여기, 우리 장 submucosa 순차적 EDTA 외피를 사용 하 여 divalent 양이온 그리고 외피 비 효소 세포 복구 솔루션에 킬레이트 하에서 장 glial 세포의 설명. 폴 리-D-리 신과 laminin에 결과 세포 현 탁 액을 도금 기능 분석을 위한 submucosal glial 세포의 매우 풍부한 문화에 발생 합니다.
신경 세포 및 평활 근 벽, submucosa 및 lamina propria 상주 장 glial 세포 (EGCs) 장 신 경계 (ENS)에 의하여 이루어져 있다. EGCs 다양 한 영양 요인의 출시를 통해 직감 항상성에서 중요 한 역할을 하 고 상피 방 벽의 무결성을. 기본 장 폐해 문화의 대부분 연구 사용 세포 효소 분리 후 myenteric 총에서 분리. 여기, 격리 하 고 장 submucosa 및 lamina propria EGCs 문화 비 효소 방법 설명 되어 있습니다. 경도 근육 층의 수동 제거 후 EGCs lamina propria submucosa 상용 비 효소 세포 복구 솔루션에 외피 다음 순차 HEPES 버퍼링 EDTA 외피를 사용 하 여에서 해방 되었다. EDTA 외피 세포 복구 솔루션 submucosal EGCs 해방 수 있도록 lamina propria에서 상피 점 막의 대부분을 제거 하기에 충분 했다. 모든 잔여 lamina propria와 부드러운 근육 myenteric 명과 함께 삭제 되었다. EGCs 쉽게 폐해 fibrillary 산 성 단백질 (GFAP)를 표현 하는 그들의 능력에 의해 확인 되었다. 세포 현 탁 액의 약 50% 포함 된 GFAP + 셀 조직 외피를 완료 한 후 폴 리-D-리/laminin 기판에 도금 하기 전에. 그러나, glial 세포 파생 된 neurotrophic 요인 (GDNF)에서 세포 배양의 3 일 후-문화 미디어를 포함, 기판 코팅 판에 고착 하는 세포 인구 구성 > 95% 장 명과. 우리는 hGFAP-Cre 마우스 GFAP + 생 세포 형광을 사용 하 여 셀의 비율을 추적 하는 사 tdTomato 기자 라인을 사육 하 여 하이브리드 마우스 라인을 만들었습니다. 따라서, 비-myenteric 장 명과 비 효소 방법으로 격리 하 고 적어도 5 일 동안 배양 될 수 있습니다.
장의 glial 세포 (EGCs)의 기능에 대 한 관심 용기 무결성 및 항상성1,2에 그들의 인식된 역할 때문에 꾸준히 증가 했다. 또한, EGCs GI로3,4의 길이 따라 위치에 따라 다릅니다. EGCs glial 세포 파생 된 neurotrophic 요인 (GDNF) 등 다양 한 영양 요인 해제, 운동1,5 를 직감 하 고 미생물 부산물6,7에 응답을. 연구는 EGC 인구는 이기종 및 그들의 기능 여부 submucosal 또는 myenteric 총1,7내 따라 나타내 었 다. 예를 들어 내는 submucosa EGCs 꽉 접속점8에 기여 한다. 차동 GFAP 표현과 EGCs 인 산화가 장애9의 본질적인 표현 형에 그들의 가능한 연결을 제안 하는 파 킨 슨 병에 연결 되었습니다. 최근, 인접 장 submucosa에서 EGCs의 고립 된 문화에 있는 핵 단백질 menin의 손실을 했다 호르몬 gastrin10의 식을 유도 하기에 충분 한 관찰 되었다. 결과적으로, 그것은 EGCs 십이지 장 gastrinomas, 신경 내 분 비 종양10의 종류의 수 있습니다 제안 했다. 샨 다, 이러한 예 절연된 EGCs neuropathic 질환 및 암11의 기능과 동작의 관련성 밑줄.
필드에 도전 중 하나 또는 모두 EGC 인구에서 생체 외에서연구를 격리 하는 방법 남아 있습니다. 혈통 추적 실험 submucosa 및 lamina propria EGCs myenteric 총7에 조상 세포에서 발생 설명 했다. 여러 게시 된 격리 프로토콜 myenteric EGCs12,13,14,15,,1617의 문화를 생성 하는 사용할 수는 있지만 18,19, 아무도 특히 submucosal/lamina propria EGC 인구의 격리 대상. EGC 격리에 대 한 기존 프로토콜은 특별히 기계적 분리의 조합 또는 효소 분리, 점 막 세포 층을 결국 삭제와 함께 부드러운 근육의 기정을 사용 합니다.
이 원고의 목표 비 효소 lamina propria 생체 외에서 연구에서 기본 EGCs를 분리 하는 단계를 설명 하는 것입니다. 특별히 그는 submucosa에서 myenteric EGCs 구별 없는 마커 때문 평활 근에서 상피 점 막의 공간 분리 submucosal EGCs을 악용 했다. 또한, EDTA chelation 비 효소 분리와 결합 하 여 EGCs 관련된 인터 myenteric EGCs 함께 삭제 되었다 부드러운 근육 달리 submucosa 격리 했다. Submucosa의 lamina propria EGCs 더 분리 glial 세포 친화적인 기판, 예를 들어, 폴 리-D-리 신과 laminin에 세포 배양에 의해 발생 했습니다.
EGCs 직감 항상성에 중요 한 역할 그리고 분리 하 고 그들 에 체 외연구 필수적 이다. 이 프로토콜에서 성인 마우스 내장의 lamina propria에서 EGCs를 격리 하기 위한 간단한 방법 장 폐해 기능을 공부 도입 되었다.
면봉으로 부착 mesentery와 LMMP를 제거 경도 원형 근육 사이 있는 간 myenteric 명과의 일부를 제거, 버퍼 submucosal 표면에의 접근성 증가 하 고 많은 큰 모세 혈관을 제거…
The authors have nothing to disclose.
저자는 인정 (JLM)에 R37 DK045729, R01 AR060837 (HX)를 미시간 위장 연구 센터 분자 코어 P30 DK034933의 대학에서 지원 하고자 합니다.
Poly-D lysine (1 mg/ml stock) | Sigma | A-003-E | Dilute 1:10 |
Laminin (0.5 mg/ml stock) | Sigma | L4544 | Dilute to 10 µg/mL on ICE |
EDTA (0.5M) | Lonza | 51201 | Dilute 1:100 in DPBS |
HEPES (1 M) | Corning | 36216004 | Dilute 1:100 in DPBS |
Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | HyClone | SH30028.02 | |
DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
Penicillin-Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140-122 | |
Gentamicin (50mg/mL stock) | Life Technologies | 15750060 | |
GDNF (10 µg stock) | Sigma | SRP3200 | |
L-Glutamine (200 mM stock) | Life Technologies | 25030-081 | |
Chicken anti-GFAP | Thermo Fisher Scientific | PA1-10004 | |
Goat anti-a-Smooth Muscle Actin | Abcam | ab112022 | |
Mouse anti-Pgp9.5 | Novus Biologicals | NB600-1160 | |
Goat anti-E-cadherin | R&D Systems | AF748 | |
Rabbit S100 | Abcam | ab34686 | |
Mouse p75 NTR | Millipore | MAB5592 | |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Chicken IgY | Invitrogen | A-11039 | |
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG | Invitrogen | A-11055 | |
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11004 | |
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | R-37119 | |
Prolong Gold antifade Reagent with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
Fungizone (Amphotericin B) 250 µg/ml | Life Technologies | 15290-018 | |
L-Fura-2-AM | Invitrogen | F-14201 | |
CCK peptide | Anaspec, Fremont, CA | AS-20741 | |
Gastrin peptide (Gastrin-17) | Abbiotec, Bloomington, IN | 350188 | |
Nylon Mesh Celll Strainer (100 µm) | Fisher Scientific | 22363549 | |
Nylon Mesh Celll Strainer (40 µm) | Fisher Scientific | 22363547 | |
Disposable Serologic Pipet 5 ml | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Life Technologies | 25200-056 |