Summary
In vitro- brug af degenerative tenocytes er væsentlige, når undersøger effekten af roman behandling på tendinopati. Men de fleste undersøgelser bruger kun dyremodel eller en sund tenocyte. Vi foreslår følgende protokol for at isolere menneskelige degenerative tenocytes under kirurgi.
Abstract
Tendinopati, en smertefuld tilstand, som udvikler sig i reaktion på senen degeneration, er på fremmarch i den udviklede verden på grund af øget fysisk aktivitet og længere levetid. Trods dens stigende udbredelse, underliggende patogenesen er stadig uklare, og behandling er generelt symptomatisk. For nylig, mange terapeutiske muligheder, herunder vækstfaktorer, stamceller og genterapi, blev undersøgt i håb om at øge den helbredende styrken af degenerative senen. Men fleste af disse undersøgelser blev gennemført kun på dyremodeller eller sunde menneskelige tenocytes. Trods nogle undersøgelser ved hjælp af patologiske tenocytes, til bedste af vores viden er der i øjeblikket ingen protokol, der beskriver, hvordan du anskaffer menneskelige degenerative tenocytes. Formålet med denne undersøgelse er at beskrive en standardprotokol for at opnå menneskelige degenerative tenocytes. I første omgang, blev senen væv høstet fra en patient med lateral epicondylitis under kirurgi. Derefter blev biopsi prøverne taget fra den extensor carpi radialis brevis senen svarende til strukturelle ændringer observeret på tidspunktet for kirurgi. Alle de høstede sener viste sig at være kedelig, grå, smuldrende, og edematous, som gjorde dem visuelt adskilt fra de sundhedstegn. Tenocytes var kulturperler og anvendes til forsøg. I mellemtiden, halvdelen af de høstede væv blev analyseret Histologisk, og det var vist, at de delte de samme nøglen egenskaber i tendinopati (angiofibroblastic dysplasi eller hyperplasi). En sekundær analyse af immuncytokemi bekræftet, at de dyrkede celler var tenocytes med hovedparten af cellerne at have positive pletter for mohawk og tenomodulin proteiner. Kvaliteter af degenerative karakteren af tenocytes blev derefter fastsat ved at sammenligne cellerne med raske kontrol ved hjælp af en spredning assay eller qRT-PCR. De degenerative tenocyte vises en spredning sats og lignende gen expression mønstre af tendinopati, der matchede tidligere betænkninger. Samlet set kan denne nye protokol giver et nyttigt redskab for fremtidige studier af tendinopati.
Introduction
Tendinopati er en kroniske degenerative bevægeapparatet tilstand, der udvikler sig i forskellige dele af kroppen. For nylig, antallet af tilfælde af tendinopati er steget stærkt i den udviklede verden på grund af voksende deltagelse i fritidssport og levealder1,2. Årsagen til tendinopati anses for at være multifaktoriel og disse årsager omfatter iskæmi, ilt frie radikaler skader, en ubalance mellem vasokonstriktor og vasodilatator innervations, interne mikro-tårer og ændringer til neuro-forordning3 ,4,5,6,7,8. De fleste behandlinger for tendinopati kun lindre dens symptomer. Desuden behandlinger uden vævsregeneration kræver lang tid for rehabilitering og opnå et begrænset svar fra skadet sener, der pålægger en klinisk udfordring for læger9.
Inkompetence af nuværende behandlingsmuligheder sammen med manglen degenerative senen evne til at self-heal har ledende forskere at tage interesse i at udforske alternativ behandling strategier. For nylig nye undersøgelser rapporteret mange lovende resultater for at øge den helbredende virkning af tendinopati sener ved hjælp af vækstfaktorer, stamceller baseret terapi og gen terapi10,11,12.
Gennem en litteraturgennemgang, fandt vi, at de involverede undersøgelser kan opdeles i to kategorier baseret på deres analyse materialer: dyre modeller som en rotte, en mus eller en kanin; og human modeller. Med hensyn til dyremodel, i øjeblikket er der to populære teknikker til at generere tendinopati: kemiske induktion af skade eller mekaniske overbelastning modellen. Men hver dyremodel blev begrænset i at gengive den komplekse menneskelige tendinopati patologi13,14.
De fleste papirer ved hjælp af menneskelige prøver blev analyseret histologisk eller udført af in vitro- eksperiment baseret på en sund menneskelige tenocyte i stedet for en degenerative tenocyte15,16,17,18 , 19 , 20 , 21. kun et par aviser rapporterede at de brugte en menneskelig degenerative tenocyte, men de ikke beskriver i detaljer den protokol, der bruges til at få den degenerative tenocyte fra menneskelige22,23. I denne forbindelse skal det bemærkes, at succesfulde resultater fra enten den dyre model eller den sunde væv/tenocyte nødvendigvis ikke kan forudsige menneskers effektivitet eller virkningsfuldt dosering fordi senen degeneration er en kompliceret proces og patogenesen er stadig ikke fuldt forstået.
Kollektivt, er det nødvendigt at beskrive standardprotokol for at opnå den degenerative tenocyte fra humant væv uden at forårsage bivirkninger donor. I denne artikel beskrives en protokol om, hvordan til at erhverve den menneskelige degenerative tenocyte. For at godkende protokollen, blev høstede væv analyseret histologisk. Derefter blev cellen kulturperler bekræftet som den degenerative tenocyte ved hjælp af immuncytokemi (ICC), en kvantitativ realtid-polymerase kædereaktion (qRT-PCR) og en levedygtighed assay.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen blev gennemført i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen og i protokollen blev godkendt af det institutionelle Review Board på CHA Bundang Medical Center.
1. degenerative senen væv høst fra patienten
- Diagnosticere lateral epicondylitis ved at tage en sygehistorie og bruge fysisk eksamen Fund: ømhed over tendinous oprindelse tæt på den laterale epicondyle; smerter fremkaldt af modstod udvidelse af håndleddet fælles.
- Brug de følgende inklusionskriterierne: over 18 år af alder; en historie af lateral epicondylitis for minimum seks måneder; genstridige for ikke-operativ behandling; mindst tre måneder er gået siden injektion af binyrebarkhormon, trombocyttal rige plasma eller botulinumtoksin
- Udelukke følgende: gravide kvinder; patienter med en anamnese med halshvirvelsøjlen sygdom, albue arthritis, reumatologiske sygdomme, kirurgi omkring albuen og nerve entrapment syndrom; patienter nægter at donere væv.
-
Kirurgisk teknik
Bemærk: Se figur 124.- Efter narkose ved isofluran og endotracheal intubation, sætte armen på bordet og anvende en tourniquet. Derefter anvende betadine agent på hele armen og drapere med en aseptisk kirurgisk ark.
- Udsætte den laterale albue gennem en 3-5 cm snit med No. 15 kirurgisk skalpel klinge bare anteromedial til den laterale epicondyle og proksimalt for niveauet for fælles.
- Visuelt identificere extensor carpi radialis longus (ECRL) og extensor aponeurosis interface og gøre en opsplitning snit 2-3 mm i dybden mellem ECRL og extensor aponeurosis med No. 15 kirurgisk skalpel klinge på de identificerede interface.
- Uddrag ECRL anteriorly, som vil bringe patologiske extensor carpi radialis longus brevis (ECRB) oprindelse nedenfor i direkte visning.
- Visuelt identificere patologiske degenerative væv ved sin karakteristiske kedelig grålig farve og normalt edematous og letsmuldrende væv.
- Efter identifikation, omhyggeligt resect alle degenerative væv kraftigt ved hjælp af No. 15 kirurgisk skalpel og mini-vinger.
- Integrere resektion væv (ca. 1 cm3) i fosfatbufferet saltopløsning (PBS) straks og fjerne alle de omkringliggende væv undtagen senen væv omhyggeligt i ca. 10 mL PBS så hurtigt som muligt.
- I tilfælde med knoklet exostosis på den laterale epicondyle, fjerne exostosis ved hjælp af en rongeur og udjævne det med en rasp. Gøre flere bore huller (diameter 1,6 mm, ca 6-8 huller) i den anterolaterale kondyl at forbedre vaskulær forsyning. Dette er valgfrit.
- Lukke såret lag på lag ved hjælp af ikke-resorberbare suture klæde.
-
Sund styring tenocyte
- Få sunde tenocytes fra den resterende senen af auto-forstrækning eller auto-patella senen under forreste korsbånd genopbygning, og bruge det som kontrol for følgende eksperiment25.
Bemærk: Antallet af prøver, der indgår i denne undersøgelse var tre i hver gruppe.
- Få sunde tenocytes fra den resterende senen af auto-forstrækning eller auto-patella senen under forreste korsbånd genopbygning, og bruge det som kontrol for følgende eksperiment25.
2. histologi
- Gemme omkring halvdelen af de høstede væv i neutral bufferet 10% formalin i en kemisk stinkskab eller tilsvarende.
- Integrere vævet i en paraffin blok (4-5 mL) og del den i 4-5 µm sektioner coronally.
-
Pletten sektioner fra kontrol og degenerative senen med hæmatoxylin og Eosin pletten (H & E) og Alcian blå plet ved en pH på 2,5. Udføre H & E farvning i et automatiseret pletten maskine som følger.
- Deparaffinize ved hjælp af xylen (3 gange, 5 min, henholdsvis).
- Hydrat fra sorterede alkoholer til vand (100% alkohol, 4 min 100% alkohol, 3 min. 95% alkohol, 2 min; 70% alkohol, 1 min; vand, 2 min).
- Pletten i hæmatoxylin i 5 min. Skyl godt i vand i 2 min.
- Differentiere i 1% syre alkohol (1% HCl i 70% alkohol) for 3 s. vask i vand i 3 min.
- Neutralisere HCl ved dypning i en 0,5% ammoniak for 10 s, efterfulgt af en 3 min vand vask.
- Pletten i Eosion i 5 min.
- Dehydrere gennem alkoholer (80% alkohol, 30 s; 95% alkohol, 1 min 100% alkohol 1 min, 100% alkohol 2 min).
- Klart i xylen (3 gange, 2 min, 2 min, og 3 min, henholdsvis).
- Mount med et cover dias.
-
Udføre immunohistochemitry (IHC) ved hjælp af Bond Polymer forfine Detection kit ifølge producentens anvisninger med mindre ændringer.
- Efter deparaffinization ved hjælp af xylen, udføre en antigen hentning procedure ved hjælp af Bond epitop hentning løsning i 30 min. ved 100 ° C. Bond epitop hentning løsning indeholder en baseret citratbuffer og overfladeaktivt (1 L, pH 5.9-6.1).
- Dæmpning endogent peroxidases ved at inkubere væv med hydrogenperoxid i 5 min.
- Inkuber sektioner i 15 minutter ved en stuetemperatur (21-22 ° C) med primær antistoffer mod vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) (1:200), tenomodulin (1:200) eller mohawk (1:200).
- Udføre sekundær antistof tagging med et biotin-fri polymere peberrodsperoxidase-linker antistof konjugat system.
- Brug sekundær kanin anti mus IgG i 10% (v/v) animalske serum i Tris-buffered saline/0.09% 2-Methyl-4-isothiazolin-3-one løsning til at lokalisere museantistoffer.
- Bruge polymer anti-kanin Poly-HRP-IgG (< 25 µg/mL) der indeholder 10% (v/v) animalske serum i Tris-buffered saline/0.09% at lokalisere kanin antistoffer.
- Brug 3, 3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrat i en stabilisator løsning at visualisere komplekse via en brun bundfald.
- Kontrastfarve med < 0,1% hæmatoxylin (blå) til at visualisere cellekerner.
- Observere dias plettet med H & E, Alcian blå pletter og IHC VEGF, tenomodulin og mohawk under lysmikroskop og opnå repræsentative mikroskopiske billeder af de enkelte dias under en høj effekt felt (400 X).
3. Tenocyte kultur
-
Væv forberedelse
- Forberede senen prøven ved at fjerne alle de omkringliggende væv grundigt med mikro-saks og pincet.
- Vask med PBS og hakkekød i små stykker (omkring 1 mm3 eller derunder).
- Fordøje væv til 1 h 30 ml Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) suppleret med 30 mg/mL Collagenase II ved 37 ° C.
- Passere celler gennem en 100 µm celle si.
- Deaktivere Collagenase II ved tilsætning af 1 mL af føtal bovint serum (FBS).
- Der centrifugeres ved 196 x g i 5 min.
-
Cellekultur
- Seed 3 x 105 celler i en 100 mm skål og kultur med DMEM suppleret med 10% FBS og 1% antibiotikum-antimykotikum løsning ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator for 1 uge.
- Ændre næringssubstratet hver tre dage indtil 80% sammenløbet opstår. Kultur både sund kontrol og degenerative celle prøver indtil passage fire og bruge til forsøget.
4. immuncytokemi (ICC)
- Overføre 200 µL af kulturperler celle (2 x 105 celler) otte brønde af et kammer dias og vokse i cellerne til sammenløbet med tilsætning af friske medier for 1 dag.
- Cellerne vaskes med PBS og fix med 500 µL af 4% formaldehyd pr. brønd.
- Glassene inkuberes med 0,5% Triton X-100 i PBS for 10 min til permeabilization af membraner.
- Blokere i PBS med 1% bovint serumalbumin og 0,05% TWEEN-20 for mohawk og tenomodulin, henholdsvis.
- Inkuber i mørke med musen anti-mohawk monoklonalt antistof (1: 100 fortynding) og ged anti-tenomodulin antistof (1: 100 fortynding) ved 4 ° C natten over.
- Inkuber de sekundære antistoffer (Alexa 555-anti ged (1:200) for tenomodulin; Alexa 488-anti mus (1:200) for mohawk) i mørke i 1 time ved stuetemperatur.
- Mount med 0,5 µL af en fluorescens montering medium.
- Analysere ved hjælp af et fluorescens mikroskop (400 X).
5. spredning analyse
-
Måle celle viabilities ved hjælp af vandopløselige tetrazolium (WST) -1.
- Frø både sund og degenerative celler i 96 godt plader med en tæthed på 2 x 103 celler pr. brønd for 24 og 72 120 h.
- Efter inkubering tilsættes Tilsæt 10 µL af 10% WST-1 løsning til hver brønd.
- Inkuber plader i 3 timer ved 37 ° C i 5% CO2.
- Måle den optiske tæthed ved 450 nm med en mikrotiterplade læser. Tage aflæsninger på mindst tre gange på alle tidspunkter for hver prøve.
-
Foranstaltning cellulære DNA beløb ved hjælp af BrdU assay.
- Frø både sund og degenerative celle i 96 plader godt med en tæthed på 2 x 103 celler pr. brønd for 24 og 72 120 h.
- Efter inkubering tilsættes Tilsæt 10 µL af 10% BrdU løsning til hver brønd.
- Inkuber plader i 3 timer ved 37 ° C i 5% CO2.
- Tilføj 100 µL/brønd af fastsættelse/Denaturing løsning (60-70% ethanol, 0,1-0,5% natriumhydroxid) og holde pladen ved stuetemperatur i 30 min.
- Tilsæt 100 µL/brønd forberedt 1 x afsløring antistof løsning og holde pladen ved stuetemperatur i 1 time.
- Fjerne løsning og vaske plade tre gange med 1 x vaskebuffer.
- Tilsæt 100 µL/brønd forberedt 1 x HRP-konjugerede sekundær antistof løsning og holde pladen ved stuetemperatur i 30 min.
- Fjerne løsning og vask pladen tre gange med 1 x vaskebuffer.
- Tilsæt 100 µL af 50% TMB substrat.
- Inkuber i 30 min. ved stuetemperatur.
- Tilsæt 100 µL stopopløsning.
- Måle den optiske tæthed ved 450 nm med en mikrotiterplade læser.
Bemærk: Tag målinger mindst tre gange på alle tid point for hver prøve.
6. den statistiske analyse
- Indsamle og analysere data ved hjælp af SPSS.
- Afbilde data af gennemsnit ± standard fejl af middelværdien.
- Brug Mann Whitney U test.
- Overvej forskellene statistisk signifikant, når p -værdien er mindre end 0,05 (p < 0,05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Histologiske analyser viste, at de høstede væv fra lateral epicondylitis havde Karakteristik af en tendinopathic senen. H & E afsnit af tendinopati degenerative senen afslørede en uorganiseret kollagen bundter med tab af polaritet og fine lige, stærkt pakket parallelle fiber strukturer. Histologiske tegn tyder på degeneration såsom højere celleforandringer og udvidede kerner uden figuren typisk spindel var fælles i prøver. Derudover kollagen bundter af degenererede senen var relativt svage eosin farves af H & E men positivt blev plettet af Alcian blå viser øget proteoglycaner og glycosaminoglycans stof.
I alle tilfælde, blodkar blev øget i antal og aggregater besætter rum indlejret mellem fibre sammenlignet med normale slids-lignende blodkar. I IHC farvning celler af degenererede sener viste cytoplasmatisk granulat positive reaktion på VEGF i forhold til den negative reaktion af kontrol ones. Kollektivt, disse resultater bekræftede, at de høstede væv fra lateral epicondylitis var degenerative væv og egnet til degenerative tenocyte kultur (Se figur 2).
De dyrkede celler blev bekræftet som tenocytes af ICC og de høstede væv blev bekræftet af IHC som senen væv. De fleste af de dyrkede celler og celler i senen væv viste en positiv pletten for repræsentative tenocyte markører kendt som mohawk (grøn) proteiner og tenomodulin (rød) proteiner med en langstrakt udseende under mikroskopi (Se figur 3). De høstede væv havde også, den positive farvning for mohawk proteiner og tenomodulin proteiner immunohistochemically (Se tillægs figur 1). Disse foreslog, at de høstede væv blev komponeret af senen væv.
Kulturperler tenocytes fra den høstede væv af lateral epicondylitis havde de karakteristiske træk, der svarer til tendinopati. Degenerative og sunde tenocytes blev kulturperler i 4 dage på samme betingelse. På hvert tidspunkt, blev spredning sats målt af BrdU assay og WST-1 assay. Resultaterne viste, at spredning sats af degenerative celler var betydeligt højere i forhold til den kontrol, som tidligere rapporteret (p < 0,05) (Se figur 4A).
Fem gener, som er kendt for at være op-reguleret i degenerative senen blev analyseret af qRT-PCR. Udtryk af gener, COL3A1, ACTA2, TAC1 (SP), TAC receptor 1, og PTGS2 (COX2) var steget mere markant i kulturperler celler fra degenerative senen end i celler fra de sundhedstegn. De relative udtryk for alle gener er vist i figur 4B og supplerende figur 2.
Figur 1 : Kirurgisk foto af degenerative sene høst. (A) efter hud indsnit og dissektion, den patologiske degenerative væv på den fælles extensor oprindelse blev udsat, viser en karakteristisk kedelig grålig farve med edematous ændring (rød linje). Omvendt, helhedsindtrykket af normale senen væv var skinnende og fast med en lidt grålig tone (sort streg). (B) alle identificerede degenerative væv var resektion skarpt og derefter radialt hoved knoglen var udsat. (C) alle resektion væv var indlejret i fosfatbufferet saltopløsning straks og det omgivende ikke-tendinous væv blev omhyggeligt dissekeret hurtigst muligt. ECRB: extensor carpi radialis brevis. EDC: extensor digitorum communis. ECU: extensor carpi ulnaris. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Bekræftelse af degenerative senen histologisk. (A) i H & E farvning, degenerative prøver fra den lateral epicondylitis havde uorganiseret kollagen bundter med tab af polaritet og øget celle nummer i forhold til den sunde kontrol. (B). Alcian blå farvning viste at den degenerative senen var steget grundsubstansen bestående af proteoglycaner og glycosaminoglycans med flere mucoid patches og vacuoles mellem fibre (pil). (C). Derudover VEGF Immunhistokemi påvist øget farvning i fartoej formation i degenerative senen prøver i forhold til kontrolprøver. VEGF: Vaskulær endotel vækstfaktor. Skalalinjen = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Identifikation af tenocyte af ICC. Dyrkede celler og celler i senen væv blev bekræftet som tenocyte af ICC. De fleste af cellerne viste positiv pletten for repræsentative tenocyte markør, herunder mohawk (grøn) og tenomodulin (rød) med aflange udseende under mikroskopi. Chondrocyt blev brugt som den negative kontrol. ICC: immuncytokemi. Skalalinjen = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Karakteristik af degenerative tenocyte. (A, B) Degenerative tenocytes (rød) havde en højere spredning sats med en bemærkelsesværdig stigning i celleforandringer. (C) fem gener, der er kendt for at være forbundet i udviklingen af tendinopati var markant forhøjet i den degenerative tenocytes. Gen expression niveauer var normaliseret mod GAPDH. *: betyde < 0,05, **: betyder < 0,01, henholdsvis. SP: stof P. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Tillægs figur 1: histologisk bekræftelse af den høstede væv som senen væv. Den høstede væv blev også analyseret af IHC for mohawk og tenomodulin til at afgøre, om den høstede væv havde de passende Karakteristik af senen væv. IHC: Immunhistokemi. Skalalinjen = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Tillægs figur 2: udtryk for tendinopati relaterede gener i tenocyte. Udskrifter af fem gener normaliseret af actin udtryk var markant forhøjet i den degenerative tenocytes og har lignende tendenser til figur 4. Gen expression niveauer var normaliseret mod actin med en middelværdi < 0,05 og < 0,01, henholdsvis. SP: stof P. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En række tidligere undersøgelser har rapporteret Sådan oprettes kronisk tendinopathic dyremodeller ved hjælp af forskellige procedurer såsom collagenase eller kartogenin injektion, løbebånd kører og flere26,27. Selv om talrige undersøgelser viste lovende terapeutiske virkninger baseret på disse dyremodeller, ville eksperimenter ved hjælp af den menneskelige degenerative tenocyte være afgørende inden for tendinopati for at reproducere effekten af behandlingen. I denne artikel etableret vi en protokol for at kunne høste og kultur menneskelige degenerative tenocytes konsekvent. Både høstet senen væv og den kultiverede tenocyte viste de fælles karakteristika ved de degenerative sene og tenocyte7,28.
Vores erfaring er for den vellykkede væv høst, det vigtigt at forstå de morfologiske ændringer ofte forbundet med degenerativ senen og præcist afgrænse området under kirurgi. Degenerative væv er typisk grå eller brun i farven og vævet er tynde, skrøbelige og uorganiseret med løs tekstur. De medtagelse og udelukkelse kriterier i protokollen bør holdes strengt med omhyggelig vurdering af tidligere behandlinger før høst.
Væv størrelse er også vigtigt for en vellykket cellekultur. Vi anbefaler, høst mere end 1 cm3. Normalt, så længe alle degenerative området er fjernet, ville mængden af indsamlede væv være nok for cellekultur. Endelig vi ikke bruge tenocytes over passage seks i alle eksperimenter. Indtil passage seks mener vi, at de dyrkede celler stadig havde Karakteristik af degeneration.
Vores protokol har flere fordele. Disse fordele omfatter ingen skade på patienten, da de degenerative væv skulle fjernes under operationen, effektivitet, da mængden af væv krævede er nok for eksperimentet, stærkt etiske på grund af ingen overtrædelse af sunde væv, reproducerbarhed i at patologisk væv fra mennesker kan let opnået under operationen, og endelig lethed af ansøgningen én gang kirurgiske teknikker fortrolig.
Men vi erkender, at vores eksperiment har flere begrænsninger. Først, vi kan ikke helt udelukke rest effekten af tidligere kortikosteroid eller trombocyt rige plasma injektion selvom vi omfattede kun patienter, der havde bestået mindst tre måneder fra at modtage enhver tidligere behandling. Desuden, i denne protokol, vi kun høstet ECRB senen og brugt det til kultur degenerative tenocytes da ECRB senen er en fælles tendinopati site for kirurgi samt Achilles og rotator cuff sener. Yderligere undersøgelser bør gennemføres med en større stikprøvestørrelse fokuserer på eventuelle forskelle mellem forskellige tendinopati sites.
Afslutningsvis, vil dette validerede protokol for at opnå menneskelige degenerative tenocytes være et nyttigt redskab for fremtidige undersøgelser i senen biologi og for test roman terapeutiske indgreb.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af en bevilling fra Korea sundhed Technology R & D projekt gennem Korea sundhed industri udvikling Institute (KHIDI), som blev finansieret af Ministeriet for sundhed og velfærd, Republikken Korea (giver nummer: HI16C1559).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Scalpel | Kisanbio | KS-Q0306-15 | No. 15 |
| Mini-blade | Beaver | 374769 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco | 11995065 | |
| PBS | Gibco | 14190250 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| 50 mM ascorbic acid-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Gibco | 15240062 | |
| 4% formaldehyde | Bio-solution | BP031 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ml | |
| BSA | Rdtech | C0082 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ml | |
| MKX (C-5) | Santa cruz biotechnology | sc-515878 | |
| Tenomodulin (N-14) | Santa cruz biotechnology | sc-49325 | |
| Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| WST-1 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | |
| BrdU Cell Proliferation Assay Kit | Cell Signaling Technology | #6813 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8891 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
| GAPDH | Thermo Fisher Scientific | Hs02786624_g1 | |
| COL3A1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00943809_m1 | |
| ACTA2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00426835_g1 | |
| TAC1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00243225_m1 | |
| TACR1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00185530_m1 | |
| PTGS2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00153133_m1 | |
| ACTB | Thermo Fisher Scientific | Hs99999903_m1 | |
| Cell Strainers (100 µm) | Corning | 352360 | |
| 100mm culture dish | Thermo Fisher Scientific | 8188207 | |
| 8-well Chamber Slide | Thermo Fisher Scientific | 154534 | |
| 96 Well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3596 | |
| Nikon Eclipse 50i Microscope | Nikon | ||
| VERSA max microplate reader | Molecular Devices | ||
| CFX96 Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | ||
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Paraffins | Leica Biosystems | 3801340 | |
| Ethanol | JUNSEI CHEMICAL | 90303-2185 | |
| Hematoxylin | DAKO | CS70030-2 | |
| Eosin | DAKO | CS70130-2 | |
| Alcian blue | DAKO | AR16011-2 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Xylene | JUNSEI CHEMICAL | 25165-0430 | |
| Endogenous peroxidases | DAKO | S200380-2 | |
| Canada balsam | JUNSEI CHEMICAL | 23255-1210 | |
| Microtome Blade | FEATHER | A35 | |
| Slide glass | SUPERIOR | 1000612 | |
| Cover glass | Marienfeld-Superior | 101050 | |
| VEGF | Santa cruz biotechnology | sc-7269 | |
| SPSS Software | IBM | Ver. 18.0 | |
| Multi-purpose Centrifuge | LABOGENE | 1248R |
References
- Ackermann, P. W., Renstrom, P. Tendinopathy in sport. Sports Health. 4 (3), 193-201 (2012).
- Maffulli, N., Wong, J., Almekinders, L. C.
- Lui, P. P., Chan, L. S., Fu, S. C., Chan, K. M. Expression of sensory neuropeptides in tendon is associated with failed healing and activity-related tendon pain in collagenase-induced tendon injury. American Journal of Sports Medicine. 38 (4), 757-764 (2010).
- Han, S. H., et al. Effects of corticosteroid on the expressions of neuropeptide and cytokine mRNA and on tenocyte viability in lateral epicondylitis. Journal of Inflammation (London). 9 (1), 40 (2012).
- Uchio, Y., et al. Expression of neuropeptides and cytokines at the extensor carpi radialis brevis muscle origin. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 11 (6), 570-575 (2002).
- Lieber, R. L., Loren, G. J., Friden, J. In vivo measurement of human wrist extensor muscle sarcomere length changes. Journal of Neurophysiology. 71 (3), 874-881 (1994).
- Regan, W., Wold, L. E., Coonrad, R., Morrey, B. F. Microscopic histopathology of chronic refractory lateral epicondylitis. American Journal of Sports Medicine. 20 (6), 746-749 (1992).
- Sharma, P., Maffulli, N. Tendon injury and tendinopathy: healing and repair. Journal of Bone and Joint Surgery American volume. 87 (1), 187-202 (2005).
- Lui, P. P. Stem cell technology for tendon regeneration: current status, challenges, and future research directions. Stem Cells Cloning. 8, 163-174 (2015).
- Dahlgren, L. A., van der Meulen, M. C., Bertram, J. E., Starrak, G. S., Nixon, A. J. Insulin-like growth factor-I improves cellular and molecular aspects of healing in a collagenase-induced model of flexor tendinitis. Journal of Orthopedic Research. 20 (5), 910-919 (2002).
- Schnabel, L. V., et al. Mesenchymal stem cells and insulin-like growth factor-I gene-enhanced mesenchymal stem cells improve structural aspects of healing in equine flexor digitorum superficialis tendons. Journal of Orthopedic Research. 27 (10), 1392-1398 (2009).
- Durgam, S. S., Stewart, A. A., Sivaguru, M., Wagoner Johnson, A. J., Stewart, M. C. Tendon-derived progenitor cells improve healing of collagenase-induced flexor tendinitis. Journal of Orthopedic Research. 34 (12), 2162-2171 (2016).
- Titan, A., Andarawis-Puri, N. Tendinopathy: Investigating the Intersection of Clinical and Animal Research to Identify Progress and Hurdles in the Field. Journal of Bone and Joint Surgery Review. 4 (10), (2016).
- Dirks, R. C., Warden, S. J.
- de Mos, M., et al. Can platelet-rich plasma enhance tendon repair? A cell culture study. American Journal of Sports Medicine. 36 (6), 1171-1178 (2008).
- Scherb, M. B., Han, S. H., Courneya, J. P., Guyton, G. P., Schon, L. C. Effect of bupivacaine on cultured tenocytes. Orthopedics. 32 (1), 26 (2009).
- Wong, M. W., et al. Effect of dexamethasone on cultured human tenocytes and its reversibility by platelet-derived growth factor. Journal of Bone and Joint Surgery American Volume. 85 (10), 1914-1920 (2003).
- Tempfer, H., et al. Effects of crystalline glucocorticoid triamcinolone acetonide on cultered human supraspinatus tendon cells. Acta Orthopaedics. 80 (3), 357-362 (2009).
- Menon, A., et al. New insights in extracellular matrix remodeling and collagen turnover related pathways in cultured human tenocytes after ciprofloxacin administration. Muscles Ligaments Tendons J. 3 (3), 122-131 (2013).
- Backman, L. J., Fong, G., Andersson, G., Scott, A., Danielson, P. Substance P is a mechanoresponsive, autocrine regulator of human tenocyte proliferation. PLoS One. 6 (11), 27209 (2011).
- Backman, L. J., Eriksson, D. E., Danielson, P. Substance P reduces TNF-alpha-induced apoptosis in human tenocytes through NK-1 receptor stimulation. Britich Journal of Sports Medicine. 48 (19), 1414-1420 (2014).
- Rolf, C. G., Fu, B. S., Pau, A., Wang, W., Chan, B. Increased cell proliferation and associated expression of PDGFRbeta causing hypercellularity in patellar tendinosis. Rheumatology (Oxford). 40 (3), 256-261 (2001).
- Hoppe, S., et al. Tenocytes of chronic rotator cuff tendon tears can be stimulated by platelet-released growth factors. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 22 (3), 340-349 (2013).
- Schipper, O. N., Dunn, J. H., Ochiai, D. H., Donovan, J. S., Nirschl, R. P. Nirschl surgical technique for concomitant lateral and medial elbow tendinosis: a retrospective review of 53 elbows with a mean follow-up of 11.7 years. American Journal of Sports Medicine. 39 (5), 972-976 (2011).
- Cook, J. L., Feller, J. A., Bonar, S. F., Khan, K. M. Abnormal tenocyte morphology is more prevalent than collagen disruption in asymptomatic athletes' patellar tendons. Journal of Orthopedic Research. 22 (2), 334-338 (2004).
- Yuan, T., et al. Creating an Animal Model of Tendinopathy by Inducing Chondrogenic Differentiation with Kartogenin. PLoS One. 11 (2), 0148557 (2016).
- Lui, P. P., Maffulli, N., Rolf, C., Smith, R. K. What are the validated animal models for tendinopathy. Scandinavian Journal of Medical Scientific Sports. 21 (1), 3-17 (2011).
- Wilhelm, A. Lateral epicondylitis review and current concepts. Journal of Hand Surgery American Volume. 34 (7), author reply 1359-1360 1359-1360 (2009).
