Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Submukoza ve Lamina Propria yetişkin fare enterik gliyal hücrelerini izolasyon

doi: 10.3791/57629 Published: August 15, 2018

Summary

Burada, bağırsak submukoza divalent katyonlar ve enzimatik olmayan hücre kurtarma çözümü kuluçka şelasyon yapın için sıralı EDTA incubations kullanarak gliyal enterik hücre izolasyon açıklayın. Sonuç hücre süspansiyon poli-D-lizin ve laminin kaplama submucosal Gliyal hücreler fonksiyonel analiz için zenginleştirilmiş bir kültür sonuçlanır.

Abstract

Nöronlar ve düz kas duvar, submukoza ve lamina propria içinde bulunan enterik Gliyal hücreler (EGCs) enterik sinir sistemi (ENS) oluşur. EGCs gut homeostazı çeşitli trofik faktörler sürümü ile önemli rol oynarlar ve epitel bariyer bütünlüğünü katkıda bulunmak. Birincil enterik gliyal kültürlerin en çalışmaları myenteric pleksus sonra enzimatik ayrılma izole hücreler kullanın. Burada, ayırmak ve bağırsak submukoza ve lamina propria EGCs kültür enzimatik olmayan bir yöntemi açıklanmıştır. Sonra el kaldırma boyuna kas tabakasının EGCs lamina propria ve piyasada bulunan enzimatik olmayan hücre kurtarma çözümü kuluçka ardından sıralı HEPES tampon EDTA incubations kullanarak submukoza kurtarılmış. EDTA incubations gelen submucosal EGCs kurtarmak hücre kurtarma çözümü sağlayan lamina propria epitelyal mukoza çoğunu şerit yeterliydi. Herhangi bir kalıntı lamina propria ve düz kas myenteric glia birlikte atılır. EGCs kolayca gliyal fibrillary asidik protein (GFAP'nin) hızlı yeteneğini tarafından tespit edilmiştir. Hücre süspansiyon sadece yaklaşık % 50 GFAP'nin + hücrelerin doku incubations tamamladıktan sonra ve poli-D-lizin/laminin substrat üzerine kaplama öncesi bulunan. Ancak, gliyal hücre kaynaklı nörotrofik faktör (GDNF) hücre kültürü çalışmalarının 3 gün sonra-oluşan yüzey kaplamalı plakalar kalarak hücre nüfus kültür ortamı içeren, > % 95 enterik glia. Biz bir melez fare çizgi hGFAP-Cre fare endojen hücre floresans kullanarak GFAP'nin + hücre yüzdesini izlemek için ROSA-tdTomato muhabir hattına ıslahı tarafından oluşturdu. Böylece, myenteric enterik glia enzimatik olmayan yöntemlerle izole ve en az 5 gün için kültürlü.

Introduction

Enterik Gliyal hücreler (EGCs) fonksiyonu ilgi giderek tanınan rolleri olarak gut bütünlüğü ve homeostasis1,2nedeniyle artmıştır. Buna ek olarak, EGCs GI yolu3,4uzunluğu boyunca konumlarına göre değişiklik gösterir. EGCs, gliyal hücre kaynaklı nörotrofik faktör (GDNF) de dahil olmak üzere çeşitli trofik faktörler bırakın hareketliliği1,5 delik deşik ve mikrobiyal yan6,7' ye yanıt vermek için katkıda bulunmak. Çalışmalar EGC nüfus türdeş olmayan ve işlevlerine onlar submucosal veya myenteric pleksus1,7içinde bulunan bağlı olarak değişir belirttiler. Örneğin, EGCs submukoza içinde sıkı kavşak8' e katkıda bulunur. Diferansiyel GFAP'nin ifade ve EGCs fosforilasyon Parkinson hastaligi, gut fenotip Bu bozukluk9olası onların bağlantı telkin için bağlantılı olmuştur. Son zamanlarda, nükleer protein menin EGCs izole kültürlerin proksimal bağırsak submukoza üzerinden kaybı hormon gastrin10ifade ikna etmek yeterli görülmüştür. Sonuç olarak, EGCs duodenal gastrinomas, nöroendokrin tümör10türü kökeni olabilir önerildi. Toplu olarak, bu örnekler nöropatik bozuklukları ve kanser11izole EGCs işlevini ve davranış eğitimi alaka altını çiziyor.

Alan mücadelesine nasıl yalıtmak ve birini veya her ikisini EGC nüfus vitroçalışma kalır. Soy izleme deneyleri EGCs submukoza ve lamina propria progenitör hücre myenteric pleksus7kaynaklanan gösterdi. Birkaç yayımlanmış yalıtım protokol myenteric EGCs12,13,14,15,16,17kültürleri oluşturmaya uygun olmakla birlikte, 18,19, hiçbiri özellikle yalıtım submucosal/lamina propria EGC nüfusunun hedefleyen. Varolan iletişim kuralları EGC yalıtım için özellikle bir arada mekanik ayrılması veya sonunda mukozal hücre katmanı atarak enzimatik ayrılma ile birlikte düz kas mikrodiseksiyon kullanır.

Bu el yazması non-enzimatik lamina propria vitro çalışmalar için gelen birincil EGCs yalıtmak için adımları göstermek için hedeftir. Özellikle myenteric EGCs ayırt alanındaki bu submukoza hiçbir işaretleri olduğundan, düz kas kayma ayrılması epitel Fibromu submucosal EGCs yalıtmak için istismar edildi. Buna ek olarak, EDTA şelasyon enzimatik olmayan ayrılma ile birleştirerek, EGCs ilişkili Inter-myenteric EGCs ile birlikte atıldı düz kas aksine submukoza yalıtılmış. Submukoza ve lamina propria EGCs daha fazla ayrılması gliyal cep dostu yüzeylerde, Örneğin, poli-D-lizin ve laminin hücre kültürü çalışmalarının tarafından oluştu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Açıklanan tüm hayvan deneyleri kullanımı ve bakımı hayvanların University of Michigan'ın Komitesi tarafından kabul edildi.

1. steril Poly-D-lizin (PDL) ve Laminin çözümleri hazırlanması

  1. En az bir gün önce hücre izolasyon, poli-D-lizin (PDL) ve laminin kaplamalı plakalar hazırlayın.
    Not: 6-şey ve 12-iyi plakaları bağlı olarak deneysel gol hazırlanmıştır. Tipik olarak, 12-şey plakaları kantitatif Batı açıkları kullanarak analiz için kullanılmıştır; Oysa 6-şey plakaları immünhistokimya için autoclaved (steril) coverslips tutmak için kullanıldı. 24-şey plakaları EGCs Ca2 + için kültür için kullanılan akı görüntüleme.
  2. DNaz-alerjik ve RNase free su doku kültürü Hood Hava HEPA filtre ile ultrasaf doku kültürü notu ile hisse senedi çözümleri sulandırmak.
  3. Cam coverslips sterilize
    1. Coverslip steril forseps ile tutun ve coverslips bir ölçek % 100 etanol 15 dk. doku kültürü mahallede buharlaşır ve 6-şey plakayı yerleştirmek için izin ver'etanol için bırakın.
    2. Alternatif olarak, birkaç coverslips tek tek bir Plastik Konteyner ve sonra otoklav 2 mm kalınlığında Bloting kağıt yerleştirin.

2. kaplama plakalar

Not: bir steril doku kültürü laminar akış başlık altında aşağıdaki adımları gerçekleştirin.

  1. 1 mg/mL PDL hisse senedi çözülme ve böylece nihai toplama 100 µg/mL steril, doku kültürü sınıf su ile 1:10 oranında seyreltin. 2 mL iyi 6-iyi tabaklar, 12-şey plaka bir şey kapsayacak şekilde 1 mL ve 0.5 mL 24-şey plakaları bir kuyuda için kat için kullanın. Kalan seyreltilmiş PDL 12 mL aliquots-20 ° C'de depolayın
  2. Kuyular için en az 1 h kat PDL izin sonra steril bir pipet ile PDL kaldırın. Hava plakalara doku kültürü laminar akış başlık altında tamamen kuru izin.
    Not: PDL çözüm steril bir pipet ile kaldırıldıktan sonra bu olabilir iki kez daha 1 hafta içinde 0.22 µm filtreden geçirerek ve 4 ° C'de depolamak sonra kullanılan
  3. Jel oluşumunu önlemek için buz laminin stokta çözülme.
    Not: Su katılmamış laminin 8 ° c sıcak zaman katı haline gelir
  4. Laminin hisse senedi (0,5 mg/mL) 1:50 ile steril Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz (10 µg/mL nihai bir konsantrasyon elde etmek için DPBS) oranında seyreltin. Seyreltilmiş laminin 12 mL aliquots-20 ° C'de depolayın
  5. Seyreltilmiş laminin içeren wells için PDL kurutulmuş ekleyin. 1 mL 6-şey yüzey ve 12-şey tabak dibinde kapsayacak şekilde 0.5 mL kapsayacak şekilde kullanın. Coverslips için 400 µL seyreltilmiş laminin, yüzey kapsama alanı elde etmek için coverslips ekleyin.
  6. Plaka aynı gün (hızlı kaplama) kullanılırsa, kaplamalı plakalar için 2 h, 37 ° C'de kuluçkaya. Eğer değilse, plastik wrap ile plakalarının ve gecede 4 ° C'de (yavaş kaplama) saklayın.
    Not: Sızdırmazlık kurutma ve kontaminasyonu önlemek için önemlidir.
  7. Laminin çözüm yüzeyi çizilmemesi önlemek için dikkatli bir pipet ile kaldırın. Yavaşça wells üç kez steril DPBS ile yıkayın.
  8. Tam gliyal büyüme medya her şey ve 37 ° C'de plakaları EGC süspansiyon eklemek için hazır kadar korumak ekleyin.
    Not: Poly-D lizin ve laminin kaplamalı plakalar 4 ° C'de 3 gün saklanabilir Birkaç gün kala plakasını ceket ve 4 ° C'de depolayın, steril DPBS ile plakalar üç kere yıka. 2 mL steril DPBS her şey için nihai yıkama sonra ekleyin. Parafilm ve 4 ° C'de mağaza ile plaka mühür Laminin kurumasına olduğunu emin olmak için önemlidir.

3. hazırlık yalıtım çözümleri

  1. EDTA/HEPES/DPBS ayrılma çözüm hazırlamak. Çözümün 500 mL için kullanın (kalsiyum ve magnezyum) olmadan steril DPBS 10 mM HEPES ve 5 mM EDTA son bir çözüm yapmak. DPBS 490 mL için 1 M HEPES tampon 5 mL ve 5 mL 0.5 M EDTA stok çözeltisi ekleyin. 4 ° C'de kullanmak kadar saklamak.
  2. Tablo 1' de listelenen reaktifler kullanarak gliyal hücreye resuspension ortam hazırlamak.
  3. Tablo 2' de listelenen reaktifler kullanarak gliyal büyüme ortam hazırlamak.
    Not:-Ebilmek var olmak stok GDNF içeren gliyal büyüme medya 4 ° C'de bir hafta için

4. bağırsak Segment kaldırılması

Not: Fareler yiyecek ve su euthanization önce ücretsiz erişim isoflurane bırak yöntemini ve kaldırma-in hayati bir organ tarafından izin verildi. C57BL/6 fareler 8 hafta-in yaş eskisinden daha fazla. Her iki cinsiyette hazırlık göze çarpan farklılıklar olmadan kullanılmıştır.

  1. Fare ile bir doz aşımı isoflurane ötenazi ve parçalanmış bir tepsi içinde sırtüstü yerleştirin. Ekstremitelerde pin ve karın % 70 etanol ile sterilize. Forseps ile cilt çadır ve karın makasla açın.
  2. Karaciğer kaldırın ve distal mide/mide tanımlar. Proksimal bağırsak 7 cm kaldır. Bağırsak gözyaşı için dikkatli olun.
  3. Mide uzağa bıçaklanmasından kırpma iken forseps ile tutun.
    1. Künt Diseksiyon makas arka ile dış görev yapisan pankreas kazımak için kullanın.
    2. Bağırsak segment Ca2 + veya Mg2 + (Şekil 1A) olmadan buz gibi DPBS içine koyun.
      Not: Bağırsak veya iki nokta üst üste diğer kesimleri de aynı tekniği kullanarak kaldırılabilir.
  4. 5 veya 10 mL şırınga bağlı bir künt son 20 G iğne buz ile dışkı içeriğini dışarı floş için kullanım soğuk DPBS (Şekil 1B).
  5. Bağırsak başlangıçta Smith et al. tarafından açıklanan tekniği kullanarak boyuna kas kaldırmak için 3 cm parçalara bölmek 12 ve Sundaresan vd. değiştirilmiş olarak 10.
    Not: En çok iki fareler gelen bağırsak kesimleri 30 mL HEPES/EDTA/DPBS yalıtım çözeltisi kullanılır.
  6. Tahta sopa pamuk uç--dan ayırmak için yaklaşık 4 cm koparmak. Tahta sopa DPBS (Şekil 1 c) emmek.
  7. Sorunsuz üzerine ıslak sopa (Şekil 2A-C) bağırsak kesimleri biri kayıp.
  8. Yapisan bıçaklanmasından hâlâ iğne-burun forseps (Şekil 2B) kullanarak bağlı kaldırın.
  9. Temiz bir jilet kullanın ya da nerede olduğunu bıçaklanmasından bağırsak boyunca iki boyuna rumuz yapmak için neşter (2E rakam) bağlı.
    1. DPBS pamuk ucuyla ıslak. Islak pamuk uç boyuna kas/myenteric pleksus (LMMP) gevşetmek için boyuna kas boyunca ovalayın. Sonra yatay olarak uzak gelen bağırsak kesimin uzunluğu boyunca dairesel kas LMMP LMMP kaldırma sırasında alay pamuk uç taşıyın.
    2. Başparmak ve işaret parmağı arasında sopa ucu orta ve dördüncü parmak (Şekil 2F) segment sabitleme süre tutun. Tamamlandığında, LMMP kolayca bağırsak kesimi soyma.
  10. LMMP bağırsak tüpünden striptiz yapıp, para için pamuklu çubukla myenteric pleksus EGCs hasat sürece bağlı atma isteniyorsa.
  11. Bir tıraş bıçağı açık paylamak için boyuna ahşap sopa kaldırmak bağırsak segment kullanın.
  12. Sökülen bağırsak dokusu (ağırlıklı olarak mukoza ve submukoza artı dairesel kas) DPBS buzda saklayın. Tüm bağırsak kesimleri hazırlanır 4.4-4.11 tamamlayana dek.

5. epitel mukoza kaldırılması

  1. Bağırsakların iyi makasla ~0.5 cm daha küçük parçalar halinde kesin.
  2. Doku 30 mL buz gibi EDTA/HEPES/DPBS çözeltisi içeren bir steril 50 mL konik santrifüj tüpü yerleştirin.
  3. Kaya dokusu içeren çözüm 4 ° c ~ 60 Eğer min başına 10 dakika için.
  4. Önceden bir kez yukarı ve aşağı EDTA/HEPES/DPBS tampon pipetting tarafından bir 5 mL plastik pipet nemlendirin ve doku pipette ve süspansiyon (toz) yukarı ve aşağı 20 kez tampon için önceden ıslatılmış pipet kullanın epitel mukoza çıkarmak için.
  5. Doku EDTA kuluçka 100 µm naylon hücre süzgeç aracılığıyla karışımı dökerek toplamak. Bulanık mukus dolu akışı-den (Şekil 3) atmak.
  6. Buz 30 mL içeren bir yeni 50 mL konik santrifüj tüpüne süzgeç muhafaza doku yer soğuk EDTA/HEPES/DPBS iğne-burun forseps kullanarak.
  7. 4 ° c ~ 60 Eğer ek epitel mukoza şerit için dakika başına 10 min için doku Rock yaparak EDTA/HEPES/DPBS kuluçka ikinci kez tekrarlayın.
  8. Ön tampon ile 5 mL pipet nemlendirin ve mukoza hücreleri çıkarmak için 20 kat yukarı ve aşağı doku süspansiyon pipette.
    Not: Doku daha epitel kaldırıldı için pipet içinde sopa eğiliminde olacaktır.
  9. 100 µm naylon hücre süzgeç aracılığıyla karışımı dökerek ikinci kuluçka sonra doku toplamak ve aracılığıyla akış atın. İkinci akışı aracılığıyla ilk (Şekil 3) daha belirgin bir şekilde daha az bulanık olmalıdır.
  10. Kadar çözüm yaklaşık 10 dk EDTA incubations temizleyin (yaklaşık 3-4 incubations doku miktarını ve toz verimliliğini bağlı olarak) tekrar (Şekil 3).

6. Lamina Propria ve submukoza enterik Gliyal hücreler topluluğu

  1. Doku piyasada bulunan hücre kurtarma çözümü ve rock için 25 – 30 dk 4 ° C'de 5 mL içeren 15 mL konik santrifüj tüpü naylon süzgeç aktarmak
  2. Lamina propria enterik gliyal hücrelerden ayırmak için hafifçe 10 x triturate.
    1. 40 µm filtre ile filtre ve filtrate temiz 50 mL tüp içinde toplamak.
    2. Doku naylon filtre DPBS 1 mL ile yıkayın.
    3. Doku atmak ve transfer ~ 5-6 mL filtrate temiz 15 mL konik santrifüj tüpü için.
    4. Filtrate 4 ° C'de 5 min için sallanan bir kova santrifüj 2.000 x g de spin
  3. Gliyal hücreyi içeren pelet resuspension arabellek en az 1 mL yavaşça yukarı ve aşağı Pelet 500 µL pipet ucu ile pipetting tarafından yeniden askıya alma. Kabarcıklar tanıtan kaçının.
    Not: resuspension sesi wells ve plaka sayısı için gerektiği gibi ayarlayın. Örneğin, bir 6-şey plaka için 1.2 mL; 2.4 mL iki 6-şey plakaları için; 2.4 mL bir 12-şey plaka için.
  4. 6-iyi veya 100 µL gliyal büyüme ortamı içeren 12-şey PDL-laminin kaplamalı plakalar için her kuyuya hücre süspansiyon 200 µL pipet.
  5. Bulaşıkları plakaları için hücreleri ekleme ve hücreleri bağlı kalmak için maksimum sayıda izin vermek için 37 ° C kuluçka makinesine yerleştirerek sonra rahatsız etmeyin.
    Not: Hücrelerinin sağlıklı bir hazırlık içinde 6-8 h takmak ama nazikçe yapışık olmayan hücreleri ile birlikte medya kapalı pipetting tarafından medya değiştirmeden önce en az 24 saat bekleyin.
  6. Hücreleri deneyler için 3-4 gün sonra bunlar kültür (Şekil 4) yerleştirilir kullanın. Antikorlar ilgi belirli protein işaretleri (Tablo 3) kullanarak immünfloresan çözümlemesi gerçekleştirin. Örneğin, GFAP'nin, S100b ve p75NTR veya Sox10 burada kullanılmıştır. E-cadherin veya Alfa düz kas aktin antikorlar diğer hücre tipleri kirlenme derecesini değerlendirmek için kullanılmıştır.

7. immünfloresan boyama

  1. Basına kapalı kültürler Aspire edin ve iki kez PBS ile durulayın.
  2. Kültürler 20 dk için oda sıcaklığında %4 paraformaldehyde ile düzeltmek.
  3. Sabitleştirici kaldırmak ve sonra 3 kez PBS ile durulayın.
  4. Hücreleri % 0,2 içeren PBS ile permeabilize Triton X-100 oda sıcaklığında.
  5. Permeabilized hücreleri Anti-tavuk IgY, Anti-tavşan veya oda sıcaklığında 2 h için anti-fare IgG oluşan engelleme çözümleri ile kuluçkaya.
  6. Birincil antikorlar bir gecede, Örneğin, GFAP'nin (1:1, 000) içeren hücreleri kuluçkaya.
    1. Hücreleri 3 kez PBS ile yıkayın. Colocalization gerçekleştirmek için adım 7,7 devam ederseniz.
  7. Oda sıcaklığında en az 2 h için birincil antikorlar sonraki kümesini kuluçkaya, ama tercihen 4 ° C'de gece 1: 1000 seyreltme tavşan anti-S100 olarak veya fare anti-p75NTR bir 1:500 seyreltme kullanın.
    Not: Tüm antikorlar PBS içinde seyreltilmiş.
  8. Birincil antikorlar kaldırmak için 3 kez PBS hücrelerle durulayın. Daha sonra durulanır hücreleri (Tablo 3) Oda sıcaklığında 2 h için uygun fluorescently öğesini ikincil antikorlar ile kuluçkaya.
  9. 3 kez ikincil antikorlar kaldırmak için PBS ile yıkayın.
  10. Coverslips 1-2 damla montaj ortamının DAPI ile kullanarak slaytlar üzerine monte ve hücreleri floresan mikroskop altında görüntüleyin.

8. akış sitometresi

  1. DPBS bir kez hücrelerle durulama tarafından akış sitometresi yapisan gliyal hücrelerini kaldırın ve sonra % 0.25 tripsin-EDTA üreticinin iletişim kuralı başına ekleyin. Tripsin-EDTA çözüm 3 dk. sonlandırma sindirimi için 37 ° C'de hücrelerde tam gliyal hücre büyüme medya hücrelerde toplayarak kuluçkaya.
  2. 400 x g 5 min için de centrifuging tarafından hücreleri toplamak ve PBS hücrelerde yeniden askıya.
  3. Hücreleri % 4 paraformaldehyde 10 dk ile düzeltin ve sonra % 0,2 ile adım 7,4 içinde açıklandığı gibi PBS Triton X-100 permeabilize.
  4. Hücreleri % 1 BSA ve doku belirli immünglobulin 20 dk, Örneğin, eşek Anti-tavuk IgY (IgG) (H + L) (1:1, 000) veya eşek Anti-keçi IgG (H + L) (1:1, 000) içeren PBS ile engelleyin.
  5. Birincil antikorlar GFAP'nin (1:2, 000), hücrelerle kuluçkaya E-cadherin (1: 400), α-düz kas aktin (1:500) veya Pgp9.5 (1:500) bir gecede 4 ° C'de
  6. PBS ile antikor silsin.
    1. Antijen-antikor kompleksi ile ikincil antikorlar fluorescently öğesini 30 dk için oda sıcaklığında inkübe kuluçkaya.
    2. İkincil antikor ile inkübe hücre ayrı bir aliquot izotip kontrol hizmet etmek için kullan. Her iki örneğin alınma olasılığını hücre yıkanmış ve PBS içinde akış sitometresi önce resuspended.
    3. İki popülasyonun bir akış sitometresi sayfasında bulunan bir hücreler üzerinde canlı hücreleri çoğunluğuna göre analiz.

9. hazırlanıyor fare dokulara hGFAP-Cre:tdTomato fareler

Not: Somon balığı-STOP-Lox-tdTomato cDNA ROSA locus22,23 (Jackson Labs, #007914) ifade edilir ve Cre recombinase (hGFAP-Cre) ifade bir fare için yetiştirilmiş zaman endojen floresans oluşturur. Situ çözümleme donmuş doku bölümler oluşturarak yapılır.

  1. Bağırsak dokusu %4 paraformaldehyde 1 h için fix ve gecede 1 M Sükroz PBS içinde içinde kurutmak.
  2. Ticari olarak % 10 Polivinil alkol oluşan en uygun kesme doku (OCT) bileşik satın alınan doku katıştırmak ve % 4.2 Polietilen glikol ve sonra ek sıvı azot içinde dondurma.
  3. 5 µm cryosections hazırlamak ve ortam DAPI ile takma bir antifade kullanarak bağlayabilirsiniz.
  4. Akış Sitometresi için EGCs hGFAP hazırlamak-4.1-6.5 adımlarda açıklandığı gibi Cre:tdTomato+ fareler.
  5. Kültürlerinde olduğu gibi adım 8.1 3 gün sonra plaka hücrelerden trypsinize ve % 4 paraformaldehyde 10 min için düzeltin.
  6. Cre negatif fareler hGFAP izole hücreler ile paralel olarak gelen izole hücreler analiz-Cre:tdTomato+ fareler üzerinde bir akış sitometresi.
    Not: Gates ölü hücreleri ve enkaz önlemek için inşa edildi.

10. Ca2 + akı görüntüleme

  1. 24-şey tabağa 3 µM ile kaplama EGCs kuluçkaya Fluo-4-AM için 30 dk 37 ° C'de.
  2. Ca2 + sinyal ticari olarak satın alınan Tyrode'nın çözüm dönen disk confocal mikroskop ve uyarma dalga boyu 480 kullanarak görüntü CCK veya gastrin peptid ekledikten sonra nm (F480). Görüntü analizi Sundaresan vd. bildirildi 10 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Eğer GFAP'nin + hücre vermedi bağlı kalmak ve içinde 24 h (Şekil 4A) yaymak preps başarısız kabul edildi. Hücreleri yapıştırılır ve düz toplamları (Şekil 4B) Yayilim kanıt gösterdi gliyal hücre sayısı 24 saat kadar sonra belirlenemedi. Hücre kümeleri kenarında uzun işlemleri genişletmek eğilimi ve Örneğin, GFAP'nin, klasik gliyal işaretleri, S100b ve p75NTR (Şekil 4 c, 4 D)10,16dile getirdi. 2nd gündüzleri, Gliyal hücreler sıkıca yapışık olmayan nüfus uzakta PBS ile durulanır izin yüzey yapıştırılır. Kayan hücrelerin çoğu epitel ve hücre artıkları ile birlikte lamina propria hücreleri. Bu yüzen hücre kümeleri varlığı akışı aracılığıyla neredeyse açık, epitel hücreleri lamina kaldırılmıştır sinyal gelene kadar EDTA incubations performans önemini vurgulamış yapisan Gliyal hücreler verim azalır propria çekirdek. Buna ek olarak, hücre kurtarma çözümü kuluçka sonra Santrifüjü 1.500 x g düşük hızlarda etkin bir şekilde tüm hücrelerin düşük verimleri için önde gelen bir Pelet içine toplamak değil. Genellikle, 100.000 40.000 hücreleri morfolojik EGCs ile tutarlı sıkıca kültür 3 günde tarafından yapıştırılır.

İmmunohistokimyasal analizi ile gliyal ilişkili antikorlar, belirtilen hücrenin o kaldı yapışık gün 3 GFAP'nin, S100b, Sox 10 olumlu10,ve16 (5A rakam) olduğunu kümeleri. Mevcut çalışmada, bu aynı derecede saflık tarafından hücreleri permeabilizing ve akış sitometresi (Şekil 5B-F) tarafından analiz gözlendi. Hemen submucosal/Lamina propria gliyal hücrelerini izole sonra akış sitometresi ortaya hücreleri yaklaşık % 51 GFAP'nin GFAP'nin negatif hücre tipleri, Örneğin, epitel, hematopoetik varlığı öne + (5B rakam), olduğunu, endotel, nöronal hücre epitel ve lamina propria içinde bulunduğunun bilinmesi myofibroblasts. Kültür 3 gün sonra GFAP'nin + hücre sayısı üzerinde % 95'i temsil özgün medya çıkardıktan sonra analiz hücre nüfusu yavaşça PBS ile durulama ve taze medya (Şekil 5C) ekleme. İlginçtir, akışı analizi yüksek ve düşük GFAP'nin protein ifade nüfus (Şekil 5C) saptandı. Nitekim, immünfloresan çözümleme hücre kümeleri çevre GFAP'nin (Şekil 4 c, 4 D) düzeyleri daha yüksek hızlı eğilimi ortaya. Birlikte ele alındığında, analiz iki tür EGC vade veya farklılaşma durumu farklılıklar gösterebilir. Topluca, α yüzdesi-SMA + (myofibroblast Hücre işaretçisi), E-cadherin + (epitel Hücre işaretçisi) ve Pgp 9.5 + (nöronal hücre işaretçisi) hücreleri olduğunu az % 5 (Şekil 5 d-F). Bu sonuçlar önceki çalışma ile tutarlı GFAP'nin + 10hücreleri immünfloresan yaklaşık %93 gösterilen EGCs etiketleme kullanılarak gerçekleştirilir. Akışı analizi hücrelere yaklaşık %5 kültürlerin oluşan bulaşıcı hücre popülasyonlarının kaldırılmasını sağlar beri plakaları için uygun izin vermenin önemini vurguluyor.

GFAP'nin-harekete geçirmek muhabir akış sitometresi hücre daha fazla çözümleme için kolaylaştırmak için ve endojen bir floresan işaretçisi (Şekil 6) kullanarak EGC zenginleştirme derecesini karşılaştırmak için kullanmak için bu çalışmanın bir hedefi oldu. HGFAP-Cre fare çizgi aslında Messing ve iş arkadaşlarınızla 20tarafından tanımlanmıştır. Kısacası, Cre recombinase 2,2 kb insan gliyal fibrillary asit protein (hGFAP) Düzenleyicinin kontrolü altında yerleştirildi. Böylece, bu hGFAP organizatörü transkripsiyonu herhangi bir hücreyi kırmızı floresan muhabir tdTomato dile getirdi. TdTomato muhabir ile etiketli hücre nüfusu görüntülenmeyecektir in situ yukarıda açıklanan EGC yalıtım yordamları gerçekleştirmeden önce dondurulmuş bölümleri bağırsak ve kolon (Şekil 6A, 6B) kullanarak idi. EDTA/hücre kurtarma yalıtım gerçekleştirme ve hücre kültürü çalışmalarının 3 gün boyunca sonra EGCs bu fareler üzerinden kolayca onların endojen Floresan (Şekil 6C) tarafından tespit edilmiştir. GFAP'nin + hücrelerin tartışmalı proksimal bağırsak4,21' daha çeşitli olmakla birlikte, tdTomato + EGCs ayrıca kolon (Şekil 6B) tespit edildi. HGFAP-Cre tarafından aktive tdTomato+ floresan muhabir kullanarak aynı zamanda ortaya hGFAP biomodel nüfusu-tdTomato + hücreleri (GFAP'nin immünfloresan analizini kullanarak gözlemlediği gibiŞekil 6D) protein (Şekil 5C). Her ne kadar tüm EGCs GFAP'nin protein4hızlı bildirilmiştir, bu noktada GFAP'nin ifade düzeyde farklılıklar gösterebilir. Ortalama olarak, analiz hücreleri yaklaşık % 66 tdTomato floresan en üst düzeyde sergiledi. Bu nedenle, EDTA/hücre kurtarma protokolüne EGCs alt kümelerine ince bağırsak ve kolon gen ekspresyonu farklılıkları incelemek için muhabiri tarafından etiketli boyunca yalıtmak için kullanılabilir.

Bu iletişim kuralı nispeten saf GFAP'nin + Gliyal hücreler biyokimyasal çalışmaları ve western blot analizi için yeterli sayıda üretilen 10. gliyal hücreye yanıt verme hızını göstermek için 3 günlük gliyal hücreye hazırlık hormonlar cholecystokinin (CCK) veya Ca2 + akı ikna etmek için gastrin ile tedavi edildi (Şekil 7A-7B)10. Sonuçlar bu GFAP'nin + yapışık hücreleri ekstrasellüler agonistler bilinen enterik gliyal işlevi sergilemek için yeteneklerini gösteren tepki gösterdi.

Figure 1
Şekil 1: Set up ve fare bağırsak hazırlanması. (A)resim ayıklanan bağırsak da dahil olmak üzere buza kurmak tecrit. Dışkı içeriğini floş için (B) resmi bir 20 G künt son iğneye bağlı 5 mL şırınga. (C) DPBS arabellekte iliklerine kadar bir ahşap pamuklu çubukla (~ 4 cm) Engineered sonu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: bağırsak temiz ve boyuna kas/myenteric pleksus (LMMP) kaldırmak için kullanılan adımları. (A-C) Islak bir tahta sopa üzerine bağırsak bir kesimini kayar. (D) kaldırılması yapisan bıçaklanmasından. (E) bir tıraş bıçağı ile bağırsak Nicking. (F) LMMP bir ıslak pamuk bez ile kaldırma. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: sıralı akış-throughs EDTA incubations sonra. 4 sıralı incubations üç 7 cm bağırsak kesimleri için 5 mM EDTA/10 mM HEPES DPBS ve sonra triturated ile 10 dk 20 kez inkübe kullanarak akış-throughs örnekler gösterilmiştir. 100 µm naylon mesh süzgeç aracılığıyla dökülen sonra temsilcisi akışı throughs gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: EGC görüntüleri 24 saat sonra kaplama. Resuspended hücreleri 24 h Işık mikroskopik muayene sonrasında kaplama. (A)gösterildi kayan epitel hücre kümeleri (ok) ve enkaz gösteren bir zavallı hazırlık temsilcisi bir örnektir. Hiçbir yapışık EGCs sonra 24 h gözlendi (B) gösterildi hücre izolasyon ve resuspension EGCs yamalari PDL/Laminin yapıştırılır plakaları kaplı sonra mükemmel bir hazırlık 24 h temsilcisi bir örneği olduğunu. Görüntüler üzerinde ters bir floresan mikroskobu ile bir dijital fotoğraf makinesi ele geçirildi. Ölçek çubukları 500 µm (A-B) =. (C) yüksek güçte bir yama EGC hücrelerin görünümünü lekeli GFAP'nin antikor ile (yeşil çevre hücreleri etiketleme bir daha yüksek yoğunluğu ile gösterilen). Hücreleri birkaç çift çekirdek (ok ucu, DAPI, mavi) gösterdi. (D) Colocalization, GFAP'nin (yeşil) S100 (kırmızı) veya p75NTR (kırmızı). Ölçek çubukları 20 µm (C-D) =. Hücreleri bir antifade reaktif ve DAPI (Mavi çekirdeği) ile monte edildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: akış sitometresi yetişkin fare duodenal lamina propria izole enterik Gliyal hücreler. (A)ayirt GFAP'nin, S100B ve Sox10 3 gün sonra EGC kültürler üzerinde. Oklar, Sox 10 olumlu çekirdekler gösterir. Ölçek çubukları 20 µm (Sundaresan ve ark. izniyle kullanılan = 10). (B) yüzde GFAP'nin pozitif hücrelerinin daha önce kaplama kaplama plakaları (floresan yoğunluğu (veya ileri dağılım, x ekseni) karşı tarafı dağılım (y ekseni). (C) GFAP'nin pozitif (D) α-SMA pozitif (E) E-cadherin pozitif (F) ve Pgp 9.5 pozitif hücrelerinin 3 daysafter kaplama yüzdesi. Gates ölü hücreleri ve enkaz önlemek için inşa edildi. Hücreleri (yan dağılım) sayısına oranla floresan nüfusun ortalama yüzde gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: HGFAP-Cre+, duodenal lamina propria izole enterik Gliyal hücreler tanımlaması: tdTomato+ yetişkin fare. Endojen tdTomato Floresan (kırmızı) görüntüleri bir faz kontrast floresan mikroskop(a)bağırsak dijital kamera ele geçirildi. (gömme) Aynı derecede A dışında DAPI görüntü (Mavi çekirdeği) ile birleştirdi. (B) iki nokta üstüste DAPI ile birleştirilir. (C) enterik Gliyal hücreler hGFAP izole (kırmızı)-Cre:dtTomato+ fareler ve kültürlü PDL/Laminin substrat üzerine 3 gündür. Ölçek çubukları 50 µm. (D) akış sitometrik analizinde tdTomato hücreleri =. Ortalama % GFAP'nin + hücre ± SEM için 3 farklı hazırlıkları (hazırlık başına 3 fareler) gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7: Ca2 + Video sonra hormon tedavisi değişimlerinde. EGCs 24-şey PDL ve laminin kaplı üzerinde kaplama plakaları 3 gün boyunca gliyal büyüme medyada kültürlü. Hücreleri ile Fura-2-AM 3 µM 37 ° C'de 20 dk için önceden yüklenmiş olduğunu ve o zaman tedavi ile (A) 100 nM cholecystokinin (CCK) veya (B) 100 nM gastrin. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Bileşenleri Eklenecek birim Son konsantrasyonu
DMEM/F12 44,5 mL _
Fetal sığır Serum (FBS) 5 mL % 10
Penisilin-streptomisin 500 ΜL 100 IU/mL kalem
Streptomisin 100 µg/mL Strep
Gentamisin (50 mg/mL stok) 20 ΜL 20 µg/mL

Tablo 1: Kompozisyon gliyal hücreye Resuspension medya.

Bileşenleri Eklenecek birim Son konsantrasyonu
DMEM/F12 44 mL _
Fetal sığır Serum (FBS) 5 mL % 10
Penisilin-streptomisin (100 x) 500ΜL 100 IU/mL (Pen)
100 µg/mL (Strep)
Gentamisin (50 mg/mL stok) 20 ΜL 20 µg/mL
GDNF (10 µg/mL stok) 50 ΜL 10 ng/mL
L-glutamin (200 mM stok) 500ΜL 2 mM

Tablo 2: Kompozisyon gliyal hücre büyüme ortamının.

Bileşenleri Ayirt seyreltme Akış Sitometresi seyreltme
Tavuk anti-GFAP'nin 1-500 1-2000
Tavşan anti-S100 1-500 1-500
Fare anti-p75 NTR 1-500 1-500
Keçi anti-E-cadherin 1-400
Fare anti-Pgp9.5 1-500
Keçi anti-a-düz kas aktin 1-500
Alexa Fluor 488 keçi Anti-tavuk IgY 1-1000 1-1000
Alexa Fluor 568 keçi Anti-fare IgG 1-1000 1-1000
Alexa Fluor 594 eşek Anti-tavşan IgG 1-1000
Alexa Fluor 488 eşek Anti-keçi IgG 1-1000

Tablo 3: Antikor listesi

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

EGCs gut homeostazı önemli rol oynarlar ve yalıtmak ve onları içinde vitroçalışma için önemlidir. Bu protokol için EGCs yetişkin fare bağırsak lamina propria izole için basit bir yöntem enterik gliyal işlev eğitim için kullanılmaya başlandı.

Yapisan bıçaklanmasından ve LMMP ile bir pamuklu çubukla kaldırma bazı boyuna ve dairesel kas arasında ikamet eden Inter-myenteric glia ortadan kaldırır, arabellek submucosal yüzeye erişilebilirliğini artırır ve çok daha büyük kapiller kaldırır . İkinci kırmızı kan hücreleri son kültürler kirletici sayısını azaltır. EDTA incubations dizi uzak lamina propria ve submucosal glia, hangi şelat çözümler maruz kaldıktan sonra kırılgan olabilir ortaya epitel mukoza şerit. Ajitasyon sallayarak, vortexing veya triturating (tekrarlayan pipetting yukarı ve aşağı) dikkatle gerçekleştirilen ve hücrelere aşırı zarar görmemesi için zaman aşımına uğradı. Çünkü teknik yapışık, uygun Gliyal hücreler daha tutarlı bir verim içinde sonuçlandı toz burada kullanılmıştır. Sallayarak kabarcıklar tanıtmak ve morfolojik kaplamalı plakalar hücre bağlılık tarafından değerlendirilen hücre canlılığı azaltmak olarak gördüler. Doku parçalar halinde kesilmiş < 0.5 cm etkili 5 mL pipet ile doku triturate.

Genellikle, en az 3 fare üzerinden 7 cm kesimleri bir 6-şey plaka yaklaşık 20-%30 karşılamak için yeterli EGCs oluşturmak için yeterli confluency, daha sonra immunocytochemistry ve qPCR için kullanılabilir. Ancak, daha fazla hücre okudu gen ifade düzeyine bağlı olarak Batı lekesi gibi biyokimyasal yöntemler için gerekli olabilir. Her ne kadar 1 kollajen yazın veya Matrigel kısaca poli-D-lizin/Laminin substrat alternatif olarak incelendiğinde, epitel hücre nüfusunun büyük bağlılık, sonuçta diğer hücre tipleri ile EGC kültürlerin kirlenme artan gözlenmiştir . Buna ek olarak, tip 1 kollajen sıkıca plakaları için uygun değil ve medya değiştirirken yüzeyden kolayca yerinden çıkarmış. Fibronektin kullanılan24oldu, ama burada test değil başka bir substrat var. Laminin, Görünüşe göre bağlama artırır ve farklılaşma Crest sinir hücreleri25türetilmiş. Ancak, çok sayıda laminin değişebilir, etkileyen hücre bağlılık ve verimleri. Kültürlerin mikrobiyal kirlenme zaman yaklaşık % 5 oluştu ve minimumda steril reaktifler, tekniği ve antibiyotik kullanımı tarafından tutuldu. Antifungal reaktif kullanımı isteğe bağlıdır.

Büyük protokolü burada epitel temel EGCs zarar vermeden kaldırmak için ajitasyon standardizasyon kısıtlamasıdır. Hemen kaplamalı plakalar hücre bağlılık bağlıdır beri Ayrıca, hazırlık değerlendirmesi yapılamaz. Sorun giderme sırasında odaklanmak için üç alan içerir: 1) taze PDL ve laminin plakaları; kat için kullanımı 2) yardımcıları sayısını artırarak EDTA incubations başlayan vakti diseksiyon üzerinden simge durumuna küçültme; 3) zaman ve etkin bir şekilde epitel ve EGCs kaldırmak için doku kışkırtmak için kullanılan yöntemi ölçmek. Bu adımlardan birini zamanında uzanan EGC kırılganlık ve onlar ne zaman büyüme medyada kaplama kurtarmaz olasılığını artırır. Epitel ayırmak için toz yöntemi burada kullanılmış olmasına rağmen daha fazla operatör bağımlı ve ölçmek zordur çünkü sallayarak ve vortexing da tutarsız sonuçlar ile belki de test edildi. Yapışık hücreleri verim kaplama hücreleri 16-24 h için rahatsız değil, büyük oldu.

Burada sunulan yöntem özgün araştırmaya göre Smith et al. tarafından güncellenmiştir LMMP izole üzerinde odaklanan 12. Smith yaklaşım burada sadece kaldırmak ve böylece çoğunu izole Gliyal hücreler submukoza ve lamina propria köken LMMP atmak için kullanıldı. Buna ek olarak, enzimatik sindirim myenteric EGCs kolayca kurtarılmış12değildir. Yine de, myenteric karşı submucosal glia için belirli hiçbir işaretleri olduğundan, Inter-myenteric pleksus gliyal hücrelerini varlığı dışarıda bırakılamaz. Rosenbaum ve ark. akış sitometrik Analizi gelişmiş yeşil flüoresan protein (EGFP) hGFAP organizatörü ifade EGCs bildirdi. Onlar çok genç fareler (Doğum sonrası gün 7) kullanılan ve EGCs tüm bağırsak enzimatik sindirim19tarafından izole. Buna ek olarak, akış sitometrik çözümlemesi serbest yüzer neurosphere oluşumu terfi koşulları Bakımı iki hafta sonra gerçekleştirildi. Her ne kadar neurospheres son derece GFAP'nin ve S100b ifade yazarlar bildirdi, kayan hücre toplamları da güçlü α-SMA, genişleme myofibroblast hücre nüfusunun gliosphere geliştirme aksine teşvik düşündüren ifade Burada anlatılan düz levha gibi morfoloji için. Bu nedenle, ilginç ise, çalışma bu iletişim kuralı için doğrudan karşılaştırılabilir değildir karşılaştırılabilir. Buna karşılık, hücre morfolojisi birleştiğinde ile önemli ölçüde daha az α-SMA + hücre önermek bu protokol için açıklanan EGCs 3 boyutlu morfolojisi 3-5 gün kültür döneminde sergi değil ki. Yine de, burada iletişim kuralı hem Rosenbaum yöntemi floresan bir muhabir tanımlanmasını ve yalıtılmasını araştırmacı'nın hücre profil oluşturma yaşıyorsun yeteneğini artıracak GFAP'nin + hücreler kullanın.

Sonuç olarak, geçerli protokol enzimatik olmayan bir yaklaşım kullanarak submukoza enterik gliyal hücrelerini izolasyon açıklar. Tüm iletişim kuralı ilk kaplama fare diseksiyon yaklaşık 3 h ön kaplamalı doku kültürü tabaklarda alır. En zaman yoğun iletişim kuralı kaldırma ve bağırsak hazırlanması için ilk EDTA kuluçka adımdır. Tabakları hazırlanması ve DPBS içinde depolama kesinlikle önerilir. Temel EGCs zarar vermeden epitel verimli kaldırma üzerine hazırlık başarısı bağlıdır ve bağlılık içinde 24 h birincil EGCs PDL/Laminin kaplamalı plakalar biyokimyasal analiz gibi vitro çalışmalar için yararlı, CA2 + Cerayanlar ve adenoviral transfections10. Yeteneğini submukoza veya LMMP EGCs izole etmek EGC büyüme özellikleri, farklılaşma ve tüm genom yaklaşımları kullanarak morfoloji farklılıkları tanımlamak için daha fazla çalışmaları verecektir öngörülmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Yazarlar R37 DK045729 (JLM için) R01 AR060837 (için HX) ve University of Michigan Gastrointestinal araştırma merkezi moleküler çekirdek P30 DK034933 destek kabul etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly-D lysine (1 mg/mL stock) Sigma A-003-E Dilute 1:10
Laminin (0.5 mg/mL stock) Sigma L4544 Dilute to 10 µg/mL on ICE
EDTA (0.5 M) Lonza 51201 Dilute 1:100 in DPBS
HEPES (1 M) Corning 36216004 Dilute 1:100 in DPBS
Cell Recovery Solution Corning 354253
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) HyClone SH30028.02
DMEM/F-12 Thermo Fisher Scientific 11320033
Penicillin-Streptomycin (100x) Life Technologies 15140-122
Gentamicin (50 mg/mL stock) Life Technologies 15750060
GDNF (10 µg stock) Sigma SRP3200
L-Glutamine (200 mM stock) Life Technologies 25030-081
Chicken anti-GFAP Thermo Fisher Scientific PA1-10004
Goat anti-a-Smooth Muscle Actin  Abcam ab112022
Mouse anti-Pgp9.5  Novus Biologicals NB600-1160
Goat anti-E-cadherin  R&D Systems AF748
Rabbit S100  Abcam ab34686
Mouse p75 NTR  Millipore MAB5592
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Chicken IgY Invitrogen A-11039
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG Invitrogen A-11055
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG Invitrogen A-11004
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG Invitrogen R-37119
Prolong Gold antifade Reagent with DAPI Thermo Fisher Scientific P36931
Fungizone (Amphotericin B) 250 µg/mL Life Technologies 15290-018
L-Fura-2-AM Invitrogen F-14201
CCK peptide Anaspec, Fremont, CA AS-20741
Gastrin peptide (Gastrin-17) Abbiotec, Bloomington, IN 350188
Nylon Mesh Celll Strainer (100 µm) Fisher Scientific 22363549
Nylon Mesh Celll Strainer (40 µm) Fisher Scientific 22363547
Disposable Serologic Pipet 5 mL Fisher Scientific 13-678-11D
0.25% Trypsin-EDTA (1x) Life Technologies 25200-056

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grubisic, V., Gulbransen, B. D. Enteric glia: the most alimentary of all glia. Journal of Physiology. 595, (2), 557-570 (2017).
  2. Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 9, (11), 625-632 (2012).
  3. Rao, M., et al. Enteric Glia Regulate Gastrointestinal Motility but Are Not Required for Maintenance of the Epithelium in Mice. Gastroenterology. 153, (4), 1068-1081 (2017).
  4. Rao, M., et al. Enteric glia express proteolipid protein 1 and are a transcriptionally unique population of glia in the mammalian nervous system. Glia. (2015).
  5. McClain, J., et al. Ca2+ responses in enteric glia are mediated by connexin-43 hemichannels and modulate colonic transit in mice. Gastroenterology. 146, (2), 497-507 (2014).
  6. Cunha Franceschi, R., et al. Enteric glial reactivity to systemic LPS administration Changes in GFAP and S100B protein. Neuroscience Research. 119, 15-23 (2017).
  7. Kabouridis, P. S., et al. Microbiota controls the homeostasis of glial cells in the gut lamina propria. Neuron. 85, (2), 289-295 (2015).
  8. Yu, Y. B., Li, Y. Q. Enteric glial cells and their role in the intestinal epithelial barrier. World Journal of Gastroenterology. 20, (32), 11273-11280 (2014).
  9. Clairembault, T., et al. Enteric GFAP expression and phosphorylation in Parkinson's disease. Journal of Neurochemistry. 130, (6), 805-815 (2014).
  10. Sundaresan, S., et al. Gastrin Induces Nuclear Export and Proteasome Degradation of Menin in Enteric Glial Cells. Gastroenterology. 153, 1555-1567 (2017).
  11. Gulbransen, B. D. Enteric Glia: The Origin of Duodenal Gastrinomas? Gastroenterology. (2017).
  12. Smith, T. H., Ngwainmbi, J., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. An in vitro preparation of isolated enteric neurons and glia from the myenteric plexus of the adult mouse. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
  13. Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In situ Ca2+ imaging of the enteric nervous system. Journal of Visualized Experiments. (95), (2015).
  14. Bernstein, C. N., Vidrich, A. Isolation, identification, and culture of normal mouse colonic glia. Glia. 12, (2), 108-116 (1994).
  15. Jaeger, C. B. Isolation of enteric ganglia from the myenteric plexus of adult rats. Journal of Neural Transplantation & Plasticity. 5, (4), 223-232 (1995).
  16. Almond, S., Lindley, R. M., Kenny, S. E., Connell, M. G., Edgar, D. H. Characterisation and transplantation of enteric nervous system progenitor cells. Gut. 56, (4), 489-496 (2007).
  17. Ruhl, A., Trotter, J., Stremmel, W. Isolation of enteric glia and establishment of transformed enteroglial cell lines from the myenteric plexus of adult rat. Neurogastroenterology & Motility. 13, (1), 95-106 (2001).
  18. Boyen, G. B., et al. Distribution of enteric glia and GDNF during gut inflammation. BMC Gastroenterology. 11, 3 (2011).
  19. Rosenbaum, C., et al. Activation of Myenteric Glia during Acute Inflammation In Vitro and In Vivo. Public Library of Science One. 11, (3), e0151335 (2016).
  20. Zhuo, L., et al. hGFAP-cre transgenic mice for manipulation of glial and neuronal function in vivo. Genesis. 31, (2), 85-94 (2001).
  21. Boesmans, W., Lasrado, R., Vanden Berghe, P., Pachnis, V. Heterogeneity and phenotypic plasticity of glial cells in the mammalian enteric nervous system. Glia. 63, (2), 229-241 (2015).
  22. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22, (12), 1567-1572 (2004).
  23. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13, (1), 133-140 (2010).
  24. Kabouridis, P. S., et al. The gut microbiota keeps enteric glial cells on the move; prospective roles of the gut epithelium and immune system. Gut Microbes. 6, (6), 398-403 (2015).
  25. Pomeranz, H. D., Sherman, D. L., Smalheiser, N. R., Tennyson, V. M., Gershon, M. D. Expression of a neurally related laminin binding protein by neural crest-derived cells that colonize the gut: relationship to the formation of enteric ganglia. The Journal of Comparative Neurology. 313, (4), 625-642 (1991).
Submukoza ve Lamina Propria yetişkin fare enterik gliyal hücrelerini izolasyon
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Wang, Z., Ocadiz-Ruiz, R., Sundaresan, S., Ding, L., Hayes, M., Sahoo, N., Xu, H., Merchant, J. L. Isolation of Enteric Glial Cells from the Submucosa and Lamina Propria of the Adult Mouse. J. Vis. Exp. (138), e57629, doi:10.3791/57629 (2018).More

Wang, Z., Ocadiz-Ruiz, R., Sundaresan, S., Ding, L., Hayes, M., Sahoo, N., Xu, H., Merchant, J. L. Isolation of Enteric Glial Cells from the Submucosa and Lamina Propria of the Adult Mouse. J. Vis. Exp. (138), e57629, doi:10.3791/57629 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter