Summary
В vitro использование дегенеративные tenocytes имеет важное значение при исследовании эффективности Роман лечения на плеча. Однако большинство исследований использовать только животную модель или здорового tenocyte. Мы предлагаем следующий протокол изолировать человека дегенеративных tenocytes во время операции.
Abstract
Плеча, болезненное состояние, которое развивается в ответ на сухожилие дегенерации, находится на подъеме в развитых странах за счет увеличения физической активности и продолжительности жизни. Несмотря на его рост распространенности основной патогенез до сих пор остается неясным, и как правило симптоматическое лечение. Недавно многочисленные лечебные варианты, включая факторы роста, стволовых клеток и генной терапии, были расследованы надежде повышения исцеления потенции дегенеративных сухожилия. Однако большинство из этих исследований были проведены только на животных моделях или здорового человека tenocytes. Несмотря на некоторые исследования, используя патологических tenocytes в меру наших знаний существует в настоящее время протокол не описывается получение человека дегенеративных tenocytes. Цель этого исследования заключается в описывают стандартный протокол для получения человека дегенеративных tenocytes. Первоначально сухожильных тканей было собрано от пациента с боковой эпикондилит во время операции. Затем образцы биопсии были взяты из Карпи разгибателей запястья лучевой brevis сухожилие соответствующие структурные изменения, наблюдаемые во время хирургии. Все собранные сухожилий, как представляется, быть скучный, серый, рыхлая, и отечной, который делает их визуально отличаются от здоровыми. Tenocytes были культивировали и использоваться для экспериментов. Тем временем половина заготовленной тканей были проанализированы гистологически, и было показано, что они разделяют те же основные функции плеча (angiofibroblastic дисплазии или гиперплазия). Вторичный анализ immunocytochemistry подтвердил, что клетки культивировали tenocytes с большинством ячейки, имеющие позитивные пятна mohawk и tenomodulin белков. Качества дегенеративный характер tenocytes были затем определяется путем сравнения клетки с здорового управления, с помощью анализа распространения или qRT-PCR. Дегенеративных tenocyte отображается более высокий уровень распространения и подобных картин выражения гена из плеча, совпадающий с предыдущих докладах. В целом этот новый протокол может стать полезным инструментом для будущих исследований плеча.
Introduction
Плеча является хронические дегенеративные опорно-условие, которое развивается в различных частях тела. В последнее время значительно возросло количество случаев плеча в развитых странах из-за растущего участия в рекреационных видов спорта и увеличение продолжительности жизни1,2. Считается, что причиной плеча многофакторных и эти причины включают ишемию, травмы свободных радикалов кислорода, дисбаланс между сосудосуживающие и сосудорасширяющим иннервации, внутренней микро слезы и изменения в нейро регулирование3 ,4,5,6,,78. Большинство методов лечения для плеча только уменьшить ее симптомы. Кроме того лечение без регенерации тканей требуют много времени для реабилитации и достижения ограниченный отклик от потерпевшего сухожилий, который вводит клинической проблемой для врачей9.
Некомпетентность текущих вариантов лечения наряду с отсутствием дегенеративных сухожилия способность self-heal имеет ведущих исследователей взять интерес к изучению стратегий альтернативного лечения. Недавно новые исследования сообщили многие многообещающие результаты для повышения эффективности лечения сухожилий плеча, с использованием факторов роста, стволовой терапии и генной терапии10,,1112.
Через обзор литературы, мы обнаружили, что участие исследований можно разделить на две категории, на основании их анализа материалов: животных моделей как крыса, мышь или кролика; и человека модели. Что касается модели на животных, в настоящее время существует два популярных методов для создания плеча: химической индукции травмы или механические перегрузки модель. Однако каждое животное модель была ограничена в воспроизведении сложных человеческих плеча патологии13,14.
Большинство работ с использованием человеческих образцов были проанализированы гистологически или в пробирке эксперимент, основанный на здорового человека tenocyte вместо дегенеративные tenocyte15,16,17,18 , 19 , 20 , 21. лишь несколько документов сообщили, что они использовали человека дегенеративных tenocyte, но они не описывают в деталях протокол, используемый для получения дегенеративные tenocyte от человека22,23. В этом контексте следует отметить, что успешные результаты от животной модели или здоровые ткани/tenocyte не может предсказать обязательно, человека эффективность или эффективных дозирования, потому что сухожилия дегенерации является сложным процессом и является патогенеза еще не полностью изучены.
Коллективно необходимо описать стандартный протокол для получения дегенеративные tenocyte из тканей человека не вызывая отрицательные последствия для донора. Эта статья описывает протокол о том, как приобрести человека дегенеративных tenocyte. Чтобы проверить протокол, были проанализированы гистологически заготовленной тканей. Затем культивируемых клеток было подтверждено дегенеративные tenocyte с помощью immunocytochemistry (ICC), количественные реального времени полимеразной цепной реакции (qRT-PCR) и жизнеспособности assay.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протокол был проведен в соответствии с Хельсинкской декларации и протокол был утвержден Советом по рассмотрению институциональных на ча Bundang медицинский центр.
1. дегенеративных сухожильных тканей урожай от пациента
- Диагностировать боковых эпикондилит, принимая медицинской истории и используя физический экзамен результаты: нежность над тендиноза происхождения недалеко от боковой надмыщелок; боль, вызываемые сопротивление расширение лучезапястного сустава.
- Используйте следующие критерии включения: старше 18 лет; История боковых эпикондилит как минимум шести месяцев; непокорных для non оперативная лечения; по крайней мере три месяца прошло с момента инъекции кортикостероидов, богатой плазмы тромбоцитов или ботулинический токсин
- Исключить следующие: беременных женщин; Пациенты с историей болезни шейного отдела позвоночника, колено артрит, ревматических болезней, хирургии локтя, и нервных захвата синдром; пациенты, отказавшись пожертвовать ткани.
-
Хирургическая техника
Примечание: См. Рисунок 124.- После общей анестезии, изофлюрановая и эндотрахеальной интубации Положите руку на стол и применять жгут. Затем примените Бетадин агент на всю руку и драпировки с асептических хирургические лист.
- Разоблачить боковой локоть через 3 – 5 см разрез с № 15 хирургического скальпеля лезвия просто переднемедиальной боковой надмыщелок и проксимальнее уровня совместной.
- Визуально определить Карпи разгибатель запястья лучевой мышцы (ECRL) и разгибателей апоневроза интерфейса и сделать расщепления разрез 2 – 3 мм в глубину между ECRL и разгибателей апоневроза с лезвием хирургического скальпеля № 15 на выявленных интерфейс.
- Экстракт ECRL кпереди, который принесет Карпи патологического разгибатель запястья лучевой Лонг brevis (ECRB) происхождения ниже в прямой видимости.
- Визуально Определите патологические дегенеративных ткани, его характерный тупой сероватый цвет и обычно отечной и рыхлая ткань.
- После идентификации тщательно иссечения всех дегенеративных ткани, резко с помощью хирургического скальпеля № 15 и мини лезвия.
- Немедленно внедрить резекции тканей (около 1 см3) в-фосфатный буфер (PBS) и удалить все окружающие ткани за исключением сухожильных тканей тщательно в около 10 мл PBS как можно скорее.
- В случаях с костлявые экзостозов на боковой надмыщелок удаление экзостозов, с помощью rongeur и сгладить его рашпилем. Сделать несколько просверлить отверстия (диаметром 1,6 мм, около 6-8 отверстий) в передне-боковой мыщелка для улучшения кровоснабжения. Это не является обязательным.
- Закройте рану слоя с использованием не рассасывающиеся шовные материалы.
-
Tenocyte здоровый управления
- Получить здоровых tenocytes от остальных сухожилия auto-подколенного сухожилия или auto-коленная чашечка сухожилие во время реконструкции передней крестообразной связки и использовать его в качестве элемента управления для следующих эксперимент25.
Примечание: Количество проб, используемые в данном исследовании были три в каждой группе.
- Получить здоровых tenocytes от остальных сухожилия auto-подколенного сухожилия или auto-коленная чашечка сухожилие во время реконструкции передней крестообразной связки и использовать его в качестве элемента управления для следующих эксперимент25.
2. гистология
- Хранить около половины собранного ткани в нейтральных буферизации формалина 10% в Химический вытяжной шкаф или эквивалент.
- Внедрить ткани в блоке парафина (4-5 мл) и раздел его в разделы 4 – 5 мкм coronally.
-
Пятно Секции управления и дегенеративных сухожилия с гематоксилином и эозином пятно (H & E) и Альциановый синий пятно на pH 2.5. Выполните, H & E пятнать в машине автоматизированной пятно следующим образом.
- Deparaffinize с помощью ксилола (3 раза, 5 мин, соответственно).
- Гидрат от градуированных спиртов в воде (100% алкоголя, 4 мин; 100% спирта, 3 мин; 95% спирта, 2 мин; 70% спирта, 1 мин; вода, 2 мин).
- Пятно в гематоксилином на 5 мин мыть хорошо в воде в течение 2 мин.
- Дифференцировать кислоты спиртовой 1% (1% HCl в 70% спирта) для 3 s. мыть хорошо в воде в течение 3 мин.
- Нейтрализовать HCl путем погружения в 0,5% аммиака для 10 сек, затем вымыть водой 3 мин.
- Пятно в Eosion на 5 мин.
- Обезвоживанию через спирты (80% спирта, 30 s; 95% спирта, 1 мин; 100% спирта 1 мин, 100% спирт 2 мин).
- В ксилоле (3 раза, 2 мин, 2 мин и 3 мин, соответственно).
- Крепление с слайд крышка.
-
Выполните immunohistochemitry (IHC) с помощью комплекта Бонд полимер уточнить определение согласно инструкциям производителя с незначительными изменениями.
- После депарафинизации с помощью ксилол, антиген извлечения процедуру выполните с помощью облигаций Epitope поиска решения для 30 минут при 100 ° C. Бонд Epitope извлечения раствора содержит буфера цитрата основе и ПАВ (1 Л, pH 5.9 – 6.1).
- Утолите эндогенной пероксидазы, инкубации ткани с перекисью водорода для 5 мин.
- Инкубируйте в разделах 15 мин при температуре (21-22 ° C) с первичных антител против Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) (1: 200), tenomodulin (1: 200) или Мохок (1: 200).
- Выполните, вторичное антитело пометки с системой конъюгата антитела пероксидаза компоновщик биотин бесплатно полимерных хрен.
- Использование вторичных кролик анти мыши IgG в 10% (v/v) Животные сыворотки в 2-Methyl-4-isothiazolin-3-one растворе трис буфер saline/0.09% для локализации антитела мыши.
- Использование полимерных анти поли-ПХ-IgG кролика (< 25 мкг/мл) содержит 10% (v/v) Животные сыворотки в трис буфере saline/0.09% для локализации антитела кролика.
- Использование 3, 3'-диаминобензидин tetrahydrochloride гидратов в стабилизатор решения для визуализации комплекса через коричневый осадок.
- Изображение с < гематоксилином (синий) 0,1% для визуализации клеточных ядер.
- Наблюдать за слайды, окрашенных с H & E, Альциановый синий пятна и IHC VEGF, tenomodulin и ирокез под световой микроскоп и получить представитель микроскопических изображений каждого слайда под полем одной высокой мощности (400 X).
3. Tenocyte культура
-
Подготовка тканей
- Подготовьте образец сухожилия, удалив все окружающие ткани тщательно с микро ножницы и пинцет.
- Вымойте с PBS и фарш на мелкие кусочки (около 1 мм3 или меньше).
- Дайджест ткани для 1 h 30 мл Дульбекко изменение орла среды (DMEM) дополнены коллагеназы II 30 мг/мл при 37 ° C.
- Клетки проходят через стрейнер ячейки 100 мкм.
- Деактивируйте коллагеназы II, добавив 1 мл сыворотки плода говядину (ФБС).
- Центрифуга на 196 x g за 5 мин.
-
Культура клеток
- Семян 3 x 105 клеток в 100 мм блюдо и культуры с DMEM, дополненная 10% FBS и антибиотик-противогрибковое раствор 1% при 37 ° C в 5% CO2 инкубатора на 1 неделю.
- Изменение культуры среднего каждые три дня, до тех пор, пока 80% слияния происходит. Культура здорового управления и дегенеративных клеток образцов до прохождения четырех и использовать для эксперимента.
4. Immunocytochemistry (ICC)
- Передать восемь скважин слайд камеры 200 мкл культивируемых клеток (2 x 105 клеток) и расти клетки до слияния с добавлением свежих СМИ за 1 день.
- Вымыть клетки с PBS и исправить с 500 мкл 4% формальдегида в колодец.
- Инкубируйте слайды с 0,5% Тритон X-100 в PBS 10 мин для permeabilization мембран.
- Блок в PBS с 1% бычьего сывороточного альбумина и 0,05% TWEEN-20 для mohawk и tenomodulin, соответственно.
- Инкубируйте в темноте с мыши анти могавков моноклональных антител (разбавления 1: 100) и антитела анти tenomodulin коза (разбавления 1: 100) при 4 ° C на ночь.
- Инкубировать вторичные антитела (Alexa 555-анти козы (1: 200) для tenomodulin; Alexa 488-анти мышь (1: 200) для mohawk) в темноте за 1 ч при комнатной температуре.
- Крепление с 0.5 мкл флуоресценции установки среды.
- Анализ с помощью флуоресцентным микроскопом (400 X).
5. распространение Assay
-
Мера жизнеспособность клеток с использованием водорастворимых tetrazolium (WST) -1.
- Семя как здоровых, так и дегенеративных клеток в 96 хорошо пластины на плотности 2 x 103 клеток на хорошо для 24, 72 и 120 h.
- После инкубации мкл 10 WST-1 10% раствора в каждую лунку.
- Инкубируйте пластины для 3 ч при 37 ° C в 5% CO2.
- Измерение оптической плотности при 450 Нм, используя Считыватель микропланшетов. Возьмите чтений по крайней мере три раза во всех точках времени для каждого образца.
-
Мера клеточных ДНК сумму с помощью BrdU assay.
- Оба здоровых семян и дегенеративных клеток в 96 хорошо плиты на плотности 2 x 103 клеток на хорошо для 24, 72 и 120 h.
- После инкубации добавьте 10 мкл 10% раствора BrdU в каждой скважине.
- Инкубируйте пластины для 3 ч при 37 ° C в 5% CO2.
- Добавить 100 мкл/хорошо фиксация/денатурировать раствора (60 – 70% этанол, 0.1 – 0.5% гидроксида натрия) и держите пластины при комнатной температуре за 30 мин.
- Добавьте 100 мкл/хорошо подготовлен 1 x раствор обнаружения антител и держите пластины при комнатной температуре за 1 час.
- Удаление решения и мыть плиту три раза с 1 x мыть буфера.
- Добавить 100 мкл/хорошо подготовлен 1 x вторичное антитело проспряганное HRP раствора и держите пластины при комнатной температуре за 30 мин.
- Удаление решения и мыть плиты три раза с 1 x мыть буфера.
- 100 мкл 50% ТМБ субстрата.
- Инкубируйте 30 мин при комнатной температуре.
- 100 мкл стоп решения.
- Измерение оптической плотности при 450 Нм, используя Считыватель микропланшетов.
Примечание: По крайней мере три раза принимать чтениях все время точек для каждого образца.
6. Статистический анализ
- Собирать и анализировать данные с помощью SPSS.
- Изображать данные по среднее ± Среднеквадратичная ошибка среднего.
- Использование теста Mann-Whitney U.
- Рассмотрим различия статистически, когда значение p меньше чем 0,05 (p < 0,05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Гистологические анализы показали, что собранный ткани от боковых эпикондилит характеристики tendinopathic сухожилие. H & E секции дегенеративных сухожилий плеча показал дезорганизованы коллагена расслоения с потерей полярности и тонкой прямой, настоятельно Упакованные параллельные волокна структур. Гистологические признаки наводящий дегенерации, такие, как выше, клеточности и расширенного ядра без типичных шпинделя формы были распространены в образцах. Кроме того коллагена расслоения выродились сухожилия были относительно слабыми эозина запятнана H & E но положительно запятнана Альциановый синий, указывающее увеличению протеогликанов и гликозаминогликанов вещество.
Во всех случаях кровеносные сосуды были увеличены в номер и агрегатов, занимая запрещено, встроенное между волокнами были по сравнению с нормальной щели как кровеносные сосуды. В ИХС окрашивание, клетки выродились сухожилий показал цитоплазматических гранулированный положительной реакции VEGF по сравнению с негативной реакцией контрольными. Коллективно, эти выводы подтвердили, что собранный тканей от боковых эпикондилит дегенеративных тканей и подходит для дегенеративного tenocyte культуры (см. Рисунок 2).
Культивируемых клеток были подтверждены в качестве tenocytes МТП и заготовленной тканей были подтверждены IHC как ткани сухожилия. Большинство культивируемых клеток и клеток в тканях сухожилий показали положительный пятно для представителя tenocyte маркеры известный как белки Мохок (зеленый) и tenomodulin (красный) белки с удлиненными внешнего вида при микроскопии (см. рис. 3). Кроме того собранные тканей имел положительный пятнать для могавков белков и tenomodulin белки immunohistochemically (см. дополнительный рисунок 1). Эти предлагаемые, что собранный тканей состоят ткани сухожилия.
Искусственный tenocytes из собранного ткани боковых эпикондилит были характерные черты, которые соответствуют плеча. Дегенеративные и здоровой tenocytes были культивированный на 4 дня, при том же условии. В каждый момент времени уровень распространения был измерен BrdU пробирного и пробирного WST-1. Результаты показали, что уровень распространения дегенеративных клеток была значительно выше по сравнению с элементов управления как сообщалось ранее (p < 0,05) (см. рис. 4A).
Были проанализированы пять генов, которые известны как вверх регулируются дегенеративных сухожилие qRT ПЦР. Выражения из генов, COL3A1, ACTA2, TAC1 (SP), TAC приемного устройства 1, и PTGS2 (COX2) были более значительно увеличилось в культивируемых клеток от дегенеративных сухожилие чем в клетках со здоровыми. Относительные выражения для всех генов показаны в Рисунок 4B и дополнительная цифра 2.
Рисунок 1 : Хирургическая фото дегенеративных сухожилия урожая. (A) после разреза кожи и рассечение, патологически дегенеративных ткани на общего разгибателя происхождения был разоблачен, показаны характерный цвет серовато скучно с изменением отечной (красная линия). И наоборот общий вид обычных сухожильных тканей был блестящий и фирмы с слегка сероватый тон (черная линия). (B) все выявленные дегенеративных ткани были резецируется резко и затем был разоблачен радиальные головы костей. (C) все резекции тканей были внедрены в фосфатный буфер немедленно и окружающих тканей не тендиноза был тщательно расчлененный как можно скорее. ECRB: разгибатель запястья лучевой brevis. EDC: разгибателей пальцев соттишз. ECU: разгибателей запястья ulnaris. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Подтверждение дегенеративных сухожилия гистологически. (A) в H & E окрашивание, дегенеративные образцы из боковых эпикондилит дезорганизованы коллагена расслоения с потерей полярности и увеличение числа клеток, по сравнению с здорового контроля. (B). Альциановый синий пятнать показал, что дегенеративные сухожилие увеличилась земле вещества, состоящие из протеогликанов и гликозаминогликанов с несколькими слизистый патчей и вакуоли между волокнами (стрелка). (C). Кроме того, иммуногистохимия VEGF свидетельствует увеличение пятнать в формировании судна в образцах дегенеративных сухожилия, по сравнению с образцами управления. VEGF: Сосудистый эндотелиальный фактор роста. Шкалы бар = 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Идентификация tenocyte МТП. Культивируемых клеток и клеток в тканях сухожилий были подтверждены как tenocyte МТП. Большинство клеток показали положительный пятно для представителя tenocyte маркера, включая Мохок (зеленый) и tenomodulin (красный) с удлиненным внешнего вида при микроскопии. Хондроцитов использовался в качестве отрицательного контроля. МТП: иммуноцитохимии. Шкалы бар = 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Характеристики дегенеративные tenocyte. (A, B) Дегенеративных tenocytes (красный) имели более высокий уровень распространения с заметным увеличением в клеточности. (C) пять генов, которые связаны в развитии плеча значительно были подняты в дегенеративные tenocytes. Уровни выражения гена были нормализованы против GAPDH. *: означает < 0,05, **: означает < 0.01, соответственно. SP: вещество P. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Дополнительный рисунок 1: гистологическое подтверждение заготовленной ткани ткани сухожилия. Собранный ткани также был проанализирован IHC mohawk и tenomodulin определить ли собранный ткани имели адекватные характеристики ткани сухожилия. IHC: иммуногистохимия. Шкалы бар = 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Дополнительный рисунок 2: выражение плеча связанных генов в tenocyte. Стенограммы пяти генов, нормированный выражением актина были значительно повышенные в дегенеративные tenocytes и имеют аналогичные тенденции на рисунке 4. Уровни выражения гена были нормализованы против актина с медианой < 0,05 и < 0.01, соответственно. SP: вещество P. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ряд предыдущих исследований сообщили как создать хронический tendinopathic животных моделей с использованием различных процедур, таких как коллагеназы или инъекций kartogenin, беговая дорожка работает и более26,27. Несмотря на многочисленные исследования показали многообещающие терапевтические эффекты, основанные на этих животных моделях, эксперименты с использованием человека дегенеративных tenocyte будут иметь решающее значение в области плеча для того чтобы воспроизвести эффективность лечения. В этой статье мы создали протокол успешно урожай и культура человека дегенеративных tenocytes последовательно. Как собирают ткани сухожилия и культивировали tenocyte показал общие характеристики дегенеративных сухожилие tenocyte7,и28.
По нашему опыту для успешного ткани урожая, важно понять морфологические изменения, часто связанные с дегенеративными сухожилия и точно определить эту область во время операции. Дегенеративных ткани обычно серого или коричневого цвета и ткани, тонкие, хрупкие и неорганизованное с свободные текстур. Критерии включения и исключения протокола должны храниться строго с тщательной оценки предыдущего лечения до сбора урожая.
Размер ткани также имеет важное значение для успешного клеточной культуры. Мы рекомендуем, уборки более, чем 1 см3. Обычно до тех пор, пока все области дегенеративных удаляется, количество собранных ткани будет достаточно для клеточной культуры. И наконец мы не использовали tenocytes через проход шесть в всех экспериментов. До прохождения шести мы считаем, что культивируемых клеток по-прежнему имеет характеристики дегенерации.
Наш протокол имеет несколько преимуществ. Эти преимущества включают без вреда для больного, так как дегенеративных ткани должен был быть удалены во время операции, эффективность, так как количество ткани требуется достаточно для эксперимента, высоко этические вследствие нарушения не здоровые ткани, воспроизводимость результатов в этом патологических тканей от людей могут быть легко получены во время операции, и, наконец, простота применения после хирургических методов ознакомления.
Однако мы признаем, что наш эксперимент имеет ряд ограничений. Во-первых мы нельзя полностью исключить эффект остатки предыдущих кортикостероидов или тромбоцитов богатой плазмы инъекции, даже несмотря на то, что мы включили только пациенты, которые прошли по крайней мере три месяца от любого предыдущего лечения. Кроме того в этом протоколе, мы только собирают ECRB сухожилия и использовали его для дегенеративные tenocytes культуры, так как ECRB сухожилие общий сайт плеча для хирургии наряду с сухожилия Ахиллеса и вращающей манжеты. Дальнейшие исследования должны осуществляться с упором на любые различия между различными сайтами плеча больше размер выборки.
В заключение это проверяемое протокол для приобретения человека дегенеративных tenocytes будет полезным инструментом для будущих исследований в биологии сухожилия и для тестирования роман терапевтических вмешательств.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грант от Кореи медицинских технологий R & D проекта через Корея здравоохранения промышленности развития института (ХИДИ), который финансируется министерством здравоохранения и социального обеспечения, Республика Корея (номер гранта: HI16C1559).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Scalpel | Kisanbio | KS-Q0306-15 | No. 15 |
| Mini-blade | Beaver | 374769 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco | 11995065 | |
| PBS | Gibco | 14190250 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| 50 mM ascorbic acid-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Gibco | 15240062 | |
| 4% formaldehyde | Bio-solution | BP031 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ml | |
| BSA | Rdtech | C0082 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ml | |
| MKX (C-5) | Santa cruz biotechnology | sc-515878 | |
| Tenomodulin (N-14) | Santa cruz biotechnology | sc-49325 | |
| Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| WST-1 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | |
| BrdU Cell Proliferation Assay Kit | Cell Signaling Technology | #6813 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8891 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
| GAPDH | Thermo Fisher Scientific | Hs02786624_g1 | |
| COL3A1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00943809_m1 | |
| ACTA2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00426835_g1 | |
| TAC1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00243225_m1 | |
| TACR1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00185530_m1 | |
| PTGS2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00153133_m1 | |
| ACTB | Thermo Fisher Scientific | Hs99999903_m1 | |
| Cell Strainers (100 µm) | Corning | 352360 | |
| 100mm culture dish | Thermo Fisher Scientific | 8188207 | |
| 8-well Chamber Slide | Thermo Fisher Scientific | 154534 | |
| 96 Well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3596 | |
| Nikon Eclipse 50i Microscope | Nikon | ||
| VERSA max microplate reader | Molecular Devices | ||
| CFX96 Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | ||
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Paraffins | Leica Biosystems | 3801340 | |
| Ethanol | JUNSEI CHEMICAL | 90303-2185 | |
| Hematoxylin | DAKO | CS70030-2 | |
| Eosin | DAKO | CS70130-2 | |
| Alcian blue | DAKO | AR16011-2 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Xylene | JUNSEI CHEMICAL | 25165-0430 | |
| Endogenous peroxidases | DAKO | S200380-2 | |
| Canada balsam | JUNSEI CHEMICAL | 23255-1210 | |
| Microtome Blade | FEATHER | A35 | |
| Slide glass | SUPERIOR | 1000612 | |
| Cover glass | Marienfeld-Superior | 101050 | |
| VEGF | Santa cruz biotechnology | sc-7269 | |
| SPSS Software | IBM | Ver. 18.0 | |
| Multi-purpose Centrifuge | LABOGENE | 1248R |
References
- Ackermann, P. W., Renstrom, P. Tendinopathy in sport. Sports Health. 4 (3), 193-201 (2012).
- Maffulli, N., Wong, J., Almekinders, L. C.
- Lui, P. P., Chan, L. S., Fu, S. C., Chan, K. M. Expression of sensory neuropeptides in tendon is associated with failed healing and activity-related tendon pain in collagenase-induced tendon injury. American Journal of Sports Medicine. 38 (4), 757-764 (2010).
- Han, S. H., et al. Effects of corticosteroid on the expressions of neuropeptide and cytokine mRNA and on tenocyte viability in lateral epicondylitis. Journal of Inflammation (London). 9 (1), 40 (2012).
- Uchio, Y., et al. Expression of neuropeptides and cytokines at the extensor carpi radialis brevis muscle origin. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 11 (6), 570-575 (2002).
- Lieber, R. L., Loren, G. J., Friden, J. In vivo measurement of human wrist extensor muscle sarcomere length changes. Journal of Neurophysiology. 71 (3), 874-881 (1994).
- Regan, W., Wold, L. E., Coonrad, R., Morrey, B. F. Microscopic histopathology of chronic refractory lateral epicondylitis. American Journal of Sports Medicine. 20 (6), 746-749 (1992).
- Sharma, P., Maffulli, N. Tendon injury and tendinopathy: healing and repair. Journal of Bone and Joint Surgery American volume. 87 (1), 187-202 (2005).
- Lui, P. P. Stem cell technology for tendon regeneration: current status, challenges, and future research directions. Stem Cells Cloning. 8, 163-174 (2015).
- Dahlgren, L. A., van der Meulen, M. C., Bertram, J. E., Starrak, G. S., Nixon, A. J. Insulin-like growth factor-I improves cellular and molecular aspects of healing in a collagenase-induced model of flexor tendinitis. Journal of Orthopedic Research. 20 (5), 910-919 (2002).
- Schnabel, L. V., et al. Mesenchymal stem cells and insulin-like growth factor-I gene-enhanced mesenchymal stem cells improve structural aspects of healing in equine flexor digitorum superficialis tendons. Journal of Orthopedic Research. 27 (10), 1392-1398 (2009).
- Durgam, S. S., Stewart, A. A., Sivaguru, M., Wagoner Johnson, A. J., Stewart, M. C. Tendon-derived progenitor cells improve healing of collagenase-induced flexor tendinitis. Journal of Orthopedic Research. 34 (12), 2162-2171 (2016).
- Titan, A., Andarawis-Puri, N. Tendinopathy: Investigating the Intersection of Clinical and Animal Research to Identify Progress and Hurdles in the Field. Journal of Bone and Joint Surgery Review. 4 (10), (2016).
- Dirks, R. C., Warden, S. J.
- de Mos, M., et al. Can platelet-rich plasma enhance tendon repair? A cell culture study. American Journal of Sports Medicine. 36 (6), 1171-1178 (2008).
- Scherb, M. B., Han, S. H., Courneya, J. P., Guyton, G. P., Schon, L. C. Effect of bupivacaine on cultured tenocytes. Orthopedics. 32 (1), 26 (2009).
- Wong, M. W., et al. Effect of dexamethasone on cultured human tenocytes and its reversibility by platelet-derived growth factor. Journal of Bone and Joint Surgery American Volume. 85 (10), 1914-1920 (2003).
- Tempfer, H., et al. Effects of crystalline glucocorticoid triamcinolone acetonide on cultered human supraspinatus tendon cells. Acta Orthopaedics. 80 (3), 357-362 (2009).
- Menon, A., et al. New insights in extracellular matrix remodeling and collagen turnover related pathways in cultured human tenocytes after ciprofloxacin administration. Muscles Ligaments Tendons J. 3 (3), 122-131 (2013).
- Backman, L. J., Fong, G., Andersson, G., Scott, A., Danielson, P. Substance P is a mechanoresponsive, autocrine regulator of human tenocyte proliferation. PLoS One. 6 (11), 27209 (2011).
- Backman, L. J., Eriksson, D. E., Danielson, P. Substance P reduces TNF-alpha-induced apoptosis in human tenocytes through NK-1 receptor stimulation. Britich Journal of Sports Medicine. 48 (19), 1414-1420 (2014).
- Rolf, C. G., Fu, B. S., Pau, A., Wang, W., Chan, B. Increased cell proliferation and associated expression of PDGFRbeta causing hypercellularity in patellar tendinosis. Rheumatology (Oxford). 40 (3), 256-261 (2001).
- Hoppe, S., et al. Tenocytes of chronic rotator cuff tendon tears can be stimulated by platelet-released growth factors. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 22 (3), 340-349 (2013).
- Schipper, O. N., Dunn, J. H., Ochiai, D. H., Donovan, J. S., Nirschl, R. P. Nirschl surgical technique for concomitant lateral and medial elbow tendinosis: a retrospective review of 53 elbows with a mean follow-up of 11.7 years. American Journal of Sports Medicine. 39 (5), 972-976 (2011).
- Cook, J. L., Feller, J. A., Bonar, S. F., Khan, K. M. Abnormal tenocyte morphology is more prevalent than collagen disruption in asymptomatic athletes' patellar tendons. Journal of Orthopedic Research. 22 (2), 334-338 (2004).
- Yuan, T., et al. Creating an Animal Model of Tendinopathy by Inducing Chondrogenic Differentiation with Kartogenin. PLoS One. 11 (2), 0148557 (2016).
- Lui, P. P., Maffulli, N., Rolf, C., Smith, R. K. What are the validated animal models for tendinopathy. Scandinavian Journal of Medical Scientific Sports. 21 (1), 3-17 (2011).
- Wilhelm, A. Lateral epicondylitis review and current concepts. Journal of Hand Surgery American Volume. 34 (7), author reply 1359-1360 1359-1360 (2009).
