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Medicine

मानव से अपक्षयी Tenocyte प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल

Published: June 9, 2018 doi: 10.3791/57634
Automatic Translation
*1, *2, *1, 3, 1, 1, 1, 4, 1, 1
1Department of Orthopaedic Surgery, CHA Bundang Medical Center, CHA University School of Medicine, 2Department of Pathology, Kyung Hee University Hospital at Gangdong, Kyung Hee University School of Medicine, 3Department of Physiology, CHA University School of Medicine, 4Department of Rehabilitation, CHA Bundang Medical Center, CHA University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

इन विट्रो में अपक्षयी tenocytes के उपयोग tendinopathy पर उपंयास उपचार की प्रभावकारिता की जांच करने के लिए आवश्यक है । हालांकि, ज्यादातर शोध अध्ययन केवल पशु मॉडल या एक स्वस्थ tenocyte का उपयोग करें । हम सर्जरी के दौरान मानव अपक्षयी tenocytes को अलग करने के लिए निंनलिखित प्रोटोकॉल का प्रस्ताव ।

Abstract

Tendinopathy, एक दर्दनाक हालत है कि पट्टा अध की प्रतिक्रिया में विकसित, विकसित दुनिया में वृद्धि शारीरिक गतिविधि और अब जीवन प्रत्याशा के कारण बढ़ रही है । अपनी बढ़ती व्यापकता के बावजूद, अंतर्निहित रोगजनन अभी भी अस्पष्ट बनी हुई है, और उपचार आम तौर पर रोगसूचक है । हाल ही में, कई चिकित्सीय विकल्प, विकास कारकों सहित, स्टेम सेल, और जीन थेरेपी, अपक्षयी पट्टा की चिकित्सा शक्ति को बढ़ाने की उंमीद में जांच की गई । हालांकि, इन अनुसंधान अध्ययनों के बहुमत केवल पशु मॉडल या स्वस्थ मानव tenocytes पर आयोजित किया गया । कुछ रोग tenocytes का उपयोग अध्ययनों के बावजूद, हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा वहां वर्तमान में कोई कैसे मानव अपक्षयी tenocytes प्राप्त करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन है । इस अध्ययन का उद्देश्य मानव अपक्षयी tenocytes प्राप्त करने के लिए एक मानक प्रोटोकॉल का वर्णन करना है. शुरू में, tendons ऊतक सर्जरी के दौरान पार्श्व epicondylitis के साथ एक रोगी से काटा गया था । फिर बायोप्सी नमूने सर्जरी के समय मनाया संरचनात्मक परिवर्तन करने के लिए इसी प्रसारक carpi radialis brevis पट्टा से लिया गया था । काटा tendons के सभी सुस्त, ग्रे, friable, और edematous है, जो उंहें नेत्रहीन स्वस्थ लोगों से अलग किया हो दिखाई दिया । Tenocytes कल्चर्ड थे और प्रयोगों के लिए इस्तेमाल करते थे । इस बीच, फसल के ऊतकों के आधे histologically विश्लेषण किया गया, और यह दिखाया गया कि वे tendinopathy (angiofibroblastic dysplasia या हाइपरप्लासिया) की एक ही प्रमुख विशेषताएं साझा की है । immunocytochemistry द्वारा एक माध्यमिक विश्लेषण की पुष्टि की है कि संस्कृतिक कोशिकाओं पहननी और tenomodulin प्रोटीन के लिए सकारात्मक दाग वाले कोशिकाओं के बहुमत के साथ tenocytes थे । tenocytes के अपक्षयी स्वभाव के गुण तो एक जखीरे की परख या qRT-पीसीआर का उपयोग कर स्वस्थ नियंत्रण के साथ कोशिकाओं की तुलना करके निर्धारित किए गए थे. अपक्षयी tenocyte एक उच्च प्रसार दर और tendinopathy के समान जीन अभिव्यक्ति पैटर्न है कि पिछली रिपोर्टों मिलान प्रदर्शित किया । कुल मिलाकर, इस नए प्रोटोकॉल tendinopathy के भविष्य के अध्ययन के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान कर सकता है ।

Introduction

Tendinopathy एक पुरानी अपक्षयी गठिया हालत है कि शरीर के विभिन्न भागों में विकसित करता है । हाल ही में, tendinopathy के मामलों की संख्या बहुत विकसित दुनिया में मनोरंजन के खेल में भागीदारी बढ़ रही है और जीवन प्रत्याशा1,2के कारण वृद्धि हुई है । tendinopathy के कारण multifactorial माना जाता है और इन कारणों ischemia, ऑक्सीजन मुक्त कट्टरपंथी चोटों, vasoconstrictor और vasodilator innervations, आंतरिक सूक्ष्म आँसू, और न्यूरो-विनियमन 3 के लिए परिवर्तन के बीच एक असंतुलन शामिल है ,4,5,6,7,8. tendinopathy के लिए अधिकांश उपचार केवल इसके लक्षणों से छुटकारा । इसके अलावा, ऊतक पुनर्जनन के बिना उपचार पुनर्वास के लिए एक लंबे समय की आवश्यकता है और घायल tendons, जो9चिकित्सकों के लिए एक नैदानिक चुनौती लगाता है से एक सीमित प्रतिक्रिया प्राप्त करने ।

वर्तमान उपचार के विकल्प की अक्षमता को स्वयं के लिए अपक्षयी है tendons की क्षमता की कमी के साथ-चंगा में शोधकर्ताओं का नेतृत्व करने के लिए वैकल्पिक उपचार रणनीतियों की खोज में रुचि ले रहा है । हाल ही में, नए अध्ययनों के विकास कारकों का उपयोग कर tendinopathy tendons की चिकित्सा प्रभावकारिता बढ़ाने के लिए कई आशाजनक परिणाम की रिपोर्ट, स्टेम सेल आधारित चिकित्सा, और जीन थेरेपी10,11,12.

एक साहित्य की समीक्षा के माध्यम से, हमने पाया कि शामिल अध्ययन दो श्रेणियों में विभाजित किया जा सकता है उनके विश्लेषण सामग्री के आधार पर: पशु मॉडल जैसे कि एक चूहे, एक चूहा, या एक खरगोश; और मानव मॉडल । पशु मॉडल के संबंध में, वर्तमान में वहां दो लोकप्रिय तकनीक tendinopathy उत्पंन करने के लिए कर रहे हैं: चोट या यांत्रिक मॉडल ओवरलोडिंग के रासायनिक प्रेरण । हालांकि, प्रत्येक पशु मॉडल जटिल मानव tendinopathy विकृति13,14reproducing में सीमित था ।

अधिकांश कागज मानव नमूने का उपयोग कर histologically विश्लेषण किया गया या में इन विट्रो प्रयोग एक स्वस्थ मानव tenocyte पर आधारित के बजाय एक अपक्षयी tenocyte15,16,17,18 , 19 , 20 , 21. केवल कुछ कागजात की सूचना है कि वे एक मानव अपक्षयी tenocyte इस्तेमाल किया, लेकिन वे विस्तार में वर्णन नहीं किया प्रोटोकॉल मानव22,23से अपक्षयी tenocyte प्राप्त करते थे । इस संदर्भ में, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि या तो पशु मॉडल या स्वस्थ ऊतक/tenocyte जरूरी मानव प्रभावकारिता या प्रभावोत्पादक खुराक की भविष्यवाणी नहीं है क्योंकि पट्टा अध: पतन एक जटिल प्रक्रिया है और रोगजनन है से सफल परिणाम फिर भी पूरी तरह नहीं समझ पाए ।

सामूहिक रूप से, यह दाता को प्रतिकूल प्रभाव पैदा किए बिना मानव ऊतक से अपक्षयी tenocyte प्राप्त करने के लिए मानक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए आवश्यक है । यह आलेख मानव अपक्षयी tenocyte प्राप्त करने के तरीके पर एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है । प्रोटोकॉल को मांय करने के लिए, काटा ऊतकों histologically विश्लेषण किया गया । फिर, प्रसंस्कृत सेल immunocytochemistry (आईसीसी), एक मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (qRT-पीसीआर), और एक व्यवहार्यता परख का उपयोग करके अपक्षयी tenocyte के रूप में पुष्टि की गई थी ।

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Protocol

प्रोटोकॉल हेलसिंकी की घोषणा के अनुसार आयोजित किया गया था और प्रोटोकॉल को चा Bundang मेडिकल सेंटर में संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था ।

1. रोगी से अपक्षयी पट्टा ऊतक फसल

  1. एक चिकित्सा इतिहास लेने और शारीरिक परीक्षा निष्कर्षों का उपयोग करके पार्श्व epicondylitis का निदान: पार्श्व epicondyle के करीब tendinous मूल पर कोमलता; दर्द कलाई संयुक्त का विरोध विस्तार से पैदा की ।
  2. निंनलिखित शामिल किए जाने के मानदंडों का प्रयोग करें: उंर के 18 साल से अधिक; पार्श्व epicondylitis का एक ंयूनतम छह महीने के लिए इतिहास; गैर-ऑपरेटिव उपचार के लिए अड़ियल; corticosteroid, प्लेटलेट रिच प्लाज्मा, या बोटुलिनम विष के इंजेक्शन के बाद से कम से तीन महीने बीत चुके हैं
  3. निंनलिखित को छोड़ दें: गर्भवती महिलाओं; ग्रीवा रीढ़ की बीमारी का एक इतिहास के साथ रोगियों, कोहनी गठिया, rheumatologic रोग, कोहनी के आसपास सर्जरी, और तंत्रिका फंसाने सिंड्रोम; मरीजों को ऊतक दान करने से मना कर ।
  4. सर्जिकल तकनीक
    नोट: चित्र 124देखें ।
    1. isoflurane और endotracheal इंटुबैषेण द्वारा सामांय संज्ञाहरण के बाद, मेज पर हाथ रख दिया और एक tourniquet लागू होते हैं । फिर एक अपूतित सर्जिकल शीट के साथ पूरे बांह और कपड़े पर betadine एजेंट लागू होते हैं ।
    2. No .15 सर्जिकल स्केलपेल ब्लेड के साथ एक 3-5 सेमी चीरा के माध्यम से पार्श्व कोहनी बेनकाब सिर्फ पार्श्व epicondyle और संयुक्त के स्तर के लिए समीपस्थ करने के लिए anteromedial ।
    3. नेत्रहीन प्रसारक carpi radialis लंग्स (ECRL) और प्रसारक aponeurosis इंटरफेस की पहचान करने और एक बंटवारे चीरा 2 – 3 मिमी गहराई में ECRL और प्रसारक aponeurosis के बीच की पहचान की इंटरफ़ेस पर एक No .15 सर्जिकल स्केलपेल ब्लेड के साथ.
    4. ECRL पूर्वकाल, जो रोग प्रसारक carpi radialis लंग्स brevis (ECRB) मूल नीचे सीधे देखने में लाना होगा निकालें ।
    5. नेत्रहीन अपनी विशेषता सुस्त भूरा रंग और आमतौर पर edematous और friable ऊतक द्वारा रोग अपक्षयी ऊतक की पहचान ।
    6. पहचान के बाद, ध्यान से सभी अपक्षयी ऊतक तेजी से नहीं 15 सर्जिकल स्केलपेल और मिनी ब्लेड का उपयोग कर संप्रदाय ।
    7. (के बारे में 1 सेमी3) फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) में तुरंत और पट्टा ऊतक को छोड़कर सभी आसपास के ऊतकों को हटाने के बारे में जल्दी से जल्द ही पंजाब के बारे में 10 मिलीलीटर में संप्रदाय ऊतक एंबेड ।
    8. पार्श्व epicondyle में बोनी exostosis के साथ मामलों में, एक rongeur का उपयोग कर exostosis निकालें और एक smoothen के साथ rasp । संवहनी आपूर्ति बढ़ाने के लिए अग्रपाश्विक condyle में कई ड्रिल छेद (व्यास १.६ मिमी, के बारे में 6-8 छेद) बनाओ । यह वैकल्पिक है ।
    9. गैर अवशोषित टांका सामग्री का उपयोग कर परत द्वारा घाव परत को बंद करें ।
  5. स्वस्थ नियंत्रण tenocyte
    1. स्वत:-दौडऩे या पूर्वकाल cruciate बंधन पुनर्निर्माण के दौरान ऑटो वुटने पट्टा के शेष पट्टा से स्वस्थ tenocytes प्राप्त करें, और निंनलिखित प्रयोग25के लिए नियंत्रण के रूप में इसका इस्तेमाल करते हैं ।
      नोट: इस अध्ययन में प्रयुक्त नमूनों की संख्या प्रत्येक समूह में तीन थी.

2. प्रोटोकॉल

  1. एक रासायनिक धुएं हुड या समकक्ष में तटस्थ बफ़र्ड 10% formalin में काटा ऊतक के बारे में आधा स्टोर ।
  2. एक आयल ब्लॉक में ऊतक एंबेड (4-5 मिलीलीटर) और खंड यह 4 में-5 µm वर्गों के राज्याभिषेक ।
  3. Hematoxylin और Eosin दाग के साथ नियंत्रण और अपक्षयी पट्टा से दाग वर्गों (एच एंड ई) और Alcian नीले दाग २.५ के एक पीएच पर । इस प्रकार के रूप में एक स्वचालित दाग मशीन में एच एंड ई धुंधला प्रदर्शन ।
    1. Deparaffinize का उपयोग xylene (3 बार, 5 मिनट, क्रमशः) ।
    2. वर्गीकृत शराब से पानी के लिए हाइड्रेट (१००% शराब, 4 मिनट, १००% शराब, 3 मिनट; ९५% शराब, 2 मिनट; ७०% शराब, 1 मिनट; पानी, 2 मिनट) ।
    3. 5 मिनट के लिए Hematoxylin में दाग 2 मिनट के लिए पानी में अच्छी तरह से धो लें ।
    4. 1% एसिड अल्कोहल में अंतर (1% एचसीएल में ७०% अल्कोहल) 3 एस के लिए 3 मिनट के लिए पानी में अच्छी तरह से धो लें ।
    5. एक 3 मिनट पानी धोने के बाद 10 एस के लिए एक ०.५% अमोनिया में डूबा द्वारा एचसीएल बेअसर ।
    6. 5 मिनट के लिए Eosion में दाग ।
    7. शराब के माध्यम से निर्जलीकरण (८०% शराब, 30 एस; ९५% अल्कोहल, 1 मिनट; १००% अल्कोहल 1 मिनट, १००% अल्कोहल 2 मिनट) ।
    8. xylene में स्पष्ट (3 बार, 2 मिनट, 2 मिनट, और 3 मिनट, क्रमशः) ।
    9. एक कवर स्लाइड के साथ माउंट ।
  4. प्रदर्शन immunohistochemitry (आइएचसी) छोटे संशोधनों के साथ निर्माता के निर्देशों के अनुसार बॉण्ड बहुलक परिष्कृत डिटेक्शन किट का उपयोग कर ।
    1. xylene का उपयोग deparaffinization के बाद, १०० डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए बॉण्ड Epitope पुनर्प्राप्ति समाधान का उपयोग कर एक antigen पुनर्प्राप्ति प्रक्रिया निष्पादित करें । बांड Epitope पुनर्प्राप्ति समाधान एक साइट्रेट आधारित बफर और surfactant (1 एल, पीएच 5.9-6.1) शामिल हैं ।
    2. 5 मिनट के लिए हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ ऊतक मशीन द्वारा बुझाने अंतर्जात peroxidases ।
    3. संवहनी endothelial वृद्धि कारक (वीईजीएफ़) (1:200), tenomodulin (1:200), या पहननी (1:200) के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ एक परिवेश तापमान (21-22 डिग्री सेल्सियस) पर 15 मिनट के लिए वर्गों की मशीन ।
    4. एक बायोटिन मुक्त बहुलक सहिजन peroxidase-linker एंटीबॉडी संयुग्मी प्रणाली के साथ माध्यमिक एंटीबॉडी टैगिंग करते हैं ।
      1. का प्रयोग करें द्वितीयक खरगोश विरोधी माउस आईजीजी में 10% (v/v) पशु सीरम में Tris-बफ़र्ड खारा/0.09% 2-मिथाइल-4-isothiazolin-3-एक समाधान माउस एंटीबॉडी स्थानीयकृत करने के लिए ।
      2. का प्रयोग करें बहुलक विरोधी खरगोश पाली-एचआरपी-आईजीजी (< 25 µ g/एमएल) से युक्त 10% (v/v) पशु सीरम Tris-बफ़र्ड खारा/0.09% में खरगोश एंटीबॉडी स्थानीयकृत ।
      3. उपयोग 3, 3 '-Diaminobenzidine tetrahydrochloride हाइड्रेट एक स्थिरता समाधान में एक भूरे रंग की हाला के माध्यम से जटिल कल्पना करने के लिए ।
      4. कक्ष नाभिक को विज़ुअलाइज़ करने के लिए < 0.1% hematoxylin (नीला) के साथ Counterstain ।
  5. एच एंड ई के साथ सना हुआ स्लाइड का निरीक्षण, नीले दाग Alcian, और वीईजीएफ़, tenomodulin के लिए आइएचसी, और प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत पहननी और एक उच्च शक्ति क्षेत्र (400X) के तहत प्रत्येक स्लाइड के प्रतिनिधि माइक्रोस्कोपी छवियों को प्राप्त.

3. Tenocyte कल्चर

  1. ऊतक तैयारी
    1. सभी आसपास के ऊतक सूक्ष्म कैंची और संदंश के साथ अच्छी तरह से हटाने के द्वारा पट्टा नमूना तैयार करें ।
    2. छोटे टुकड़ों में पंजाबियों और कीमा के साथ धो लें (लगभग 1 मिमी3 या उससे कम) ।
    3. Dulbecco है संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) के 30 मिलीलीटर में 1 एच के लिए डाइजेस्ट ऊतक ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिलीग्राम/एमएल Collagenase द्वितीय के साथ पूरक ।
    4. एक १०० µm सेल छलनी के माध्यम से कोशिकाओं पास ।
    5. भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) की 1 मिलीलीटर जोड़कर Collagenase द्वितीय को निष्क्रिय करें ।
    6. 5 मिनट के लिए १९६ x g पर केंद्रापसारक ।
  2. सेल संस्कृति
    1. बीज एक १०० mm पकवान और DMEM के साथ संस्कृति में 10% FBS और 1% एंटीबायोटिक-Antimycotic समाधान के साथ एक 5% CO2 मशीन में 1 सप्ताह के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस में 3 x 105 कोशिकाओं ।
    2. संस्कृति माध्यम को बदलें हर तीन दिन तक ८०% संगम होता है. संस्कृति दोनों स्वस्थ नियंत्रण और अपक्षयी सेल नमूने बीतने तक चार और प्रयोग के लिए उपयोग करें ।

4. Immunocytochemistry (आईसीसी)

  1. स्थानांतरण २०० µ प्रसंस्कृत सेल के एल (2 एक्स 105 कोशिकाओं) एक चैंबर स्लाइड के आठ कुओं के लिए और 1 दिन के लिए ताजा मीडिया के अलावा के साथ संगम के लिए कोशिकाओं को विकसित.
  2. पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धो लें और ठीक प्रति 4% formaldehyde के ५०० µ l के साथ फिक्स करें ।
  3. permeabilization की झिल्ली के लिए 10 मिनट के लिए पंजाब में ०.५% ट्राइटन X-१०० के साथ स्लाइडें ।
  4. 1% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन और ०.०५% के बीच-20 पहननी और tenomodulin के लिए, क्रमशः के साथ पंजाबियों में ब्लॉक ।
  5. माउस विरोधी के साथ अंधेरे में मशीन-पहननी मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (1:100 कमजोर पड़ने) और बकरी विरोधी tenomodulin एंटीबॉडी (1:100 कमजोर पड़ने) 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर ।
  6. माध्यमिक एंटीबॉडी (Alexa ५५५-विरोधी बकरी (1:200) tenomodulin के लिए मशीन; Alexa ४८८-विरोधी माउस (1:200) के लिए अंधेरे में 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर ।
  7. एक प्रतिदीप्ति बढ़ते माध्यम के ०.५ µ एल के साथ माउंट ।
  8. एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (400X) का उपयोग कर विश्लेषण करें ।

5. प्रसार परख

  1. पानी में घुलनशील tetrazolium (WST)-1 का उपयोग कर कोशिका viabilities का उपाय ।
    1. बीज दोनों स्वस्थ और अपक्षयी कोशिकाओं में ९६ अच्छी तरह से एक घनत्व पर प्लेटें 2 एक्स 103 कोशिकाओं के लिए ठीक 24, ७२, और १२० एच के लिए ।
    2. मशीन के बाद, 10% WST-1 एक अच्छी तरह से समाधान के 10 µ एल जोड़ें ।
    3. 5% CO2में ३७ ° c में 3 ज के लिए प्लेट्स की मशीन ।
    4. एक microplate रीडर का उपयोग ४५० एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व उपाय । प्रत्येक नमूने के लिए सभी समय बिंदुओं पर कम से तीन बार रीडिंग ले लो ।
  2. उपाय सेलुलर डीएनए BrdU परख का उपयोग कर राशि ।
    1. बीज दोनों स्वस्थ और अपक्षयी सेल में ९६ अच्छी तरह से एक घनत्व पर प्लेटें 2 x 103 कोशिकाओं के लिए ठीक 24, ७२, और १२० एच के लिए ।
    2. मशीन के बाद, 10% BrdU समाधान के 10 µ एल जोड़ने के लिए एक अच्छी तरह से ।
    3. 5% CO2में ३७ ° c में 3 ज के लिए प्लेट्स की मशीन ।
    4. //Denaturing समाधान (60-70% इथेनॉल, 0.1-0.5% सोडियम हीड्राकसीड) और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर थाली रखने के १०० µ एल जोड़ें/
    5. Add १०० µ l/अच्छी तरह से तैयार 1x डिटेक्शन एंटीबॉडी सॉल्यूशन और प्लेट को 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर रखें ।
    6. समाधान और धो प्लेट 1x धो बफर के साथ तीन बार निकालें ।
    7. जोड़ें १०० µ एल/अच्छी तरह से तैयार 1x एचआरपी-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर थाली रखने के लिए ।
    8. समाधान और धो प्लेट 1x धो बफर के साथ तीन बार निकालें ।
    9. जोड़ें ५०% TMB सब्सट्रेट के १०० µ एल ।
    10. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए मशीन ।
    11. जोड १०० µ l का समाधान रोकें ।
    12. एक microplate रीडर का उपयोग ४५० एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व उपाय ।
      नोट: प्रत्येक नमूने के लिए सभी समय बिंदुओं पर कम से कम तीन बार रीडिंग लें.

6. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. SPSS का उपयोग करके डेटा एकत्र और विश्लेषण करें ।
  2. मतलब के अर्थ ± मानक त्रुटि द्वारा डेटा चित्रित ।
  3. का उपयोग मान Whitney यू परीक्षण ।
  4. जब p मान ०.०५ से कम है (p < 0.05) अंतर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण पर विचार करें ।

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Representative Results

ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण से पता चला कि पार्श्व epicondylitis से काटा ऊतक एक tendinopathic पट्टा की विशेषताओं था । H & tendinopathy अपक्षयी पट्टा के खंड ई ध्रुवीकरण और ठीक सीधे, दृढ़ता से समानांतर फाइबर संरचनाओं पैक की हानि के साथ एक अव्यवस्थित कोलेजन बंडल का पता चला । ऊतकवैज्ञानिक विशिष्ट धुरी आकार के बिना उच्च सेलुलर और बढ़े हुए नाभिक के रूप में अध... के संकेत विचारोत्तेजक नमूने में आम थे । इसके अतिरिक्त, पतित पट्टा के कोलेजन बंडल अपेक्षाकृत कमजोर eosin एच एंड ई द्वारा दाग रहे थे, लेकिन सकारात्मक Alcian नीले रंग का संकेत बढ़ proteoglycans और glycosaminoglycans पदार्थ से सना हुआ थे ।

सभी मामलों में, रक्त वाहिकाओं संख्या में वृद्धि हुई और समुच्चय फाइबर के बीच एंबेडेड स्थानों पर कब्जा कर रहे थे सामांय भट्ठा की तरह रक्त वाहिकाओं की तुलना में थे । आइएचसी धुंधला में, पतित tendons की कोशिकाओं cytoplasmic दानेदार नियंत्रण वालों की नकारात्मक प्रतिक्रिया की तुलना में वीईजीएफ़ को सकारात्मक प्रतिक्रिया दिखाई । सामूहिक रूप से, इन निष्कर्षों की पुष्टि की है कि पार्श्व epicondylitis से काटा ऊतक अपक्षयी ऊतकों और अपक्षयी tenocyte संस्कृति के लिए उपयुक्त थे ( चित्रा 2देखें) ।

प्रसंस्कृत कोशिकाओं आईसीसी द्वारा tenocytes के रूप में पुष्टि की और काटा ऊतकों पट्टा ऊतक के रूप में आइएचसी द्वारा की पुष्टि की गई । प्रसंस्कृत कोशिकाओं और tendons ऊतक में कोशिकाओं के अधिकांश प्रतिनिधि के रूप में जाना tenocyte मार्करों के लिए एक सकारात्मक दाग दिखाया (हरा) प्रोटीन और tenomodulin (लाल) माइक्रोस्कोपी के तहत एक लंबी उपस्थिति के साथ प्रोटीन ( चित्रा 3देखें) । इसके अलावा, काटा ऊतक पहननी प्रोटीन और tenomodulin प्रोटीन immunohistochemically के लिए सकारात्मक दाग था ( अनुपूरक चित्रा 1देखें) । इन का सुझाव दिया है कि काटा ऊतकों पट्टा ऊतक द्वारा रचित थे ।

पार्श्व epicondylitis के संचयन ऊतक से प्रसंस्कृत tenocytes विशेषता विशेषताएं है कि tendinopathy के अनुरूप था । दोनों अपक्षयी और स्वस्थ tenocytes एक ही शर्त के तहत 4 दिनों के लिए संस्कृति थे । हर बार बिंदु पर, प्रसार दर BrdU परख और WST-1 परख द्वारा मापा गया था । परिणामों से पता चला कि अपक्षयी कोशिकाओं की प्रसार दर पहले की रिपोर्ट (p < 0.05) के रूप में नियंत्रणों की तुलना में काफी अधिक थी ( चित्र 4Aदेखें) ।

पांच जीन जो अप करने के लिए जाना जाता है अपक्षयी पट्टा में विनियमित qRT-पीसीआर द्वारा विश्लेषण किया गया । जीन की अभिव्यक्ति, COL3A1, ACTA2, TAC1 (सपा), टीएसी को रिसेप्टर 1, और PTGS2 (COX2) स्वस्थ लोगों से कोशिकाओं की तुलना में अपक्षयी पट्टा से प्रसंस्कृत कोशिकाओं में अधिक महत्वपूर्ण वृद्धि हुई. सभी जीनों के लिए सापेक्ष भाव चित्रा 4बी और पूरक चित्रा 2में दिखाए जाते हैं ।

Figure 1
चित्रा 1 : अपक्षयी पट्टा फसल की शल्य तस्वीर । (क) त्वचा चीरा और विच्छेदन के बाद, आम प्रसारक मूल पर रोग अपक्षयी ऊतक, edematous परिवर्तन (लाल रेखा) के साथ एक विशेषता सुस्त-भूरा रंग दिखा उजागर किया गया था । इसके विपरीत, सामांय पट्टा ऊतक के सामांय उपस्थिति चमकदार था और एक थोड़ा भूरा टोन (काली रेखा) के साथ फर्म । (ख) सभी की पहचान अपक्षयी ऊतकों को तेजी से और फिर रेडियल सिर की हड्डी को उजागर किया गया था । (ग) सभी कीटों के ऊतकों को फॉस्फेट में एंबेड किया गया था और आसपास के गैर-tendinous ऊतक को सावधानीपूर्वक यथासंभव शीघ्रता से विच्छेदित किया गया । ECRB: प्रसारक carpi radialis brevis. EDC: प्रसारक digitorum communis । ECU: प्रसारक carpi ulnaris. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : अपक्षयी पट्टा histologically की पुष्टि । (ए) में एच और ई धुंधला, पार्श्व epicondylitis से अपक्षयी नमूनों में ध्रुवीयता के नुकसान के साथ कोलेजन बंडलों अव्यवस्थित था और स्वस्थ नियंत्रण की तुलना में वृद्धि की कोशिका संख्या । (ख). Alcian नीले दाग से पता चला है कि अपक्षयी पट्टा जमीन proteoglycans और फाइबर (तीर) के बीच कई mucoid पैच और रिक्तिकाएं के साथ glycosaminoglycans से मिलकर पदार्थ बढ़ गया था । (ग). इसके अतिरिक्त, वीईजीएफ़ immunohistochemistry नियंत्रण के नमूनों की तुलना में अपक्षयी पट्टा नमूनों में पोत गठन में बढ़ दाग का प्रदर्शन किया । वीईजीएफ़: संवहनी endothelial वृद्धि कारक । स्केल बार = ५० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3 : आइसीसी द्वारा tenocyte की पहचान । प्रसंस्कृत कोशिकाओं और tendons ऊतक में कोशिकाओं आईसीसी द्वारा tenocyte के रूप में पुष्टि की गई । अधिकांश कोशिकाओं के प्रतिनिधि tenocyte मार्कर के लिए सकारात्मक दाग दिखाया, पहननी (हरी) और tenomodulin (लाल) सहित माइक्रोस्कोपी के तहत लंबी उपस्थिति के साथ. Chondrocyte नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था । ICC: Immunocytochemistry. स्केल बार = ५० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: अपक्षयी tenocyte के लक्षण । (A, B) अपक्षयी tenocytes (लाल) सेलुलर में एक उल्लेखनीय वृद्धि के साथ एक उच्च प्रसार दर था । (ग) tendinopathy के विकास में संबंधित ज्ञात किए जाने वाले पाँच जीन अपक्षयी tenocytes में काफी तरक्की कर चुके थे. जीन अभिव्यक्ति स्तर GAPDHके खिलाफ सामान्यीकृत थे । *: का मतलब है < 0.05, * *: मतलब < 0.01, क्रमशः । एसपी: मादक पदार्थ पी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Supplementary Figure 1
अनुपूरक चित्रा 1: पट्टा ऊतक के रूप में काटा ऊतक के ऊतकवैज्ञानिक पुष्टि । काटा ऊतक भी पहननी और tenomodulin के लिए आइएचसी द्वारा विश्लेषण किया गया था यह निर्धारित करने के लिए कि क्या काटा ऊतक पट्टा ऊतक के पर्याप्त लक्षण था । आइएचसी: Immunohistochemistry । स्केल बार = ५० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Supplementary Figure 2
अनुपूरक चित्रा 2: tenocyte में tendinopathy संबंधित जीन की अभिव्यक्ति । पांच actin अभिव्यक्ति द्वारा सामान्यीकृत जीन के टेप काफी अपक्षयी tenocytes में बुलंद किया गया और 4 चित्राके समान रुझान है । जीन अभिव्यक्ति स्तर क्रमशः < ०.०५ और < ०.०१, माध्य के साथ actin के विरुद्ध सामान्यीकृत किया गया । एसपी: मादक पदार्थ पी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

पिछले अध्ययनों की एक संख्या की सूचना दी है कि कैसे जीर्ण tendinopathic पशु ऐसे collagenase या kartogenin इंजेक्शन, ट्रेडमिल चल रहा है, और अधिक26,27के रूप में विभिंन प्रक्रियाओं का उपयोग मॉडल बनाने के लिए । हालांकि कई अध्ययनों से पता चलता है कि इन जानवरों के मॉडल के आधार पर चिकित्सीय प्रभाव का वादा किया, प्रयोग मानव अपक्षयी tenocyte का उपयोग tendinopathy के क्षेत्र में महत्वपूर्ण होगा ताकि उपचार की प्रभावकारिता को पुन: उत्पंन करने के लिए । इस अनुच्छेद में, हम सफलतापूर्वक फसल और संस्कृति मानव अपक्षयी tenocytes लगातार के लिए एक प्रोटोकॉल की स्थापना की । दोनों काटा पट्टा ऊतक और संस्कृतिपूर्ण tenocyte अपक्षयी tendons और tenocyte7,28के आम लक्षण दिखाया ।

हमारे अनुभव में, सफल ऊतक फसल के लिए, यह अक्सर अपक्षयी पट्टा के साथ जुड़े रूपात्मक परिवर्तन समझने के लिए और सही ढंग से सर्जरी के दौरान उस क्षेत्र चित्रित करने के लिए आवश्यक है । अपक्षयी ऊतक आम तौर पर भूरे या भूरे रंग में है और ऊतक पतली, नाजुक है, और ढीली बनावट के साथ अव्यवस्थित । प्रोटोकॉल का समावेश और अपवर्जन मानदंड सख्ती से फसल से पहले पिछले उपचार के सावधान मूल्यांकन के साथ रखा जाना चाहिए ।

ऊतक का आकार एक सफल सेल संस्कृति के लिए भी महत्वपूर्ण है । हम 1 सेमी3से अधिक संचयन की सलाह देते हैं । आमतौर पर, के रूप में लंबे समय के रूप में अपक्षयी क्षेत्र के सभी हटा दिया है, एकत्र ऊतक की मात्रा सेल संस्कृति के लिए पर्याप्त होगा । अंत में, हम सभी प्रयोगों में छह मार्ग पर tenocytes का उपयोग नहीं किया । छह बीतने तक, हम मानते है कि संस्कृतिक कोशिकाओं अभी भी अध की विशेषताओं था ।

हमारे प्रोटोकॉल के कई फायदे हैं । इन लाभों के बाद से अपक्षयी ऊतक शल्य चिकित्सा के दौरान हटाया जा करने के लिए चाहिए था के बाद से रोगी को कोई नुकसान शामिल है, दक्षता आवश्यक ऊतक की मात्रा के बाद से प्रयोग के लिए पर्याप्त है, उच्च नैतिक स्वस्थ ऊतकों का कोई उल्लंघन के कारण, मनुष्य से रोग के ऊतकों में reproducibility आसानी से सर्जरी के दौरान प्राप्त किया जा सकता है, और, अंत में, आवेदन की आसानी एक बार शल्य चिकित्सा तकनीक परिचित हो जाते हैं ।

हालांकि, हम स्वीकार करते है कि हमारे प्रयोग में कई सीमाएं हैं । सबसे पहले, हम पूरी तरह से पिछले corticosteroid या प्लेटलेट अमीर प्लाज्मा इंजेक्शन के अवशेष प्रभाव को बाहर नहीं कर सकते भले ही हम केवल रोगियों को जो किसी भी पिछले उपचार प्राप्त करने से कम तीन महीने पारित किया था शामिल थे । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल में, हम केवल ECRB पट्टा काटा और यह संस्कृति अपक्षयी tenocytes के लिए इस्तेमाल के बाद से ECRB tendons दुखती और रोटेटर कफ tendons के साथ साथ सर्जरी के लिए एक आम tendinopathy साइट है । इसके अलावा अध्ययन विभिंन tendinopathy साइटों के बीच किसी भी मतभेद पर ध्यान केंद्रित एक बड़ा नमूना आकार के साथ बाहर किया जाना चाहिए ।

अंत में, मानव अपक्षयी tenocytes प्राप्त करने के लिए इस मांय प्रोटोकॉल पट्टा जीवविज्ञान में भविष्य की जांच के लिए एक उपयोगी उपकरण होगा और उपंयास चिकित्सीय उपायों के परीक्षण के लिए ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस शोध कोरिया स्वास्थ्य उद्योग विकास संस्थान (KHIDI), जो स्वास्थ्य और कल्याण, कोरिया गणराज्य (अनुदान संख्या: HI16C1559) के मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित किया गया के माध्यम से कोरिया हेल्थ टेक्नोलॉजी अनुसंधान एवं विकास परियोजना से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scalpel Kisanbio KS-Q0306-15 No. 15
Mini-blade Beaver 374769
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) Gibco 11995065
PBS Gibco 14190250
fetal bovine serum (FBS) Gibco 16000044
50 mM ascorbic acid-2-phosphate Sigma-Aldrich A5960
Antibiotic-Antimycotic solution Gibco 15240062
4% formaldehyde Bio-solution BP031
Triton X-100  Sigma-Aldrich X100-100ml
BSA Rdtech C0082
TWEEN 20 Sigma-Aldrich P9416-100ml
MKX (C-5) Santa cruz biotechnology sc-515878
Tenomodulin (N-14) Santa cruz biotechnology sc-49325
Fluorescence Mounting Medium DAKO S3023
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Thermo Fisher Scientific D1306
WST-1 Dojindo Molecular Technologies CK04
BrdU Cell Proliferation Assay Kit Cell Signaling Technology #6813
TRIzol Reagent Invitrogen 15596018
iScript cDNA Synthesis Kit  Bio-Rad 170-8891
TaqMan Gene Expression Master Mix Applied Biosystems 4369016
GAPDH Thermo Fisher Scientific Hs02786624_g1
COL3A1 Thermo Fisher Scientific Hs00943809_m1
ACTA2 Thermo Fisher Scientific Hs00426835_g1
TAC1 Thermo Fisher Scientific Hs00243225_m1
TACR1 Thermo Fisher Scientific Hs00185530_m1
PTGS2 Thermo Fisher Scientific Hs00153133_m1
ACTB Thermo Fisher Scientific Hs99999903_m1
Cell Strainers (100 µm)  Corning 352360
100mm culture dish Thermo Fisher Scientific 8188207
8-well Chamber Slide Thermo Fisher Scientific 154534
96 Well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates Corning 3596
Nikon Eclipse 50i Microscope  Nikon
VERSA max microplate reader  Molecular Devices
CFX96 Real-Time PCR Detection System Bio-Rad
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma-Aldrich HT501128
Paraffins Leica Biosystems 3801340
Ethanol JUNSEI CHEMICAL 90303-2185
Hematoxylin DAKO CS70030-2
Eosin DAKO CS70130-2
Alcian blue DAKO AR16011-2
Citric acid Sigma-Aldrich 251275
Xylene JUNSEI CHEMICAL 25165-0430
Endogenous peroxidases  DAKO S200380-2
Canada balsam JUNSEI CHEMICAL 23255-1210
Microtome Blade FEATHER A35
Slide glass SUPERIOR 1000612
Cover glass Marienfeld-Superior 101050
VEGF Santa cruz biotechnology sc-7269
SPSS Software IBM Ver. 18.0
Multi-purpose Centrifuge LABOGENE 1248R

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References

  1. Ackermann, P. W., Renstrom, P. Tendinopathy in sport. Sports Health. 4 (3), 193-201 (2012).
  2. Maffulli, N., Wong, J., Almekinders, L. C. Types and epidemiology of tendinopathy. Clinical Sports Medicine. 22 (4), 675-692 (2003).
  3. Lui, P. P., Chan, L. S., Fu, S. C., Chan, K. M. Expression of sensory neuropeptides in tendon is associated with failed healing and activity-related tendon pain in collagenase-induced tendon injury. American Journal of Sports Medicine. 38 (4), 757-764 (2010).
  4. Han, S. H., et al. Effects of corticosteroid on the expressions of neuropeptide and cytokine mRNA and on tenocyte viability in lateral epicondylitis. Journal of Inflammation (London). 9 (1), 40 (2012).
  5. Uchio, Y., et al. Expression of neuropeptides and cytokines at the extensor carpi radialis brevis muscle origin. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 11 (6), 570-575 (2002).
  6. Lieber, R. L., Loren, G. J., Friden, J. In vivo measurement of human wrist extensor muscle sarcomere length changes. Journal of Neurophysiology. 71 (3), 874-881 (1994).
  7. Regan, W., Wold, L. E., Coonrad, R., Morrey, B. F. Microscopic histopathology of chronic refractory lateral epicondylitis. American Journal of Sports Medicine. 20 (6), 746-749 (1992).
  8. Sharma, P., Maffulli, N. Tendon injury and tendinopathy: healing and repair. Journal of Bone and Joint Surgery American volume. 87 (1), 187-202 (2005).
  9. Lui, P. P. Stem cell technology for tendon regeneration: current status, challenges, and future research directions. Stem Cells Cloning. 8, 163-174 (2015).
  10. Dahlgren, L. A., van der Meulen, M. C., Bertram, J. E., Starrak, G. S., Nixon, A. J. Insulin-like growth factor-I improves cellular and molecular aspects of healing in a collagenase-induced model of flexor tendinitis. Journal of Orthopedic Research. 20 (5), 910-919 (2002).
  11. Schnabel, L. V., et al. Mesenchymal stem cells and insulin-like growth factor-I gene-enhanced mesenchymal stem cells improve structural aspects of healing in equine flexor digitorum superficialis tendons. Journal of Orthopedic Research. 27 (10), 1392-1398 (2009).
  12. Durgam, S. S., Stewart, A. A., Sivaguru, M., Wagoner Johnson, A. J., Stewart, M. C. Tendon-derived progenitor cells improve healing of collagenase-induced flexor tendinitis. Journal of Orthopedic Research. 34 (12), 2162-2171 (2016).
  13. Titan, A., Andarawis-Puri, N. Tendinopathy: Investigating the Intersection of Clinical and Animal Research to Identify Progress and Hurdles in the Field. Journal of Bone and Joint Surgery Review. 4 (10), (2016).
  14. Dirks, R. C., Warden, S. J. Models for the study of tendinopathy. Journal of Musculoskeletal Neuronal Interaction. 11 (2), 141-149 (2011).
  15. de Mos, M., et al. Can platelet-rich plasma enhance tendon repair? A cell culture study. American Journal of Sports Medicine. 36 (6), 1171-1178 (2008).
  16. Scherb, M. B., Han, S. H., Courneya, J. P., Guyton, G. P., Schon, L. C. Effect of bupivacaine on cultured tenocytes. Orthopedics. 32 (1), 26 (2009).
  17. Wong, M. W., et al. Effect of dexamethasone on cultured human tenocytes and its reversibility by platelet-derived growth factor. Journal of Bone and Joint Surgery American Volume. 85 (10), 1914-1920 (2003).
  18. Tempfer, H., et al. Effects of crystalline glucocorticoid triamcinolone acetonide on cultered human supraspinatus tendon cells. Acta Orthopaedics. 80 (3), 357-362 (2009).
  19. Menon, A., et al. New insights in extracellular matrix remodeling and collagen turnover related pathways in cultured human tenocytes after ciprofloxacin administration. Muscles Ligaments Tendons J. 3 (3), 122-131 (2013).
  20. Backman, L. J., Fong, G., Andersson, G., Scott, A., Danielson, P. Substance P is a mechanoresponsive, autocrine regulator of human tenocyte proliferation. PLoS One. 6 (11), 27209 (2011).
  21. Backman, L. J., Eriksson, D. E., Danielson, P. Substance P reduces TNF-alpha-induced apoptosis in human tenocytes through NK-1 receptor stimulation. Britich Journal of Sports Medicine. 48 (19), 1414-1420 (2014).
  22. Rolf, C. G., Fu, B. S., Pau, A., Wang, W., Chan, B. Increased cell proliferation and associated expression of PDGFRbeta causing hypercellularity in patellar tendinosis. Rheumatology (Oxford). 40 (3), 256-261 (2001).
  23. Hoppe, S., et al. Tenocytes of chronic rotator cuff tendon tears can be stimulated by platelet-released growth factors. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 22 (3), 340-349 (2013).
  24. Schipper, O. N., Dunn, J. H., Ochiai, D. H., Donovan, J. S., Nirschl, R. P. Nirschl surgical technique for concomitant lateral and medial elbow tendinosis: a retrospective review of 53 elbows with a mean follow-up of 11.7 years. American Journal of Sports Medicine. 39 (5), 972-976 (2011).
  25. Cook, J. L., Feller, J. A., Bonar, S. F., Khan, K. M. Abnormal tenocyte morphology is more prevalent than collagen disruption in asymptomatic athletes' patellar tendons. Journal of Orthopedic Research. 22 (2), 334-338 (2004).
  26. Yuan, T., et al. Creating an Animal Model of Tendinopathy by Inducing Chondrogenic Differentiation with Kartogenin. PLoS One. 11 (2), 0148557 (2016).
  27. Lui, P. P., Maffulli, N., Rolf, C., Smith, R. K. What are the validated animal models for tendinopathy. Scandinavian Journal of Medical Scientific Sports. 21 (1), 3-17 (2011).
  28. Wilhelm, A. Lateral epicondylitis review and current concepts. Journal of Hand Surgery American Volume. 34 (7), author reply 1359-1360 1359-1360 (2009).

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चिकित्सा मुद्दा १३६ अपक्षयी tenocyte tendinopathy पट्टा मानव सेल संस्कृति
मानव से अपक्षयी Tenocyte प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल
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Han, S. H., Kim, H. K., Ahn, J. H.,… More

Han, S. H., Kim, H. K., Ahn, J. H., Lee, D. H., Baek, M., Ye, G., Lee, J. M., Min, K., Oh, C., Lee, S. A Protocol to Acquire the Degenerative Tenocyte from Humans. J. Vis. Exp. (136), e57634, doi:10.3791/57634 (2018).

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