Summary
Vor-Ort-mikrobielle Bereicherung oder in Situ Anbautechniken können die Isolierung der mikrobiellen Taxa schwierig zu Kultur, vor allem von Low-Biomasse oder geochemisch extreme Umgebungen erleichtern. Hier beschreiben wir eine elektrochemische Einrichtung ohne eine externe Stromquelle, um mikrobielle Belastungen zu bereichern, die extrazelluläre Elektronentransport (EET) geeignet sind.
Abstract
Anaerobe Atmung gepaart mit Elektronentransport zu unlöslichen Mineralien (extrazelluläre Elektronentransport [EET] genannt) wird angenommen, dass kritische für mikrobielle Energieerzeugung und Persistenz in vielen unterirdischen Umgebungen, insbesondere fehlt es an löslichen terminal Elektronen-Akzeptoren. Während EET-fähigen Mikroben aus verschiedenen Umgebungen erfolgreich isoliert wurden, die Vielfalt der Bakterien in der Lage, EET ist immer noch schlecht verstanden, vor allem in schwierigen Probe, niedrige Energie oder extreme Umgebungen, wie viele Untergrund Ökosysteme. Hier beschreiben wir eine vor-Ort-elektrochemischen System EET-fähigen Bakterien mit eine Anode als eine respiratorische terminal Elektron Akzeptor zu bereichern. Diese Anode ist mit einer Kathode in der Lage katalysieren abiotischen sauerstoffreduktion verbunden. Vergleicht man diesen Ansatz mit Electrocultivation Methoden, mit denen ein potentiostaten für nutzmöglichkeiten potenzielle Elektrode, ist das zwei-Elektroden-System nicht erforderlich, eine externe Stromquelle. Wir präsentieren Ihnen ein Beispiel für unsere vor-Ort-Anreicherung in einem alkalischen Teich an der Zedern, eine terrestrische assimiliert Website in Nordkalifornien genutzt. Vorherige Versuche, mineralischen reduzierende Bakterien kultivieren scheiterten, dürfte aufgrund der niedrigen Biomasse Natur dieser Website und/oder niedrige relative Häufigkeit des Metalls, die Verringerung der Mikroben. Vor der Implementierung unserer zwei-Elektroden-Anreicherung, haben wir das Höhenprofil des gelösten Sauerstoff-Konzentration gemessen. Dies erlaubt uns, legen Sie die Kohle fühlte fühlte Anode und Platin galvanisch gebundenen Kohlenstoff Kathode in tiefen, die anaeroben und aeroben unterstützen würde bzw. verarbeitet. Nach vor-Ort-Inkubation weiter bereichert die anodische Elektrode im Labor und bestätigt eine ausgeprägte mikrobiellen Gemeinschaft im Vergleich zu der Oberfläche befestigt oder Biofilm-Gemeinschaften, die normalerweise bei der Zedern beobachtet. Diese Bereicherung führte später zur Isolierung von der ersten elektrogenes Mikrobe von Zedern. Diese Methode der vor-Ort-mikrobielle Bereicherung hat das Potenzial, die Isolation der EET-fähigen Bakterien aus niedrigen Biomasse oder schwer zu Probe Lebensräume erheblich verbessern.
Introduction
Mehrere Mineral-reduzierende Mikroben haben gezeigt, dass Festphasen-Mineralien als terminal Elektronen Akzeptoren nutzen durch extrazelluläre Elektronentransport (EET) Prozesse, die Elektronen an der Außenseite der Zelle über Redox Enzyme1durchführen. EET ist entscheidend, nicht nur für Mikroben-Mineral Prozesse aber auch Angewandte Energie- und Umwelttechnologien, wie mikrobielle Brennstoffzellen2, Elektrode Synthese3und Bioremediation4. Neue EET-fähigen Bakterien sind sehr begehrt und wurden von einem grundlegenden und angewandten Perspektive5ausgiebig untersucht. Allerdings haben wir nur einen Einblick in die ökologischen oder biogeochemische Bedeutung dieser Bakterien beschränkt. Die Mehrheit der EET-fähigen Mikroben wurden isoliert nach Anreicherung von Aqua, Sediment oder anaeroben Fermenter mit solide Elektronen-Akzeptoren wie MnO2, Fe2O3 oder balanciert Elektroden im Labor6, 7 , 8. jedoch diese Methoden produzieren häufig ähnliche Konsortien und empfindlicher Taxa, die Niedrigenergie- oder niedrigen Biomasse-Systeme, Vorspannen der Anpassungsfähigkeit dieser Mikroben an Labor oder in der axenic Kultur Umwelt9 dominieren können potenziell zu verpassen . In der Regel sind für Umgebungen mit niedrigen Biomasse, große Mengen Wasser von einer Website gefiltert, um bakterielle Zellen zu konzentrieren. Allerdings EET-fähigen Bakterien zeigen oft anaeroben Stoffwechsel und daher Sauerstoff-Exposition kann weiter hemmen oder verhindern, dass ihr Anbau. Alternative vor-Ort-Methoden, um Zellen zu konzentrieren, ohne sie zu Sauerstoff könnte die Isolation der EET-fähigen Bakterien erleichtern. Hier berichten wir Einrichtungsdetails für eine vor-Ort-elektrochemische Technik, EET-fähigen Mikrobe über einen langen Zeitraum hinweg ohne die Notwendigkeit für eine externe Stromquelle zu bereichern.
Mit unseren Electrocultivation Experimenten aus einer stark alkalischen Quelle in Nordkalifornien, die Zedern10, beschreiben wir diese vor Ort elektrochemische Technik. Die Geochemie der Federn bei The Cedars werden durch assimiliert im Untergrund belastet. Die Federn sind sehr reduktiv, mit Sauerstoffkonzentrationen unterhalb der Nachweisgrenze unter der Luft-Wasser-Grenzfläche Hervorhebung das Potenzial für die mikrobielle Energieerzeugung über EET in dieser funktional anoxischen Umwelt11. Allerdings gibt es keine Beweise für EET-fähigen Mikroben aus Zedern (in 16 s rRNA oder Metagenomischen Analyse) zu unterstützen. Obwohl dieser Umgebung ist, als Elektronen-Akzeptor begrenzt charakterisiert worden, das Potenzial für die Verwendung von unlöslicher Minerals als terminal Elektronen-Akzeptoren, einschließlich Mineralien wie Eisen, die Mineralien, die aus assimiliert (d.h., baring Magnetit), wurde nicht ausführlich untersuchten12. Wir, hat daher unsere elektrochemische System bereitgestellt, am Campingplatz Feder, ein hoher pH-Wert Feder an den Zedern, EET-fähigen Mikroben (Abbildung1)13zu bereichern.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bau eines zwei-Elektroden-Systems zur Umwelt Inkubation
-
Vorbereitung des Materials Anode und Behandlung von Carbon fühlte Elektrode (Abbildung 2).
- Schneiden Sie die Kohle gleich Dimensionen je nach gewünschten Biomasse Bereicherung empfunden. Einweichen Sie jede Elektrode in 90 % Ethanol für 30 min, dann spülen Sie mindestens 8 Mal mit entionisiertem Wasser, nach jedem Spülgang für 1 min beschallen.
- Waschen Sie die Elektroden zweimal in 1 M HCl, rühren für mindestens 12 h für jede Wäsche.
- Trocknen Sie die Elektroden in einem Ofen Warm (37 ° C) für 6 – 12 h oder bis frei von Flüssigkeit.
- Titan-Draht mit Graphit-Epoxid pro des Herstellers Protokoll auf einem Teller Polytetrafluorethylen (Antihaft-Beschichtung) zuordnen Sie Elektroden.
Hinweis: Wir verwendet einen Titan-Draht durch seine hohe Toleranz gegenüber aeroben Korrosion. - Backen Sie die Elektrode bei 120 ° C für 6 h.
- Testen Sie den Widerstand zwischen Titan-Draht und Kohlenstoff mit einem Ohmmeter fühlte und bestätigen, dass der Widerstand zwischen dem Draht und Filz Elektroden ist weniger als 5 Ohm.
-
Matritzenschnitt von Platin auf den Kohlenstoff fühlte Elektrode für die Vorbereitung der das Kathodenmaterial
- Tauchen Sie Filz Kohleelektroden in Schritt 1.1, in 2 M KOH für ein Minimum von 12 h in einem Glasbehälter vorbereitet.
- Zum elektrochemischen reinigen, legen Sie die Elektrode als Elektrode (WE) arbeitet in einem drei-Elektroden-Reaktor, der auch eine Referenz (RE) und Gegenelektrode (CE) beherbergt. Verbinden wir, RE und CE potentiostaten mit Krokodilklemmen. Bestätigen Sie alle Verbindungen mit einem Ohmmeter.
Hinweis: Wir haben eine Ag/AgCl (KCl gesättigt) Elektrode und einer Platin Draht als RE und CE, beziehungsweise. - Haltung der Elektrode bei 1,0 V Vs. AG/AgCl für 600 s im Elektrolyt-Lösung mit 2 M KOH (mit einer ausreichenden Menge die ganze Elektrode untertauchen). Nehmen Sie die Elektrode aus dem elektrochemischen Reaktor (die aus Glas besteht). Spülen Sie die Elektrode in entionisiertem Wasser mindestens 8 Mal für 1 min nach jeder Spülung beschallen. Trocknen Sie Elektroden bei 100 ° C für mindestens 12 Stunden.
- Um die Beschichtung Lösung vorzubereiten, fügen Sie 100 g Zitronensäure, 5 g Natriumsulfat und 2 g Dihydrogen Hexachloroplatinate (IV) Hexahydrat 1 L 2 M Schwefelsäure hinzu.
- Wiegen gereinigt und getrocknet Elektroden wie in Schritten 1.2.1–1.2.2 vorbereitet und dann decken die Elektrode in einer Beschichtung-Lösung, wie in Schritt 1.2.3 vorbereitet. Beschallen Sie die Elektrode in der Beschichtung Lösung dreimal für 30 s.
- Galvanisieren der Elektroden durch nutzmöglichkeiten potenzielle Elektrode auf -0,2 V vs. Ag/AgCl für 460 s in plating-Lösung. Elektroden zweimal in entionisiertem Wasser spülen und die Platin Abfälle entsorgen.
- Spülen Sie Elektroden in entionisiertem Wasser mindestens 3 Mal beschallen für 20 s nach jedem spülen. Spülen Sie ohne Beschallung mindestens drei weitere Male.
- Trockene Elektroden bei 100 ° C für mindestens 12 Std. wiegen Elektrode, die galvanische Platin auf Filz kohlenstoffelektrode zu quantifizieren.
2. Konstruktion und den Einbau von zwei-Elektroden-System
-
Untersuchung des Installationsortes für jede Elektrode in der natürlichen Umwelt.
- Bestimmen Sie Sauerstoff-Konzentration mit einer Sonde für gelösten Sauerstoff (DO).
- Überprüfen Sie das Tiefenprofil des DO am Standort.
Hinweis: Die gewünschten Umgebungsbedingungen für die Anode sind konsequente Flüssigkeitszufuhr und Sauerstoffmangel. Falls gewünscht, entfernen Sie den Einfluss der sauerstoffhaltige Photosynthese durch Abschirmung der Anode aus Licht. Die idealen Bedingungen für die Platzierung von Kathode konsequent hydratisiert und in der Nähe von Oberflächengewässer oxischen sein. Bei Bedarf legen Sie schwimmt um Oberflächenkontakt in der Kathode zu erhalten.
-
Bau von Typ 2-Elektrode Inkubation Brennstoffzellensystem
- Schließen Sie den isolierten Draht der gewünschten Länge und einen Vorsprung von Titan-Draht von den Elektroden (eine Anode und eine Platin plattiert Kathode) durch Verdrehen der beiden Linien. Die Verbindungen mit wasserfesten Wachs abdecken und weitere schützen mit marine Grade Schrumpfschläuche.
- Verbinden Sie zwei Drähte mit einer Kathode und Anode durch einen Widerstand von bekannten Widerstand.
Hinweis: Für biologische Systeme führen geringere Widerstände (10 bis 1.000 Ω) in konsequenter biologischer Aktivität. Falls gewünscht, wird ein hohen Widerstand Widerstand zu verhindern, dass biologischen Aktivität als Negativkontrolle. Um eine Korrosion der Verbindungen zwischen Widerstand und führt zu verhindern, werden wir sie mit Schrumpfschläuche geschützt.
-
Messung für Spannung und Temperatur Protokollierung im Laufe der Zeit.
- Überprüfen Sie die Spannung zwischen den Enden des Widerstands für die Schätzung der aktuellen Produktion aus der Brennstoffzelle Reaktion.
- Messen Sie die Spannungsdifferenz im Laufe der Zeit mit einem Daten-Logging-Voltmeter mit den entsprechenden Verbindungen zu der Anode und Kathode (siehe Protokoll des Herstellers).
Hinweis: Gleichzeitige Temperatur Datenaufzeichnung ist optional, aber diese Informationen können helfen, Veränderungen zu abiotischen im Gegensatz zu biologischen Stromschwankungen zu beziehen.
-
Schutz der Datenlogger und elektrische Anschlüsse
- Verwenden Sie eine stationäre und/oder Kunststoff-Tasche, um die Protokollierung und die elektrischen Anschlüsse vor Regen zu schützen.
- Befestigen Sie die Plastiktüte und Kabel fest zum Schutz vor starkem Wind. Ein Beispiel ist in Abbildung 1dargestellt.
3. Erhebung der Elektrode Probe aus der natürlichen Umgebung
- Um die Qualität der Anode Probe verhindern Beschädigung durch Sauerstoff Verschmutzung, sammeln Sie die Elektrode unter anaeroben Bedingungen.
- Mindestens 30 min vor der Entnahme der Elektrode Probe setzen ein Reagenzglas in einer anaeroben Lage. Beispielsweise setzen Sie die Reagenzglas und Deckel separat am Ende des Teiches, die Flasche in anaeroben machen.
- Schneiden Sie die Titan-Führung von der Elektrode mit einem Drahtschneider, sanft sammeln Sie die Elektrode Probe in das Reagenzglas und versiegeln Sie es in der anaeroben Wasser-Zone. Um die Probe frisch, speichern Sie das Sample bei 4 ° C unmittelbar nach der Probenentnahme.
Hinweis: Alternativ können Elektroden direkt auf anoxischen (N2 bereinigt) Medium übertragen werden. Wir verwendeten ein Cedars Medium (beschrieben von Suzuki Et al. ( 11), wurde von der wässrigen Geochemie gemessen am Standort und geändert entwickelt, um ausreichend Nährstoffe für das mikrobielle Wachstum zu bieten. Dieses Medium wurde für verschiedene Laborversuche geändert.
4. Laborbestätigung für die aktuelle Produktion und DNA-Analyse
-
Elektrochemische Bestätigung für aktuelle Produktionskapazität der mikrobielle Konsortien, die Befestigung an der Elektrode.
- Konstruieren Sie eine elektrochemische Reaktor14,15 mit der gesampelten Elektrode, ein Platindraht und eine Ag/AgCl (KCl gesättigt) Elektrode als wir, CE, und RE, bzw. in einer anaeroben Kammer. Cedars Medium mit löslichen Kohlenhydrate Elektron Spender füllen Sie den elektrochemischen Reaktor ein.
- Haltung die Elektrode Potenzial bei + 0,2 V vs. Ag/AgCl und Maßnahme der laufenden Produktion.
-
DNA-Extraktion aus der Elektrode-Probe mit einer mikrobiellen DNA kit (siehe Tabelle der Materialien).
- Reinigen Sie das Innere des anaeroben Glove-Box mit 70 % Ethanol und legte eine sterilisierte Gericht auf Aluminiumfolie.
Hinweis: Anaerobe Kammer hält Sauerstoff-Konzentration von weniger als 1 ppm durch die Aufrechterhaltung einer Wasserstoffatmosphäre um ~ 2 – 3 % Sie Sauerstoff in Anwesenheit eines Palladium-Katalysators aufräumen. - Den elektrochemischen Reaktor im Handschuhfach öffnen, legen Sie die Probe-Elektrode auf dem Teller und schneiden auf eine Größe passt das Rohr in die DNA-Kit verwendet. Fahren Sie mit der Hersteller-Protokoll.
- Reinigen Sie das Innere des anaeroben Glove-Box mit 70 % Ethanol und legte eine sterilisierte Gericht auf Aluminiumfolie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aktueller Produktion gemessen wurde erfolgreich für ca. 3 Monate mit einer Spannung Datenlogger wie in Abbildung 3dargestellt. Diesmal wurde gewählt, da es die längste stabile Inkubationszeit für das Frühjahr, aufgrund der starken Rückgang Regenfälle beeinträchtigen die Feder war. Eine kürzere Frist könnte ausreichen, wenn eine längere stärkere Anreicherung von Biomasse liefern könnten. Wir bestätigt die Verbindung von zwei-Elektroden-System nach der elektrochemischen Inkubation und keine Anzeichen von Korrosion im System beobachtet. Höhere laufende Produktion wurde in die zwei-Elektroden-System mit geringeren Widerstand (1.000 Ω) Negativkontrolle mit 100 kΩ Widerstand gegenüber beobachtet. Der allmähliche aktuelle Produktionsanstieg im ersten Monat kann Wachstum, Anhäufung oder Unterbringung von Mikroben auf der Oberfläche der Elektrode nach stabil laufende Produktion um weitere zwei Monate vorschlagen. Interessanterweise oszilliert laufende Produktion eine ca. 24 h Zyklus über den gesamten Zeitraum der elektrochemischen Bereicherung.
Um die aktuelle Produktionskapazität von mikrobiellen Konsortien, die Befestigung auf der Elektrode zu bestätigen, haben wir mit den gesammelten Anode im Labor mit einem elektrochemischen Reaktor 3-Elektrode Chronoamperometry durchgeführt. Wir bereit die Elektrode potenzielle auf + 0,4 V Vs. eine standard-Wasserstoff-Elektrode (sie) in Anwesenheit von verschiedenen Kohlenhydrat-Elektron-Geber. Die tägliche Schwingungen wurden nicht mehr auf die Anode wenn im Labor inkubiert beobachtet. Dies deutet darauf hin, dass Umweltfaktoren die mikrobielle aktuelle Produktion beeinflusst und wahrscheinlich zu der beobachteten Schwingungen führte.
Vergleicht man die mikrobielle Gemeinschaft beobachtet die angereicherten Elektroden mit den beigefügten und planktischen-Elektrode Gemeinschaften, beobachteten wir deutliche Unterschiede in der übergeordneten Struktur (Abbildung 4). Die Elektrode mikrobielle Gemeinschaft wurde in operativen taxonomischen Einheiten (OTUs) aus unkultivierten Linien sowie die Firmicute Linien von Bacillushochangereichertes. Eine Verschiebung in der Zusammensetzung der Proteobakterien wurde ebenfalls beobachtet; insbesondere Betaproteobacteria (überwiegend Serpentinamonas SP.) dominiert die Umwelt Calcit und planktischen Proben und Gammaproteobacteria dominiert die Elektrode Proben10. Differenzielle Anreicherung von mikrobiellen Belastungen zwischen Umwelt und Elektrode Proben bietet Unterstützung für mikrobielle Aktivität fahren die beobachteten Experiment. Unterstützt wurde dies durch die ultimative Isolierung eine elektrochemisch aktiven Belastung aus der angereicherten Firmictutes OTUs für die Zedern-9.
Abbildung 1 : Elektrochemische System. (ein) Schaltplan Bild des vor-Ort-elektrochemischen Systems, EET-fähigen Bakterien in der Umwelt zu bereichern. Eine Anode aus Kohlenstoff Filz nimmt Atemwege Elektronen von der Mikrobe und eine Kathode aus Pt galvanisch gebundenen Kohlenstoff Filz katalysiert sauerstoffreduktion. Aktueller Produktion wurde durch einen Datenlogger überwacht V parallel zu beiden Enden eines Widerstandes R. (b) im Cedars Frühjahr Konfigurationsbeispiel angeschlossen wo die Anode an der Unterseite des Frühlings und der Kathode in der Nähe der Wasseroberfläche gelegt wurde. (c) Schutz der Datenlogger und Widerstand durch eine Kunststoff-Tasche und einem Rock. Die Größe der Anode ist identisch mit der in Abbildung 2dargestellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Carbon Elektrode mit einem Titan-Draht verbunden fühlte. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Aktueller Produktion im zwei-Elektroden-System für eine dreimonatige Inkubationszeit beobachtet. Daten für Widerstände von 100 kΩ und 1.000 Ω-Systeme werden in (ein) angezeigt. Hintergrund aktueller wurde abgezogen, um den aktuellen Anfangswert NULL. Zentrale (b) entspricht dem Platz im Bedienfeld "(a). Tägliche aktuelle Schwingungen beobachtet über die Experimente im Bedienfeld "(a) dargestellt.
Abbildung 4: Mikrobielle Gemeinschaft Sequenz Verteilung für Campingplatz Federn. Aus extrahierte DNA gefiltertes Wasser (planktonischen CampsiteSpring) oder 1 g Calcit (CampsiteSpring Calcit befestigt) Pool unten entnommen wurden im Vergleich zu DNA extrahiert aus Filz Kohleelektroden (Elektrode angebracht) oder DNA aus Zellen in der flüssigen Phase des der Elektrochemische Reaktor (planktonischen Elektrode). Sequenz Bezeichnungen basieren auf Stamm-Ebene oder auf Klassenebene Identitäten für die dominante Stämme Firmicuten und Proteobakterien. Häufigkeiten basieren auf Prozent insgesamt mal gelesen. Änderungen in Proteobacterial Linien sind gestrichelt umrandet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In der beschriebenen Studie zeigen wir die Anreicherung eines mikrobiellen Konsortiums, verbunden mit in Situ laufende Produktion. Die beobachteten Muster in aktuellen Unterstützung mikrobielle Aktivität in diesem System über kurze und lange Zeit skaliert. Der entscheidende Schritt für den Bau einer funktionalen zwei-Elektroden (Brennstoffzellen-Typ) System ist identifizieren und nutzen eine Lage mit einer stabilen Wasserstand und Sauerstoffkonzentration in der Umwelt. Die Kathode ist Sauerstoff in der Luft-Wasser-Grenzfläche ausgesetzt während die Anode ist unter anaeroben Bedingungen gehalten, und die Elektrode Potentialdifferenz anaerobe Atmung von EET-fähigen Bakterien fördert.
Wir beobachteten täglichen aktuellen Oszillation im ökologischen elektrochemische System aber nicht im Laborreaktor. Weil diese Schwankungen des Stromes beobachtet wurde, während das Tageslicht Stunden maximale und minimale Ströme wurden beobachtet, von Sonnenaufgang bis Sonnenuntergang-die Wirkung von Sonnenlicht und/oder Temperatur könnte erklären, die Änderung in der mikrobiellen laufenden Produktion. Temperaturmessung, könnte Sonnenlicht und/oder andere Umgebungsvariablen Verständnis der Steuerelemente und Fahrer von mikrobiellen Elektronenfluss in ökologischen Systemen weiter aus. Alternativ könnte hinzufügen, dass Elemente Block Sonnenlicht helfen könnte, zu entfernen oder Milderung der Auswirkungen sauerstoffhaltige Photosynthese und/oder mögliche lichtreaktionen an der Elektrode, die dazu dienen, optimale EET Bedingungen besser zu stimulieren. Messung von anderen Umweltfaktoren könnte allerdings besser ökologischen Kontext im EET-fähigen Mikroben, einschließlich mikrobiellen Gemeinschaft Wechselwirkungen sowie die Beziehungen zwischen Mikroben und Umwelt aufzuklären.
Unser zwei-Elektroden-System bereichert potenziell nicht nur Anode atmender Bakterien, sondern auch Sauerstoff-reduzierende Bakterien, die Energie aus Elektron Aufnahme zu ernten. Obwohl wir nicht die Gemeinschaft-Analyse auf der Kathode durchführten, ist ihre Fähigkeit, mikrobielle Elektron Aufnahme testbar im drei-Elektrode Laborreaktor mit negativ nutzmöglichkeiten der gesammelten Kathode Elektrode in Gegenwart von Sauerstoff. Ein stabiles Konzentrationsgradient von Elektronen-Akzeptoren von Kathode zu Anode ermöglichen unsere Methode, um theoretisch auch Kathode atmender Bakterien bereichern. Eine alternative Anreicherung-Methode für die Kathode atmender Bakterien ist die Verwendung von Fe(0) Partikeln oder Gutscheine als solide Elektron Spender5. Obwohl Wasserstoff-Erzeugung kann auch an der Oberfläche auftreten, wurde erfolgreich Isolierung der Bakterien, die Elektrodenoberfläche direkt Elektronen entziehen können gemeldeten5,16.
Zusammenfassend, bereichert unsere Methode erfolgreich EET-fähigen Konsortien mit einem selbsttragenden elektrochemische System in einer Low-Biomasse-Umgebung. Mehrere frühere Anbau Ansätze waren erfolglos, was führte uns ein vor-Ort-Anreicherung-System zu entwickeln. In unserem System Stromausgang reflektiert die mikrobielle Aktivität, und führte zu weiteren Hypothesen über die mikrobielle Ökologie dieses Systems. Ausbau der Isolation der EET-fähigen Mikroben sowie die Vielfalt der Umgebungen wird unser Verständnis des Mechanismus der EET, sowie die Rolle der Elektronentransport in Umweltmikrobiologie verbessern.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir würden gerne Roger Raiche und David McCrory für uns Zugang zu den Zedern und Beratung über Standorte für langfristige Inkubation anerkennen. Wir danken auch die Zedern-Feld-Mannschaft in der Saison 2013 / 2014: Shino Suzuki, Shunichi Ishii, Greg Wanger, Grayson Chadwick, Bonita Lam und Matthew Schechter. Zusätzlicher Dank Shino Suzuki und Gijs Kuenen für aufschlussreiche Forschung und Kultivierung Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch eine Beihilfe für junge Wissenschaftler A und B von der Japan Society for Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant 17 H 04969 und 26810085, bzw. die Nummer und die Japan-Agentur für medizinische Forschung und Entwicklung (17gm6010002h0002) finanziert. US-Finanzierung zur Verfügung gestellt von uns Office of Global Marine Research (N62909-17-1-2038) und dem Center für dunkle Energie Biosphäre Untersuchungen (C-DEBI) (OCE0939564) und der NASA Astrobiology Institute - Life Underground (NAI-LU) (NNA13AA92A). Teil dieser Arbeit wurde als Teil einer Japan-Gesellschaft für die Förderung der Wissenschaften durchgeführt: kurzfristige Postdoc-Stipendium für Annette Rowe (PE15019) an der Universität Tokio im Labor von Kazuhito Hashimoto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carbon felt sheet | n/a | n/a | Used for anode and cathode |
| Titanium wire | The Nilaco Cooporation | TI-451485 | Used to construct fuel cell system |
| Graphite epoxy | Electrolytica lnc. | n/a | Used to connect the electrodes and Ti wire |
| Drying oven | Yamato | DY300 | bake the electrode to solidify conductive graphite epoxy |
| Digital multi meter | Fluke | 616-1454 | to check the ohmic value of resistance |
| Dissolved oxygen probe | Sper Science | # 850045 | to check the oxygen concentration in the environments |
| Resistor | Sodial | Used to construct fuel cell system |
|
| Conducting wire | Pico | 81141s | Used to construct fuel cell system |
| Voltmeter and Data logger | T&D corporation | VR-71 | Used for data recording |
| Hydrogen Hexachloroplatinate(IV) Hexahydrate | wako | 18497-13-7 | Used for electropolation |
| Citric acid | Wako | 038-06925 | Used for electropolation |
| Sulfuric acid | Wako | 192-04696 | Used for electropolation |
| HCl | Wako | 083-01095 | Used for electrode washing |
| Glass cylinder | N/A | N/A | Custom-made, used as the electrochemical reactor |
| PTFE cover and base | N/A | N/A | Custom-made, used as a cover and a foundation of the electrochemical reactor |
| Buthyl rubber | N/A | N/A | Custom-made, inserted between each component of electrochemical reactor |
| Septa | GL Science | 3007-16101 | Used as an injection port of electrochemical reactor |
| Indium tin-doped oxide (ITO) electrode | GEOMATEC | No.0001 | Used as a working electrode, 5Ω/sq |
| Ag/AgCl KCl saturated electrode | HOKUTO DENKO | HX-R5 | Used as a reference electrode, Φ0.30mm |
| Platinum wire | The Nilaco Cooporation | PT-351325 | Used as a counter electrode |
| NaHCO3 | Wako | 191-01305 | Used for The Cedars Media (CMS) |
| CaCO3 | Wako | 030-00385 | Used for CMS |
| NH4Cl | Wako | 011-03015 | Used for CMS |
| MgCl2 • 6H2O | Wako | 135-00165 | Used for CMS |
| NaOH | Wako | 198-13765 | Used for CMS |
| Na2SO4 | Wako | 194-03355 | Used for CMS |
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | Used for CMS |
| CABS | SANTA CRUZ | SC-285279 | Used for CMS |
| Incubator | TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD. | LTI-601SD | Used for precultivation |
| Autoclave machine | TOMY SEIKO CO. LTD. | LSX-500 | Used for sterilization of the electrochemical reactor and the medium |
| Clean bench | SANYO | MCV-91BNF | Used to prevent the contamination of the electrochemical reactor and the medium with other microbes |
| Centrifuge separator | Eppendorf | 5430R | Rotational speed upto 6000×g is required |
| Nitrogen gas generator | Puequ CO. LTD. | PNTN-2 | Nitrogen gas cylinder can also be used instead of gas generator |
| UV-vis spectrometer | SHIMADZU | UV-1800 | Used for optimization of cell density |
| Potentiostat | BioLogic | VMP3 | Used for biofilm formation and kinetic isotope effect experiments |
| Thermal water circulator | AS ONE | TR-1A | Used for maintanance of temperature of electrochemcial reactor |
| Faraday cage | HOKUTO DENKO | HS-201S | Used for electrochemical experiments |
| Anaerobic Chamber | COY | TypeB (Vinyl) | TO conduct experiments under anaerobic condition |
| Ultraclean DNA Extraction kit | MoBio |
References
- Nealson, K. H., Saffarini, D. Iron and manganese in anaerobic respiration: environmental significance, physiology, and regulation. Annual Reviews of Microbiology. 48, 311-343 (1994).
- Lovley, D. R. Bug juice: harvesting electricity with microorganisms. Nature Reviews Microbiology. 4 (7), 497-508 (2006).
- Rabaey, K., Rozendal, R. A. Microbial electrosynthesis - revisiting the electrical route for microbial production. Nature Reviews Microbiology. 8 (10), 706-716 (2010).
- Lovley, D. R., Coates, J. D. Bioremediation of metal contamination. Current Opinion in Biotechnology. 8 (3), 285-289 (1997).
- Dinh, H. T., et al. Iron corrosion by novel anaerobic microorganisms. Nature. 427 (6977), 829-832 (2004).
- Myers, C. R., Nealson, K. H. Bacterial manganese reduction and growth with manganese oxide as the sole electron acceptor. Science. 240 (4857), 1319-1321 (1988).
- Lovley, D. R., Phillips, E. J. Novel mode of microbial energy metabolism: organic carbon oxidation coupled to dissimilatory reduction of iron or manganese. Applied and Environmental Microbiology. 54 (6), 1472-1480 (1988).
- Arnold, R. G., DiChristina, T. J., Hoffmann, M. R. Reductive dissolution of Fe(III) oxides by Pseudomonas sp 200. Biotechnology and Bioengineering. 32 (9), 1081-1096 (1988).
- Rowe, A. R., et al. In situ electrochemical enrichment and isolation of a magnetite-reducing bacterium from a high pH serpentinizing spring. Environmentakl Microbiology. 19 (6), 2272-2285 (2017).
- Suzuki, S., et al. Microbial diversity in The Cedars, an ultrabasic, ultrareducing, and low salinity serpentinizing ecosystem. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 110 (38), 15336-15341 (2013).
- Suzuki, S., et al. Physiological and genomic features of highly alkaliphilic hydrogen-utilizing Betaproteobacteria from a continental serpentinizing site. Nature Communications. 5, 3900 (2014).
- McCollom, T. M., et al. Temperature trends for reaction rates, hydrogen generation, and partitioning of iron during experimental serpentinization of olivine. Geochimica et Cosmochimica Acta. 181, 175-200 (2016).
- Morrill, P. L., et al. Geochemistry and geobiology of a present-day serpentinization site in California: The Cedars. Geochimica et Cosmochimica Acta. 109, 222-240 (2013).
- Okamoto, A., Nakamura, R., Hashimoto, K. In-vivo identification of direct electron transfer from Shewanella oneidensis MR-1 to electrodes via outer-membrane OmcA-MtrCAB protein complexes. Electrochimica Acta. 56 (16), 5526-5531 (2011).
- Okamoto, A., Hashimoto, K., Nakamura, R. Spectroelectrochemical Investigation on Biological Electron Transfer Associated with Anode Performance in Microbial Fuel Cells. , InTech. 207-222 (2012).
- Deng, X., Nakamura, R., Hashimoto, K., Okamoto, A. Electron from an Extracellular Electrode by Desulfovibrio ferrophilus Strain IS5 Without Using Hydrogen as an Electron Carrier. Electrochemistry. 83 (7), 529-531 (2015).
