Summary
Tendinopathy에 새로운 치료의 효능을 조사할 때 퇴행 성 tenocytes의 생체 외에서 사용은 필수적입니다. 그러나, 대부분의 연구 연구 동물 모델 또는 건강 한 tenocyte를 사용합니다. 우리는 수술 하는 동안 인간의 퇴행 성 tenocytes를 분리 하는 다음 프로토콜을 제안 합니다.
Abstract
증가 신체 활동 및 더 긴 수명으로 인해 선진국에서 증가 Tendinopathy, 힘 줄 변성에 대 한 응답에서을 개발 하 고 고통 스러운 상태 이다. 그것의 증가 보급에도 불구 하 고 기본 병 인 아직도 불분명 하 게, 남아 있다 그리고 치료는 일반적으로 증상을 보인다. 최근, 성장 인자, 줄기 세포 및 유전자 치료 등 다양 한 치료 옵션은 퇴행 성 힘 줄의 치료 효능을 향상을 위해 조사 되었다. 그러나, 이러한 연구의 대부분은 동물 모델 또는 건강 한 인간 tenocytes에만 실시 되었다. 병 적인 tenocytes를 사용 하 여 일부 연구에도 불구 하 고 우리의 지식 최선을 다 해 현재는 인간의 퇴행 성 tenocytes을 구하는 방법을 설명 하는 아무 프로토콜. 이 연구의 목적은 인간의 퇴행 성 tenocytes 획득을 위한 표준 프로토콜을 설명 하는 것입니다. 처음에, 힘 줄 조직은 수술 하는 동안 측면 염증 환자에서 수확 했다. 다음 생 샘플 해당 수술 시 관찰 하는 구조적인 변화 하 신 근 피 radialis brevis 힘에서 촬영 됐다. 수확된 힘 줄의 모든 지루한, 회색, 어렵다면, 등장 하 고, edematous는 그들이 만든 건강 한 사람에서 시각적으로 뚜렷한. Tenocytes 배양 하 고 실험을 위해 사용 했다. 한편, 수확 조직의 절반 조직학, 분석 되었다 그리고 tendinopathy angiofibroblastic 형성 (증식) 같은 주요 기능을 공유 하는 그들은 보였다. Immunocytochemistry에 의해 2 차 분석 확인 배양된 세포 모호크와 tenomodulin 단백질에 대 한 긍정적인 얼룩을 갖는 셀의 대다수와 가진 tenocytes 했다. Tenocytes의 퇴행 성 자연의 자질 다음 확산 분석 결과 또는 qRT-PCR를 사용 하 여 건강 한 컨트롤 셀 비교 하 여 결정 했다. 퇴행 성 tenocyte 더 높은 확산 속도 일치 하는 이전 보고서 tendinopathy의 유사한 유전자 표현 패턴 표시. 전반적으로,이 새로운 프로토콜 tendinopathy의 미래 연구에 대 한 유용한 도구를 제공할 수 있습니다.
Introduction
Tendinopathy 신체의 다양 한 부분에서 개발 하 고 만성 퇴행 성 근 골격 계 상태 이다. 최근, tendinopathy의 케이스의 수에 참여 레크리에이션 스포츠 및 증가 평균 수명1,2성장으로 인해 선진국에서 크게 증가 했다. Tendinopathy의 원인 multifactorial 간주 됩니다 및 이러한 원인은 허 혈, 산소 자유 래 디 칼 부상, vasoconstrictor 및 vasodilator innervations, 내부 마이크로-눈물, 그리고 신경 레 귤 레이 션3에 변화 사이의 불균형 포함 ,,45,6,,78. Tendinopathy에 대 한 대부분의 치료만의 증상을 완화. 또한, 조직 재생 없이 치료 재활에 대 한 오랜 시간을 요구 하 고 의사9임상 과제 부과 부상된 힘 줄에서 제한 된 응답 달성.
현재 치료 옵션과 자체에 퇴행 성 힘 줄의 능력의 부족의 무는 대체 치료 전략을 탐구에 관심을 가져 리드 연구원. 최근, 성장 인자를 사용 하 여 tendinopathy 힘 줄의 치료 효능을 향상을 위한 많은 유망한 결과 보고 하는 새로운 연구, 줄기 세포 기반 치료, 그리고 유전자 치료10,,1112.
문학 검토를 통해 우리는 관련 된 연구의 분석 자료를 기반으로 두 가지 범주로 나눌 수 있습니다 발견: 쥐, 마우스, 또는 토끼; 같은 동물 모델 그리고 인간의 모델입니다. 동물 모델에 관해서는 현재 두 개의 인기 있는 기술이 있다 tendinopathy 생성 하: 부상 또는 모델을 오버 로드 하는 기계 화학 유도. 그러나, 각 동물 모델은 복잡 한 인간의 tendinopathy 병리학13,14재현에 제한 되었다.
대부분 논문 인간의 샘플을 사용 하 여 조직학 분석 했다 또는는 생체 외에서 퇴행 성 tenocyte15,16,,1718 대신 건강 한 인간의 tenocyte를 기반으로 하는 실험 , 19 , 20 , 21. 몇 논문만 보고 그들이 인간의 퇴행 성 tenocyte를 사용 하지만 그들은 않았다 하지 자세히 설명 인간의22,23에서 퇴행 성 tenocyte를 얻을 하는 데 사용 하는 프로토콜. 이러한 맥락에서 그것은 지적 되어야 인간의 효능 또는 효과 먹이 지 힘 줄 변성은 복잡 한 과정 때문에 병 인은 동물 모델 또는 건강 한 조직/tenocyte에서 성공적인 결과 반드시 예측 하지 수는 아직도 완전히 이해.
그것은 기증자에 게 부작용을 유발 하지 않고 인간의 조직에서 퇴행 성 tenocyte을 얻기 위한 표준 프로토콜을 설명 하는 데 필요한. 이 문서는 인간의 퇴행 성 tenocyte를 취득 하는 방법에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜의 유효성을 검사 하려면 수확된 조직 조직학 분석 되었다. 그런 다음, 교양된 셀 immunocytochemistry (ICC), 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (qRT-PCR), 생존 능력 분석 결과 사용 하 여 퇴행 성 tenocyte로 확인 되었다.
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Protocol
프로토콜은 헬싱키의 선언에 따라 실시 하 고 프로토콜 차 분당 병원 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었다.
1. 퇴행 성 힘 줄 조직 수확은 환자에서
- 의료 기록을 신체 검사 결과 사용 하 여 측면 염증 진단: 측면 뼈; 가까이 단 근원 부드러움 손목 관절의 저항된 확장에 의해 갖는 고통.
- 다음 포함 기준을 사용 하 여: 18 세 이상; 최소 6 개월;에 대 한 측면 염증의 역사 비 수술 치료; 대 한 고집 불통 적어도 3 개월이 코르 티 코 스테로이드, 혈소판 리치 플라즈마, 또는 보 톨 리누스 독 소의 주입 이후
- 다음 제외: 임신 여성; 자 궁 경관 등뼈 질병, 팔꿈치 관절염, rheumatologic 질병, 팔꿈치, 그리고 신경 함정 수사 증후군; 주위 수술의 역사를 가진 환자 조직 기증을 거부 하는 환자.
-
수술 기법
참고: 그림 124참조.- Isoflurane endotracheal 삽 관 법에 의해 일반 마 취, 후 테이블에 팔을 넣고는 지 혈 대를 적용. 그런 다음 팔 전체에 무 균 수술 시트와 드 레이프 betadine 에이전트를 적용 합니다.
- 15 번 외과 용 메스 블레이드 그냥 anteromedial 측면 뼈와 관절의 수준에 인접 된 3-5 cm 절 개를 통해 측면 팔꿈치를 노출 합니다.
- 시각 신 근 피 radialis longus (ECRL) 및 신 근 aponeurosis 인터페이스를 식별 하 고 식별 된 인터페이스에서 15 번 외과 용 메스 블레이드와 ECRL 및 신 근 aponeurosis 사이 깊이에 분할 절 개 2-3 m m를 확인 합니다.
- 추출 된 ECRL anteriorly,는 직접 보기에 아래 pathologic 신 근 피 radialis longus brevis (ECRB) 원산지를 가져올 것 이다.
- 시각 특성 단조로운 잿 빛 색에 의해 pathologic 퇴행 성 조직 및 일반적으로 edematous 및 부서 조직을 식별 합니다.
- 확인 후 신중 하 게 모든 퇴행 성 조직 급격히 15 번 외과 용 메스와 미니-블레이드를 사용 하 여 resect.
- 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 즉시 (약 1 c m3) 절제 조직을 포함 하 고 약 10 mL의 PBS로 신중 하 게 최대한 빨리 힘 줄 조직 제외 하 고 모든 주변 조직을 제거 합니다.
- 측면 뼈에서 뼈 exostosis 경우, exostosis는 rongeur를 사용 하 여 제거 하 고는 강판으로 매끄럽게 합니다. 게 여러 드릴 구멍 (직경 1.6 m m, 약 6-8 구멍) 혈관 공급을 향상 시키기 위해 anterolateral 관절 돌기에. 이것은 선택 사항입니다.
- 레이어, 레이어 비 흡수 봉합 사 물자를 사용 하 여 상처를 닫습니다.
-
건강 한 제어 tenocyte
- 전방 십자 인 대 재건, 동안 자동 햄 스트링 또는 자동-슬 개 골 힘 줄의 남은 힘 줄에서 건강 한 tenocytes를 얻을 하 고 다음 실험25컨트롤로 사용 합니다.
참고:이 연구에 사용 된 샘플 수가 각 그룹에 3 했다.
- 전방 십자 인 대 재건, 동안 자동 햄 스트링 또는 자동-슬 개 골 힘 줄의 남은 힘 줄에서 건강 한 tenocytes를 얻을 하 고 다음 실험25컨트롤로 사용 합니다.
2입니다. 조직학
- 화학 증기 두건 또는 이와 동등한 중립 버퍼링 된 10% 포 르 말린에 수확된 조직의 절반을 저장 합니다.
- 조직을 파라핀 블록 (4-5 mL)에 포함 하 고 coronally 4-5 µ m 섹션에 섹션.
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제어 및 Hematoxylin 및 오신 얼룩 (H & E)와 2.5의 pH에 Alcian 블루 얼룩 퇴행 성 힘 줄에서 섹션을 얼룩. H & E 자동된 얼룩 기계에 얼룩이 지 다음과 같이 수행 합니다.
- 크 실 렌을 사용 하 여 deparaffinize (3 시간, 5 분, 각각).
- 물 (100% 알코올, 4 분, 100% 알코올, 3 분, 95% 알코올, 2 분, 70% 알코올, 1 분, 물, 2 분) 등급된 알콜에서 하이드 레이트.
- 5 분 2 분 동안 물에 잘 세척에 대 한 되며에 얼룩.
- 1% 산 알코올 차별화 (1% 70% 알코올에 HCl) 3 3 분 물에 잘 씻어 s..
- 찍기 10는 0.5% 암모니아에 의해 HCl를 중화 s, 뒤에 3 분 물 세척.
- 5 분 동안 Eosion에 얼룩.
- 알콜을 통해 탈수 (80% 알코올, 30 100% 알코올 1 분, 100% 알코올 95% 알코올, 1 분; s 2 분).
- 크 실 렌에 취소 (3 시간, 2 분, 2 분, 3 분, 각각).
- 표지 슬라이드와 함께 탑재.
-
Immunohistochemitry (IHC) 사소한 수정 제조업체의 지침에 따라 채권 폴리머 수정 탐지 키트를 사용 하 여 수행 합니다.
- Deparaffinization 크 실 렌을 사용 하 여, 후 100 ° c.에 30 분 동안 본드 Epitope 검색 솔루션을 사용 하는 항 원 검색 절차를 수행 채권 Epitope 검색 솔루션 기반 시트르산 버퍼와 계면 활성 제 (1l, pH 5.9-6.1)에 포함 되어 있습니다.
- 5 분 동안 과산화 수소와 조직 배양 하 여 생 peroxidases를 끄다.
- 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF) (1: 200), tenomodulin (1: 200), 또는 모호크 (1: 200)에 대 한 1 차 항 체와 온도 (21-22 ° C)에서 15 분에 대 한 섹션을 품 어.
- 이차 항 체 고분자 biotin 무료 양 고추냉이 과산화 효소-링커 항 체 어원이 시스템 태그를 수행 합니다.
- 안티 사용 보조 토끼 마우스 항 체를 지역화 하려면 Tris 버퍼 saline/0.09% 2-Methyl-4-isothiazolin-3-one 솔루션에서 10% (v/v) 동물 혈 청에서 IgG를 마우스.
- 고분자 반대로 토끼 폴 리 HRP IgG를 사용 하 여 (< 25 µ g/mL) 10% (v/v) 동물 혈 청 지역화 토끼 항 체를 saline/0.09% Tris 버퍼에 포함 된.
- 3, 3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 수화물 갈색 침전을 통해 복잡 한 시각화를 안정제 솔루션에서 사용 합니다.
- 와 함께 counterstain < 셀 핵 시각화를 0.1% 되며 (파란색).
- H 물 슬라이드 관찰 & E, Alcian 파랑 얼룩 및 IHC 가벼운 현미경 VEGF, tenomodulin, 및 모호크에 대 한 하나의 높은 전력 분야 (400 X)에서 각 슬라이드의 대표적인 미세한 이미지를 얻을.
3. Tenocyte 문화
-
조직 준비
- 마이크로-가 위, 집게와 철저 하 게 모든 주변 조직을 제거 하 여 힘 줄 샘플을 준비 합니다.
- PBS로 세척 하 고 작은 조각 (약 1 m m3 이하로)으로 말하다.
- Dulbecco의 수정 독수리의 매체 (DMEM) 37 ° c.에 30 mg/mL 콜라 II와 보충의 30 mL에 1 시간에 대 한 조직을 소화합니다
- 100 µ m 셀 스 트레이너를 통해 세포를 전달 합니다.
- 소 태아 혈 청 (FBS)의 1 mL을 추가 하 여 콜라 II를 비활성화 합니다.
- 5 분 196 x g에서 원심.
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세포 배양
- 100 mm 접시에 3 x 105 셀을 씨 고 DMEM 10 %FBS 1% 항생제 Antimycotic 솔루션 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 1 주에 대 한 보완과 문화.
- 문화 매체 마다 3 일 80% 합류 발생할 때까지 변경 합니다. 통로 4까지 건강 한 제어 및 퇴행 성 셀 샘플을 문화 및 실험을 위해 사용.
4입니다. Immunocytochemistry (ICC)
- 챔버 슬라이드의 8 개의 우물을 교양된 셀 (2 x 105 셀)의 200 µ L를 전송 하 고 1 일에 대 한 신선한 미디어의 추가 함께 합류 하 셀 성장.
- PBS로 세포 세척 하 고 잘 당 4% 포름알데히드의 500 µ L로 수정.
- 0.5%와 슬라이드를 품 어 세포 막의 permeabilization에 대 일 분에 대 한 PBS에 트라이 톤 X-100.
- PBS에서 1% 소 혈 청 알 부 민 및 0.05% 차단 트윈-20 모호크와 tenomodulin, 각각.
- 마우스 방지 모호크 단일 클론 항 체 (1: 100 희석)와 4 ° C에서 염소 안티-tenomodulin 항 체 (1: 100 희석) 어둠 속에서 밤새 품 어.
- 2 차 항 체 (알 렉 사 555-안티 염소 (1: 200) tenomodulin;에 대 한을 품 어 알 렉 사 488-안티 마우스 (1: 200) 모호크) 실 온에서 1 h에 대 한 어둠 속에서.
- 형광 장착 매체의 0.5 µ L로 탑재 합니다.
- 형광 현미경 (400 X)를 사용 하 여 분석 합니다.
5. 확산 분석 결과
-
셀 viabilities 수용 성 tetrazolium (서 부 표준시)-1 사용 하 여 측정 합니다.
- 24, 72, 및 120 h 잘 당 2 x 103 셀의 밀도에서 96 잘 접시로 모두 건강 하 고 퇴행 성 셀 씨.
- 부 화, 후 각 음을 10% 서 부 표준시-1 솔루션의 10 µ L를 추가 합니다.
- 5% CO2에서 37 ° C에서 3 h에 대 한 번호판을 품 어.
- 450에서 광학 밀도 측정 nm microplate 리더를 사용 하 여. 각 샘플에 대 한 모든 시간 포인트에서 세 번 이상 읽기를 가져가 라.
-
측정 세포질 DNA 양 BrdU 분석 결과 사용 하 여입니다.
- 둘 다 건강 한 씨앗 하 고 96에 타락 셀 잘 잘 24, 72, 및 120 h 당 2 x 103 셀의 밀도에 격판덮개.
- 부 화, 후 각 음을 10 %BrdU 솔루션의 10 µ L를 추가 합니다.
- 5% CO2에서 37 ° C에서 3 h에 대 한 번호판을 품 어.
- 100 µ L/잘 고정/Denaturing 솔루션의 추가 (60-70% 에탄올, 0.1-0.5%가 성소 다) 30 분 동안 실내 온도에 접시를 유지.
- 1 시간에 대 한 탐지 항 체 솔루션 및 계속 실 온에서 플레이트 x 1을 준비 하는 100 µ L/잘 추가 합니다.
- 솔루션을 제거 하 고 세 번 워시 버퍼 x 1와 접시 세척.
- 100 µ L/잘 준비 1 x HRP 활용 된 이차 항 체 솔루션을 추가 하 고 30 분 동안 실내 온도에 접시를 유지.
- 세 번 세척 버퍼 x 1와 솔루션 및 세척 접시를 제거 합니다.
- 50 %TMB 기판의 100 µ L를 추가 합니다.
- 실 온에서 30 분 동안 품 어.
- 정지 솔루션의 100 µ L를 추가 합니다.
- 450에서 광학 밀도 측정 nm microplate 리더를 사용 하 여.
참고: 걸릴 읽기 적어도 세 번 모든 시간 포인트 각 샘플에 대 한.
6. 통계 분석
- 수집 하 고 SPSS를 사용 하 여 데이터를 분석.
- 의미의 평균 ± 표준 오차에 의해 데이터를 묘사.
- 사용만 휘트니 U 테스트 합니다.
- 때 p 값이 0.05 보다 작으면 통계적 차이 고려 (p < 0.05).
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Representative Results
조직학 분석 공개 측면 염증에서 수확된 조직 tendinopathic 힘 줄의 특성을 했다. H & E 섹션 tendinopathy 퇴행 성 힘 줄의 극성 및 좋은 직선, 강하게 포장 병렬 섬유 구조 손실 무질서 콜라겐 번들을 밝혔다. 조직학 징후 높은 cellularity 등 전형적인 스핀 들 모양 없이 확대 핵 변성의 암시 샘플에서 일반적 이었다. 또한, 퇴 화 한 힘 줄의 콜라겐 번들 상대적으로 약한 오신 H & E 스테인드 했지만 긍정적으로 증가 proteoglycans 그리고 있다 물질을 나타내는 Alcian 블루 얼룩 했다.
모든 경우에 혈관 수에 증가 했다 고 섬유 사이 포함 하는 공간을 차지 하는 집계 정상 슬릿 모양의 혈관에 비교 했다. IHC 얼룩에서 퇴 화 한 힘 줄의 셀 컨트롤 들의 부정적인 반응에 비해 VEGF에 세포질 세분화 된 긍정적인 반응을 보였다. 샨 다, 이러한 결과 측면 염증에서 수확된 조직 되었다 확인 퇴행 성 조직 퇴행 성 tenocyte 문화에 적합 하 고 ( 그림 2참조).
배양된 세포는 ICC에 의해 tenocytes로 확인 되었다 고 수확된 조직 힘 줄 조직으로 IHC에 의해 확인 되었다. 대부분의 경작된 한 세포 및 힘 줄 조직에 셀 모호크 (녹색) 단백질 및 현미경 아래 길쭉한 모양으로 tenomodulin (레드) 단백질 대표 tenocyte 표시에 대 한 긍정적인 얼룩의 알려진를 보였다 ( 그림 3참조). 또한, 수확된 조직 모호크 단백질과 tenomodulin 단백질 immunohistochemically ( 보충 그림 1참조)에 대 한 긍정적인 얼룩 했다. 이러한 제안 수확된 조직 힘 줄 조직으로 구성 되어 있었다.
측면 염증의 수확된 조직에서 교양된 tenocytes tendinopathy에 해당 하는 특징적인 기능을 했다. 퇴행 성 및 건강 한 tenocytes는 동일한 조건 하에서 4 일 동안 배양 했다. 각 시간 지점에서 확산 속도 BrdU 분석 결과 및 서 부 표준시-1 분석 결과 의해 측정 되었다. 결과 퇴행 성 세포의 확산 속도 상당히 높은 보고 이전 컨트롤에 비해 나타났다 (p < 0.05) ( 그림 4참조).
퇴행 성 힘 줄에까지 규제 하는 것으로 알려져 있는 5 개의 유전자는 qRT-PCR에 의해 분석 되었다. COL3A1, ACTA2, TAC1 (SP), 전술 수용 체 1 유전자의 표현 및 PTGS2 (COX2) 건강 한 사람에서 세포에 보다 퇴행 성 힘 줄에서 경작된 한 세포에 더 크게 증가 했다. 모든 유전자에 대 한 상대 식 그림 4B 및 보충 그림 2에 표시 됩니다.
그림 1 : 퇴행 성 힘 줄 수확의 수술 사진. (A) 피부 절 개 해 부 후에, 일반적인 신 근 근원에 pathologic 퇴행 성 조직 노출 되었다, edematous 변화 (레드 라인) 특성 무딘 잿 빛 색상을 보여주는. 반대로, 일반 힘 줄 조직의 일반적인 모양 반짝 되었고 약간 잿 빛 톤 (검은 선) 회사. (B) 모든 확인 된 퇴행 성 조직을 급격히 절제 했다 그리고 다음 방사형 머리 뼈 노출 되었다. (C) 모든 절제 조직을 즉시 버퍼링 인산 염 분에 포함 했다와 주변 단 비 조직 신중 하 게 최대한 빨리 해 부. ECRB: 신 근 피 radialis brevis EDC: 신 근 digitorum 라고도 ECU: 신 근 피 ulnaris 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 확인 퇴행 성 힘 줄의 조직학. (A) 에 H & E 얼룩, 퇴행 성 샘플 측면 염증에서 극성의 손실 콜라겐 번들 무질서 및 건강 한 통제에 비해 세포 수를 증가 했다. (B). Alcian 퇴행 성 힘 줄 proteoglycans 그리고 있다 여러 mucoid 패치와 섬유 (화살표) 사이 그들의 구성 하는 지상 물질 증가 했다 보여 블루 얼룩. (C). 또한, VEGF immunohistochemistry 시연 증가 퇴행 성 힘 줄 샘플 컨트롤 샘플에 비해 혈관 형성에 얼룩. VEGF: 혈관 내 피 성장 요소입니다. 눈금 막대 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : ICC에 의해 tenocyte의 id. 배양된 세포 및 셀 힘 줄 조직에는 ICC에 의해 tenocyte로 확인 되었다. 대부분 세포의 모호크 (녹색) 및 tenomodulin (적색) 현미경 아래 길쭉한 모양으로를 포함 하 여 대표 tenocyte 표식에 대 한 긍정적인 얼룩을 보여주었다. Chondrocyte 부정적인 컨트롤으로 사용 되었다. ICC: Immunocytochemistry. 눈금 막대 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 퇴행 성 tenocyte의 특성. (A, B) 퇴행 성 tenocytes (적색) cellularity에 주목할 만한 증가 함께 더 높은 확산 속도를 했다. (C) 5 유전자 tendinopathy의 개발에 관련 된 퇴행 성 tenocytes에 크게 상승 했다. 진 식 레벨 GAPDH에 대해 정규화 되었다. *: 의미 < 0.05, * *: 의미 < 0.01, 각각. SP: 물질 P. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 그림 1: 힘 줄 조직으로 수확 조직의 조직학 확인. 수확된 조직 IHC 모호크와 tenomodulin 수확된 조직 힘 줄 조직의 적절 한 특성을 했다 있는지 확인 하 여도 분석 했다. IHC: Immunohistochemistry. 눈금 막대 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 그림 2: tendinopathy의 표현 관련 유전자 tenocyte. 걸 식으로 정규화 하는 5 개의 유전자의 성적 퇴행 성 tenocytes에서 크게 상승 했다 있고 그림4와 유사한 동향. 진 식 레벨 말라 의미와에 대해 정규화 되었다 < 0.05와 < 0.01, 각각. SP: 물질 P. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이전 연구의 숫자는 콜라 또는 kartogenin 주입, 실행, 디딜 방 아 등 더 많은26,27다른 절차를 사용 하 여 만성 tendinopathic 동물 모델을 만드는 방법을 보고 있다. 수많은 연구가 동물 모델에 따라 유망한 치료 효과 보여, 비록 인간의 퇴행 성 tenocyte를 사용 하 여 실험 것입니다 중요 한 tendinopathy의 분야에서 치료의 효능을 재생 하기 위하여. 이 문서에서는, 우리는 성공적으로 수확 하 고 일관 되 게 인간의 퇴행 성 tenocytes 문화 프로토콜 설립. 둘 다 힘 줄 조직 수확 하 고 교양된 tenocyte 퇴행 성 힘 줄 및 tenocyte7,28의 일반적인 특성을 보였다.
우리의 경험에서는, 성공적인 조직 수확에 대 한 필수적입니다 자주 퇴행 성 힘 줄과 관련 된 형태학 상 변화를 이해 하 고 정확 하 게 수술 하는 동안 그 영역을 나타냅니다. 퇴행 성 직물은 일반적으로 회색 또는 갈색 색깔 및 조직, 깨지기 쉬운, 얇고 느슨한 짜임새로 무질서. 프로토콜의 포함 및 제외 기준 수확을 하기 전에 이전 치료의 주의 깊은 평가와 엄격 하 게 지켜져야 한다.
조직 크기 또한 성공적인 세포 배양에 대 한 중요 하다. 1 c m3보다 더 많은 수확 하는 것이 좋습니다. 일반적으로, 모든 퇴행 성 영역 제거로 수집 된 조직 양의 것입니다 세포 배양에 대 한 충분. 마지막으로, 우리 모든 실험에서 6 통로에 tenocytes을 사용 하지 않았다. 통로 6까지 우리는 경작된 한 세포 아직 변성의 특성을 했다 다는 것을 믿는다.
우리의 프로토콜에는 여러 가지 장점이 있습니다. 이러한 장점이 포함 환자에 게 전혀 해를 끼치지 때문에 퇴행 성 조직 효율 실험, 매우 건강 한 조직에 대 한 위반으로 윤리에 대 한 충분 한 조직 필요한 금액 이므로 수술 하는 동안 제거 했는데 인간에서 그 병 적인 조직에서 재현성, 수술 중 쉽게 얻어질 수 있다 그리고, 마지막으로, 응용 프로그램 한 번 수술 기술을 쉽게 친숙.
그러나, 우리는 우리의 실험에는 몇 가지 제한이 인정 합니다. 첫째, 수 없습니다 완전히 배제 이전 코르 티 코 스테로이드 또는 혈소판 풍부 혈장 주사의 잔여 효과 비록 우리가 어떤 이전 치료를 받고에서 최소 3 개월을 통과 했다 환자만 포함 합니다. 또한,이 프로토콜에 우리만 수확 ECRB 힘 줄 고 문화 퇴행 성 tenocytes을 사용 하는 이후 ECRB 힘 줄은 아 킬 레 스와 회전 커 프 힘 줄 함께 수술에 대 한 일반적인 tendinopathy 사이트. 더 연구는 다양 한 tendinopathy 사이트 간의 차이에 초점을 맞추고 큰 샘플 크기와 함께 실행 되어야 한다.
결론적으로, 인간의 퇴행 성 tenocytes 획득을 위한이 검증된 프로토콜 테스트 소설 치료 개입 힘 줄 생물학에서 미래 조사에 대 한 유용한 도구를 있을 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 연구는 한국 건강 기술 R & D 프로젝트 통해는 한국 보건 산업 개발 연구소 (진흥원), 사역의 건강 및 복지, 한국에 의해 투자 되었다는에서 교부 금에 의해 지원 되었다 (허가 번호: HI16C1559).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Scalpel | Kisanbio | KS-Q0306-15 | No. 15 |
| Mini-blade | Beaver | 374769 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco | 11995065 | |
| PBS | Gibco | 14190250 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| 50 mM ascorbic acid-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Gibco | 15240062 | |
| 4% formaldehyde | Bio-solution | BP031 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ml | |
| BSA | Rdtech | C0082 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ml | |
| MKX (C-5) | Santa cruz biotechnology | sc-515878 | |
| Tenomodulin (N-14) | Santa cruz biotechnology | sc-49325 | |
| Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| WST-1 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | |
| BrdU Cell Proliferation Assay Kit | Cell Signaling Technology | #6813 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8891 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
| GAPDH | Thermo Fisher Scientific | Hs02786624_g1 | |
| COL3A1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00943809_m1 | |
| ACTA2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00426835_g1 | |
| TAC1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00243225_m1 | |
| TACR1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00185530_m1 | |
| PTGS2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00153133_m1 | |
| ACTB | Thermo Fisher Scientific | Hs99999903_m1 | |
| Cell Strainers (100 µm) | Corning | 352360 | |
| 100mm culture dish | Thermo Fisher Scientific | 8188207 | |
| 8-well Chamber Slide | Thermo Fisher Scientific | 154534 | |
| 96 Well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3596 | |
| Nikon Eclipse 50i Microscope | Nikon | ||
| VERSA max microplate reader | Molecular Devices | ||
| CFX96 Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | ||
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Paraffins | Leica Biosystems | 3801340 | |
| Ethanol | JUNSEI CHEMICAL | 90303-2185 | |
| Hematoxylin | DAKO | CS70030-2 | |
| Eosin | DAKO | CS70130-2 | |
| Alcian blue | DAKO | AR16011-2 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Xylene | JUNSEI CHEMICAL | 25165-0430 | |
| Endogenous peroxidases | DAKO | S200380-2 | |
| Canada balsam | JUNSEI CHEMICAL | 23255-1210 | |
| Microtome Blade | FEATHER | A35 | |
| Slide glass | SUPERIOR | 1000612 | |
| Cover glass | Marienfeld-Superior | 101050 | |
| VEGF | Santa cruz biotechnology | sc-7269 | |
| SPSS Software | IBM | Ver. 18.0 | |
| Multi-purpose Centrifuge | LABOGENE | 1248R |
References
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