Summary
وهنا يصف لنا عزل الخلايا المعوية الدبقية من الأمعاء سوبموكوسا استخدام متسلسلة يدتا إينكوبيشنز يخلب الكاتيونات ديفالينت والحضانة في الخلية غير الانزيمية حل الاسترداد ثم. تصفيح تعليق الخلية الناتجة في بولي-د-يسين و laminin النتائج في ثقافة مخصب بدرجة عالية من الخلايا الدبقية سوبموكوسال للتحليل الوظيفي.
Abstract
الجهاز العصبي المعوي (ENS) يتكون من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية المعوي (اجكس) الموجودة داخل الجدار العضلات الملساء وسوبموكوسا وبروبريا الصفيحة. اجكس تلعب أدواراً هامة في التوازن الغريزي عن طريق الإفراج عن مختلف العوامل التغذوية، ويسهم في سلامة الحاجز الظهارية. معظم الدراسات الأولية الثقافات الدبقية المعوي استخدام الخلايا المعزولة من الضفيرة myenteric بعد الانفصال الانزيمية. هنا، يتم وصف أسلوب غير الانزيمية لعزل والثقافة اجكس من سوبموكوسا المعوية والصفيحة بروبريا. بعد الإزالة اليدوية لطبقة العضلات الطولية، تم تحرير اجكس من الصفيحة بروبريا وسوبموكوسا باستخدام إينكوبيشنز يدتا مخزنة حبيس متسلسلة تليها الحضانة في حل الاسترداد المتوفرة تجارياً الخلية غير الانزيمية. إينكوبيشنز يدتا كانت كافية لتجريد معظم المخاطية الظهارية من بروبريا الصفيحة، مما يتيح حل الاسترداد خلية لتحرير اجكس submucosal. تم تجاهل أي بقايا الصفيحة بروبريا والعضلات الملساء جنبا إلى جنب مع إطلاق مينتيريك. وحددت اجكس بسهولة بقدرتها على التعبير عن البروتين حمضية فيبريلاري الدبقية (توصيني). فقط حوالي 50% تعليق خلية الواردة توصيني + الخلايا بعد إكمال إينكوبيشنز الأنسجة وقبل الطلاء على الركازة بولي-د-يسين/لامينين. ومع ذلك، بعد 3 أيام من استزراع الخلايا في معامل نيوروتروفيك المستمدة من الخلايا الدبقية (جدنف)-التي تحتوي على وسائط الثقافة، السكان خلية التمسك بلوحات المغلفة بالركيزة تتألف من > إطلاق المعوي 95%. قمنا بإنشاء خط الفأر هجين بتربية ماوس هجفاب-لجنة المساواة العرقية إلى خط مراسل تدتوماتو روزا لتعقب النسبة المئوية توصيني + الخلايا باستخدام صف الخلية الذاتية. وهكذا، يمكن عزلة بواسطة أساليب غير الانزيمية إطلاق المعوية غير مينتيريك ومثقف لمدة 5 أيام على الأقل.
Introduction
الفائدة في وظيفة الخلايا الدبقية المعوي (اجكس) يزداد باطراد بسبب أدوارها المعترف بها في القناة الهضمية النزاهة والتوازن1،2. وباﻹضافة إلى ذلك، اجكس تختلف باختلاف مواقعها على طول غي المسالك3،4. اجكس الإفراج عن مختلف العوامل التغذوية، بما في ذلك عامل نيوروتروفيك المستمدة من الخلايا الدبقية (جدنف)، والمساهمة في القناة الهضمية حركية1،5 والرد على تركات الميكروبية6،7. وقد بينت الدراسات أن السكان الغانية غير متجانسة وأن وظيفتها تختلف تبعاً لما إذا كانت هي سوبموكوسال أو الموجودة ضمن ال1،الضفيرة مينتيريك7. على سبيل المثال، تسهم اجكس داخل سوبموكوسا تقاطعات ضيق8. وربطت التفاضلية التعبير توصيني والفسفره في اجكس لمرض باركنسون، مما يوحي باحتمال وجود صلة للنمط الظاهري القناة الهضمية من هذا الاضطراب9. في الآونة الأخيرة، لوحظ أن فقدان مينين البروتين النووي في ثقافات منعزلة من اجكس من سوبموكوسا المعوية الدانية كافية للحث على التعبير عن هرمون جاسترين10. كنتيجة لذلك، اقترح أن اجكس قد يكون منشأ الإثناعشرية gastrinomas، نوع من ورم الغدد الصم العصبية10. جماعياً، وهذه الأمثلة تؤكد أهمية دراسة السلوك ووظيفة اجكس معزولة في اضطرابات الأعصاب والسرطان11.
ويظل التحدي هو في المجال كيفية عزل ودراسة أحد أو كلا الغانية السكان في المختبر. النسب تتبع التجارب أثبتت أن اجكس في سوبموكوسا والصفيحة بروبريا تنشأ من خلايا السلف في ضفيرة مينتيريك7. على الرغم من أن هناك عدة بروتوكولات العزلة المنشورة المتاحة لتوليد ثقافات myenteric اجكس12،13،،من1415،،من1617، 18،19، لا تستهدف على وجه التحديد عزلة السكان الغانية بروبريا submucosal/الصفيحة. على وجه التحديد استخدام البروتوكولات القائمة لعزل الغانية مزيجاً من فصل الميكانيكية أو ميكروديسيكشن للعضلات الملساء جنبا إلى جنب مع تفكك الانزيمية، في نهاية المطاف التخلص من طبقة الخلايا المخاطية.
والهدف من هذه المخطوطة إظهار الخطوات لعزل غير انزيماتيكالي اجكس الأولية من بروبريا الصفيحة للدراسات في المختبر . نظراً لوجود لا علامات على وجه التحديد التمييز بين اجكس myenteric من تلك الموجودة في سوبموكوسا، استغلت الفصل المكاني بين المخاطية الظهارية من العضلات الملساء لعزل اجكس submucosal. وبالإضافة إلى ذلك، عن طريق الجمع بين أدتا استخلاب مع الانفصال غير الانزيمية، عزلت اجكس عن submucosa خلافا للعضلات الملساء، قد تم تجاهلها جنبا إلى جنب مع اجكس myenteric جملة المرتبطة بها. حدث آخر فصل سوبموكوسا واجكس بروبريا الصفيحة باستزراع الخلايا على ركائز الصديقة للخلية الدبقية، مثلاً، بولي-د-يسين ولامينين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وافق جميع التجارب على الحيوانات ووصف اللجنة جامعة ميتشغان في استخدام ورعاية الحيوانات.
1-إعداد العقيمة بولي-د-يسين (PDL) وحلول لامينين
- يوم واحد على الأقل قبل عزل الخلية، إعداد لوحات laminin المغلفة وبولي-د-يسين (PDL).
ملاحظة: تم إعداد لوحات 6-جيدا وكذلك 12 تبعاً لأهداف تجريبية. عادة، تستخدم لوحات 12-جيدا للتحليل الكمي باستخدام البقع الغربية؛ في حين، واستخدمت لوحات 6-جيدا لعقد يعقم كوفيرسليبس (العقيمة) إيمونوهيستوتشيميستري. واستخدمت لوحات 24-جيدا للثقافة اجكس لل Ca2 + الجريان التصوير. - تمييع حلول الأسهم مع الصف عالي النقاوة زراعة الأنسجة، خالية من الدناز والمياه خالية من رناسي في غطاء زراعة الأنسجة مع تصفية هيبا الهواء.
-
تعقيم الزجاج كوفيرسليبس
- عقد ساترة مع ملقط معقم وتزج كوفيرسليبس في كوب إيثانول 100% للسماح الإيثانول تتبخر في هود زراعة الأنسجة ومن ثم ضع في لوحات 6-جيدا 15 دقيقة.
- بدلاً من ذلك، ضع كوفيرسليبس عدة على حدة على ورق نشاف سميكة 2 مم في حاوية بلاستيكية ثم اﻷوتوكﻻف.
2-طلاء ألواح
ملاحظة: هذه الخطوات تحت غطاء الاندفاق الصفحي زراعة الأنسجة عقيمة.
- تحسن الأسهم PDL 1 ملغ/مل وتمييع 01:10 مع المياه الصف زراعة الأنسجة المعقمة، حيث يكون التركيز النهائي 100 ميكروغرام/مل. استخدام 2 مل كل بئر لمعطف لوحات جيدا 6، 1 مل لتغطية بئر واحدة من صفيحة 12-جيدا و 0.5 مل لبئر واحدة في لوحات 24-جيدا. تخزين PDL المخفف المتبقية في مختبرين 12 مل في-20 درجة مئوية.
- بعد السماح PDL معطف الآبار على الأقل 1 ح، إزالة PDL مع ماصة معقمة. السماح لوحات للهواء الجاف تماما تحت غطاء الاندفاق الصفحي زراعة الأنسجة.
ملاحظة: بعد إزالة الحل PDL مع ماصة معقمة، فإنه يمكن استخدام مرتين أكثر في غضون أسبوع واحد بعد تمرير من خلال عامل تصفية 0.22 ميكرومتر وتخزينها في 4 درجات مئوية. - تحسن الأسهم لامينين على الجليد لتجنب تكوين هلام.
ملاحظة: لامينين غير مخفف يصبح صلبة عند درجة حرارة فوق 8 درجات مئوية. - تمييع في لامينين الأسهم (0.5 ملغ/مل) 01:50 مع الفوسفات مخزنة المالحة (دببس العقيمة دولبيكو) للحصول على تركيز نهائي 10 ميكروغرام/مل. تخزين laminin المخفف في مختبرين 12 مل في-20 درجة مئوية.
- إضافة laminin المخفف للآبار التي تحتوي على المجففة PDL. استخدم 1 مل لتغطية سطح 6-جيدا ومل 0.5 لتغطية الجزء السفلي من لوحات 12-جيدا. كوفيرسليبس، إضافة 400 ميليلتر من laminin المخفف إلى كوفيرسليبس لتحقيق التغطية السطحية.
- احتضان لوحات المغلفة في 37 درجة مئوية ح 2، إذا تم استخدام اللوحة في اليوم نفسه (طلاء سريع). إذا لم يكن كذلك، ختم اللوحات مع غلاف بلاستيكي، وتخزين بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية (طلاء بطيء).
ملاحظة: ختم أمر حاسم لتجنب التلوث والتجفيف. - إزالة الحل لامينين بعناية مع ماصة لتجنب خدش السطح. تغسل برفق الآبار ثلاث مرات مع دببس العقيمة.
- إضافة وسائط النمو الدبقية كاملة لكل الخير والحفاظ على اللوحات في 37 درجة مئوية حتى على استعداد لإضافة تعليق الغانية.
ملاحظة: يسين بولي-د و laminin مغلفة لوحات يمكن تخزينها لمدة 3 أيام في 4 درجات مئوية. معطف اللوحات قبل عدة أيام وثم تخزينها في 4 درجات مئوية، وتغسل اللوحات مع دببس العقيمة ثلاث مرات. إضافة 2 مل دببس العقيمة لكل بئر بعد الغسيل النهائي. ختم اللوحة مع بارافيلم ومخزن في 4 درجات مئوية. من الضروري التأكد من أن تجف لامينين لا.
3-إعداد حلول العزل
- إعداد الحل الانفصال يدتا/حبيس/دببس. 500 مل من الحل، استخدم دببس العقيمة (دون الكالسيوم والمغنيسيوم) لجعل حل نهائي يدتا حبيس و 5 ملم 10 ملم. لمل 490 من دببس، إضافة 5 مل م 1 حبيس المخزن المؤقت و 5 مل من 0.5 م يدتا الأسهم الحل. تخزين في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
- تعد وسائل الإعلام استثارة الخلايا الدبقية باستخدام المواد الكيميائية المدرجة في الجدول 1.
- إعداد وسائط النمو الدبقية باستخدام الكواشف ترد في الجدول 2.
ملاحظة: يمكن تخزين وسائط النمو الدبقية التي تحتوي على جدنف لمدة أسبوع واحد في 4 درجات مئوية.
4-إزالة الجزء المعوي
ملاحظة: سمح الفئران حرية الوصول إلى الغذاء والماء قبل يوثانيزيشن بأسلوب إسقاط isoflurane وإزالة جهازا حيويا. وقد استخدمت الفئران C57BL/6 أكبر من 8 أسابيع عمر. وقد استخدمت كلا الجنسين دون اختلافات ملحوظة في الإعداد.
- Euthanize الماوس مع جرعة زائدة من إيسوفلوراني ومكان ضعيف في علبة تشريح. دبوس في الأطراف وتعقيم البطن مع الإيثانول 70%. خيمة الجلد بالملقط ثم قم بفتح البطن مع المقص.
- رفع الكبد وتحديد القاصي المعدة/بواب. قم بإزالة 7 سم الأمعاء الدانية. كن حذراً لا للدموع الأمعاء.
-
اضغط بواب مع الملقط أثناء القص بعيداً في مساريق.
- استخدام تشريح حادة مع الجزء الخلفي من مقص كشط البنكرياس ملتصقة بعيداً.
- ضع الجزء المعوية في دببس المثلج دون Ca2 + أو Mg2 + (الشكل 1A).
ملاحظة: شرائح أخرى من الأمعاء أو القولون يمكن أيضا إزالتها باستخدام نفس الأسلوب.
- استخدام حقنه 5 أو 10 مل المرفقة بإبرة ز 20 نهاية حادة لطرد محتويات البراز مع الجليد الباردة دببس (الشكل 1B).
- تقسيم الأمعاء إلى شرائح 3 سم لإزالة العضلات الطولية باستخدام هذه التقنية في البداية وصف سميث et al. 12 والمعدلة في سونداريسان et al. 10.
ملاحظة: تستخدم القطع المعوية من يصل إلى اثنين من الفئران كل 30 مل الحل العزلة حبيس/يدتا/دببس. - قطع حوالي 4 سم لفصل عصا خشبية من طرف القطن. نقع عصا خشبية في دببس (الشكل 1).
- كشف أحد قطاعات الأمعاء بسلاسة على عصا ترطب (الشكل 2 أ-ج).
- إزالة مساريق ملتصقة لا تزال تعلق باستخدام إبرة الآنف الملقط (الشكل 2D).
-
استخدام شفرة حلاقة نظيفة أو مشرط جعل نيكس طولية اثنين على طول الأمعاء حيث كان مساريق المرفقة (الشكل 2E).
- ويت نصيحة القطن مع دببس. فرك تلميح القطن ترطب طوليا على امتداد العضلات لتخفيف الضفيرة العضلية الطولية/مينتيريك (لممب). ثم حرك طرف القطن أفقياً ندف بعيداً لممب من العضلات دائرية على طول الجزء المعوية أثناء إزالة لممب.
- عقد غيض عصا بين الإبهام والسبابة حين استقرار الجزء بالإصبع الأوسط والرابع (الشكل 2 واو). عند الانتهاء، سيتم بسهولة تقشر لممب الجزء المعوية.
- تجاهل لممب جردت من الأنبوبة المعوية وتعلق على مسحه القطن إلا حصاد اجكس من الضفيرة myenteric هو المطلوب.
- استخدام شفرة حلاقة لأسلخ فتح الجزء المعوية طوليا لإزالة من عصا خشبية.
- تخزين الأنسجة المعوية جردت (غالباً الغشاء المخاطي وسوبموكوسا بالإضافة إلى العضلات دائرية) في دببس على الجليد. كرر الخطوات من 4، 4 – 4.11 حتى يتم إعداد جميع قطاعات الأمعاء.
5-إزالة الغشاء المخاطي طلائي
- قص الأمعاء إلى أجزاء أصغر من سم ~0.5 مع مقص جيد.
- وضع الأنسجة في أنبوب الطرد مركزي مخروطية عقيمة 50 مل تحتوي على 30 مل من المثلج يدتا/حبيس/دببس الحل.
- روك الحل التي تحتوي على الأنسجة عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في يميل ~ 60 في الدقيقة.
- قبل ترطيب ماصة بلاستيكية 5 مل من بيبيتينج المخزن المؤقت يدتا/حبيس/دببس صعودا وهبوطاً مرة واحدة، ومن ثم استخدام ماصة ترطب قبل "الماصة؛" الأنسجة والمخزن المؤقت تعليق صعودا وهبوطاً (تريتوريشن) 20 مرة لإزاحة المخاطية الظهارية.
- جمع الأنسجة من حضانة يدتا بصب هذا الخليط من خلال مصفاة خلية نايلون 100 ميكرومتر. تجاهل عكر مملوءة بالأغشية المخاطية التدفق من خلال (الشكل 3).
- ضع الأنسجة الإبقاء المصفاة في أنبوب 50 مل مخروطية أجهزة الطرد مركزي جديدة تحتوي على 30 مل جليد الباردة يدتا/حبيس/دببس استخدام الملقط إبرة الآنف.
- تكرار في الحضانة يدتا/حبيس/دببس لمرة ثانية بواسطة هزاز الأنسجة عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في ~ 60 يميل كل دقيقة لتجريد قبالة الأغشية المخاطية الظهارية إضافية.
- قبل ترطيب ماصة 5 مل مع المخزن المؤقت وثم "الماصة؛" تعليق الأنسجة صعودا وهبوطاً 20 مرة لإزاحة الخلايا المخاطية.
ملاحظة: سوف تميل الأنسجة إلى التمسك داخل ماصة كما تتم إزالة أكثر من الظهارة. - جمع الأنسجة بعد الحضانة الثانية بصب هذا الخليط من خلال مصفاة خلية نايلون 100 ميكرومتر وتجاهل التدفق من خلال. الثانية التدفق من خلال ينبغي أن تكون ملحوظة عكر أقل من الأول (الشكل 3).
- تكرار مسح إينكوبيشنز يدتا 10 دقيقة حتى يتم الحل تقريبا (حوالي 3 إلى 4 إينكوبيشنز تبعاً لكمية الأنسجة وفعالية تريتوريشن) (الشكل 3).
6-مجموعة من الخلايا الدبقية المعوي من الصفيحة بروبريا وسوبموكوسا
- نقل الأنسجة من مصفاة النايلون إلى أنبوب الطرد مركزي مخروطية 15 مل يحتوي على 5 مل حل الاسترداد الخلية المتاحة تجارياً والصخور لمدة 25 – 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
-
تريتوراتي برفق 10 العاشر لينأى بالخلايا الدبقية المعوي من بروبريا الصفيحة.
- التصفية من خلال عامل تصفية 40 ميكرومتر وجمع فيلتراتي في أنبوب 50 مل نظيفة.
- شطف الأنسجة على تصفية النايلون مع 1 مل دببس.
- تجاهل الأنسجة ونقل ~ 5 – 6 مل فيلتراتي إلى أنبوب الطرد مركزي مخروطية نظيفة 15 مل.
- تدور فيلتراتي في 2,000 س ز في دلو يتأرجح جهاز الطرد مركزي لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- إعادة تعليق بيليه الذي يحتوي على الخلية الدبقية في 1 مل على الأقل من المخزن المؤقت لاستثارة بلطف بيبيتينج بيليه صعودا وهبوطاً مع تلميح ماصة 500 ميليلتر. تجنب إدخال الفقاعات.
ملاحظة: ضبط حجم استثارة حسب الحاجة للعدد من الآبار ولوحات. على سبيل المثال، 1.2 مل للوح 6-بئر واحد؛ 2.4 مل لاثنين 6-جيدا لوحات؛ 2.4 مل للوح 12-بئر واحد. - "الماصة؛" 200 ميليلتر من تعليق خلية في كل بئر ميليلتر 6-جيدا أو 100 لوحات PDL-laminin المغلفة 12-جيدا التي تحتوي على وسائط النمو الدبقية.
- عدم الإزعاج الأطباق بعد إضافة الخلايا إلى اللوحات ووضع في حاضنة 37 درجة مئوية للسماح بالحد الأقصى لعدد من الخلايا للانضمام.
ملاحظة: سيتم إرفاق ضمن ح 6 – 8 إعداد خلايا صحية لكن انتظر 24 ساعة على الأقل قبل تغيير وسائط الإعلام بلطف بيبيتينج قبالة وسائل الإعلام جنبا إلى جنب مع الخلايا غير ملتصقة. - استخدام الخلايا لإجراء تجارب عليها 3-4 أيام بعد وضعها في الثقافة (الشكل 4). إجراء تحليل إيمونوفلوريسسينت باستخدام الأجسام المضادة التي تهم علامات البروتين محددة (الجدول 3). على سبيل المثال، استخدمت هنا توصيني، و S100b و p75NTR أو Sox10. ﻫ-كادهيرين أو الأجسام المضادة للعضلات الملساء ألفا أكتين استخدمت لتقييم درجة التلوث من أنواع الخلايا الأخرى.
7-تلوين إيمونوفلوريسسينت
- نضح وسائط الإعلام إيقاف الثقافات وشطف مرتين مع برنامج تلفزيوني.
- إصلاح الثقافات لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع بارافورمالدهيد 4%.
- إزالة مثبت وشطف ثم 3 مرات مع برنامج تلفزيوني.
- بيرميبيليزي الخلايا مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.2% X-100 تريتون في درجة حرارة الغرفة.
- احتضان الخلايا بيرميبيليزيد مع حلول حظر يتألف من الدجاج لمكافحة IgY، أرنب المضادة أو الماوس المضادة مفتش ح 2 في درجة حرارة الغرفة.
-
احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها، مثلاً، توصيني (1:1، 000).
- شطف الخلايا 3 مرات مع برنامج تلفزيوني. إذا كان أداء كولوكاليزيشن المضي قدما إلى الخطوة 7.7.
- احتضان المجموعة التالية من الأجسام المضادة الأولية على الأقل 2 ح في درجة حرارة الغرفة، ولكن يفضل أن يكون ذلك بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. استخدام إضعاف أرنب المضادة-S100 1: 1000 أو 1: 500 إضعاف الماوس المضادة-p75NTR.
ملاحظة: يتم إضعاف جميع الأجسام المضادة في برنامج تلفزيوني. - شطف الخلايا 3 مرات مع برنامج تلفزيوني لإزالة الأجسام المضادة الأولية. ثم احتضان الخلايا مشطوف مع المناسبة معلم فلوريسسينتلي الثانوي الأجسام المضادة ح 2 في درجة حرارة الغرفة (الجدول 3).
- شطف 3 مرات مع برنامج تلفزيوني لإزالة الأجسام المضادة الثانوية.
- جبل كوفيرسليبس على الشرائح باستخدام 1-2 قطرات من وسائل الإعلام المتزايدة مع DAPI وعرض الخلايا تحت مجهر فلوري.
8-التدفق الخلوي
- إزالة الخلايا الدبقية ملتصقة للتدفق الخلوي بدهن الخلايا مرة واحدة مع دببس ثم قم بإضافة 0.25% التربسين-يدتا في البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة. احتضان الخلايا في حل التربسين-يدتا في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 3 إنهاء عملية الهضم عن طريق جمع الخلايا في الخلية الدبقية كاملة النمو وسائط الإعلام.
- جمع الخلايا من سينتريفوجينج في 400 x ز لمدة 5 دقائق، ومن ثم إعادة تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني.
- إصلاح الخلايا مع بارافورمالدهيد 4% لمدة 10 دقائق وثم بيرميبيليزي بنسبة 0.2 في المائة X-100 تريتون في برنامج تلفزيوني كما هو موضح في "الخطوة 7، 4".
- كتلة الخلايا مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 1% جيش صرب البوسنة والمناعي أنسجة محددة 20 دقيقة، مثل الدجاج IgY (IgG) (H + L) (1:1، 000) من حمار المضادة أو حمار الماعز المضادة IgG (H + L) (1:1، 000).
- احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية توصيني (1:2، 000)، ه-كادهيرين (1: 400)، والعضلات الملساء α أكتين (1: 500)، أو Pgp9.5 (1: 500) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
-
يغسل الجسم مع برنامج تلفزيوني.
- احتضان المجمع ضد مستضد مع الأضداد الموسومة فلوريسسينتلي الثانوية المحتضنة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
- استخدام قاسمة منفصلة من الخلايا المحتضنة مع الجسم المضاد الثانوي ليكون بمثابة عنصر التحكم ايستب. كل السكان من الخلايا يتم غسلها وحراكه في برنامج تلفزيوني قبل التدفق الخلوي.
- تحليل السكان اثنين من الخلايا على سيتوميتير تدفق خلال النابضة على الخلايا الحية.
9-إعداد "الأنسجة الماوس" من هجفاب-Cre:tdTomato الفئران
ملاحظة: كدنا لوكس-توقف-لوكس-تدتوماتو هو أعرب من روزا موضع22،23 (مختبرات جاكسون، #007914) ويولد fluorescence الذاتية عندما ولدت لماوس معربا عن ريكومبيناسي لجنة المساواة العرقية (Cre-هجفاب). يتم إجراء تحليل في الموقع عن طريق إنشاء أقسام الأنسجة المجمدة.
- إصلاح الأنسجة المعوية في بارافورمالدهيد 4% ح 1 ويذوي ثم بين عشية وضحاها في السكروز 1 م في برنامج تلفزيوني.
- تضمين الأنسجة في تجارياً بشراء قطع الأمثل الأنسجة (OCT) مركب يتكون من 10% البولي فينيل الكحول و 4.2 في المائة البولي إيثيلين غليكول، والأداة ثم تجمد في النتروجين السائل.
- إعداد 5 ميكرومتر كريوسيكشنز ومن ثم تحميل باستخدام أنتيفادي تركيب وسائط مع DAPI.
- للتدفق الخلوي، إعداد اجكس من هجفاب-الفئران Cre:tdTomato+ كما هو موضح في الخطوات 4.1-6.5.
- تريبسينيزي الخلايا من اللوحة بعد 3 أيام في الثقافات كما هو الحال في "الخطوة 8، 1" ومن ثم إصلاحها لمدة 10 دقائق في بارافورمالدهيد 4%.
- تحليل الخلايا المعزولة من الفئران سلبية لجنة المساواة العرقية بالتوازي مع الخلايا المعزولة من هجفاب-الفئران Cre:tdTomato+ على سيتوميتير تدفق.
ملاحظة: تم تشييد البوابات لتجنب الخلايا الميتة والحطام.
10-Ca2 + الجريان التصوير
- احتضان اجكس مطلي على لوحة 24-جيدا مع 3 ميكرومتر فلوو-4-صباحا عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- صورة Ca2 + الإشارة في حل تم شراؤها تجارياً تيرودي استخدام مجهر [كنفوكل] قرص غزل وآثاره الطول موجي 480 نانومتر (F480) بعد إضافة الببتيد CCK أو جاسترين. وذكر تحليل الصور في سونداريسان et al. 10 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
محضرات تعتبر ناجحة إذا لم تتقيد توصيني + الخلايا وتنتشر داخل ح 24 (الشكل 4 أ). تعذر تحديد عدد الخلايا الدبقية حتى بعد 24 ساعة عند الخلايا التقيد، وأظهرت الأدلة ينتشر في المجاميع مسطحة (الشكل 4 باء). الخلايا عند الحافة من المجموعات التي تميل إلى توسيع عمليات طويلة، وأعرب عن علامات الكلاسيكية الدبقية، مثلاً، توصيني، S100b و p75NTR (الشكل 4، 4 د)10،16. يوما بعد يوم 2nd ، تلتزم الخلايا الدبقية أحكام السطح السماح للسكان غير المنتسب أن تشطف بعيداً مع برنامج تلفزيوني. كانت معظم العائمة الخلايا الظهارية والصفيحة بروبريا الخلايا جنبا إلى جنب مع خلية الحطام. وجود هذه كتل الخلايا العائمة خفض عائد الخلايا الدبقية ملتصقة مما يؤكد أهمية إجراء إينكوبيشنز يدتا حتى التدفق عبر واضحة تقريبا، مما يشير إلى أن الخلايا الظهارية قد أزيلت من الصفيحة بروبريا الأساسية. وباﻹضافة إلى ذلك، الطرد المركزي بسرعة أقل من س 1,500 ز بعد حضانة في حل استرداد خلية لم فعالية تجمع كافة الخلايا قادرة على البقاء إلى بيليه مما أدى إلى انخفاض المحاصيل. عادة، خلايا 40,000 إلى 100,000 شكلياً متسقة مع اجكس التقيد بشدة يوم 3 في الثقافة.
التحليل المناعي مع الأجسام المضادة المرتبطة الدبقية، أشارت إلى أن الخلية المجموعات التي ظلت ملتصقة بيوم 3 كانت توصيني، S100b، والجوارب 10 إيجابية10،16 (الشكل 5A). في الدراسة الحالية، وقد لوحظ هذا نفس درجة النقاء بيرميبيليزينج الخلايا وتحليلها بالتدفق الخلوي (الشكل 5B-F). وكشف التدفق الخلوي فورا بعد عزل الخلايا الدبقية بروبريا submucosal/الصفيحة، أن حوالي 51 في المائة الخلايا، كانت توصيني + (الشكل 5B)، مما يوحي بوجود أنواع الخلايا السلبية توصيني، مثلاً، الظهارية، المكونة للدم، خلايا بطانية، والخلايا العصبية، myofibroblasts معروفة موجودة في ظهارة والصفيحة بروبريا. وبعد 3 أيام في الثقافة، يمثل عدد الخلايا توصيني + أكثر من 95% من السكان خلية تحليل بعد إزالة الوسائط الأصلية، الشطف بلطف مع برنامج تلفزيوني ومن ثم إضافة وسائط جديدة (الشكل 5). من المثير للاهتمام، كشف تحليل التدفق العالية والمنخفضة توصيني معربا عن البروتين السكان (الشكل 5). وفي الواقع، كشف تحليل إيمونوفلوريسسينت الخلايا أن هامش الكتل تميل إلى التعبير عن مستويات أعلى من توصيني (الشكل 4، 4 د). أخذت معا، هذين النوعين من التحليل قد تشير إلى اختلافات في حالة النضج أو التمايز الغانية. جماعياً، النسبة مئوية α-SMA + (علامة خلية أرومية)، ه-كادهيرين + (علامة الخلايا الظهارية)، و Pgp 9.5 + الخلايا (الخلايا العصبية ماركر) كان أقل من 5% (الشكل 5-F). تتفق هذه النتائج مع الدراسة السابقة إجراء باستخدام وسم إيمونوفلوريسسينت من اجكس عرض حوالي 93% توصيني + الخلايا 10. ويؤكد تحليل تدفق أهمية السماح للخلايا على التمسك باللوحات نظراً لأنها تتيح إزالة تلويث السكان خلية تضم حوالي 5% الثقافات.
وكان هدف في هذه الدراسة استخدام مراسل توصيني المنشط لتسهيل التدفق الخلوي للخلايا لمزيد من التحليل ومقارنة درجة تخصيب الغانية باستخدام علامة نيون ذاتية (الشكل 6). ووصف عبث وزملاء العمل 20أصلاً السطر الماوس هجفاب-لجنة المساواة العرقية. باختصار، وضعت recombinase لجنة المساواة العرقية تحت سيطرة 2.2 كيلو بايت من المروج البشرية الدبقية البروتين حمض فيبريلاري (هجفاب). وهكذا، أعرب أية خلية تدوين هذا المروج هجفاب تدتوماتو مراسل الفلورسنت الأحمر. وكان السكان الخلية المسمى مع المراسل تدتوماتو تصور في الموقع باستخدام الأجزاء المجمدة من الأمعاء والقولون (الشكل 6A، 6B) قبل القيام بإجراءات عزل الغانية المذكورة أعلاه. بعد القيام بعزل الانتعاش يدتا/خلية واستزراع الخلايا لمدة 3 أيام، حددت اجكس من هذه الفئران بسهولة على الأسفار الذاتية (الشكل 6). على الرغم من أن توصيني + خلايا أكثر عددا في الأمعاء الدانية4،21بالقول، تدتوماتو + اجكس لوحظت أيضا في القولون (الشكل 6B). تدتوماتو+ المراسل الفلورسنت تفعيلها من خلال هجفاب-لجنة المساواة العرقية باستخدام كشف أيضا عن عدد سكانها ثنائي الصيغة هجفاب-تدتوماتو + الخلايا (الشكل 6) كما لاحظ استخدام تحليل إيمونوفلوريسسينت توصيني البروتين (الشكل 5). على الرغم من أن أفيد بأن اجكس ليست كلها تعبر عن توصيني البروتين4، هذه النقطة قد تعكس الاختلافات في مستوى التعبير توصيني. في المتوسط، حوالي 66% خلايا تحليل أظهرت أعلى مستوى من الأسفار تدتوماتو. ولذلك، يمكن استخدام البروتوكول الاسترداد يدتا/خلية لعزل مجموعات فرعية اجكس في جميع أنحاء الأمعاء الدقيقة والقولون المسمى من قبل مراسل لدراسة الاختلافات في التعبير الجيني.
هذا البروتوكول إنشاء عدد كاف من الخلايا الدبقية نقي نسبيا توصيني + الدراسات البيوكيميائية وتحليل لطخة غربية 10-لإثبات استجابة الخلايا الدبقية، عومل الإعدادية خلية الدبقية 3 أيام مع الهرمونات سيكريتين (CCK) أو جاسترين للحث على Ca2 + الجريان (الشكل 7 ألف-7B)10. وأظهرت النتائج أن هذه الخلايا ملتصقة توصيني + استجابت ليضع خارج الخلية مما يدل على قدرتها على معرض الدالة الدبقية المعوية المعروفة.
رقم 1: تعيين أعلى وإعداد الماوس الأمعاء. (أ) صورة من العزلة التي تم إعدادها على الجليد بما في ذلك الأمعاء المستخرجة. (ب) صورة من 5 مل-حقنه المرفقة بإبرة حادة نهاية 20 غ لطرد محتويات البراز. (ج) نهاية Engineered مسحه القطن خشبية (~ 4 سم) في المخزن المؤقت دببس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: الخطوات المستخدمة لتنظيف الأمعاء وإزالة الضفيرة العضلية الطولية/مينتيريك (لممب)- (أ-ج) انزلاق جزء الأمعاء على عصا خشبية ترطب. (د) إزالة مساريق ملتصقة. (ﻫ) نيكينج الأمعاء بشفرة حلاقة. (و) إزالة لممب مع مسحه القطن رطبة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: الأقدام تدفق متتابعة بعد يدتا إينكوبيشنز- سيظهر أمثلة الأقدام التدفق من 4 إينكوبيشنز متسلسلة باستخدام ثلاثة أجزاء الأمعاء 7 سم المحتضنة لمدة 10 دقائق مع 5 مم يدتا/10 مم حبيس في دببس وثم يسحق 20 مرة. يتم إظهار الأقدام تدفق الممثل بعد سكب من خلال مصفاة مش نايلون 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: صور EGC 24 ساعة بعد الطلاء. ضوء الفحص المجهري للخلايا حراكه ح 24 بعد الطلاء. تظهر (A) مثال ممثل الإعدادية الفقراء عرض كتل الخلايا الظهارية العائمة (سهم) والحطام. لم يلاحظ أي ملتصقة اجكس بعد 24 h. (ب) تظهر مثال ممثل للإعدادية ممتازة ح 24 بعد عزلة الخلية واستثارة التي تلتزم بقع من اجكس PDL/Laminin مغلفة بلوحات. تم القبض على الصور في مجهر فلوري مقلوب مع كاميرا رقمية. تغيير حجم أشرطة = 500 ميكرومتر (أ-ب). (ج) عالية الطاقة ويرى تصحيحًا للخلايا EGC ملطخة بجسم توصيني (الأخضر) عرض الخلايا في المحيط بكثافة أعلى من وضع العلامات. وأظهرت العديد من الخلايا نويات مزدوجة (رأس السهم، DAPI، أزرق). (د) "كولوكاليزيشن من توصيني" (الأخضر) مع S100 (أحمر) أو p75NTR (أحمر). تغيير حجم أشرطة = 20 ميكرومتر (ج-د). وقد شنت الخلايا مع كاشف أنتيفادي و DAPI (نويات الأزرق). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: التدفق الخلوي للخلايا الدبقية المعوية المعزولة من بروبريا الصفيحة الإثناعشرية الماوس الكبار- الفلورة توصيني (A)، و S100B، و Sox10 على الثقافات الغانية بعد 3 أيام. تشير الأسهم إلى 10 الجوارب النوى إيجابية. تغيير حجم أشرطة = 20 ميكرومتر (تستخدم بإذن من سونداريسان et al. 10)-(ب) "النسبة المئوية توصيني" الخلايا إيجابية قبل الطلاء على ألواح المغلفة (كثافة الأسفار (أو الأمام مبعثر، المحور س) مقابل الجانب مبعثر المحور (ص). (ج) النسبة المئوية توصيني الإيجابية (د) α-SMA الإيجابية (ه) ه-كادهيرين الإيجابية (F) والطلاء دايسافتير الخلايا إيجابية 3 Pgp 9.5. وشيدت بوابات لتجنب الخلايا الميتة والحطام. يظهر هو متوسط النسبة المئوية للسكان الفلورسنت مقارنة بعدد الخلايا (الجانب مبعثر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 6: تحديد الخلايا الدبقية المعوية المعزولة من بروبريا الصفيحة الإثناعشرية من هجفاب-لجنة المساواة العرقية+: الماوس الكبار تدتوماتو+ - تم القبض على الصور (أحمر) الفلورسنت تدتوماتو الذاتية في مرحلة تباين مجهر فلوري مع كاميرا رقمية في الأمعاء (A). (داخلي) نفس باستثناء اندمجت مع الصورة DAPI (نويات الأزرق). (ب) القولون اندمجت مع DAPI. (ج) المعوية الخلايا الدبقية (أحمر) المعزولة من هجفاب-Cre:dtTomato+ الفئران ومثقف لمدة 3 أيام على الركازة PDL/لامينين. تغيير حجم أشرطة = 50 ميكرومتر. (د) سيتوميتريك تحليل تدفق الخلايا تدتوماتو. يظهر هو % يعني من الخلايا ± توصيني + وزارة شؤون المرأة لاستعدادات مختلفة 3 (الفئران 3 كل الإعدادية). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 7: تدفق الفيديو من Ca2 + بعد العلاج الهرموني. اجكس مطلي PDL 24-جيدا و laminin مغلفة ألواح تم مثقف في وسائط النمو الدبقية لمدة 3 أيام. الخلايا كانت محملة مسبقاً مع 3 ميكرومتر Fura-2-صباحا لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية وثم تعامل مع () 100 نانومتر سيكريتين (CCK) أو (ب) 100 جاسترين شمال البحر الأبيض المتوسط. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
| المكونات | وحدة التخزين المراد إضافتها | التركيز النهائي |
| DMEM/F12 | مل 44.5 | _ |
| مصل الدم البقري الجنين (FBS) | 5 مل | 10 ٪ |
| البنسلين-ستربتوميسين | 500 ميليلتر | 100 وحدة دولية/مل القلم |
| ستربتوميسين | بكتيريا 100 ميكروغرام/مل | |
| الجنتاميسين (50 ملغم/مل الأوراق المالية) | 20 ميليلتر | 20 ميكروغرام/مل |
الجدول 1: تكوين الخلية الدبقية استثارة وسائل الإعلام.
| المكونات | وحدة التخزين المراد إضافتها | التركيز النهائي |
| DMEM/F12 | 44 مل | _ |
| مصل الدم البقري الجنين (FBS) | 5 مل | 10 ٪ |
| البنسلين-ستربتوميسين (100 x) | 500ΜL | 100 وحدة دولية/مليلتر (القلم) |
| 100 ميكروغرام/مل (بكتيريا) | ||
| الجنتاميسين (50 ملغم/مل الأوراق المالية) | 20 ميليلتر | 20 ميكروغرام/مل |
| جدنف (10 ميكروغرام/مل الأوراق المالية) | 50 ميليلتر | 10 نانوغرام/مل |
| لام-الجلوتامين (الأسهم 200 ملم) | 500ΜL | 2 مم |
الجدول 2: تكوين وسائط النمو الخلايا الدبقية.
| المكونات | تمييع الفلورة | التدفق الخلوي تمييع |
| دجاج مكافحة--توصيني | 1 إلى 500 | 1-2000 |
| أرنب المضادة-S100 | 1 إلى 500 | 1 إلى 500 |
| الماوس المضادة-p75 NTR | 1 إلى 500 | 1 إلى 500 |
| ماعز المضادة-ه-كادهيرين | 1 إلى 400 | |
| الماوس المضادة-Pgp9.5 | 1 إلى 500 | |
| أكتين العضلات المضادة سلسة الماعز | 1 إلى 500 | |
| فلور أليكسا 488 الماعز المضادة الدجاج IgY | 1 إلى 1000 | 1 إلى 1000 |
| مفتش أليكسا فلور 568 الماعز المضادة الماوس | 1 إلى 1000 | 1 إلى 1000 |
| فلور أليكسا 594 أرنب حمار المضادة مفتش | 1 إلى 1000 | |
| مفتش أليكسا فلور 488 حمار المضادة الماعز | 1 إلى 1000 |
الجدول 3: قائمة بالأجسام المضادة
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
اجكس تلعب أدواراً هامة في التوازن القناة الهضمية، ومن الضروري أن عزل ودراستها في المختبر. في هذا البروتوكول، قدم طريقة بسيطة لعزل اجكس من بروبريا الصفيحة الأمعاء الماوس الكبار لدراسة وظيفة الدبقية المعوي.
إزالة مساريق ملتصقة ولممب مع مسحه القطن يزيل بعض من إطلاق إنتر-myenteric المقيمين بين العضلات الطولية والدائرية، ويزيد من إمكانية الوصول إلى المخازن المؤقتة إلى السطح سوبموكوسال ويزيل الكثير من الشعيرات الدموية أكبر . هذا الأخير يقلل من عدد خلايا الدم الحمراء تلويث الثقافات النهائي. سلسلة إينكوبيشنز يدتا قطاع بعيداً في الغشاء المخاطي الظهارية تعريض بروبريا الصفيحة وإطلاق سوبموكوسال، الذي يمكن أن يكون هشا بعد التعرض للحلول شيلاتينغ. التحريض أما بالهز أو فورتيكسينج أو تريتوراتينج (المتكررة صعودا وهبوطاً بيبيتينج) يجب تنفيذها بدقة وفي الوقت المناسب لتجنب الضرر المفرط للخلايا. واستخدمت تريتوريشن هنا لأن الأسلوب الذي أسفر عن عائد أكثر اتساقا من الخلايا الدبقية ملتصقة، وقابلة للحياة. هز تميل إلى إدخال فقاعات والحد من صلاحية خلية تقييم شكلياً بخلية التمسك بلوحات المغلفة. يجب أن تكون قطع الأنسجة إلى قطع < 0.5 سم فعالية تريتوراتي الأنسجة مع ماصة 5 مل.
عموما، سم 7 شرائح من الفئران على الأقل 3 كافية لتوليد ما يكفي اجكس لتغطية لوحة 6-بئر واحدة في حوالي 20-30% كونفلوينسي، التي يمكن استخدامها بعد ذلك إيمونوسيتوتشيميستري وقبكر. ومع ذلك، قد يلزم المزيد من الخلايا لأساليب الكيمياء الحيوية مثل البقع الغربية تبعاً لمستوى التعبير الجيني درس. وعلى الرغم من نوع الكولاجين 1 أو تم فحص ماتريجيل بإيجاز كبديل للركيزة بولي-د-يسين/لامينين، لوحظ مزيد من الانضمام للسكان الخلايا الظهارية، في نهاية المطاف زيادة تلوث ثقافات الغانية بأنواع الخلايا الأخرى . وبالإضافة إلى ذلك، لم تلتزم بحزم اللوحات الكولاجين من النوع 1 وتم فكها بسهولة من على سطح الأرض عند تغيير الوسائط. فيبرونيكتين هو الركيزة الأخرى التي قد تستخدم24، ولكن كان لم تختبر هنا. لامينين يبدو أن يعزز الربط والتفريق بين العصبية كريست اشتقاق خلايا25. ومع ذلك، يمكن أن تختلف الكثير من لامينين، التي تؤثر على الخلية الانضمام والغلال. التلوث الميكروبي للثقافات وقع حوالي 5 في المائة الوقت، وأبقى إلى الحد أدنى باستخدام الكواشف معقمة وتقنية والمضادات الحيوية. وكان استخدام الكاشف الفطور اختياري.
القيد الرئيسي من البروتوكول هنا توحيد الانفعالات لإزالة ظهارة دون إتلاف اجكس الكامنة. وعلاوة على ذلك، لا يمكن إجراء تقييم للإعداد فورا نظراً لأنه يعتمد على خلية التمسك بلوحات المغلفة. وتشمل ثلاثة مجالات للتركيز على عند استكشاف الأخطاء وإصلاحها: 1) استخدام الطازجة PDL ولامينين معطف اللوحات؛ 2) التقليل إلى أدنى حد من الوقت من تشريح لبداية إينكوبيشنز يدتا بزيادة عدد مساعدي؛ 3) قياس الوقت والطريقة المستخدمة تحرض الأنسجة لفعالية إزالة الظهارة ومن ثم اجكس. تمديد الوقت في أي من هذه الخطوات يزيد من هشاشة الغانية واحتمال أنهم سوف لا استرداد عند مطلي في وسائط النمو. على الرغم من أن استخدم الأسلوب تريتوريشن لننأى الظهارة هنا، تهز فورتيكسينج تم أيضا اختبار ومع نتائج غير متناسقة ربما لأنها عامل أكثر اعتماداً ويصعب قياسها كمياً. متى مطلي عائد الخلايا ملتصقة كان أكبر إذا كانت الخلايا لا انزعج ح 16 – 24.
تعديل طريقة عرض هنا وفقا للدراسة الأصلية قبل سميث et al. 12، الذي ركز على عزل في لممب. استخدم نهج سميث هنا فقط لإزالة وتجاهل لممب حيث أنه سوف تنشأ معظم الخلايا الدبقية معزولة من سوبموكوسا وبروبريا الصفيحة. وباﻹضافة إلى ذلك، دون الهضم الأنزيمي، اجكس myenteric غير المحررة سهولة12. ومع ذلك، نظراً لوجود لا علامات محددة ل myenteric مقابل إطلاق سوبموكوسال، لا يمكن استبعاد وجود الخلايا الدبقية من الضفيرة إنتر-myenteric. وأفادت روزنباوم et al. سيتوميتريك تحليل لتدفق اجكس معربا عن البروتين المعزز الفلورية الخضراء (اجفب) من المروج هجفاب. أنها تستخدم الفئران الصغار جداً (اليوم السابع بعد الولادة) ومعزولة اجكس من الأمعاء كلها بالهضم الأنزيمي19. وبالإضافة إلى ذلك، تم إجراء تحليل تدفق سيتوميتريك بعد أسبوعين من الحفاظ على الظروف التي تشجع على تشكيل نيوروسفيري التعويم الحر. على الرغم من أن الكتاب ذكر أن نيوروسفيريس أعربت عن الغاية توصيني و S100b، المجاميع الخلية عائمة بشدة أيضا أعرب عن α-SMA، مما يوحي بأن تشجيع توسيع السكان خلية أرومية جليوسفيري التنمية في المقابل مورفولوجية مثل ورقة مسطحة الموصوفة هنا. ولذلك، بينما مثيرة للاهتمام، الدراسة ليست قابلة للمقارنة مباشرة لهذا البروتوكول. وفي المقابل، مقرونا مورفولوجيا الخلايا α أقل بشكل ملحوظ-SMA + الخلايا توحي أن اجكس الموصوفة في هذا البروتوكول لا يحمل مورفولوجية ثلاثية الأبعاد خلال فترة الثقافة 3 إلى 5 أيام. على الرغم من ذلك، استخدام البروتوكول هنا والأسلوب روزنباوم مراسل فلورسنت لتحديد وعزل توصيني + الخلايا التي ستحسن قدرة المحقق أن تعيش الخلية التنميط.
وفي الختام، يصف البروتوكول الحالي بعزل الخلايا الدبقية المعوي من سوبموكوسا استخدام نهج غير الانزيمية. بروتوكول كامل يأخذ حوالي 3 ح من تشريح الماوس للطلاء الأولى على لوحات زراعة الأنسجة المغلفة مسبقاً. معظم الوقت خطوة مكثفة في البروتوكول هو إزالة وإعداد الأمعاء للاحتضان يدتا الأولى. من المستحسن إعداد اللوحات وتخزينها في دببس. نجاح الإعداد يتوقف على كفاءة إزالة الظهارة دون الأضرار اجكس الأساسية والتمسك بلوحات PDL/Laminin المغلفة داخل 24 h. "اجكس الأولية" مفيدة للدراسات في المختبر مثل تحليل الكيمياء الحيوية، Ca2 + الدفقات وترانسفيكشنز أدينوفيرال10. ومن المتوقع أن القدرة على عزل اجكس من سوبموكوسا أو لممب سوف تسمح بإجراء مزيد من الدراسات لتحديد الاختلافات في خصائص النمو الغانية، والتمايز والتشكل باستخدام النهج الجينوم كله.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
الكتاب أتمنى أن نعترف بدعم من DK045729 R37 (إلى جلم)، AR060837 R01 (إلى HX) وجامعة ميشيغان الجهاز الهضمي بحوث مركز الجزيئية الأساسية P30 DK034933.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-D lysine (1 mg/mL stock) | Sigma | A-003-E | Dilute 1:10 |
| Laminin (0.5 mg/mL stock) | Sigma | L4544 | Dilute to 10 µg/mL on ICE |
| EDTA (0.5 M) | Lonza | 51201 | Dilute 1:100 in DPBS |
| HEPES (1 M) | Corning | 36216004 | Dilute 1:100 in DPBS |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | HyClone | SH30028.02 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Gentamicin (50 mg/mL stock) | Life Technologies | 15750060 | |
| GDNF (10 µg stock) | Sigma | SRP3200 | |
| L-Glutamine (200 mM stock) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Chicken anti-GFAP | Thermo Fisher Scientific | PA1-10004 | |
| Goat anti-a-Smooth Muscle Actin | Abcam | ab112022 | |
| Mouse anti-Pgp9.5 | Novus Biologicals | NB600-1160 | |
| Goat anti-E-cadherin | R&D Systems | AF748 | |
| Rabbit S100 | Abcam | ab34686 | |
| Mouse p75 NTR | Millipore | MAB5592 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Chicken IgY | Invitrogen | A-11039 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG | Invitrogen | A-11055 | |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11004 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | R-37119 | |
| Prolong Gold antifade Reagent with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Fungizone (Amphotericin B) 250 µg/mL | Life Technologies | 15290-018 | |
| L-Fura-2-AM | Invitrogen | F-14201 | |
| CCK peptide | Anaspec, Fremont, CA | AS-20741 | |
| Gastrin peptide (Gastrin-17) | Abbiotec, Bloomington, IN | 350188 | |
| Nylon Mesh Celll Strainer (100 µm) | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Nylon Mesh Celll Strainer (40 µm) | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Disposable Serologic Pipet 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-056 |
References
- Grubisic, V., Gulbransen, B. D. Enteric glia: the most alimentary of all glia. Journal of Physiology. 595 (2), 557-570 (2017).
- Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 9 (11), 625-632 (2012).
- Rao, M., et al. Enteric Glia Regulate Gastrointestinal Motility but Are Not Required for Maintenance of the Epithelium in Mice. Gastroenterology. 153 (4), 1068-1081 (2017).
- Rao, M., et al. Enteric glia express proteolipid protein 1 and are a transcriptionally unique population of glia in the mammalian nervous system. Glia. , (2015).
- McClain, J., et al. Ca2+ responses in enteric glia are mediated by connexin-43 hemichannels and modulate colonic transit in mice. Gastroenterology. 146 (2), 497-507 (2014).
- Cunha Franceschi, R., et al. Enteric glial reactivity to systemic LPS administration Changes in GFAP and S100B protein. Neuroscience Research. 119, 15-23 (2017).
- Kabouridis, P. S., et al. Microbiota controls the homeostasis of glial cells in the gut lamina propria. Neuron. 85 (2), 289-295 (2015).
- Yu, Y. B., Li, Y. Q. Enteric glial cells and their role in the intestinal epithelial barrier. World Journal of Gastroenterology. 20 (32), 11273-11280 (2014).
- Clairembault, T., et al. Enteric GFAP expression and phosphorylation in Parkinson's disease. Journal of Neurochemistry. 130 (6), 805-815 (2014).
- Sundaresan, S., et al. Gastrin Induces Nuclear Export and Proteasome Degradation of Menin in Enteric Glial Cells. Gastroenterology. 153, 1555-1567 (2017).
- Gulbransen, B. D. Enteric Glia: The Origin of Duodenal Gastrinomas? Gastroenterology. , (2017).
- Smith, T. H., Ngwainmbi, J., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. An in vitro preparation of isolated enteric neurons and glia from the myenteric plexus of the adult mouse. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In situ Ca2+ imaging of the enteric nervous system. Journal of Visualized Experiments. (95), (2015).
- Bernstein, C. N., Vidrich, A. Isolation, identification, and culture of normal mouse colonic glia. Glia. 12 (2), 108-116 (1994).
- Jaeger, C. B. Isolation of enteric ganglia from the myenteric plexus of adult rats. Journal of Neural Transplantation & Plasticity. 5 (4), 223-232 (1995).
- Almond, S., Lindley, R. M., Kenny, S. E., Connell, M. G., Edgar, D. H. Characterisation and transplantation of enteric nervous system progenitor cells. Gut. 56 (4), 489-496 (2007).
- Ruhl, A., Trotter, J., Stremmel, W. Isolation of enteric glia and establishment of transformed enteroglial cell lines from the myenteric plexus of adult rat. Neurogastroenterology & Motility. 13 (1), 95-106 (2001).
- Boyen, G. B., et al. Distribution of enteric glia and GDNF during gut inflammation. BMC Gastroenterology. 11, 3 (2011).
- Rosenbaum, C., et al. Activation of Myenteric Glia during Acute Inflammation In Vitro and In Vivo. Public Library of Science One. 11 (3), e0151335 (2016).
- Zhuo, L., et al. hGFAP-cre transgenic mice for manipulation of glial and neuronal function in vivo. Genesis. 31 (2), 85-94 (2001).
- Boesmans, W., Lasrado, R., Vanden Berghe, P., Pachnis, V. Heterogeneity and phenotypic plasticity of glial cells in the mammalian enteric nervous system. Glia. 63 (2), 229-241 (2015).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Kabouridis, P. S., et al. The gut microbiota keeps enteric glial cells on the move; prospective roles of the gut epithelium and immune system. Gut Microbes. 6 (6), 398-403 (2015).
- Pomeranz, H. D., Sherman, D. L., Smalheiser, N. R., Tennyson, V. M., Gershon, M. D. Expression of a neurally related laminin binding protein by neural crest-derived cells that colonize the gut: relationship to the formation of enteric ganglia. The Journal of Comparative Neurology. 313 (4), 625-642 (1991).
