Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

בידוד תאי גליה המעית מן Submucosa פרופריה. מוסקולריס של העכבר למבוגרים

doi: 10.3791/57629 Published: August 15, 2018

Summary

כאן, אנו מתארים את ניתוקה של המעית-גלייה מ המעי-submucosa באמצעות incubations EDTA רציפים כדי chelate קטיונים דו ערכיים ולאחר מכן הדגירה ב פתרון שחזור תאים שאינם אנזימטיות. ציפוי התליה תא תוצאות על פולי-D-ליזין ו- laminin תוצאות בתרבות מועשר של תאי גליה submucosal לניתוח פונקציונלי.

Abstract

מערכת העצבים המעית (ENS) מורכב נוירונים, תאי גליה המעית (EGCs) הנמצאים בתוך שריר חלק מהקיר, submucosa וכן פרופריה. מוסקולריס. EGCs תפקיד חשוב הומאוסטזיס הבטן דרך שחרורו של גורמים שונים עם מחלות ולתרום השלמות של המכשול אפיתל. רוב המחקרים של תרבויות גליה המעית ראשי להשתמש בתאים מבודד של מקלעת myenteric לאחר דיסוציאציה אנזימטיות. . הנה, מתוארת שיטה שאינה אנזימטי לבודד, תרבות EGCs מן submucosa מעיים פרופריה. מוסקולריס. לאחר הסרה ידנית של שכבת שרירים אורכיים, EGCs היו שוחררה מן פרופריה. מוסקולריס submucosa באמצעות incubations EDTA באגירה HEPES רציפים ואחריו הדגירה ב פתרון שחזור תא הלא-אנזימטי זמינים מסחרית. Incubations EDTA הספיקו להתפשט רוב רירית אפיתל מ פרופריה. מוסקולריס ומאפשר את פתרון שחזור התא לשחרר את EGCs submucosal. כל שיורית פרופריה. מוסקולריס, שריר חלק גורש יחד עם עכשיו, דונלד myenteric. EGCs אותרו בקלות על ידי היכולת שלהם לבטא גליה חלבון חומצי fibrillary (GFAP). רק כ- 50% של התליה תא הכילה GFAP + תאים לאחר השלמת רקמות incubations ולפני ציפוי על המצע פולי-D-ליזין/laminin. עם זאת, לאחר 3 ימים של culturing תאי גליה neurotrophic תא-derived factor (GDNF)-המכיל תרבות המדיה, האוכלוסייה תא הקפדה על הלוחות מצופים המצע מורכבת > עכשיו, דונלד המעית 95%. יצרנו קו העכבר היברידית על ידי גידול עכבר hGFAP-Cre לקו כתב רוזה-tdTomato כדי לעקוב אחר האחוז של GFAP + תאים באמצעות קרינה פלואורסצנטית תא אנדוגני. לכן, עכשיו, דונלד המעית הלא-myenteric יכול להיות מבודדת על ידי שיטות שאינן אנזימטי ותרבותית למשך 5 ימים לפחות.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

עניין תפקוד תאי גליה המעית (EGCs) עלה בהתמדה עקב תפקידיהם מוכרת הבטן הומאוסטזיס של תקינות1,2. בנוסף, EGCs משתנים לפי המיקום שלהן לאורכו של GI בדרכי3,4. EGCs שחרר גורמים עם מחלות שונות, כולל גליה neurotrophic תא-derived factor (GDNF), לתרום בטן תנועתיות1,5 ולהגיב תוצרי לוואי מיקרוביאלי6,7. מחקרים הראו כי האוכלוסייה EGC היא הטרוגנית, כי תפקידם משתנה בהתאם אם הם submucosal או לשכון ב- the1,פלקסוס myenteric7. לדוגמה, EGCs בתוך submucosa לתרום צמתי צר8. מחלת פרקינסון, רומז שלהם קשר אפשרי פנוטיפ הבטן של הפרעה זו9היו קשורים דיפרנציאלי GFAP וביטוי זרחון במצב EGCs. . לאחרונה, זה היה ציין כי אובדן גברים חלבון גרעיני בתרבויות מבודד של EGCs מ- submucosa מעיים הפרוקסימלית היה מספיק כדי לגרום ביטוי של הורמון גסטרין10. כתוצאה מכך, הוצע כי EGCs עשוי להיות המקור של gastrinomas תריסריון, סוג של גידולים נוירואנדוקריניים10. באופן קולקטיבי, דוגמאות אלה מדגישים את הרלוונטיות של הלומדים את ההתנהגות והתפקוד של EGCs מבודדים הפרעות נאורופתיות ו סרטן11.

האתגר בשדה נשאר כיצד לבודד ולימודים או שניהם EGC אוכלוסיות במבחנה. השושלת מעקב ניסויים הראו כי EGCs submucosa, פרופריה. מוסקולריס שמקורם ובתאים מקלעת myenteric7. יש אמנם מספר פרוטוקולים בידוד שפורסמו זמין ליצירת תרביות של myenteric EGCs12,13,14,15,16,17, 18,19, לא במיוחד מטרות בידוד של האוכלוסייה EGC מוסקולריס submucosal/פרופריה. קיימים פרוטוקולים לבידוד EGC דוקא שילוב של ההפרדה מכני או את microdissection של שריר חלק בשילוב עם דיסוציאציה אנזימטיות, בסופו של דבר השמטת את שכבת תאי הרירית.

המטרה של כתב יד זה היא להדגים את השלבים לבודד שאינם enzymatically EGCs העיקרי של פרופריה. מוסקולריס ללימודי במבחנה . כיוון שיש אין סמני המבדילות באופן ספציפי myenteric EGCs מאלו submucosa, ההפרדה המרחבי של רירית אפיתל של שריר חלק נוצלה כדי לבודד submucosal EGCs. בנוסף, על ידי שילוב קלאציה EDTA עם דיסוציאציה אנזימטי, EGCs הם בודדו אותנו מהמתרחש submucosa בניגוד שריר חלק, אשר גורש יחד עם EGCs המשויך אינטר-myenteric. הפרדה נוספת של submucosa ושל EGCs פרופריה. מוסקולריס אירעה מאת culturing התאים על מצעים ידידותי תא גליה, למשל, פולי-D-ליזין ו- laminin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כל הניסויים המתוארים אושרו על ידי הוועדה של אוניברסיטת מישיגן השימוש ועל טיפול בבעלי חיים.

1. הכנת סטרילי פולי-D-ליזין (PDL) ופתרונות Laminin

  1. לפחות יום אחד לפני לתא הבידוד, להכין פולי-D-ליזין (PDL) laminin מצופה לוחות.
    הערה: 6-טוב וגם טוב 12 צלחות הוכנו בהתאם למטרות ניסוי. בדרך כלל, ובכן 12 צלחות שימשו לניתוח כמותי באמצעות שהכלים המערבי; בעוד 6-ובכן צלחות שימשו לאחסון בלוק coverslips (סטרילי) עבור אימונוהיסטוכימיה. ובכן 24 צלחות שימשו כדי תרבות EGCs עבור Ca2 + שטף הדמיה.
  2. לדלל מלאי פתרונות הנדסה גנטית תרביות רקמה בציון, נטולת DNase ומים ללא RNase בשכונה תרביות רקמה עם אוויר HEPA-מסוננים.
  3. לחיטוי coverslips זכוכית דקה
    1. להחזיק את coverslip עם מלקחיים סטרילי, לטבול coverslips בתוך 100% אתנול במשך 15 דקות אפשר האתנול להתאדות בשכונה תרביות רקמה ולאחר מכן מקם לוחית 6-. טוב.
    2. לחלופין, במקום מספר coverslips בנפרד על נייר סופג בעובי 2 מ מ מיכל פלסטיק ולאחר מכן אוטוקלב.

2. ציפוי לוחות

הערה: בצע את הפעולות הבאות תחת ברדס זרימה שכבתית תרביות רקמה סטרילי.

  1. הפשרת מניות PDL 1 מ"ג/מ"ל, לדלל 1:10 במים כיתה תרביות רקמה סטרילי, כך הריכוז הסופי הוא 100 µg/mL. השתמש 2 מ"ל לכל טוב כדי מעיל טוב 6 צלחות, 1 מ"ל לכיסוי טוב אחד של צלחת 12-ובכן, 0.5 mL עבור באר אחת לוחית 24-. טוב. החנות PDL מדולל הנותרים ב 12 מ ל aliquots ב-20 ° C.
  2. לאחר מתן אפשרות של PDL להרגיע את הבארות לפחות שעה, להסיר את PDL עם פיפטה סטרילי. לאפשר את הצלחות מהאוויר יבש לחלוטין תחת ברדס זרימה שכבתית תרביות רקמה.
    הערה: לאחר הסרת הפתרון PDL עם פיפטה סטרילי, זה יכול להיות בשימוש פעמיים יותר בתוך שבוע אחד לאחר עובר דרך מסנן מיקרומטר 0.22 ואחסון ב 4 º C.
  3. להפשיר את המניה laminin בקרח למנוע יצירת ג'ל.
    הערה: laminin מדולל הופך מוצק חימם מעל 8 ° C.
  4. לדלל את laminin מניות (0.5 mg/mL) 1:50 עם Dulbecco סטרילי פוספט Buffered מלוחים (DPBS) בריכוז הסופי של 10 µg/mL. לאחסן את laminin מדולל ב 12 מ ל aliquots ב-20 ° C.
  5. הוסף laminin מדולל לבארות המכיל מיובשים PDL. השתמש 1 מ"ל כדי לכסות את השטח 6-ובכן, 0.5 mL כדי לכסות את החלק התחתון של הלוחות 12-. טוב. על coverslips, להוסיף µL 400 של laminin מדולל coverslips כדי להשיג כיסוי משטחים.
  6. דגירה הלוחות מצופה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים, אם לצלחת משמש באותו היום (ציפוי מהירה). אם לא, לאטום הלוחות בניילון נצמד, לאחסן לילה ב 4 ° C (ציפוי איטי).
    הערה: איטום חיוני כדי למנוע ייבוש וזיהום.
  7. הסר את הפתרון laminin בזהירות עם פיפטה כדי להימנע מגרד את פני השטח. יש לשטוף בעדינות הבארות שלוש פעמים עם DPBS סטרילי.
  8. הוסף מדיה צמיחה גליה מלאה לכל טוב ולתחזק את הצלחות ב 37 ° C עד מוכן להוסיף את המתלים EGC.
    הערה: ליזין פולי-D ו- laminin מצופה לוחות ניתן לאחסן במשך 3 ימים ב- 4 מעלות צלזיוס. מעיל הלוחות מספר ימים מראש, ואז לאחסן ב 4 ° C, לשטוף הצלחות עם DPBS סטרילי שלוש פעמים. להוסיף 2 מ של DPBS סטרילי מכל קידוח לאחר כביסה הסופי. לאטום את הצלחת עם מצלמות-מיקרוסקופים וחנות ב 4 º C. זה חיוני כדי להבטיח כי laminin לא יתייבש.

3. הכנת פתרונות הבידוד

  1. להכין את הפתרון דיסוציאציה EDTA/HEPES/DPBS. עבור 500 מ"ל של הפתרון, להשתמש DPBS סטרילי (ללא סידן ומגנזיום) כדי ליצור פתרון סופי של EDTA HEPES ו- 5 מ מ 10 מ מ. 490 מ של DPBS, הוסף 5 מ של 1 מ' HEPES מאגר 5 מ של 0.5 M EDTA פתרון מניות. לאחסן ב 4 ° C עד השימוש.
  2. להכין את התקשורת resuspension תא גליה באמצעות של ריאגנטים המפורטים בטבלה1.
  3. להכין את הצמיחה גליה מדיה באמצעות של ריאגנטים המפורטים בטבלה מס ' 2.
    הערה: המדיה צמיחה גליה המכילה GDNF ניתן לאחסן במשך שבוע אחד ב 4 º C.

4. להסרת מקטע המעי

הערה: עכברים הורשו גישה חופשית מזון ומים לפני euthanization על ידי איזופלוריין טיפה שיטת הסרה של איבר חיוני. C57BL/6 עכברים גדול יותר בגיל 8 שבועות שימשו. שני המינים שימשו ללא הבדלים מורגש בהכנה.

  1. המתת חסד את העכבר עם מנת יתר של איזופלוריין ומניחים במגש ויבתר פרקדן. הצמד את קצות הגפיים ולחטא את הבטן עם 70% אתנול. המאהל העור עם מלקחיים ולאחר מכן לפתוח את הבטן עם מספריים.
  2. הרם את הכבד, לזהות את השוער/הקיבה דיסטלי. ואז להסיר 7 ס מ של המעי הפרוקסימלית. יש להיזהר לא לקרוע את המעי.
  3. החזק את השוער עם מלקחיים בעת החיתוך משם את מצע המעי.
    1. השתמש עמום בגב המספריים לגרד משם הלבלב חסיד.
    2. מניחים על קטע המעי אל תוך קר כקרח DPBS ללא Ca2 + או מ ג2 + (איור 1 א').
      הערה: מקטעים אחרים של המעי או המעי הגס ניתן גם להסיר באותה שיטה.
  4. שימוש מזרק 5 או 10 מ"ל המצורפת מחט 20 גרם הקהה לחשוף את תוכן צואתי עם קרח קר DPBS (איור 1B).
  5. לחלק את המעי 3 ס"מ מקטעים כדי להסיר את השריר האורך בטכניקה תיאר בתחילה על ידי סמית. et al. 12 , כפי ששונה ב. Sundaresan et al. 10.
    הערה: מקטעי במעיים עד שני עכברים משמשים לכל 30 מ של הפתרון בידוד HEPES/EDTA/DPBS.
  6. להתפרק כ- 4 ס מ כדי להפריד את מקל עץ מהקצה כותנה. להשרות את מקל עץ DPBS (איור 1C).
  7. . אכניס אחד המקטעים מעיים בצורה חלקה על הסטיק wetted (איור 2 א).
  8. הסר חסיד מצע המעי עדיין מחוברת באמצעות פינצטה, מלקחיים (איור דו-ממדי).
  9. השתמש סכין גילוח נקי או אזמל לעשות שני אורכי ניקס לאורך המעי איפה מצע המעי היה מצורף (איור 2E).
    1. הרטב את הטיפ כותנה עם DPBS. לשפשף את הטיפ שנרטבו כותנה longitudinally לאורך השריר כדי לשחרר את מקלעת שרירים אורכיים/myenteric (LMMP). לאחר מכן להזיז את הטיפ כותנה אופקית כדי לקנטר משם את LMMP של השריר מעגליות לאורך מקטע המעי במהלך ההסרה LMMP.
    2. להחזיק את קצה המקל בין האגודל לאצבע תוך ייצוב על הקטע עם האצבע לקמיצה (2F איור). כשהפעולה תסתיים, LMMP שיקלף בקלות על קטע המעי.
  10. להשליך LMMP התפשטה מהצינור מעיים ולא מחובר ניקוי אוזניים אלא אם קציר EGCs מ מקלעת myenteric היא הרצויה.
  11. השתמש סכין גילוח לפשוט את עורו פתוח על קטע המעי longitudinally כדי להסיר מקל עץ.
  12. אחסן את רקמת המעי הפשיטו (בעיקר רירית ו submucosa ועוד שריר מעגלית) DPBS על הקרח. חזור על שלבים 4.4 – 4.11 עד כל שכבות המעי מוכנים.

5. הסרה של רירית אפיתל

  1. לחתוך את המעיים לחתיכות קטנות יותר של ~0.5 ס מ עם מספריים בסדר.
  2. מקם את הרקמה שפופרת צנטרפוגה חרוט סטרילי 50 מ ל, המכיל 30 מ של פתרון EDTA/HEPES/DPBS קר כקרח.
  3. רוק הפתרון המכיל רקמות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב ~ 60 מטה לכל מין.
  4. מראש להרטיב פיפטה 5 מ"ל פלסטיק על-ידי pipetting המאגר EDTA/HEPES/DPBS הלוך ושוב פעם אחת, ולאחר מכן השתמש על פיפטה בטעימת מראש כדי pipette את הרקמה ואת החיץ ההשעיה למעלה ולמטה (trituration) 20 פעמים מכך רירית אפיתל.
  5. לאסוף את הרקמה הדגירה EDTA מאת לשפוך את התערובת דרך מסננת תא ניילון 100 מיקרומטר. למחוק את עכורים ריריות מלאות הזרימה דרך (איור 3).
  6. מקם את הרקמה נשמרים ב- מסננת לתוך שפופרת צנטרפוגה חרוט 50 מ ל חדש המכיל 30 מ של קרח קר EDTA/HEPES/DPBS באמצעות פינצטה, מלקחיים.
  7. חזור על הדגירה EDTA/HEPES/DPBS בפעם השנייה במוזיקת הרקמה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב ~ 60 מטה כל דקות כדי להתפשט רירית אפיתל נוספים.
  8. מראש להרטיב פיפטה 5 מ עם המאגר, ואז pipette התליה רקמות לאורך 20 פעמים מכך תאי ריריות.
    הערה: הרקמה נוטים לדבוק בתוך פיפטה יותר של האפיתל הוסר.
  9. לאסוף את הרקמות לאחר הדגירה השני על ידי לשפוך את התערובת דרך מסננת תא ניילון 100 מיקרומטר וזורקים את הזרימה. השני הזרימה דרך צריך להיות באופן בולט פחות עכורים יותר מהראשון (איור 3).
  10. אני חוזר incubations EDTA 10 דקות עד הפתרון הוא כמעט ברור (בערך 3 עד 4 incubations בהתאם את כמות רקמת ואת האפקטיביות של trituration) (איור 3).

6. אוסף של תאי גליה המעית פרופריה. מוסקולריס ו Submucosa

  1. להעביר את הרקמה מסננת ניילון שפופרת צנטרפוגה חרוט 15 מ"ל המכיל 5 מ של פתרון שחזור תא זמינים מסחרית, רוק למשך 25-30 דקות ב 4 º C.
  2. Triturate בעדינות x 10 מביצועם וזאנה המעית מ פרופריה. מוסקולריס.
    1. לסנן דרך מסנן 40 µm ולאסוף את פילטרט של צינור נקי 50 מ.
    2. יש לשטוף את הרקמה מסנן ניילון עם 1 מ"ל של DPBS.
    3. למחוק את הרקמה ולהעביר את ~ 5 – 6 מ של פילטרט של כדי שפופרת צנטרפוגה חרוט נקי 15 מ"ל.
    4. לסובב את פילטרט של x 2,000 g ומפרידה דלי מתנדנדים למשך 5 דקות ב 4 º C.
  3. מחדש להשעות בגדר המכילים תאי גליה לפחות 1 מ"ל של מאגר resuspension על ידי בעדינות pipetting בגדר למעלה ולמטה עם טיפ פיפטה µL 500. הימנע היכרות עם בועות.
    הערה: להתאים את עוצמת הקול של resuspension לפי הצורך עבור מספר בארות וצלחות. לדוגמה, 1.2 מ"ל לצלחת 6-ובכן אחד; 2.4 mL עבור שתי צלחות 6-טוב; 2.4 מ עבור לוח 12-טוב אחד.
  4. פיפטה µL 200 של התליה תא לבאר כל של µL 6-ובכן או 100 עבור לוחות PDL-laminin מצופה 12-ובכן המכיל צמיחה גליה מדיה.
  5. נא לא להפריע את הכלים לאחר הוספת התאים הצלחות והצבת בחממה 37 ° C כדי לאפשר את המספר המרבי של תאים לדבוק.
    הערה: הכנת תאים בריאים לצרף בתוך 6-8 h אלא לחכות לפחות 24 שעות לפני שינוי בתקשורת על-ידי pipetting בעדינות את התקשורת יחד עם תאים שאינם מחסידי.
  6. השתמש בתאים לניסויים 3-4 ימים אחרי הם ממוקמים לתוך התרבות (איור 4). לבצע ניתוח immunofluorescent באמצעות נוגדנים לעניין סמני חלבונים ספציפי (טבלה 3). לדוגמה, GFAP, S100b, p75NTR או Sox10 שימש כאן. E-קדהרין או שריר חלק אלפא אקטין נוגדנים שימשו כדי להעריך את מידת הזיהום של סוגי תאים אחרים.

7. immunofluorescent מכתים

  1. האחות התקשורת את התרבויות ולשטוף פעמיים עם PBS.
  2. לתקן את התרבויות במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר עם 4% paraformaldehyde.
  3. הסר מקבע את ולאחר מכן לשטוף 3 פעמים עם PBS.
  4. Permeabilize התאים עם PBS המכיל 0.2% טריטון X-100 בטמפרטורת החדר.
  5. דגירה התאים permeabilized עם פתרונות חסימה מורכבת נגד עוף איגי, אנטי-ארנב או העכבר אנטי איג 2 h בטמפרטורת החדר.
  6. דגירה התאים עם נוגדנים העיקרי לילה, למשל, GFAP (1:1, 000).
    1. יש לשטוף את התאים 3 פעמים עם PBS. אם ביצוע colocalization המשך שלב 7.7.
  7. דגירה הסט הבא של נוגדנים העיקרי לפחות 2 h בטמפרטורת החדר, אך רצוי להשרות ללילה ב 4 º C. השתמש 1:1000 לדילול ארנב אנטי-S100 או לדילול שבערך העכבר אנטי-p75NTR.
    הערה: לכל הנוגדנים הם מדולל ב- PBS.
  8. יש לשטוף את התאים 3 פעמים עם PBS להסיר נוגדנים העיקרי. ואז דגירה התאים שטופים עם המתאים מתויג fluorescently משני הנוגדנים כבר שעתיים בטמפרטורת החדר (טבלה 3).
  9. לשטוף 3 פעמים עם PBS כדי להסיר את הנוגדנים משני.
  10. הר על coverslips על גבי שקופיות באמצעות 1-2 טיפות של התקשורת הרכבה עם דאפי ולהציג את התאים במיקרוסקופ פלואורסצנטי.

8. דנ

  1. להסיר תאים גליה חסיד עבור cytometry זרימה על ידי שטיפה התאים פעם אחת עם DPBS ולאחר מכן להוסיף 0.25% טריפסין-EDTA לכל הפרוטוקול של היצרן. דגירה התאים הפתרון טריפסין-EDTA ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 דק סיים תהליך העיכול על ידי איסוף התאים בתקשורת צמיחה תא גליה מלאה.
  2. לאסוף את התאים על ידי צריך שתוציאו ב x 400 g למשך 5 דקות ולאחר מכן מחדש להשעות את התאים ב- PBS.
  3. לתקן את התאים עם 4% paraformaldehyde 10 דקות, ואז permeabilize עם 0.2% טריטון X-100 ב- PBS כמתואר ב- 7.4 שלב.
  4. לחסום את התאים עם PBS המכיל 1% BSA את רקמת אימונוגלובולין ספציפי עבור 20 דקות, למשל, החמור נגד עוף איגי (IgG) (H + L) (1:1, 000) או חמור נגד עז IgG (H + L) (1:1, 000).
  5. דגירה תאים עם נוגדנים הראשי GFAP (1:2, 000), E-קדהרין (1:400), שריר חלק-α אקטין (שבערך) או Pgp9.5 (שבערך) בן לילה ב 4 º C.
  6. לשטוף את הנוגדן עם PBS.
    1. דגירה הקומפלקס אנטיגן-נוגדן עם נוגדנים משניים מתויג fluorescently מודגרות בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
    2. השתמש aliquot נפרדים של תאי הדגירה עם נוגדנים משניים כדי לשמש הפקד isotype. שתי אוכלוסיות של תאי שטופים resuspended ב- PBS לפני cytometry זרימה.
    3. לנתח את שתי האוכלוסיות של תאים cytometer זרימה על ידי gating על תאים חיים.

9. מכינים את העכבר רקמות מן hGFAP-Cre:tdTomato עכברים

הערה: cDNA לקס-עצור-סלומון-tdTomato מבוטא מ רוזה לוקוס22,23 (מעבדות ג'קסון, #007914) ומייצר אנדוגני זריחה כאשר הוליד עכבר לבטא את recombinase Cre (hGFAP-Cre). בחיי עיר ניתוח מבוצע על ידי יצירת רקמות קפוא מקטעים.

  1. לתקן את רקמת המעי paraformaldehyde 4% לשעה, ואז מייבשים לילה ב- 1 מ' סוכרוז ב- PBS.
  2. להטביע את הרקמות שנרכשו באופן מסחרי חיתוך אופטימאליים רקמות (אוקטובר) מתחם של 10% אלכוהול, 4.2% פוליאתילן גליקול והצמדה ואז להקפיא במצב חנקן נוזלי.
  3. להכין 5 מיקרומטר cryosections והר ואז באמצעות antifade של הרכבה מדיה עם דאפי.
  4. עבור cytometry זרימה, להכין EGCs hGFAP-Cre:tdTomato+ עכברים כמתואר בצעדים 4.1-6.5.
  5. Trypsinize התאים מהצלחת לאחר 3 ימים בתרבויות כמו שלב 8.1 ולתקן ואז 10 דקות ב- 4% paraformaldehyde.
  6. לנתח את התאים מבודד Cre שלילי עכברים במקביל עם תאים מבודד את hGFAP-עכברים Cre:tdTomato+ על cytometer זרימה.
    הערה: שערים נבנו כדי להימנע תאים מתים ופסולת.

10. Ca2 + שטף הדמיה

  1. דגירה EGCs מצופה על צלחת 24-ובכן מיקרומטר 3 Fluo-4-AM ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  2. תמונת האות2 + Ca בפתרון של Tyrode מסחרית שנרכש באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי של הדיסק מסתובב הגל של עירור של 480 ננומטר (F480) לאחר הוספת פפטיד CCK או גסטרין. ניתוח תמונות דווח. Sundaresan et al. 10 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Preps נחשבו לא מוצלח אם GFAP + תאי לא לדבוק ולהפיץ בתוך 24 שעות (איור 4A). לא היתה אפשרות לקבוע את מספר תאי גליה עד לאחר 24 שעות כאשר התאים דבקה והציג עדויות להתפשט לתוך שטוח אגרגטים (איור 4B). התאים בקצה של האשכולות נטו להרחיב תהליכים ארוכים, הביע קלאסי גליה סמנים, למשל, GFAP, S100b ו p75NTR (איור 4C, 4 D)10,16. לפי יום 2nd , גלייה דבקה בחוזקה פני השטח ומאפשר האוכלוסייה הלא-חסיד לשטוף משם עם PBS. רוב התאים צפים אפיתל, פרופריה. מוסקולריס תאים יחד עם שאריות תאים. הנוכחות של אלה גושים תא צף מופחתת התשואה של חסיד גלייה המלמד את החשיבות של ביצוע את incubations EDTA עד הזרימה דרך ברור כמעט, איתות כי בתאי אפיתל הוסרו ממנו הנדן . מוסקולריס הליבה. בנוסף, צנטריפוגה במהירויות נמוך יותר מאשר x 1,500 גר' לאחר המקננת בפתרון שחזור התא לא ביעילות אסף כל התאים קיימא לתוך גלולה שמוביל התשואות מופחת. בדרך כלל, 40,000 ל 100,000 תאים קורפוס עקבי עם EGCs דבקה בחוזקה על ידי יום 3 בתרבות.

ניתוח Immunohistochemical עם גליה-הקשורים נוגדנים, יצוין כי התא אשכולות מחסידי נשארו באותו יום 3 היו GFAP, S100b ו 10 סוקס חיובית10,16 (איור 5A). במחקר הנוכחי, זו באותה מידה של טוהר נצפתה על ידי permeabilizing התאים וניתוח מאת cytometry זרימה (איור 5B-F). מיד לאחר בידוד submucosal/פרופריה מוסקולריס וזאנה, cytometry זרימה חשף כי היו כ- 51% של התאים GFAP + (איור 5B), מציע את הנוכחות של סוגי תאים GFAP-שלילי, למשל, אפיתל, hematopoietic, אנדותל, עצביים תאים, myofibroblasts ידועים להתקיים אפיתל, פרופריה. מוסקולריס. לאחר 3 ימים בתרבות, מספר התאים GFAP + ייצג מעל 95% של האוכלוסייה תא מנותח לאחר הסרת המדיה המקורית, שטיפה בעדינות עם PBS, ולאחר מכן הוספת מדיה טריים (איור 5C). מעניין, ניתוח תזרים חשף גבוה ונמוך אוכלוסיות לבטא-חלבון GFAP (איור 5C). אכן, ניתוח immunofluorescent של התאים גילה כי הפריפריה של האשכולות נטו לבטא רמות גבוהות יותר של GFAP (איור 4C, 4 D). יחדיו, שני סוגים של ניתוח עשוי להצביע על הבדלים EGC בגרות או בידול למצב. באופן קולקטיבי, האחוז של α-SMA + (סמן תא myofibroblast), E-קדהרין + (תאים אפיתל מרקר), ו- Pgp 9.5 + תאים (סמן דופאמינרגיים) היה פחות מ- 5% (איור 5D-F). תוצאות אלה עלו בקנה אחד עם המחקר מוקדמת המתבצעת באמצעות תיוג immunofluorescent של EGCs מציג כ- 93% GFAP + תאים של 10. הניתוח זרימת מדגיש את החשיבות של מתן אפשרות התאים לדבוק הלוחות, שכן הוא מאפשר הסרה של אוכלוסיות תאים מזהמים הכוללת כ- 5% של התרבויות.

המטרה במחקר זה היה להשתמש כתב GFAP מופעל כדי להקל על cytometry זרימה של תאים לצורך ניתוח נוסף וכדי להשוות את מידת EGC העשרה באמצעות סמן פלורסנט אנדוגני (איור 6). הקו העכבר hGFAP-Cre תוארה לראשונה על ידי מסינג ועמיתים 20. בקצרה, recombinase Cre הושם תחת השליטה של 2.2 kb של האמרגן גליה fibrillary חומצה חלבון אנושי (hGFAP). לפיכך, תא כלשהו תעתיק זה יזם hGFAP הביע את tdTomato כתב ניאון אדום. האוכלוסייה תאים עם תוויות עם הכתב tdTomato היה מטמיעים בחיי עיר באמצעות סעיפים קפוא של המעי, המעי הגס (איור 6A, 6B) לפני ביצוע ההליכים בידוד EGC שתוארו לעיל. לאחר ביצוע הבידוד שחזור EDTA/תא culturing התאים במשך 3 ימים, EGCs של עכברים אלה זוהו בקלות על ידי שלהם קרינה פלואורסצנטית אנדוגני (איור 6C). למרות GFAP + תאי ניתן לטעון הם רבים יותר המעי proximal4,21, tdTomato + EGCs גם נצפו במעי הגס (איור 6B). באמצעות הכתבת פלורסנט tdTomato+ מופעל על ידי hGFAP-Cre התגלה גם אוכלוסיה דו-אופנית של hGFAP-tdTomato + חלבון (איור 6D) כפי שנמדדו באמצעות ניתוח immunofluorescent של GFAP (איור 5C) תאים. למרות דווח כי לא כל EGCs אקספרס GFAP חלבון4, נקודה זו עלול לשקף הבדלים ברמת הביטוי GFAP. בממוצע, כ- 66% של תאים ניתח הציג הרמה הגבוהה ביותר של זריחה tdTomato. לכן, פרוטוקול שחזור תא EDTA יכול לשמש כדי לבודד קבוצות משנה של EGCs ברחבי המעי הדק, המעי הגס הנקרא על ידי הכתבת לבחון הבדלים בביטוי הגנים.

פרוטוקול זה שנוצר מספר מספיק של יחסית טהור GFAP + גלייה מחקרים ביוכימיים וניתוח תספיג חלבון 10. להפגין יכולת התגובה של תא גליה, הכנה תא גליה 3 ימים טופלה עם הורמונים כוליציסטוקינין (CCK) או גסטרין לזירוז Ca2 + השטף (איור 7 א-7 ב)10. התוצאות הראו כי אלה GFAP + תאים חסיד הגיב חוץ-תאית אגוניסטים להפגין את היכולת שלהם התערוכה ידוע המעית פונקציה גליה.

Figure 1
איור 1: הגדרת והכנות של העכבר המעיים. (א) תמונה של בידוד להגדיר על הקרח כולל המעיים שחולצו. (B) תמונה של 5 מ"ל-מזרק מצורף מחט הקהה 20 גרם כדי. להוריד את תוכן צואתי. (ג) סוף ספוגית כותנה עץ (~ 4 ס מ) לספוג את המאגר DPBS הנדסה לאחור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: צעדים נהגו לנקות את המעיים להסיר את מקלעת שרירים אורכיים/myenteric (LMMP). (A-C) הזזה מקטע המעי על מקל עץ wetted. (ד) הסרה של מצע המעי חסיד. (E) חותך המעי עם סכין גילוח. (F) להסיר את LMMP באמצעות מקלון צמר גפן לח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: רציפות הזרימה-שנכנסו. ויצאו לאחר EDTA incubations. מוצגות דוגמאות הזרימה שנכנסו. ויצאו מ 4 incubations רציפים באמצעות שלוש 7 ס מ מעיים מקטעי הדגירה למשך 10 דקות עם 5 מ מ EDTA/10 מ מ HEPES DPBS, ואז triturated את פי 20. נציג זרימה-שנכנסו. ויצאו לאחר יציקת דרך מסננת רשת ניילון 100 מיקרומטר מוצגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: EGC תמונות 24 שעות לאחר ציפוי. אור בבדיקה מיקרוסקופית של תאים resuspended 24 שעות לאחר ציפוי. (א) מוצג היא דוגמה ייצוגית הכנה המסכן מציג תאים אפיתל צף גושים (חץ) ופסולת. לא מחסידי EGCs נצפו לאחר 24 ח' (B) מוצג היא דוגמה ייצוגית הכנה מצויינת 24 שעות לאחר בידוד תא של resuspension שבו כתמים של EGCs דבקה PDL/Laminin מצופה לוחות. תמונות נתפסו על מיקרוסקופ פלורסנט הפוכה עם מצלמה דיגיטלית. גודל ברים = 500 מיקרומטר (A-B). (ג) תצוגה מתח גבוה של תיקון של תאים EGC צבעונית עם נוגדנים GFAP (ירוק) מראה התאים בפריפריה בעוצמה גבוהה יותר של תיוג. מספר התאים הראה זוגי גרעינים (חץ, דאפי, כחול). (ד) Colocalization של GFAP (ירוק) עם S100 (אדום) או p75NTR (אדום). גודל ברים = 20 מיקרומטר (C-D). התאים רכוב עם ריאגנט antifade, דאפי (גרעינים כחול). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: Flow cytometry תאי גליה המעית מבודד פרופריה תריסריון. מוסקולריס של העכבר למבוגרים. (א) Immunofluorescence של GFAP, S100B ו- Sox10 על תרבויות EGC לאחר 3 ימים. חיצים מציינים סוקס 10 גרעינים חיובי. גודל ברים = 20 מיקרומטר (בשימוש בהיתר Sundaresan. et al. 10)-תאים חיוביים (B) אחוז של GFAP לפני ציפוי על צלחות מצופה (עוצמת קרינה פלואורסצנטית (או פיזור קדימה, ציר x) לעומת הצד פיזור (ציר y). (ג) אחוז GFAP חיובי (D) α-SMA חיובי (E) E-קדהרין חיובי (F) ו- Pgp 9.5 חיובי תאים 3 daysafter יופיצ. שערים נבנו כדי להימנע תאים מתים ופסולת. המוצג הוא האחוז אכזרי של האוכלוסייה פלורסנט יחסית מספר התאים (לצד פיזור). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: זיהוי של תאי גליה המעית מבודד פרופריה תריסריון. מוסקולריס של hGFAP-Cre+: העכבר למבוגרים tdTomato+ . תמונות (אדום) פלורסנט tdTomato אנדוגני נתפסו על מיקרוסקופ פלואורסצנטי של ניגודיות שלב עם מצלמה דיגיטלית במעי (A). (פנימי) בדיוק כמו A אלא התמזגה עם דאפי תמונה (גרעינים כחול). המעי הגס (B) התמזגה עם דאפי. (ג) Enteric תאי גליה (אדום) מבודד hGFAP-Cre:dtTomato+ עכברים ותרבותית במשך 3 ימים על PDL/Laminin המצע. גודל ברים = 50 מיקרומטר. (ד) cytometric ניתוח תזרים של תאים tdTomato. המוצג הוא % כלומר GFAP + תאים ± SEM עבור 3 תכשירים שונים (3 עכברים לכל הכנה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7: וידאו של Ca2 + והנתיבים לאחר טיפול הורמונלי. EGCs מצופה PDL 24-ובכן, laminin מצופה לוחות היו תרבותי בתקשורת צמיחה גליה במשך 3 ימים. התאים היו טעון מראש עם 3 מיקרומטר של Fura-2-אם עבור 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, ואז היו מטופלים עם () 100 ננומטר כוליציסטוקינין (CCK) או (B) 100 ננומטר גסטרין. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

רכיבים אמצעי האחסון כדי להוסיף ריכוז סופי
DMEM/F12 44.5 מ _
סרום שור עוברית (FBS) 5 מ 10%
פניצילין-סטרפטומיצין 500 ΜL עט 100 IU/mL
סטרפטומיצין דלקת µg 100/mL
גנטמיצין (מניות 50 מ"ג/מ"ל) 20 ΜL µg 20/mL

טבלה 1: ההרכב של תא גליה Resuspension מדיה.

רכיבים אמצעי האחסון כדי להוסיף ריכוז סופי
DMEM/F12 מ ל 44 _
סרום שור עוברית (FBS) 5 מ 10%
פניצילין-סטרפטומיצין (100 x) 500ΜL 100 IU/mL (עט)
µg 100/mL (דלקת)
גנטמיצין (מניות 50 מ"ג/מ"ל) 20 ΜL µg 20/mL
GDNF (µg 10/mL במלאי) 50 ΜL 10 ng/mL
-גלוטמין (מניות 200 מ"מ) 500ΜL 2 מ מ

טבלה 2: ההרכב של תא גליה צמיחה מדיה.

רכיבים דילול immunofluorescence דילול Cytometry זרימה
עוף אנטי-GFAP 1 עד 500 1 עד 2000
ארנב אנטי-S100 1 עד 500 1 עד 500
העכבר NTR אנטי-p75 1 עד 500 1 עד 500
עז אנטי-E-קדהרין 1-400
העכבר אנטי-Pgp9.5 1 עד 500
עז שריר anti--חלק אקטין 1 עד 500
אלקסה עבור חיל הים 488 עז נגד עוף איגי 1 עד 1000 1 עד 1000
אלקסה עבור חיל הים 568 עז העכבר נגד אג 1 עד 1000 1 עד 1000
אלקסה עבור חיל הים 594 החמור נגד הארנב אג 1 עד 1000
אלקסה עבור חיל הים 488 חמור עז נגד אג 1 עד 1000

טבלה 3: רשימה של נוגדנים

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

EGCs תפקיד חשוב הומאוסטזיס הבטן, זה חיוני כדי לבודד וללמוד אותם בתוך חוץ גופית. ב פרוטוקול זה, שיטה פשוטה עבור בידוד EGCs מ פרופריה. מוסקולריס של המעי העכבר למבוגרים הוצג ללמוד המעית פונקציה גליה.

הסרת מצע המעי חסיד של LMMP באמצעות מקלון צמר גפן מסיר חלק אינטר-myenteric עכשיו, דונלד המתגוררים בין השריר אורכי, מעגלית, מגדילה את הנגישות של מאגרי המים submucosal ומסירה של הנימים גדול יותר . האחרון מפחית את מספר תאי הדם האדומים שמזהם את התרבויות הסופי. הסדרה של EDTA incubations לעקור את רירית אפיתל לחשוף את פרופריה. מוסקולריס ואת submucosal עכשיו, דונלד, שיכולה להיות שביר לאחר חשיפה הפתרונות chelating. עצבנות רועדת, vortexing או triturating (חוזרות לאורך pipetting) חייב להיות שבוצעה בזהירות ולא תוזמן כדי למנוע נזק מופרז על התאים. Trituration שימש כאן כי הטכניקה, גרמו תשואה עקבית יותר של חסיד, קיימא גלייה. רועדת נטו להציג בועות ולהפחית את הכדאיות תא העריך מורפולוגית על-ידי דבקות תא הלוחות מצופים. הרקמה חייב להיות חתוך לחתיכות < 0.5 ס מ כדי ביעילות triturate הרקמה עם פיפטה 5 מ ל.

באופן כללי, מקטעי 7 ס מ לפחות 3 עכברים מספיקה לייצר מספיק EGCs כדי לכסות את לוח 6-ובכן אחד כ 20 – 30% confluency, אשר יכול לשמש עבור immunocytochemistry ו- qPCR. עם זאת, ייתכן יותר תאים נדרש עבור שיטות ביוכימיות כמו שהכלים המערבי בהתאם לרמת הביטוי של הגן למד. למרות, הקלד 1 קולגן או Matrigel נבחנה בקצרה כחלופה המצע פולי-D-ליזין/Laminin, דבקות גדול מהאוכלוסייה תאים אפיתל נצפתה, בסופו של דבר להגברת זיהום של התרבויות EGC עם סוגי תאים אחרים . בנוסף, קולגן מסוג 1 לא לדבוק בחוזקה הצלחות, היה ניתק בקלות מהמשטח בעת שינוי בתקשורת. Fibronectin הוא המצע עוד היה בשימוש24, אך לא נבחנה כאן. Laminin כנראה מגביר את הכריכה, הבידול של עצבי-קרסט נגזר תאים25. עם זאת, המון laminin יכול להשתנות, להשפיע על התא הדבקות התשואות. זיהום מיקרוביאלי של התרבויות אירעה כ- 5% מהזמן, נשמר עד למינימום את השימוש ריאגנטים סטרילי, טכניקה, אנטיביוטיקה. השימוש הכימית פטריות היה אופציונלי.

המגבלה העיקרית של פרוטוקול כאן הוא האחדה של התסיסה להסרת האפיתל מבלי להזיק את EGCs הבסיסית. יתר על כן, אין אפשרות לבצע הערכה של התכשיר מיד כיוון שהוא תלוי על הדבקות תא הלוחות מצופים. שלושה תחומים להתמקד בעת פתרון בעיות כוללים: 1) השימוש PDL ורענן laminin כדי להרגיע את הצלחות; 2) למזער את הזמן של דיסקציה מתחיל את incubations EDTA על ידי הגדלת מספר העוזרים; 3) לכמת את הזמן ואת שיטת כדי להתסיס את הרקמה כדי להסיר האפיתל, ולאחר מכן את EGCs. הארכת הזמן באחד השלבים מגביר EGC השבריריות ואת הסבירות כי הם לא יתאושש כאשר מצופה בתקשורת צמיחה. למרות השיטה trituration מביצועם האפיתל שימש כאן, רועדת, vortexing נבדקו גם עם תוצאות לא עקביות. אולי כי זה מפעיל יותר תלויים וקשה לכמת. ברגע מצופה את התשואה של תאים חסיד היה גדול אם התאים היו לא הופרע על 16-24 h.

השיטה המוצגת כאן שונה על פי המחקר המקורי על ידי סמית. et al. 12, שהתמקד לבודד את LMMP. הגישה סמית שימש כאן רק כדי להסיר ולמחוק את LMMP כך רוב וזאנה מבודד מקורן submucosa ואת פרופריה. מוסקולריס. בנוסף, ללא עיכול אנזימטי, EGCs myenteric אינן ברצון המשוחרר12. בכל זאת, כיוון שיש אין סמנים ספציפי עבור myenteric לעומת submucosal עכשיו, דונלד, הנוכחות של תאי גליה של מקלעת אינטר-myenteric לא ייכללו. רוזנבאום. et al. דיווח ניתוח תזרים cytometric של EGCs לבטא משופרת חלבון פלואורסצנטי ירוק (EGFP) של האמרגן hGFAP. הם השתמשו בעכברים צעירים מאוד (כמחנכת יום 7), מבודד EGCs מן המעי כולו על ידי עיכול אנזימטי19. בנוסף, ניתוח תזרים cytometric בוצעה לאחר שבועיים של שמירה על תנאים המעודדים היווצרות neurosphere לתרשים. למרות המחברים דיווחו כי neurospheres מאוד באה לידי ביטוי הן GFAP והן S100b, מצרפי תא צף הביע גם α-SMA, מציעה הרחבה של האוכלוסייה תא myofibroblast עודד פיתוח gliosphere לעומת זאת כדי המורפולוגיה שטוח כמו גיליון המתוארים כאן. לכן, בעת מעניין, המחקר הוא לא להשוות ישירות פרוטוקול זה. לעומת זאת, המורפולוגיה של תאי בשילוב עם באופן משמעותי פחות α-SMA + תאים מציע כי EGCs המתוארות פרוטוקול זה לא מוצג המורפולוגיה תלת-ממדי במהלך תקופת תרבות 3 עד 5 ימים. ובכל זאת, פרוטוקול כאן וגם את שיטת רוזנבאום להשתמש כתב פלורסנט לזיהוי ולבידוד GFAP + תאים לשיפור היכולת של החוקר חיים פרופיל תא.

לסיכום, בפרוטוקול הנוכחי מתאר את ניתוקה של המעית גלייה מ submucosa תוך שימוש בגישה הלא-אנזימטי. פרוטוקול כולו לוקח כ-3 שעות מן דיסקציה העכבר כדי ציפוי הראשונית על הלוחות מצופים מראש תרביות רקמה. הכי אינטנסיבית צעד בפרוטוקול הוא הסרת הכנה של המעיים הדגירה EDTA הראשון. הכנת לוחיות הרישוי ואחסון ב- DPBS מומלץ מאוד. ההצלחה של ההכנה תלוי הסרת יעיל של האפיתל מבלי להזיק את EGCs הבסיסית, ההקפדה הלוחות PDL/Laminin מצופה בתוך ה 24 ראשי EGCs שימושיים עבור מחקרים במבחנה כגון ניתוח הביוכימי, פלקסים2 + Ca, adenoviral transfections10. הוא צפוי כי היכולת לבודד את EGCs את submucosa או את LMMP יאפשרו מחקרים נוספים כדי להגדיר את ההבדלים EGC גידול בנכסים, בידול, מורפולוגיה שימוש בגישות הגנום כולו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מאחלים לקבל תמיכה R37 DK045729 (כדי! לכל הרוחות), R01 AR060837 (כדי HX), של אוניברסיטת מישיגן מערכת העיכול מחקר מרכז מולקולרית הליבה P30 DK034933.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly-D lysine (1 mg/mL stock) Sigma A-003-E Dilute 1:10
Laminin (0.5 mg/mL stock) Sigma L4544 Dilute to 10 µg/mL on ICE
EDTA (0.5 M) Lonza 51201 Dilute 1:100 in DPBS
HEPES (1 M) Corning 36216004 Dilute 1:100 in DPBS
Cell Recovery Solution Corning 354253
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) HyClone SH30028.02
DMEM/F-12 Thermo Fisher Scientific 11320033
Penicillin-Streptomycin (100x) Life Technologies 15140-122
Gentamicin (50 mg/mL stock) Life Technologies 15750060
GDNF (10 µg stock) Sigma SRP3200
L-Glutamine (200 mM stock) Life Technologies 25030-081
Chicken anti-GFAP Thermo Fisher Scientific PA1-10004
Goat anti-a-Smooth Muscle Actin  Abcam ab112022
Mouse anti-Pgp9.5  Novus Biologicals NB600-1160
Goat anti-E-cadherin  R&D Systems AF748
Rabbit S100  Abcam ab34686
Mouse p75 NTR  Millipore MAB5592
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Chicken IgY Invitrogen A-11039
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG Invitrogen A-11055
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG Invitrogen A-11004
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG Invitrogen R-37119
Prolong Gold antifade Reagent with DAPI Thermo Fisher Scientific P36931
Fungizone (Amphotericin B) 250 µg/mL Life Technologies 15290-018
L-Fura-2-AM Invitrogen F-14201
CCK peptide Anaspec, Fremont, CA AS-20741
Gastrin peptide (Gastrin-17) Abbiotec, Bloomington, IN 350188
Nylon Mesh Celll Strainer (100 µm) Fisher Scientific 22363549
Nylon Mesh Celll Strainer (40 µm) Fisher Scientific 22363547
Disposable Serologic Pipet 5 mL Fisher Scientific 13-678-11D
0.25% Trypsin-EDTA (1x) Life Technologies 25200-056

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grubisic, V., Gulbransen, B. D. Enteric glia: the most alimentary of all glia. Journal of Physiology. 595, (2), 557-570 (2017).
  2. Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 9, (11), 625-632 (2012).
  3. Rao, M., et al. Enteric Glia Regulate Gastrointestinal Motility but Are Not Required for Maintenance of the Epithelium in Mice. Gastroenterology. 153, (4), 1068-1081 (2017).
  4. Rao, M., et al. Enteric glia express proteolipid protein 1 and are a transcriptionally unique population of glia in the mammalian nervous system. Glia. (2015).
  5. McClain, J., et al. Ca2+ responses in enteric glia are mediated by connexin-43 hemichannels and modulate colonic transit in mice. Gastroenterology. 146, (2), 497-507 (2014).
  6. Cunha Franceschi, R., et al. Enteric glial reactivity to systemic LPS administration Changes in GFAP and S100B protein. Neuroscience Research. 119, 15-23 (2017).
  7. Kabouridis, P. S., et al. Microbiota controls the homeostasis of glial cells in the gut lamina propria. Neuron. 85, (2), 289-295 (2015).
  8. Yu, Y. B., Li, Y. Q. Enteric glial cells and their role in the intestinal epithelial barrier. World Journal of Gastroenterology. 20, (32), 11273-11280 (2014).
  9. Clairembault, T., et al. Enteric GFAP expression and phosphorylation in Parkinson's disease. Journal of Neurochemistry. 130, (6), 805-815 (2014).
  10. Sundaresan, S., et al. Gastrin Induces Nuclear Export and Proteasome Degradation of Menin in Enteric Glial Cells. Gastroenterology. 153, 1555-1567 (2017).
  11. Gulbransen, B. D. Enteric Glia: The Origin of Duodenal Gastrinomas? Gastroenterology. (2017).
  12. Smith, T. H., Ngwainmbi, J., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. An in vitro preparation of isolated enteric neurons and glia from the myenteric plexus of the adult mouse. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
  13. Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In situ Ca2+ imaging of the enteric nervous system. Journal of Visualized Experiments. (95), (2015).
  14. Bernstein, C. N., Vidrich, A. Isolation, identification, and culture of normal mouse colonic glia. Glia. 12, (2), 108-116 (1994).
  15. Jaeger, C. B. Isolation of enteric ganglia from the myenteric plexus of adult rats. Journal of Neural Transplantation & Plasticity. 5, (4), 223-232 (1995).
  16. Almond, S., Lindley, R. M., Kenny, S. E., Connell, M. G., Edgar, D. H. Characterisation and transplantation of enteric nervous system progenitor cells. Gut. 56, (4), 489-496 (2007).
  17. Ruhl, A., Trotter, J., Stremmel, W. Isolation of enteric glia and establishment of transformed enteroglial cell lines from the myenteric plexus of adult rat. Neurogastroenterology & Motility. 13, (1), 95-106 (2001).
  18. Boyen, G. B., et al. Distribution of enteric glia and GDNF during gut inflammation. BMC Gastroenterology. 11, 3 (2011).
  19. Rosenbaum, C., et al. Activation of Myenteric Glia during Acute Inflammation In Vitro and In Vivo. Public Library of Science One. 11, (3), e0151335 (2016).
  20. Zhuo, L., et al. hGFAP-cre transgenic mice for manipulation of glial and neuronal function in vivo. Genesis. 31, (2), 85-94 (2001).
  21. Boesmans, W., Lasrado, R., Vanden Berghe, P., Pachnis, V. Heterogeneity and phenotypic plasticity of glial cells in the mammalian enteric nervous system. Glia. 63, (2), 229-241 (2015).
  22. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22, (12), 1567-1572 (2004).
  23. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13, (1), 133-140 (2010).
  24. Kabouridis, P. S., et al. The gut microbiota keeps enteric glial cells on the move; prospective roles of the gut epithelium and immune system. Gut Microbes. 6, (6), 398-403 (2015).
  25. Pomeranz, H. D., Sherman, D. L., Smalheiser, N. R., Tennyson, V. M., Gershon, M. D. Expression of a neurally related laminin binding protein by neural crest-derived cells that colonize the gut: relationship to the formation of enteric ganglia. The Journal of Comparative Neurology. 313, (4), 625-642 (1991).
בידוד תאי גליה המעית מן Submucosa פרופריה. מוסקולריס של העכבר למבוגרים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, Z., Ocadiz-Ruiz, R., Sundaresan, S., Ding, L., Hayes, M., Sahoo, N., Xu, H., Merchant, J. L. Isolation of Enteric Glial Cells from the Submucosa and Lamina Propria of the Adult Mouse. J. Vis. Exp. (138), e57629, doi:10.3791/57629 (2018).More

Wang, Z., Ocadiz-Ruiz, R., Sundaresan, S., Ding, L., Hayes, M., Sahoo, N., Xu, H., Merchant, J. L. Isolation of Enteric Glial Cells from the Submucosa and Lamina Propria of the Adult Mouse. J. Vis. Exp. (138), e57629, doi:10.3791/57629 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter