ抗鶏 IgY | 1 ~ 1000 | 1 ~ 1000 |
| Alexa Fluor 568 ヤギ抗マウス IgG します。 | 1 ~ 1000 | 1 ~ 1000 |
| Alexa Fluor 594 ロバ抗うさぎ IgG します。 | 1 ~ 1000 | |
| Alexa Fluor 488 ロバの反やぎ IgG します。 | 1 ~ 1000 |
表 3: 抗体のリスト
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Discussion
EGCs は腸内の恒常性に重要な役割を果たすし、を分離し、体外研究が不可欠です。このプロトコルではアダルト マウス腸管の粘膜から EGCs を隔離するための簡単な方法は、腸溶性グリア機能を研究に導入されました。
綿棒で付着性腸間膜と LMMP を削除する縦走筋の間に存在する間腸管グリアのいくつかを削除します、粘膜表面にバッファーの利用可能性を高める、大きな毛細血管の多くを削除します.最終的な文化を汚染赤血球の数を減らします。EDTA の孵化のシリーズ公開粘膜固有層と粘膜下グリア、キレートのソリューションへの暴露後壊れやすいこともある上皮粘膜をはぎ取る。攪拌揺れ、ボルテックス、あるいは triturating (ピペッティング上下反復的な) は慎重に行うし、細胞への過度の損傷を避けるためにタイムアウトが必要です。製粉は、テクニックは、付着性、有望なグリア細胞のより一貫性のある降伏になるためここで使用されました。振動気泡を導入し、コーティングのプレートへの細胞付着による形態学的評価セル実行可能性を減らす傾向にあった。組織を切る必要があります < 5 mL ピペットで組織を効果的にカップ刻んだ 0.5 cm。
一般に、マウスに少なくとも 3 から 7 cm セグメントは約 20-30% で 1 つの 6 ウェル プレートをカバーする十分な EGCs を生成するための十分な密度各種と qPCR の使用することができます。しかしより多くの細胞生化学的研究遺伝子の発現レベルによって西部のしみなどの必要があります。とはいえ、タイプ 1 コラーゲン、マトリゲルをポリ-D-リジン/ラミニン基板の代替として簡単に調べた上皮細胞の人口の大きい付着を認めた最終的に他の細胞型と EGC 文化の汚染を増やす.さらに、1 型コラーゲンはプレートにしっかりと付着しなかったし、メディアを変更するときに簡単に表面から剥がれだった。フィブロネクチンは別基板使用24をされているが、ここでテストしていませんでした。ラミニンはどうやらバインディングを強化し、分化神経の頂上の派生セル25。ただし、ラミニンの多くは変更することができますに影響を与える細胞の付着および利回り。文化の微生物汚染は時間の約 5% が発生し、滅菌試薬や手法、抗生物質の使用によって最小に保たれました。抗真菌剤の使用は省略可能でした。
ここでプロトコルの主要な制限は、基になる EGCs を損なうことがなく、上皮を削除する撹拌の標準化です。さらに、コーティングのプレートへの細胞付着によりますのですぐに準備の評価が出来ません。トラブルシューティングを行うときに焦点を当てる 3 つの領域が含まれます: 1) 新鮮な PDL とラミニン コートに、プレートの使用2) 解剖からアシスタントの数を増やすことによって EDTA の孵化を開始までの時間を最小限に抑える3) 時間と上皮とし、EGCs を効果的に削除する組織を扇動するために使用されるメソッドを定量化します。次の手順のいずれかで時間を延長 EGC 脆弱性と彼らが成長媒体でめっきしたときは復旧する可能性が増加します。ここで上皮を分離する製粉法を用い, 揺れとボルテックスいたもテストは一貫性のない結果おそらくより多くの演算子は依存し定量化することは困難であります。付着性のセルの収量をメッキ後セルを 16-24 h に邪魔されていない場合が大きかった。
ここで紹介した方法はスミスらによって元の研究によると変更されました。12LMMP を分離することに焦点を当てた。スミスのアプローチは、ここだけを削除して、LMMP を破棄したグリア細胞のほとんどが粘膜と粘膜を起源として使用されました。なお、酵素消化せず腸管 EGCs は容易に解放された12ではありません。それにもかかわらず、腸管粘膜のグリア細胞との特定のマーカーがないので内側筋間神経叢からグリア細胞の存在を除外できません。ローゼンバウムらは、hGFAP のプロモーターから強化された緑色蛍光蛋白質 (EGFP) 表現する EGCs のフローサイトメトリーによる解析を報告しました。彼らは非常に若いマウス (生後 7 日)、酵素消化19全体の腸から EGCs を分離しました。さらに、フローティング neurosphere 形成を昇格条件を維持するための 2 週間後フローサイトメトリーによる解析を行った。浮遊細胞凝集塊も強く α SMA の myofibroblast セル人口の拡大が対照的に gliosphere の開発を励ましたことを示唆を表明したが、神経幹細胞は、GFAP と S100b の両方に高い表現を報告した、ここで説明したフラット シートのような形態。したがって、興味深い研究はこのプロトコルと直接比較できません。対照的に、細胞の形態と相まって大幅に少ない α-SMA + 細胞は 3 日から 5 日間の培養期間中には、このプロトコルで記述されている EGCs に 3 次元形態を示さない示唆しています。それにもかかわらず、ここのプロトコルとローゼンバウム メソッドの両方は、蛍光レポーターを使用して識別し、GFAP + ライブ細胞プロファイリング捜査員の能力を向上させる細胞を分離します。
結論としては、現在のプロトコル非酵素的アプローチを使用して粘膜から腸のグリア細胞の隔離を記述します。全体のプロトコルはプレコート組織培養プレート上マウス解剖から初期めっきに約 3 時間をかかります。プロトコルでは、最も時間の集中的なステップが除去と最初の EDTA インキュベーションのため腸の準備です。プレートを準備し、貯える DPBS では強くお勧めします。準備の成功は、基になる EGCs を損なうことがなく上皮の効率的な除去に依存し、24 h. プライマリ EGCs 内 PDL/ラミニン コート プレートへの付着は生化学的分析などの in vitro研究に有用Ca2 +フラックスとアデノ ウイルス transfections10。粘膜下組織または、LMMP から EGCs を分離する機能が全ゲノム アプローチを使用して形態発生・分化・成長特性 EGC の違いを定義するさらなる研究を許可することも予想されます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者したい (JLM) に R37 DK045729 と (HX) を R01 AR060837、ミシガン州消化管研究センター分子コア P30 DK034933 の大学からのサポートを認めます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-D lysine (1 mg/mL stock) | Sigma | A-003-E | Dilute 1:10 |
| Laminin (0.5 mg/mL stock) | Sigma | L4544 | Dilute to 10 µg/mL on ICE |
| EDTA (0.5 M) | Lonza | 51201 | Dilute 1:100 in DPBS |
| HEPES (1 M) | Corning | 36216004 | Dilute 1:100 in DPBS |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | HyClone | SH30028.02 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Gentamicin (50 mg/mL stock) | Life Technologies | 15750060 | |
| GDNF (10 µg stock) | Sigma | SRP3200 | |
| L-Glutamine (200 mM stock) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Chicken anti-GFAP | Thermo Fisher Scientific | PA1-10004 | |
| Goat anti-a-Smooth Muscle Actin | Abcam | ab112022 | |
| Mouse anti-Pgp9.5 | Novus Biologicals | NB600-1160 | |
| Goat anti-E-cadherin | R&D Systems | AF748 | |
| Rabbit S100 | Abcam | ab34686 | |
| Mouse p75 NTR | Millipore | MAB5592 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Chicken IgY | Invitrogen | A-11039 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG | Invitrogen | A-11055 | |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11004 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | R-37119 | |
| Prolong Gold antifade Reagent with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Fungizone (Amphotericin B) 250 µg/mL | Life Technologies | 15290-018 | |
| L-Fura-2-AM | Invitrogen | F-14201 | |
| CCK peptide | Anaspec, Fremont, CA | AS-20741 | |
| Gastrin peptide (Gastrin-17) | Abbiotec, Bloomington, IN | 350188 | |
| Nylon Mesh Celll Strainer (100 µm) | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Nylon Mesh Celll Strainer (40 µm) | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Disposable Serologic Pipet 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-056 |
References
- Grubisic, V., Gulbransen, B. D. Enteric glia: the most alimentary of all glia. Journal of Physiology. 595 (2), 557-570 (2017).
- Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 9 (11), 625-632 (2012).
- Rao, M., et al. Enteric Glia Regulate Gastrointestinal Motility but Are Not Required for Maintenance of the Epithelium in Mice. Gastroenterology. 153 (4), 1068-1081 (2017).
- Rao, M., et al. Enteric glia express proteolipid protein 1 and are a transcriptionally unique population of glia in the mammalian nervous system. Glia. , (2015).
- McClain, J., et al. Ca2+ responses in enteric glia are mediated by connexin-43 hemichannels and modulate colonic transit in mice. Gastroenterology. 146 (2), 497-507 (2014).
- Cunha Franceschi, R., et al. Enteric glial reactivity to systemic LPS administration Changes in GFAP and S100B protein. Neuroscience Research. 119, 15-23 (2017).
- Kabouridis, P. S., et al. Microbiota controls the homeostasis of glial cells in the gut lamina propria. Neuron. 85 (2), 289-295 (2015).
- Yu, Y. B., Li, Y. Q. Enteric glial cells and their role in the intestinal epithelial barrier. World Journal of Gastroenterology. 20 (32), 11273-11280 (2014).
- Clairembault, T., et al. Enteric GFAP expression and phosphorylation in Parkinson's disease. Journal of Neurochemistry. 130 (6), 805-815 (2014).
- Sundaresan, S., et al. Gastrin Induces Nuclear Export and Proteasome Degradation of Menin in Enteric Glial Cells. Gastroenterology. 153, 1555-1567 (2017).
- Gulbransen, B. D. Enteric Glia: The Origin of Duodenal Gastrinomas? Gastroenterology. , (2017).
- Smith, T. H., Ngwainmbi, J., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. An in vitro preparation of isolated enteric neurons and glia from the myenteric plexus of the adult mouse. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In situ Ca2+ imaging of the enteric nervous system. Journal of Visualized Experiments. (95), (2015).
- Bernstein, C. N., Vidrich, A. Isolation, identification, and culture of normal mouse colonic glia. Glia. 12 (2), 108-116 (1994).
- Jaeger, C. B. Isolation of enteric ganglia from the myenteric plexus of adult rats. Journal of Neural Transplantation & Plasticity. 5 (4), 223-232 (1995).
- Almond, S., Lindley, R. M., Kenny, S. E., Connell, M. G., Edgar, D. H. Characterisation and transplantation of enteric nervous system progenitor cells. Gut. 56 (4), 489-496 (2007).
- Ruhl, A., Trotter, J., Stremmel, W. Isolation of enteric glia and establishment of transformed enteroglial cell lines from the myenteric plexus of adult rat. Neurogastroenterology & Motility. 13 (1), 95-106 (2001).
- Boyen, G. B., et al. Distribution of enteric glia and GDNF during gut inflammation. BMC Gastroenterology. 11, 3 (2011).
- Rosenbaum, C., et al. Activation of Myenteric Glia during Acute Inflammation In Vitro and In Vivo. Public Library of Science One. 11 (3), e0151335 (2016).
- Zhuo, L., et al. hGFAP-cre transgenic mice for manipulation of glial and neuronal function in vivo. Genesis. 31 (2), 85-94 (2001).
- Boesmans, W., Lasrado, R., Vanden Berghe, P., Pachnis, V. Heterogeneity and phenotypic plasticity of glial cells in the mammalian enteric nervous system. Glia. 63 (2), 229-241 (2015).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Kabouridis, P. S., et al. The gut microbiota keeps enteric glial cells on the move; prospective roles of the gut epithelium and immune system. Gut Microbes. 6 (6), 398-403 (2015).
- Pomeranz, H. D., Sherman, D. L., Smalheiser, N. R., Tennyson, V. M., Gershon, M. D. Expression of a neurally related laminin binding protein by neural crest-derived cells that colonize the gut: relationship to the formation of enteric ganglia. The Journal of Comparative Neurology. 313 (4), 625-642 (1991).
