Summary
In-vitro- Verwendung von degenerativen Tenocytes ist wichtig, wenn die Wirksamkeit der neuartigen Behandlung auf sehnenerkrankung untersucht. Jedoch verwenden die meisten Studien nur das Tiermodell oder eine gesunde Tenocyte. Wir schlagen das folgende Protokoll um menschlichen degenerativen Tenocytes während der Operation zu isolieren.
Abstract
Sehnenerkrankung, eine schmerzhafte Erkrankung, die in Reaktion auf Degeneration der Sehne, entwickelt ist auf dem Vormarsch in der entwickelten Welt aufgrund steigender körperlicher Aktivität und längere Lebenserwartung. Trotz seiner zunehmenden Verbreitung die zugrunde liegende Pathogenese ist noch unklar, und die Behandlung ist in der Regel symptomatisch. Vor kurzem wurden zahlreiche therapeutische Optionen, einschließlich Wachstumsfaktoren, Stammzellen und Gentherapie, untersucht, in der Hoffnung auf Verbesserung der heilenden Potenz der degenerativen Sehne. Die meisten dieser Studien wurden jedoch nur auf Tiermodellen oder gesunde menschliche Tenocytes durchgeführt. Obwohl einige Studien mit pathologischen Tenocytes nach bestem Wissen und gewissen gibt es derzeit kein Protokoll beschreibt, wie menschlichen degenerativen Tenocytes zu erhalten. Das Ziel dieser Studie ist es, ein Standardprotokoll für den Erwerb der menschlichen degenerativen Tenocytes beschreiben. Zunächst war die Sehne Gewebe während der Operation eines Patienten mit seitlichen Epicondylitis geerntet. Dann wurden die Beinstrecker Carpi Radialis Brevis Sehne entsprechend zu strukturellen Veränderungen, die zum Zeitpunkt der Operation beobachtet Biopsie Proben entnommen. Aller dem geernteten sehnen erschien stumpf, grau, brüchig, und ödematös, was sie visuell unterscheidbar von den gesunden machte. Tenocytes wurden kultiviert und für Experimente verwendet. Unterdessen wurden die Hälfte der geernteten Gewebe histologisch untersucht, und es zeigte sich, dass sie die gleichen Hauptmerkmale der sehnenerkrankung (Angiofibroblastic Dysplasie oder Hyperplasie) geteilt. Eine Sekundäranalyse von Immunocytochemistry bestätigt, dass die kultivierten Zellen Tenocytes mit der Mehrheit der Zellen mit positiven Flecken für Mohawk und Tenomodulin Proteine. Die Eigenschaften der degenerativen Natur des Tenocytes wurden dann durch einen Vergleich der Zellen mit dem gesund-Steuerelement mit einer Verbreitung Assay oder qRT-PCR bestimmt. Die degenerativen Tenocyte angezeigt eine höhere Vermehrungsrate und ähnliche Gen Expressionsmuster von sehnenerkrankung, die vorherigen Berichte abgestimmt. Alles in allem könnte dieses neue Protokoll ein nützliches Werkzeug für zukünftige Studien der sehnenerkrankung bieten.
Introduction
Sehnenerkrankung ist eine chronische, degenerative, Muskel-Skelett-Erkrankung, die in verschiedenen Teilen des Körpers entwickelt. Vor kurzem, ist die Zahl der Fälle von sehnenerkrankung in der entwickelten Welt aufgrund der zunehmenden Teilnahme an Freizeitsport und gestiegene Lebenserwartung1,2stark gestiegen. Die Ursache der sehnenerkrankung gilt als multifaktoriell und diese Ursachen sind Ischämie, Sauerstoff freie Radikale Verletzungen, ein Ungleichgewicht zwischen Vasokonstriktor und gefäßerweiternde innervierungen, internen Mikro-Tränen und Änderungen an Neuro-Verordnung3 ,4,5,6,7,8. Die meisten Behandlungen für sehnenerkrankung nur lindern die Symptome. Darüber hinaus Behandlungen ohne Geweberegeneration erfordern eine lange Zeit für die Rehabilitation und erzielen eine begrenzte Antwort von verletzten sehnen, die eine klinische Herausforderung für Ärzte9aufdrängt.
Die Unfähigkeit der aktuellen Behandlungsmöglichkeiten zusammen mit der mangelnden Fähigkeit der degenerativen Sehne zu heilen hat Blei Forscher, Interesse an der Erforschung alternativer Behandlungsstrategien zu nehmen. Vor kurzem neue Studien berichteten viele vielversprechende Ergebnisse für die Verbesserung der der heilenden Wirkung der sehnenerkrankung Spannglieder mit Wachstumsfaktoren, Stammzellen basierte Therapie und Gen-Therapie10,11,12.
Durch eine Literaturstudie, wir fanden, dass die beteiligten Studien in zwei Kategorien, basierend auf der Analyse von Materialien unterteilt werden können: Tiermodelle wie eine Ratte, eine Maus oder ein Kaninchen; und menschliche Modelle. Im Hinblick auf das Tiermodell, derzeit gibt es zwei beliebte Techniken führen zu generieren: chemische Induktion von Verletzungen oder mechanische Überlastung des Modells. Allerdings war jedes Tiermodell begrenzt, bei der Reproduktion der komplexe menschliche sehnenerkrankung Pathologie13,14.
Die meisten Zeitungen mit humanen Proben wurden histologisch untersucht oder die in-vitro- Experiment basiert auf einer gesunden menschlichen Tenocyte statt einer degenerativen Tenocyte15,16,17,18 , 19 , 20 , 21. nur ein paar Zeitungen berichteten, dass sie einen menschlichen degenerativen Tenocyte verwendet, aber sie nicht im Detail das Protokoll verwendet beschreiben, um die degenerativen Tenocyte aus der menschlichen22,23. In diesem Zusammenhang ist anzumerken, dass erfolgreiche Ergebnisse aus dem Tiermodell oder das gesunde Gewebe/Tenocyte nicht unbedingt voraussagen können, menschliche Wirksamkeit oder wirksame Dosierung weil Sehne Degeneration ein komplizierter Prozess ist und die Pathogenese ist noch nicht vollständig verstanden.
Gemeinsam, ist es notwendig, das standard-Protokoll für den Erhalt der degenerativen Tenocyte aus menschlichem Gewebe ohne Nebenwirkungen für den Spender zu beschreiben. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll darüber, wie die menschlichen degenerativen Tenocyte zu erwerben. Um das Protokoll zu überprüfen, wurden die geernteten Gewebe histologisch untersucht. Dann wurde die kultivierten Zellen als degenerative Tenocyte bestätigt, mit Immunocytochemistry (ICC), eine quantitative Real-Time-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) und eine Rentabilität-Assay.
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Protocol
Das Protokoll wurde im Einklang mit der Deklaration von Helsinki und das Protokoll von der Institutional Review Board am CHA Bundang Medical Center genehmigt wurde.
1. degenerative Sehne Gewebe Ernte vom Patienten
- Laterale Epicondylitis zu diagnostizieren, indem unter eine Anamnese und körperliche Untersuchung Befunde mit: Zärtlichkeit über die Sehnige Ursprung in der Nähe der seitlichen Epicondylus; Schmerzen, hervorgerufen durch widerstanden Erweiterung des Handgelenk.
- Verwenden Sie die folgenden Einschlusskriterien: über 18 Jahre alt; eine Geschichte der laterale Epicondylitis für ein Minimum von sechs Monaten; widerspenstigen für nicht-operativen Behandlung; mindestens drei Monate vergangen seit Injektion von Kortikosteroiden, Platelet rich Plasma oder Botulinumtoxin (Botox)
- Ausschließen folgender: schwangere Frauen; Patienten mit einer Geschichte der Halswirbelsäule Krankheit, Ellenbogen Arthritis, rheumatologic Krankheit, Operation um Ellenbogen und Nerv Entrapment-Syndrom; Patienten, die sich weigern, Gewebe zu spenden.
-
OP-Technik
Hinweis: Siehe Abbildung 1-24.- Legen Sie nach allgemeiner Anästhesie mit Isofluran und endotracheale Intubation den Arm auf den Tisch und wenden Sie eine blutsperre. Dann bewerben Sie Betadine Agent auf den ganzen Arm und drapierung mit einem aseptischen op.
- Setzen Sie den seitlichen Ellenbogen durch einen Schnitt von 3 – 5 cm mit Nr. 15 chirurgischen Skalpell Klinge nur Anteromedial an der seitlichen Epicondylus und proximalen auf die Ebene des Gelenks.
- Visuell erkennen Sie Beinstrecker Carpi Radialis Longus (ECRL) und Beinstrecker Aponeurose Schnittstelle und machen Sie einen Spaltung Schnitt 2 – 3 mm in der Tiefe zwischen der ECRL und Beinstrecker Aponeurose mit Nr. 15 chirurgischen Skalpellklinge an der identifizierten Schnittstelle.
- Extrahieren Sie die ECRL anterior, den pathologischen Beinstrecker Carpi Radialis Longus Brevis (ECRB) Ursprung unten in direkter Sicht bringt.
- Identifizieren Sie visuell die pathologische degenerative Gewebe durch seine charakteristische stumpf grau Farbe und in der Regel ödematös und lockeren Gewebe.
- Resezieren Sie nach der Identifizierung sorgfältig alle degenerative Gewebe stark mit Nr. 15 chirurgischen Skalpell und Mini-Blades.
- Des resezierten Gewebes (ca. 1 cm3) sofort in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) einbinden und das umliegende Gewebe außer Sehne Gewebe vorsichtig in ca. 10 mL PBS so bald wie möglich zu entfernen.
- In Fällen mit knöchernen Überbein an der seitlichen Epicondylus Überbein mit einer Rongeur zu entfernen und mit einer Raspel zu glätten. Machen mehrere Bohrlöcher (Durchmesser 1,6 mm, ca. 6 – 8 Löcher) in den anterolateralen Kondylus Gefäßversorgung zu verbessern. Dies ist optional.
- Schließen Sie die Wunde schichtweise mit nicht resorbierbarem Nahtmaterial.
-
Gesunden tenocyte
- Die verbleibenden Sehne der Auto-Muskelfaserriss oder Auto-Patella Sehne während der Rekonstruktion des vorderen Kreuzbandes einzuholen Sie gesunde Tenocytes, und verwenden Sie es als das Steuerelement für die folgenden Experiment25.
Hinweis: Die Anzahl der in dieser Studie verwendeten Proben waren drei in jeder Gruppe.
- Die verbleibenden Sehne der Auto-Muskelfaserriss oder Auto-Patella Sehne während der Rekonstruktion des vorderen Kreuzbandes einzuholen Sie gesunde Tenocytes, und verwenden Sie es als das Steuerelement für die folgenden Experiment25.
2. Histologie
- Etwa die Hälfte des geernteten Gewebes in neutral gepufferte 10 % Formalin in einer chemischen Abzugshaube oder ähnlichem aufbewahren.
- Einbetten des Gewebes in paraffinblock (4 – 5 mL) und Abschnitt es koronal in 4 – 5 µm Abschnitten.
-
Führen Sie Abschnitte von Kontrolle und degenerative Sehne mit Hämatoxylin und Eosin Fleck (H & E) und Alcian blau Fleck bei einem pH-Wert von 2,5 zu Flecken. Durchzuführen Sie H & E Färbung in einem automatisierten Fleck-Maschine wie folgt.
- Deparaffinize mit Xylol (3-Mal, 5 min, beziehungsweise).
- Hydrat von abgestuften Alkohole, Wasser (100 % Alkohol, 4 min. 100 % Alkohol, 3 min; 95 % Alkohol, 2 min, 70 % Alkohol, 1 min; Wasser, 2 min).
- In Hämatoxylin 5 min Waschen in Wasser für 2 min gut färben.
- Unterscheiden sich in saurem Alkohol von 1 % (1 % HCl in 70 % Alkohol) für 3 s. Waschen gut in Wasser 3 Minuten lang.
- Neutralisieren von HCl durch Eintauchen in ein 0,5 % Ammoniak für 10 s, gefolgt von 3 min Wasser waschen.
- Für 5 min in Eosion färben.
- Austrocknen durch Alkohole (80 % Alkohol, 30 s, 95 % Alkohol, 1 min, 100 % Alkohol 1 min, 100 % Alkohol 2 min).
- Klar in Xylol (3-Mal, 2 min, 2 min und 3 min, beziehungsweise).
- Mit einer Abdeckung Folie montieren.
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Durchführen Sie Immunohistochemitry (IHC) mit dem Bond Polymer verfeinern Detection Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers mit geringfügigen Änderungen.
- Führen Sie nach 4.wenn mit Xylol ein Antigen Retrieval Verfahren mit Bond Epitop Retrieval Lösung für 30 min bei 100 ° C. Die Anleihe Epitop Retrieval Lösung enthält eine basierte Citrat-Puffer und Tensid (1 L, pH 5,9-6,1).
- Endogene Peroxidasen durch das Gewebe mit Wasserstoffperoxid für 5 min Inkubation zu stillen.
- Inkubieren Sie die Abschnitte für 15 min bei einer Umgebungstemperatur (21-22 ° C) mit primären Antikörper gegen den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) (1: 200), Tenomodulin (1: 200) oder Mohawk (1: 200).
- Durchführen Sie Sekundärantikörper tagging mit einem Biotin-freie Polymeren Meerrettich Peroxidase-Linker Antikörper Konjugat System.
- Verwendung sekundäre Kaninchen anti-Maus IgG in 10 % (V/V) tierische Seren in Tris gepufferte saline/0.09% 2-Methyl-4-isothiazolin-3-one Lösung, Maus-Antikörper zu lokalisieren.
- Verwenden Sie Anti-Kaninchen Polymer Poly-HRP-IgG (< 25 µg/mL) mit 10 % (V/V) tierische Seren in Tris gepufferte saline/0.09%, Kaninchen-Antikörper zu lokalisieren.
- Verwenden Sie 3, 3'-Diaminobenzidine Tetrahydrochloride Hydrat in einer Lösung der Stabilisator, den Komplex über einen braunen Niederschlag zu visualisieren.
- Gegenfärbung mit < 0,1 % Hämatoxylin (blau), die Zellkerne zu visualisieren.
- Beobachten die Dias befleckt mit H & E, Alcian blaue Flecken und IHC für VEGF, Tenomodulin und Mohawk unter Lichtmikroskop und repräsentative mikroskopische Bilder der einzelnen Folien unter einem Hochleistungs-Feld (400 X) zu erhalten.
(3) Tenocyte Kultur
-
Gewebe-Vorbereitung
- Bereiten Sie die Sehne Probe durch das Entfernen des umliegenden Gewebes mit Mikro-Scheren und Pinzetten gründlich vor.
- Mit PBS waschen und in kleine Stücke (etwa 1 mm3 oder weniger) hacken.
- Gewebe für 1 h in 30 mL Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) ergänzt mit 30 mg/mL Kollagenase II bei 37 ° c zu verdauen
- Ein 100 µm-Sieb Zelle durchlaufen Sie Zellen.
- Deaktivieren Sie Kollagenase II durch Zugabe von 1 mL der fetalen bovine Serum (FBS).
- 196 X g für 5 min zentrifugieren.
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Zellkultur
- 3 x 105 Zellen in eine 100 mm Schale Saatgut und Kultur mit DMEM mit 10 % FBS und 1 % Antibiotikum antimykotische Lösung bei 37 ° C in einem 5 % CO2 Inkubator für 1 Woche ergänzt.
- Alle drei Tage, bis 80 % Zusammenfluss tritt das Kulturmedium zu ändern. Gesunden und degenerative Zellproben bis Durchgang vier Kultur und verwenden für Experiment.
(4) Immunocytochemistry (ICC)
- Übertragen Sie 200 µL kultivierte Zelle (2 x 105 Zellen) auf die acht Vertiefungen einer Kammer Folie und wachsen Sie die Zellen zum Zusammenfluss mit der Zugabe von frischen Medien für 1 Tag.
- Die Zellen mit PBS waschen und mit 500 µL 4 % Formaldehyd pro Bohrloch befestigen.
- Inkubieren Sie die Folien mit 0,5 % Triton x-100 mit PBS-Puffer für 10 min für Permeabilisierung der Membranen.
- Block in PBS mit 1 % Rinderserumalbumin und 0,05 % TWEEN-20 für Mohawk und Tenomodulin, beziehungsweise.
- Über Nacht in der Dunkelheit mit Maus Anti-Mohawk monoklonale Antikörper (1: 100 Verdünnung) und Ziege-Anti-Tenomodulin-Antikörper (1: 100 Verdünnung) bei 4 ° C inkubieren.
- Inkubieren Sie die sekundäre Antikörper (Alexa 555-Anti Ziege (1: 200) für Tenomodulin; Alexa-488-Anti-Maus (1: 200) für Mohawk) im Dunkeln für 1 h bei Raumtemperatur.
- Mit 0,5 µL einer Fluoreszenz Eindeckmedium montieren.
- Mit einem Fluoreszenzmikroskop (400 X) zu analysieren.
5. Verbreitung Assay
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Zelle künstliche mit wasserlöslichen tetrazoliumsalz (WST)-1 zu messen.
- Säen Sie gesunde und degenerative Zellen in 96-well-Platten bei einer Dichte von 2 x 103 Zellen pro Bohrloch für 24, 72 und 120 h.
- Fügen Sie nach der Inkubation 10 µL 10 % WST-1-Lösung in jede Vertiefung.
- Inkubieren Sie die Platten für 3 h bei 37 ° C in 5 % CO2.
- Messung der optischen Dichte bei 450 nm mit einer Mikrotestplatte Reader. Nehmen Sie Lesungen mindestens dreimal zu allen Zeitpunkten für jede Probe.
-
Maßnahme zelluläre DNA-Menge mit der BrdU-Assay.
- Samen beide gesund und degenerative Zelle in 96 Platten gut bei einer Dichte von 2 x 103 Zellen pro Bohrloch für 24, 72 und 120 h.
- Fügen Sie nach der Inkubation 10 µL 10 % BrdU Lösung in jede Vertiefung.
- Inkubieren Sie die Platten für 3 h bei 37 ° C in 5 % CO2.
- Fügen Sie 100 µL/Well der Befestigung/Denaturing Lösung (60 – 70 % Ethanol, 0,1-0,5 % Natriumhydroxid) und halten Sie die Platte bei Raumtemperatur für 30 Minuten.
- Fügen Sie 100 µL/Well 1 h 1 x Erkennung Antikörperlösung und halten die Platte bei Raumtemperatur vorbereitet.
- Entfernen Sie Lösung zu und waschen Sie der Platte dreimal mit 1 x Waschpuffer.
- Fügen Sie 100 µL/Well 1 X HRP-konjugierten Sekundärantikörper Lösung vorbereitet und halten Sie die Platte bei Raumtemperatur für 30 Minuten.
- Entfernen Sie die Lösung und waschen dreimal mit 1 x Waschpuffer.
- Fügen Sie 100 µL 50 % TMB-Substrat.
- 30 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- 100 µL Stopplösung hinzufügen.
- Messung der optischen Dichte bei 450 nm mit einer Mikrotestplatte Reader.
Hinweis: Nehmen Sie Lesungen jederzeit mindestens dreimal Punkte für jede Probe.
6. statistische Analyse
- Sammeln und Analysieren von Daten mit SPSS.
- Zeigen Sie Daten vom Mittelwert ± Standardfehler von Mittelwert.
- Einsatz-Mann Whitney U-Test.
- Betrachten Sie Unterschiede statistisch signifikant, wenn der p -Wert kleiner als 0,05 ist (p < 0,05).
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Representative Results
Histologische Analysen ergaben, dass das geerntete Gewebe von laterale Epicondylitis die Merkmale einer Tendinopathic Sehne hatte. H & E Abschnitt sehnenerkrankung degenerative Sehne offenbart ein unorganisiert Kollagen-Bündel mit einem Verlust der Polarität und fine gerade, stark verpackt parallel Faser Strukturen. Histologische Zeichen der Degeneration wie höhere zellularität und vergrößerte Kerne ohne die typischen Spindel Form suggestive waren Proben üblich. Darüber hinaus Kollagen Bündel der degenerierten Sehne waren relativ schwach Eosin befleckt von H & E aber waren positiv von Alcian blau zeigt erhöhte Proteoglykanen und Glykosaminoglykanen Stoff gefärbt.
In allen Fällen Blutgefäße stiegen in Anzahl und Aggregate besetzen Räume, eingebettet zwischen den Fasern wurden im Vergleich zu normalen Schlitz-wie Blutgefäße. IHC-Färbung zeigte Zellen des degenerierten sehnen zytoplasmatischen granulare positive Reaktion auf VEGF im Vergleich zu der negativen Reaktion der Kontrolle sind. Gemeinsam, diese Ergebnisse bestätigt, dass die geernteten Gewebe aus laterale Epicondylitis degenerative Gewebe und eignet sich für die Kultur der degenerativen Tenocyte (siehe Abbildung 2).
Kultivierten Zellen wurden durch ICC als Tenocytes bestätigt und die geernteten Gewebe wurden durch IHC als Sehne Gewebe bestätigt. Die meisten kultivierten Zellen und Zellen im Gewebe der Sehne zeigte einen positiven Fleck für die repräsentativen Tenocyte Marker bekannt als Mohawk (grün) und Tenomodulin (rot) Proteine mit einem länglichen Auftritt unter Mikroskopie (siehe Abbildung 3). Die geernteten Gewebe hatten auch die positive Färbung für Mohawk Proteine und Tenomodulin Proteine-Proteins (siehe ergänzende Abbildung1). Diese vorgeschlagen, dass die geernteten Gewebe durch die Sehne Gewebe komponiert wurden.
Kultivierte Tenocytes aus dem geernteten Gewebe der laterale Epicondylitis hatte die charakteristischen Merkmale, die sehnenerkrankung entsprechen. Degenerative und gesund Tenocytes waren für 4 Tage unter den gleichen Bedingungen kultiviert. Zu jedem Zeitpunkt wurde die proliferationsrate von BrdU-Assay und WST-1-Assay gemessen. Die Ergebnisse zeigten, dass die proliferationsrate der degenerativen Zellen deutlich höher die Steuerelemente wie bereits berichtet war im Vergleich zu (p < 0,05) (siehe Abbildung 4A).
Fünf Gene, die bekannt sind, werden bis in die degenerativen Sehne geregelt wurden von qRT-PCR analysiert. Ausdruck der Gene, COL3A1, ACTA2, TAC1 (SP), TAC-Rezeptor 1, und PTGS2 (COX2) wurden in kultivierten Zellen aus der degenerativen Sehne als in den Zellen von den gesunden deutlich erhöht. Die relative Ausdrücke für alle Gene sind in Abbildung 4B und ergänzende Abbildung2dargestellt.
Abbildung 1 : Chirurgische Foto von degenerativen Sehne Ernte. (A) nach Hautschnitt und Dissektion, wurde das pathologische degenerative Gewebe auf den gemeinsamen Ursprung der Beinstrecker ausgesetzt zeigen eine charakteristische Matt-Grau Farbe mit ödematösen Veränderungen (rote Linie). Dagegen war das allgemeine Aussehen des normalen Sehne Gewebe glänzend und fest mit einem leicht gräulichen Ton (schwarze Linie). (B) alle identifizierten degenerative Gewebe reseziert wurden scharf und dann der radiale Kopf-Bone ausgesetzt war. (C) alle reseziertem Gewebe wurden sofort in die Phosphat gepufferte Kochsalzlösung eingebettet und das umliegende Gewebe nicht Sehnige wurde sorgfältig so bald wie möglich seziert. ECRB: Beinstrecker Carpi Radialis Brevis. EDC: Beinstrecker m.digitorum Communis. ECU: Beinstrecker Carpi Ulnaris. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Bestätigung der degenerativen Sehne histologisch. (A) hatte In der H & E Färbung, degenerative Proben aus der laterale Epicondylitis unorganisiert Kollagen Bundles mit Verlust der Polarität und erhöhte Zellzahl im Vergleich zu den gesunden Kontrolle. (B). Alcian blaue Färbung zeigte, dass die degenerative Sehne Grundsubstanz bestehend aus Proteoglykanen und Glykosaminoglykanen mit mehreren schleimigen Patches und Vakuolen zwischen Fasern (Pfeil) zugenommen hatte. (C). Darüber hinaus VEGF Immunohistochemistry demonstriert erhöht im Schiff Bildung in degenerativen Sehne Proben im Vergleich zu der Kontrollproben Färbung. VEGF: Vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor. Maßstabsleiste = 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Ermittlung des Tenocyte von ICC. Die kultivierten Zellen und Zellen im Gewebe der Sehne wurden als Tenocyte von ICC bestätigt. Die meisten Zellen zeigten positive Fleck für den repräsentativen Tenocyte Marker, einschließlich Mohawk (grün) und Tenomodulin (rot) mit länglichen Auftritt unter Mikroskopie. Knorpelzelltransplantation diente als die negativ-Kontrolle. ICC: Immunocytochemistry. Maßstabsleiste = 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Merkmale der degenerativen Tenocyte. (A, B) Degenerative Tenocytes (rot) hatte eine höhere Vermehrungsrate mit einem bemerkenswerten Anstieg in zellularität. (C) fünf Gene, die bekannt sind, bei der Entwicklung der sehnenerkrankung verwandt waren in der degenerativen Tenocytes deutlich erhöht. Gene Expression Ebenen wurden gegen GAPDHnormalisiert. *: meine < 0,05, **: meine < 0,01, beziehungsweise. SP: Substanz P. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Ergänzende Abbildung1: histologische Bestätigung des geernteten Gewebes als Sehne Gewebe. Die geerntete Gewebe wurde auch von IHC für Mohawk und Tenomodulin, um festzustellen, ob die geerntete Gewebe die angemessene Merkmale der Sehne Gewebe analysiert. IHC: Immunohistochemistry. Maßstabsleiste = 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Ergänzende Abbildung2: Ausdruck der sehnenerkrankung im Zusammenhang mit Genen in Tenocyte. Die Transkripte der fünf Gene durch Aktin Ausdruck normiert wurden deutlich erhöht in der degenerativen Tenocytes und haben ähnliche Tendenzen in Abbildung 4. Gene Expression Ebenen wurden gegen Aktin mit einem Mittelwert normalisiert < 0,05 und < 0,01, beziehungsweise. SP: Substanz P. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Eine Reihe von früheren Studien berichteten wie erstelle ich chronische Tendinopathic Tiermodelle mit verschiedenen Verfahren wie Kollagenase oder Kartogenin Injektion, Laufband laufen und weitere26,27. Obwohl zahlreiche Studien vielversprechende therapeutische Effekte basierend auf diesen Tiermodellen zeigten, wäre Experimente mit menschlichen degenerativen Tenocyte entscheidend im Bereich der sehnenerkrankung, um die Wirksamkeit der Behandlung zu reproduzieren. In diesem Artikel haben wir ein Protokoll, um erfolgreich ernten und Kultur menschlichen degenerativen Tenocytes konsequent etabliert. Beide geerntet Sehne Gewebe und kultivierten Tenocyte zeigte die gemeinsamen Merkmale der degenerativen Sehnen- und Tenocyte7,28.
Nach unserer Erfahrung ist für die erfolgreiche Gewebe-Ernte, es wichtig zu verstehen, die morphologischen Veränderungen, die häufig mit degenerativen Sehne verbunden und genau diesen Bereich während der Operation abzugrenzen. Degenerative Gewebe ist in der Regel grau oder braun in der Farbe und das Gewebe ist dünn, zerbrechlich und unorganisiert mit losen Textur. Die ein- und Ausschlusskriterien Kriterien des Protokolls sollte streng mit sorgfältiger Beurteilung der Vorbehandlungen vor der Ernte gehalten werden.
Gewebe-Größe ist auch wichtig für eine erfolgreiche Zellkultur. Es wird empfohlen, mehr als 1 cm3ernten. In der Regel so lange, wie alle degenerativen Bereich entfernt ist, wäre die Menge der gesammelten Gewebe für die Zellkultur genug. Zu guter Letzt haben wir nicht Tenocytes Laufe sechs in allen Experimenten benutzt. Bis zu sechs Passage glauben wir, dass die kultivierten Zellen noch die Merkmale der Degeneration hatte.
Unser Protokoll hat mehrere Vorteile. Diese Vorteile umfassen keinen Schaden für den Patienten, da die degenerative Gewebe während der Operation, Effizienz, da die Menge des Gewebes erforderlich genug für das Experiment, hohen ethischen Grund keine Verletzung von gesundem Gewebe ist entfernt werden soll, Reproduzierbarkeit in dieser pathologischen Geweben von Menschen erhalten Sie leicht während der Operation, und zu guter Letzt einfache Anwendung einmal Operationstechniken vertraut zu machen.
Allerdings erkennen wir, dass unser Experiment mehrere Einschränkungen hat. Erstens können wir nicht vollständig Effekts Überbleibsel der früheren Kortikosteroid oder Thrombozyten-Reiches Plasma-Injektion ausschließen, obwohl wir nur Patienten, die mindestens drei Monate vergangen waren eingeschlossen, aus einer früheren Behandlung. Darüber hinaus in diesem Protokoll nur die Sehne ECRB geerntet und zu degenerativen Tenocytes Kultur verwendet, da die ECRB Sehne eine gemeinsame sehnenerkrankung Website für Chirurgie zusammen mit Achilles und Rotatorenmanschette sehnen ist. Weitere Studien sollten mit einer größeren Stichprobe mit Schwerpunkt auf Unterschiede zwischen den verschiedenen sehnenerkrankung Standorten durchgeführt werden.
Zusammenfassend werden diese validierte Protokoll für den Erwerb der menschlichen degenerativen Tenocytes ein nützliches Werkzeug für zukünftige Untersuchungen in der Sehne Biologie und testen neue therapeutische Interventionen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde unterstützt durch einen Zuschuss aus den Korea Health Technology R & D Project durch das Korea Gesundheit Industrie Entwicklung Institut (KHIDI), das vom Ministerium für Gesundheit & Wohlbefinden, Republik Korea finanziert wurde (gewähren Nummer: HI16C1559).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Scalpel | Kisanbio | KS-Q0306-15 | No. 15 |
| Mini-blade | Beaver | 374769 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco | 11995065 | |
| PBS | Gibco | 14190250 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| 50 mM ascorbic acid-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Gibco | 15240062 | |
| 4% formaldehyde | Bio-solution | BP031 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ml | |
| BSA | Rdtech | C0082 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ml | |
| MKX (C-5) | Santa cruz biotechnology | sc-515878 | |
| Tenomodulin (N-14) | Santa cruz biotechnology | sc-49325 | |
| Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| WST-1 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | |
| BrdU Cell Proliferation Assay Kit | Cell Signaling Technology | #6813 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8891 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
| GAPDH | Thermo Fisher Scientific | Hs02786624_g1 | |
| COL3A1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00943809_m1 | |
| ACTA2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00426835_g1 | |
| TAC1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00243225_m1 | |
| TACR1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00185530_m1 | |
| PTGS2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00153133_m1 | |
| ACTB | Thermo Fisher Scientific | Hs99999903_m1 | |
| Cell Strainers (100 µm) | Corning | 352360 | |
| 100mm culture dish | Thermo Fisher Scientific | 8188207 | |
| 8-well Chamber Slide | Thermo Fisher Scientific | 154534 | |
| 96 Well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3596 | |
| Nikon Eclipse 50i Microscope | Nikon | ||
| VERSA max microplate reader | Molecular Devices | ||
| CFX96 Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | ||
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Paraffins | Leica Biosystems | 3801340 | |
| Ethanol | JUNSEI CHEMICAL | 90303-2185 | |
| Hematoxylin | DAKO | CS70030-2 | |
| Eosin | DAKO | CS70130-2 | |
| Alcian blue | DAKO | AR16011-2 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Xylene | JUNSEI CHEMICAL | 25165-0430 | |
| Endogenous peroxidases | DAKO | S200380-2 | |
| Canada balsam | JUNSEI CHEMICAL | 23255-1210 | |
| Microtome Blade | FEATHER | A35 | |
| Slide glass | SUPERIOR | 1000612 | |
| Cover glass | Marienfeld-Superior | 101050 | |
| VEGF | Santa cruz biotechnology | sc-7269 | |
| SPSS Software | IBM | Ver. 18.0 | |
| Multi-purpose Centrifuge | LABOGENE | 1248R |
References
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