Summary
In vitro -användning av degenerativa tenocytes är väsentlig när undersökt effekten av ny behandling på tendinopathy. Men använder de flesta forskningsstudier endast animaliska modellen eller en hälsosam tenocyte. Vi föreslår följande protokoll för att isolera mänskliga degenerativa tenocytes under kirurgi.
Abstract
Tendinopathy, ett smärtsamt tillstånd som utvecklar svar på senan degeneration, är på uppgång i den utvecklade världen på grund av ökad fysisk aktivitet och längre förväntad livslängd. Trots dess ökande prevalens, underliggande patogenesen är fortfarande oklart och behandlingen är vanligtvis symtomatisk. Nyligen har undersöktes många terapeutiska alternativ, inklusive tillväxtfaktorer, stamceller och genterapi, i hopp om att förbättra den helande potensen av degenerativa senan. Majoriteten av dessa studier genomfördes dock endast på djurmodeller eller friska mänskliga tenocytes. Trots några studier med patologiska tenocytes, till bäst av vår kunskap finns det för närvarande inget protokoll som beskriver hur du skaffar mänskliga degenerativa tenocytes. Syftet med denna studie är att beskriva ett standardprotokoll för att förvärva mänskliga degenerativa tenocytes. Inledningsvis var senan vävnaden skördas från en patient med lateral epicondylitis under operation. Sedan togs biopsiprover från extensor carpi radialis brevis senan motsvarande strukturella förändringar som observerats vid tidpunkten för kirurgi. Alla skördade senor föreföll vara tråkig, grå, spröda och edematous, som gjorde dem visuellt skiljer sig från friska. Tenocytes odlade och användes för experiment. Samtidigt hälften av de skördade vävnaderna analyserades histologiskt, och det visades att de delade samma nyckel dragen av tendinopathy (angiofibroblastic dysplasi eller hyperplasi). En sekundär analys av immuncytokemi bekräftade att de odlade cellerna var tenocytes med majoriteten av de celler som har positiva fläckar för mohawk och tenomodulin proteiner. Kvaliteterna av degenerativa naturen av tenocytes bestämdes sedan genom att jämföra cellerna med frisk kontroll med hjälp av en proliferation assay eller qRT-PCR. Den degenerativa tenocyte visas en högre spridning och liknande gen uttrycksmönster av tendinopathy som matchade tidigare rapporter. Sammantaget kan detta nya protokoll ger ett användbart verktyg för framtida studier av tendinopathy.
Introduction
Tendinopathy är en kroniska degenerativa muskuloskeletala tillstånd som utvecklas i olika delar av kroppen. Nyligen, har antalet fall av tendinopathy ökat kraftigt i den utvecklade världen på grund av växande deltagande i fritidsaktiviteter och ökad förväntad livslängd1,2. Tendinopathy orsaken anses vara multifaktoriell och dessa orsaker är ischemi, syre fria radikaler skador, en obalans mellan vasokonstriktor och vasodilaterande innervations, inre mikro-tårar och ändringar till neuro-förordningen3 ,4,5,6,7,8. De flesta behandlingar för tendinopathy endast lindra dess symptom. Dessutom behandlingar utan vävnadsregeneration kräver lång tid för rehabilitering och uppnå ett begränsat svar från skadade senor, som ålägger en klinisk utmaning för läkare9.
Inkompetens av nuvarande behandlingsalternativ tillsammans med avsaknaden av degenerativa Senans förmåga att självläka har bly forskare att intressera sig för att utforska alternativa behandlingsstrategier. Nyligen nya studier rapporterade många lovande resultat för att förbättra helande effekten av tendinopathy senor med tillväxtfaktorer, stem cell baserad terapi och gene therapy10,11,12.
Genom en litteraturstudie, Vi hittade att de inblandade studierna kan delas in i två kategorier utifrån deras analys material: djur modeller som en råtta, en mus eller en kanin; och mänskliga modeller. När det gäller animaliska modellen, för närvarande finns det två populära tekniker för att generera tendinopathy: kemisk inducering av skada eller mekanisk överbelastning modellen. Varje djurmodell begränsades dock reproducera den komplexa mänskliga tendinopathy patologi13,14.
De flesta tidningar använder mänskliga prover analyserades histologiskt eller utförs av in vitro- experiment baserat på en hälsosam mänskliga tenocyte i stället för en degenerativ tenocyte15,16,17,18 , 19 , 20 , 21. endast ett fåtal tidningar rapporterade att de använde en mänsklig degenerativa tenocyte, men de inte beskriva i detalj det protokoll som används för att få den degenerativa tenocyte från den mänskliga22,23. I detta sammanhang bör det noteras att framgångsrika resultat från antingen animaliskt modellen eller den friska vävnaden/tenocyte nödvändigtvis inte kan förutsäga mänsklig effekt eller effektiv dosering eftersom senan degeneration är en komplicerad process och patogenesen är fortfarande inte helt klarlagt.
Sammantaget är det nödvändigt att beskriva standardprotokollet för att erhålla den degenerativa tenocyte från mänsklig vävnad utan att orsaka negativa effekter för givaren. Denna artikel beskriver ett protokoll på hur förvärva den mänskliga degenerativa tenocyte. För att validera protokollet, analyserades skördade vävnader histologiskt. Sedan bekräftades odlade cellen som den degenerativa tenocyte med hjälp av immuncytokemi (ICC), en kvantitativ realtid-polymeras-kedjereaktion (qRT-PCR) och en lönsamhet analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet har genomförts i enlighet med Helsingforsdeklarationen och protokollet godkändes av den institutionella Review Board på CHA Emma Medical Center.
1. degenerativa senan vävnad skörd från patienten
- Diagnostisera lateral epikondylit genom att ta en anamnes och använda fysisk undersökning fynd: ömhet över tendinous beskärningen nära den laterala epikondylen; smärta frammanade av motstod förlängning av handleden.
- Använda de följande inklusionskriterierna: över 18 års ålder; en historia av lateral epikondylit i minst sex månader. terapiresistent för icke-operativ behandling. minst tre månader har gått sedan injektion av kortikosteroid, trombocyter rika plasma eller botulinumtoxin
- Utesluta följande: gravida kvinnor; patienter med en historia av halsryggen sjukdom, armbåge artrit, reumatologiska sjukdomar, kirurgi runt armbågen och nerv brottsprovokation syndrom; patienter som vägrar att donera vävnad.
-
Kirurgisk teknik
Obs: Se figur 124.- Efter narkos av isofluran och endotrakeal intubering, lägga armen på bordet och applicera ett tryckförband. Applicera sedan betadine agent på hela armen och drapera med ett aseptiska kirurgiska.
- Exponera laterala armbågen genom en 3 – 5 cm snitt med nr 15 kirurgisk skalpell bladet bara anteromedial till den laterala epikondylen och proximala till nivån för gemensamt.
- Visuellt identifiera extensor carpi radialis longus (ECRL) och extensor aponeurosis gränssnittet och göra en uppdelning snitt 2-3 mm i djupet mellan ECRL och extensor aponeurosis med nr 15 kirurgisk skalpell blad på identifierade gränssnittet.
- Extrahera ECRL anteriorly, som kommer att föra patologisk extensor carpi radialis longus brevis (ECRB) ursprung nedan i direkt utsikt.
- Visuellt identifiera patologiska degenerativ vävnad genom dess karakteristiska tråkig gråaktig färg och oftast edematous och spröda vävnad.
- Efter identifiering, noggrant resect alla degenerativ vävnad kraftigt med nr 15 kirurgisk skalpell och mini-blad.
- Bädda in den opererande vävnaden (ca 1 cm3) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) omedelbart och ta bort alla de omgivande vävnaden utom senan vävnad försiktigt till ca 10 mL PBS så snart som möjligt.
- I fall med beniga exostos på den laterala epikondylen, ta bort exostos med hjälp av en rongeur och släta ut det med en rasp. Göra flera borra hål (diameter 1,6 mm, ca 6 – 8 hål) i anterolaterala condyle att förbättra vaskulär utbudet. Detta är valfritt.
- Nära såret lager för lager med icke-resorberbar sutur material.
-
Friska kontroll tenocyte
- Få friska tenocytes från återstående senan av auto-hamstring eller auto-patella senan under främre korsbandsrekonstruktion, och använda den som kontroll för följande experiment25.
Anmärkning: Antalet prover som används i denna studie fanns tre i varje grupp.
- Få friska tenocytes från återstående senan av auto-hamstring eller auto-patella senan under främre korsbandsrekonstruktion, och använda den som kontroll för följande experiment25.
2. histologi
- Lagra ungefär hälften av den skördade vävnaden i neutral buffrad 10% formalin i en kemisk dragskåp eller motsvarande.
- Bädda in vävnaden i ett paraffin-block (4 – 5 mL) och avsnitt det i 4 – 5 µm avsnitt coronally.
-
Fläcken sektioner från kontroll och degenerativa senan med Hematoxylin och Eosin fläcken (H & E) och Alcian blå fläck vid pH 2.5. Utföra H & E färgning i en automatiserad fläcken maskin enligt följande.
- Deparaffinize med xylen (3 gånger, 5 min, respektive).
- Återfukta från graderade alkoholer till vatten (100% alkohol, 4 min 100% alkohol, 3 min 95% alkohol, 2 min; 70% alkohol, 1 min; vatten, 2 min).
- Fläcken i Hematoxylin för 5 min. Tvätta väl i vatten i 2 min.
- Differentiera i 1% syra alkohol (1% HCl i 70% alkohol) för 3 s. Tvätta väl i vatten för 3 min.
- Neutralisera HCl genom att doppa i en 0,5% ammoniak för 10 s, följt av en 3 min vatten tvätta.
- Fläcken i Eosion för 5 min.
- Torkar genom alkoholer (80% alkohol, 30 s; 95% alkohol, 1 min; 100% alkohol 1 min, 100% alkohol 2 min).
- Tydlig i xylen (3 gånger, 2 min, 2 min och 3 min, respektive).
- Montera med en cover bild.
-
Utföra immunohistochemitry (IHC) med hjälp av Bond Polymer förfina upptäckten kit enligt tillverkarens anvisningar med smärre ändringar.
- Efter avparaffinering med xylen, utföra en antigen retrieval proceduren med Bond epitop hämtning lösning under 30 minuter vid 100 ° C. Bond epitop hämtning lösningen innehåller en baserat citratbuffert och tensid (1 L, pH 5,9 – 6,1).
- Släcka endogena peroxidaser av ruvning vävnaden med väteperoxid för 5 min.
- Inkubera avsnitten för 15 min vid en omgivande temperatur (21-22 ° C) med primära antikroppar mot vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF) (1: 200), tenomodulin (1: 200) eller mohawk (1: 200).
- Utföra sekundär antikropp taggning med biotin-fri polymera pepparrotperoxidas-linker antikropp konjugerat system.
- Använd sekundära kanin anti mus IgG i 10% (v/v) djur serum i Tris-buffrad saline/0.09% 2-metyl-4-isotiazolin-3-on lösning att lokalisera musantikroppar.
- Använda polymer anti-kanin som Poly-HRP-IgG (< 25 µg/mL) innehållande 10% (v/v) djur serum i Tris-buffrad saline/0.09% att lokalisera kanin antikroppar.
- Använd 3, 3'-Diaminobenzidin tetrahydrochloride hydrat i en stabilisator lösning att visualisera anläggningen via en brun fällning.
- Motfärg med < 0,1% hematoxylin (blå) att visualisera cellkärna.
- Iaktta de bilder som färgas med H & E, Alcian blå fläckar och IHC för VEGF, tenomodulin och mohawk under ljusmikroskop och erhålla representativa mikroskopiska bilder av varje bild under en hög effekt fält (X 400).
3. Tenocyte kultur
-
Vävnad förberedelse
- Förbereda senan provet genom att ta bort alla de omgivande vävnaden noga med mikro-sax och pincett.
- Tvätta med PBS och finhacka i mindre bitar (om 1 mm3 eller mindre).
- Smälta vävnad för 1 h i 30 mL Dulbeccos modifierade örnens Medium (DMEM) kompletteras med 30 mg/mL kollagenas II vid 37 ° C.
- Passera en 100 µm cell SIL celler.
- Inaktivera kollagenas II genom att tillsätta 1 mL fetalt bovint serum (FBS).
- Centrifugera vid 196 x g i 5 min.
-
Cellkultur
- Seed 3 x 105 celler i en 100 mm skål och kultur med DMEM kompletteras med 10% FBS och 1% antibiotika-Antimycotic lösning vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator för 1 vecka.
- Ändra odlingssubstratet varje tre dagar tills 80% sammanflödet inträffar. Kultur både frisk kontroll och degenerativa cellprover tills passage fyra och använda för experiment.
4. immuncytokemi (ICC)
- Över 200 µL av odlade cell (2 x 105 celler) till de åtta brunnarna i en kammare bild och växa cellerna till sammanflödet med tillägg av färsk media för 1 dag.
- Tvätta cellerna med PBS och fixa med 500 µL per brunn formaldehyd på 4%.
- Inkubera i bilderna med 0,5% Triton x-100 i PBS för 10 min för permeabilisering av membran.
- Blockera i PBS med 1% bovint serumalbumin och 0,05% TWEEN-20 för mohawk och tenomodulin, respektive.
- Inkubera i mörkret med musen anti mohawk monoklonal antikropp (spädning 1: 100) och get-anti-tenomodulin antikropp (1: 100 utspädning) vid 4 ° C över natten.
- Inkubera sekundära antikroppar (Alexa 555-anti Get (1: 200) för tenomodulin; Alexa 488-anti mus (1: 200) för mohawk) i mörkret för 1 h i rumstemperatur.
- Montera med 0,5 µL av en fluorescens monteringsmedium.
- Analysera med fluorescens Mikroskop (X 400).
5. proliferation Assay
-
Mäta cell förmåga med vattenlösliga tetrazolium (WST) -1.
- Utsäde både hälsosam och degenerativa celler till 96 plattor på en densitet på 2 x 103 celler per brunn för 24, 72 och 120 h.
- Efter inkubation, tillsätt 10 µL 10% WST-1 lösningen till varje brunn.
- Inkubera plattorna för 3 h vid 37 ° C i 5% CO2.
- Mäta de optisk densiteterna vid 450 nm med en microplate reader. Ta avläsningar minst tre gånger vid alla tidpunkter för varje prov.
-
Åtgärd cellulär DNA belopp med BrdU-analys.
- Utsäde båda friska och degenerativa cell till 96 plattor väl på en densitet på 2 x 103 celler per brunn för 24, 72 och 120 h.
- Efter inkubation, tillsätt 10 µL 10% BrdU lösning till varje brunn.
- Inkubera plattorna för 3 h vid 37 ° C i 5% CO2.
- Tillsätt 100 µL per brunn av fastställande/Denaturing lösningen (60 – 70% etanol, 0,1 – 0,5% natriumhydroxid) och hålla plattan i rumstemperatur i 30 min.
- Tillsätt 100 µL per brunn förberett 1 x upptäckt antikropp lösning och hålla plattan i rumstemperatur för 1 h.
- Ta bort lösningen och tvätta tre gånger med 1 x tvättbuffert.
- Tillsätt 100 µL per brunn förberett 1 x HRP-konjugerad sekundär antikropp lösning och hålla plattan i rumstemperatur i 30 min.
- Avlägsna plattan lösningen och tvätta tre gånger med 1 x tvättbuffert.
- Tillsätt 100 µL av 50% TMB substrat.
- Inkubera i 30 min i rumstemperatur.
- Tillsätt 100 µL stopplösning.
- Mäta de optisk densiteterna vid 450 nm med en microplate reader.
Obs: Ta avläsningar minst tre gånger vid alla tidpunkter för varje prov.
6. statistisk analys
- Samla in och analysera data med hjälp av SPSS.
- Skildra data av medelvärde ± standardavvikelsen för medelvärdet.
- Användning Mann Whitney U test.
- Överväga skillnader statistiskt signifikant om p -värdet är mindre än 0,05 (p < 0,05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Histologiska analyser visade att de skördade vävnaden från laterala epikondylit hade kännetecknen av en tendinopathic senan. H & E avsnitt av tendinopathy degenerativa senan avslöjade ett oorganiserat kollagen paket med en förlust av polaritet och fina raka, starkt packade parallellt fiber strukturer. Histologiska tecken tyder på degeneration som högre cellularitet och förstorade kärnor utan formen typiska spindeln var vanliga i prover. Dessutom kollagen buntar av degenererade senan var relativt svag eosin färgad med H & E men var positivt färgas av Alcian blue som indikerar ökad proteoglykaner och glykosaminoglykaner ämne.
I alla fall blodkärl var ökat i antal och aggregat ockuperar utrymmen inbäddad mellan fibrerna var jämfört med normala slit-liknande blodkärl. I IHC färgningen visade celler av degenererade senor cytoplasmiska granulat positiv reaktion till VEGF i jämförelse med den negativa reaktionen av kontroll och kära. Sammantaget dessa fynd bekräftade att de skördade vävnaderna från laterala epikondylit var degenerativa vävnader och lämplig för degenerativa tenocyte kulturen (se figur 2).
De odlade cellerna bekräftades som tenocytes av ICC och skördade vävnader bekräftades av IHC som senan vävnad. De flesta odlade celler och celler i senan vävnad visade en positiv fläck på representativa tenocyte markörer känd som mohawk (grön) proteiner och tenomodulin (röd) proteiner med en långsträckt utseende under mikroskopi (se figur 3). Skördade vävnader hade också, den positiva färgning för mohawk proteiner och tenomodulin proteiner immunohistochemically (se kompletterande Figur1). Dessa föreslog att de skördade vävnaderna var komponerad av senan vävnaden.
Odlade tenocytes från skördade vävnaden i lateral epicondylitis hade de karakteristiska dragen som motsvarar tendinopathy. Såväl friska som degenerativa tenocytes odlades i 4 dagar på samma villkor. Vid varje tidpunkt, var spridning mätt av BrdU assay och WST-1 analys. Resultaten visade att andelen spridning av degenerativa cellerna var betydligt högre än de kontroller som tidigare rapporterats (p < 0,05) (se figur 4A).
Fem gener som är kända för att vara uppreglerat i degenerativa senan analyserades av qRT-PCR. Uttryck av gener, COL3A1, ACTA2, TAC1 (SP), TAC-receptorn 1, och PTGS2 (COX2) höjdes mer påtagligt i de odlade cellerna från degenerativa senan än i cellerna från friska. De relativa uttrycken för alla gener visas i figur 4B och kompletterande figur 2.
Figur 1 : Kirurgiska foto av degenerativa senan skörden. (A) efter huden snitt och dissektion, patologisk degenerativ vävnad på det gemensamma extensor ursprunget var utsatt, visar en karakteristisk Matt-gråaktiga färg med edematous förändring (röda linjen). Däremot var det allmänna utseendet på normala senan vävnad blanka och fast med en lite gråaktig ton (svart linje). (B) alla identifierade degenerativa vävnader var resected kraftigt och sedan radiellt huvud benet var utsatt. (C) alla opererande vävnader var inbäddade i den fosfatbuffrad saltlösning omedelbart och den omgivande icke-tendinous vävnaden var noggrant dissekeras så snart som möjligt. ECRB: extensor carpi radialis brevis. EDC: extensor digitorum communis. ECU: extensor carpi ulnaris. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Bekräftelse av degenerativa senan histologiskt. (A) i the H & E färgning, degenerativa prover från den laterala epikondylit hade oorganiserat kollagen buntar med förlust av polaritet och ökat cellantal jämfört med den friska kontrollgruppen. (B). Alcian blå färgning visade att degenerativa senan hade ökat mark ämne bestående av proteoglykaner och glykosaminoglykaner med flera slemmig patchar och vakuoler mellan fibrer (pil). (C). Dessutom ökar VEGF immunohistokemi visade färgning i bildandet av blodkärl i degenerativa senan prover jämfört med kontrollproverna. VEGF: Vaskulär endotelial tillväxtfaktor. Skalstapeln = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3 : Identifiering av tenocyte av ICC. Odlade celler och celler i senan vävnad har bekräftats som tenocyte av ICC. De flesta av cellerna visade positiva fläcken för den representativa tenocyte markör, inklusive mohawk (grön) och tenomodulin (röd) med långsträckt utseende under mikroskopi. Chondrocyte användes som den negativa kontrollen. ICC: immuncytokemi. Skalstapeln = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4: Kännetecknar degenerativa tenocyte. (A, B) Degenerativa tenocytes (röd) hade en högre spridning med en märkbar ökning i cellularitet. (C), fem gener som är kända för att vara med i utvecklingen av tendinopathy var signifikant förhöjda i den degenerativa tenocytes. Gen uttryck nivåer var normaliserade mot GAPDH. *: menar < 0,05, **: menar < 0,01, respektive. SP: substans P. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Kompletterande Figur1: histologisk bekräftelse av skördade vävnad som senan vävnaden. Skördade vävnaden var också analyseras av IHC för mohawk och tenomodulin för att avgöra huruvida de skördade vävnaden hade adekvat kännetecknen av senan vävnad. IHC: immunohistokemi. Skalstapeln = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 2: uttryck för tendinopathy relaterade gener i tenocyte. Avskrifter av fem gener normaliserade av aktin uttryck var förhöjt i den degenerativa tenocytes och har liknande trender till figur 4. Gen uttryck nivåer var normaliserade mot aktin med ett < 0,05 och < 0,01, respektive. SP: substans P. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ett antal tidigare studier har rapporterat hur du skapar kronisk tendinopathic djurmodeller med olika procedurer som kollagenas eller kartogenin injektion, löpband kör och mer26,27. Även om många studier visade lovande terapeutiska effekter utifrån dessa djurmodeller, skulle experiment med den mänskliga degenerativa tenocyte vara avgörande i fältet av tendinopathy för att återskapa effekten av behandling. I denna artikel etablerat vi ett protokoll för att framgångsrikt skörda och kultur mänskliga degenerativa tenocytes konsekvent. Båda skördats senan vävnad och den odlade tenocyte visade de gemensamma kännetecknen för den degenerativa senan och tenocyte7,28.
I vår erfarenhet är för framgångsrik vävnad skörd, det viktigt att förstå de morfologiska förändringar som ofta förknippas med degenerativa senan och att exakt avgränsa området under operation. Degenerativ vävnad är vanligen grå eller brun i färgen och vävnad är tunna, sköra och oorganiserat med lös konsistens. Uteslutnings- och urvalskriterier i protokollet bör hållas strikt med noggrann utvärdering av tidigare behandlingar innan skörd.
Vävnaden storlek är också viktigt för en framgångsrik cell-kultur. Vi rekommenderar att skörda mer än 1 cm3. Vanligtvis, så länge alla degenerativa området avlägsnas, skulle mängden insamlade vävnad räcka för cellkulturen. Slutligen, vi använde inte tenocytes över passage sex i alla experiment. Till passagen sex tror vi att de odlade cellerna fortfarande hade kännetecknen av degeneration.
Våra protokoll har flera fördelar. Dessa fördelar omfattar ingen skada för patienten eftersom degenerativ vävnad var tänkt att tas bort under operationen, effektivitet eftersom mängden vävnad som krävs är tillräckligt för experimentet, etiskt på grund av någon överträdelse av friska vävnader, reproducerbarhet i de patologiska vävnaderna från människa lätt kan erhållas under operation, och, slutligen, användarvänlighet ansökan en gång kirurgiska tekniker bekanta.
Vi erkänner dock att vårt experiment har flera begränsningar. Först, vi kan inte helt utesluta kvarleva effekten av tidigare kortikosteroid eller trombocytantal rika plasma injektion trots att vi inkluderat endast patienter som hade passerat minst tre månader från att ta emot någon tidigare behandling. Dessutom i detta protokoll, vi bara skördas ECRB senan och använt det till kultur degenerativa tenocytes sedan ECRB senan är en vanlig tendinopathy plats för kirurgi tillsammans med Achilles och rotatorkuff senor. Ytterligare studier bör utföras med en större urvalsstorlek med fokus på eventuella skillnader mellan olika tendinopathy platser.
Sammanfattningsvis kommer detta validerade protokoll för att förvärva mänskliga degenerativa tenocytes vara ett användbart verktyg för framtida utredningar i senan biologi och testa nya terapeutiska interventioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av ett bidrag från Korea hälsa teknik R & D projekt genom den Korea hälsa industri utveckling Institute (KHIDI), som finansierades av ministeriet för hälsa & välfärd, Sydkorea (bevilja nummer: HI16C1559).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Scalpel | Kisanbio | KS-Q0306-15 | No. 15 |
| Mini-blade | Beaver | 374769 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco | 11995065 | |
| PBS | Gibco | 14190250 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| 50 mM ascorbic acid-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Gibco | 15240062 | |
| 4% formaldehyde | Bio-solution | BP031 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ml | |
| BSA | Rdtech | C0082 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ml | |
| MKX (C-5) | Santa cruz biotechnology | sc-515878 | |
| Tenomodulin (N-14) | Santa cruz biotechnology | sc-49325 | |
| Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| WST-1 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | |
| BrdU Cell Proliferation Assay Kit | Cell Signaling Technology | #6813 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8891 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
| GAPDH | Thermo Fisher Scientific | Hs02786624_g1 | |
| COL3A1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00943809_m1 | |
| ACTA2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00426835_g1 | |
| TAC1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00243225_m1 | |
| TACR1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00185530_m1 | |
| PTGS2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00153133_m1 | |
| ACTB | Thermo Fisher Scientific | Hs99999903_m1 | |
| Cell Strainers (100 µm) | Corning | 352360 | |
| 100mm culture dish | Thermo Fisher Scientific | 8188207 | |
| 8-well Chamber Slide | Thermo Fisher Scientific | 154534 | |
| 96 Well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3596 | |
| Nikon Eclipse 50i Microscope | Nikon | ||
| VERSA max microplate reader | Molecular Devices | ||
| CFX96 Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | ||
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Paraffins | Leica Biosystems | 3801340 | |
| Ethanol | JUNSEI CHEMICAL | 90303-2185 | |
| Hematoxylin | DAKO | CS70030-2 | |
| Eosin | DAKO | CS70130-2 | |
| Alcian blue | DAKO | AR16011-2 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Xylene | JUNSEI CHEMICAL | 25165-0430 | |
| Endogenous peroxidases | DAKO | S200380-2 | |
| Canada balsam | JUNSEI CHEMICAL | 23255-1210 | |
| Microtome Blade | FEATHER | A35 | |
| Slide glass | SUPERIOR | 1000612 | |
| Cover glass | Marienfeld-Superior | 101050 | |
| VEGF | Santa cruz biotechnology | sc-7269 | |
| SPSS Software | IBM | Ver. 18.0 | |
| Multi-purpose Centrifuge | LABOGENE | 1248R |
References
- Ackermann, P. W., Renstrom, P. Tendinopathy in sport. Sports Health. 4 (3), 193-201 (2012).
- Maffulli, N., Wong, J., Almekinders, L. C.
- Lui, P. P., Chan, L. S., Fu, S. C., Chan, K. M. Expression of sensory neuropeptides in tendon is associated with failed healing and activity-related tendon pain in collagenase-induced tendon injury. American Journal of Sports Medicine. 38 (4), 757-764 (2010).
- Han, S. H., et al. Effects of corticosteroid on the expressions of neuropeptide and cytokine mRNA and on tenocyte viability in lateral epicondylitis. Journal of Inflammation (London). 9 (1), 40 (2012).
- Uchio, Y., et al. Expression of neuropeptides and cytokines at the extensor carpi radialis brevis muscle origin. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 11 (6), 570-575 (2002).
- Lieber, R. L., Loren, G. J., Friden, J. In vivo measurement of human wrist extensor muscle sarcomere length changes. Journal of Neurophysiology. 71 (3), 874-881 (1994).
- Regan, W., Wold, L. E., Coonrad, R., Morrey, B. F. Microscopic histopathology of chronic refractory lateral epicondylitis. American Journal of Sports Medicine. 20 (6), 746-749 (1992).
- Sharma, P., Maffulli, N. Tendon injury and tendinopathy: healing and repair. Journal of Bone and Joint Surgery American volume. 87 (1), 187-202 (2005).
- Lui, P. P. Stem cell technology for tendon regeneration: current status, challenges, and future research directions. Stem Cells Cloning. 8, 163-174 (2015).
- Dahlgren, L. A., van der Meulen, M. C., Bertram, J. E., Starrak, G. S., Nixon, A. J. Insulin-like growth factor-I improves cellular and molecular aspects of healing in a collagenase-induced model of flexor tendinitis. Journal of Orthopedic Research. 20 (5), 910-919 (2002).
- Schnabel, L. V., et al. Mesenchymal stem cells and insulin-like growth factor-I gene-enhanced mesenchymal stem cells improve structural aspects of healing in equine flexor digitorum superficialis tendons. Journal of Orthopedic Research. 27 (10), 1392-1398 (2009).
- Durgam, S. S., Stewart, A. A., Sivaguru, M., Wagoner Johnson, A. J., Stewart, M. C. Tendon-derived progenitor cells improve healing of collagenase-induced flexor tendinitis. Journal of Orthopedic Research. 34 (12), 2162-2171 (2016).
- Titan, A., Andarawis-Puri, N. Tendinopathy: Investigating the Intersection of Clinical and Animal Research to Identify Progress and Hurdles in the Field. Journal of Bone and Joint Surgery Review. 4 (10), (2016).
- Dirks, R. C., Warden, S. J.
- de Mos, M., et al. Can platelet-rich plasma enhance tendon repair? A cell culture study. American Journal of Sports Medicine. 36 (6), 1171-1178 (2008).
- Scherb, M. B., Han, S. H., Courneya, J. P., Guyton, G. P., Schon, L. C. Effect of bupivacaine on cultured tenocytes. Orthopedics. 32 (1), 26 (2009).
- Wong, M. W., et al. Effect of dexamethasone on cultured human tenocytes and its reversibility by platelet-derived growth factor. Journal of Bone and Joint Surgery American Volume. 85 (10), 1914-1920 (2003).
- Tempfer, H., et al. Effects of crystalline glucocorticoid triamcinolone acetonide on cultered human supraspinatus tendon cells. Acta Orthopaedics. 80 (3), 357-362 (2009).
- Menon, A., et al. New insights in extracellular matrix remodeling and collagen turnover related pathways in cultured human tenocytes after ciprofloxacin administration. Muscles Ligaments Tendons J. 3 (3), 122-131 (2013).
- Backman, L. J., Fong, G., Andersson, G., Scott, A., Danielson, P. Substance P is a mechanoresponsive, autocrine regulator of human tenocyte proliferation. PLoS One. 6 (11), 27209 (2011).
- Backman, L. J., Eriksson, D. E., Danielson, P. Substance P reduces TNF-alpha-induced apoptosis in human tenocytes through NK-1 receptor stimulation. Britich Journal of Sports Medicine. 48 (19), 1414-1420 (2014).
- Rolf, C. G., Fu, B. S., Pau, A., Wang, W., Chan, B. Increased cell proliferation and associated expression of PDGFRbeta causing hypercellularity in patellar tendinosis. Rheumatology (Oxford). 40 (3), 256-261 (2001).
- Hoppe, S., et al. Tenocytes of chronic rotator cuff tendon tears can be stimulated by platelet-released growth factors. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 22 (3), 340-349 (2013).
- Schipper, O. N., Dunn, J. H., Ochiai, D. H., Donovan, J. S., Nirschl, R. P. Nirschl surgical technique for concomitant lateral and medial elbow tendinosis: a retrospective review of 53 elbows with a mean follow-up of 11.7 years. American Journal of Sports Medicine. 39 (5), 972-976 (2011).
- Cook, J. L., Feller, J. A., Bonar, S. F., Khan, K. M. Abnormal tenocyte morphology is more prevalent than collagen disruption in asymptomatic athletes' patellar tendons. Journal of Orthopedic Research. 22 (2), 334-338 (2004).
- Yuan, T., et al. Creating an Animal Model of Tendinopathy by Inducing Chondrogenic Differentiation with Kartogenin. PLoS One. 11 (2), 0148557 (2016).
- Lui, P. P., Maffulli, N., Rolf, C., Smith, R. K. What are the validated animal models for tendinopathy. Scandinavian Journal of Medical Scientific Sports. 21 (1), 3-17 (2011).
- Wilhelm, A. Lateral epicondylitis review and current concepts. Journal of Hand Surgery American Volume. 34 (7), author reply 1359-1360 1359-1360 (2009).
