Summary
In vitro bruk av degenerative tenocytes er viktig når undersøke virkningen av ny behandling på tendinopathy. De fleste undersøkelser bruker imidlertid bare dyr modell eller en sunn tenocyte. Vi foreslår følgende protokollen for å isolere menneskelige degenerative tenocytes under operasjonen.
Abstract
Tendinopathy, en smertefull tilstand som utvikler svar på sene degenerasjon, er på veksten i den industrialiserte verden på grunn av økende fysisk aktivitet og lengre levetid. Til tross for dens økende utbredelse underliggende patogenesen fortsatt uklart, og behandling er vanligvis symptomatisk. Nylig ble mange behandlingsalternativer, inkludert vekstfaktorer stamceller og genterapi, undersøkt i håp om å forbedre healing styrken på degenerative senen. Men ble fleste av disse undersøkelsene utført på dyremodeller eller sunn menneskelig tenocytes. Til tross for noen studier med patologisk tenocytes, til best av vår kunnskap er det for øyeblikket ingen protokoll som beskriver hvordan du skaffer menneskelige degenerative tenocytes. Målet med denne studien er å beskrive en standardprotokoll for å anskaffe menneskelige degenerative tenocytes. Sene vevet ble først høstet fra en pasient med lateral epikondylitis(leddsmerter) under operasjonen. Deretter ble biopsi prøver tatt fra extensor carpi radialis brevis senen tilsvarer strukturelle endringer observert ved kirurgi. Alle høstet sener syntes å være kjedelig, grå, basert, og edematous, som gjorde dem visuelt forskjellig fra sunne de. Tenocytes ble kultivert og for eksperimenter. I mellomtiden, halvparten av høstet vev ble analysert histologisk, og det ble vist at de delte de samme nøkkel vise egenskaper av tendinopathy (angiofibroblastic dysplasia eller hyperplasia). En sekundær analyse av immunocytochemistry bekreftet at kulturperler cellene var tenocytes med fleste cellene ha positiv flekker for mohawk og tenomodulin proteiner. Kvaliteter av degenerative natur tenocytes ble deretter fastsatt av sammenligner cellene med sunn kontrollen bruker en spredning analysen eller qRT PCR. Den degenerative tenocyte vises høyere spredning overføringshastighet og lignende genet uttrykk mønstre for tendinopathy som matchet tidligere rapporter. Total, denne nye protokollen kan gi et nyttig verktøy for fremtidige studier av tendinopathy.
Introduction
Tendinopathy er en kronisk degenerative muskel tilstand som utvikler i ulike deler av kroppen. Nylig, antall tilfeller av tendinopathy har økt kraftig i den utviklede verden av økende deltakelse i fritidssportslige aktiviteter og økt levetid1,2. Årsaken til tendinopathy anses å være multifaktoriell og disse årsaker inkluderer iskemi, oksygen frie radikaler skader, en ubalanse mellom vasoconstrictor og vasodilator innervations, interne mikro-tårer og endringer i Nevro-regulering3 ,,4,,5,,6,,7,,8. De fleste behandlinger for tendinopathy bare lindre symptomene. Videre, behandlinger uten vev gjenfødelse krever lang tid for rehabilitering og oppnå en begrenset respons fra skadet sener, som pålegger en klinisk utfordring for leger9.
Inkompetansen til gjeldende behandlingsalternativer med mangel på degenerative senens evne til å self-heal har ledende forskere å ta interesse i å utforske alternativ behandling strategier. Nylig nye studier rapporterte mange lovende resultater for å øke den helbredende effekten av tendinopathy sener bruker vekstfaktorer, Stamcelle basert terapi og gene terapi10,11,12.
Gjennom en gjennomgang, fant vi at involvert studiene kan deles inn i to kategorier basert på sine analyser materialer: dyr modeller som rotte, en mus eller en kanin; og human modeller. Med hensyn til dyr modellen, for tiden er det to populære teknikker for å generere tendinopathy: kjemiske induksjon av skade eller mekanisk overbelastning modellen. Men var hver dyr modell begrenset inne reproduserbar det komplekse human tendinopathy patologi13,14.
De fleste dokumenter med prøver fra mennesker ble analysert histologisk eller utført den i vitro eksperimentet basert på en sunn menneskelig tenocyte i stedet for en degenerativ tenocyte15,16,17,18 , 19 , 20 , 21. bare noen papirer rapporterte at de brukte en menneskelig degenerative tenocyte, men de gjorde ikke beskrive i detalj protokollen for å få den degenerative tenocyte fra menneskelige22,23. I denne sammenheng bør det bemerkes at vellykkede resultater fra dyr modellen eller sunt vev/tenocyte ikke kan nødvendigvis forutsi menneskelige effekt eller effektiv dosering fordi sene degenerasjon er en komplisert prosess og patogenesen er fortsatt ikke fullt ut forstått.
Kollektivt, er det nødvendig å beskrive standardprotokollen for å skaffe det utarte tenocyte fra menneskelig vev uten å forårsake bivirkninger donor. Denne artikkelen beskriver en protokoll for hvordan å skaffe den menneskelige degenerative tenocyte. For å validere protokollen, ble høstet vev analysert histologisk. Deretter ble kulturperler cellen bekreftet som den degenerative tenocyte av immunocytochemistry (ICC), en kvantitativ sanntid-polymerasekjedereaksjons (qRT-PCR) og en levedyktighet analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen ble utført i henhold til erklæringen i Helsinki og protokollen ble godkjent av institusjonelle anmeldelsen bord på CHA hjem i Bundang Medical Center.
1. degenerative sene vev Harvest fra pasienten
- Diagnostisere lateral epikondylitis(leddsmerter) ved å ta en medisinsk historie og bruke fysisk eksamen funn: ømhet over tendinous opprinnelse nær den laterale epicondyle; smerter fremkalt av motstått i håndleddet joint.
- Bruk følgende inklusjonskriterier: over 18 år; en historie av lateral epikondylitis(leddsmerter) i minst seks måneder; gjenstridige for ikke-operative behandling; minst tre måneder har gått siden kortikosteroid, blodplater rik plasma eller Botulinumtoksin
- Utelat følgende: gravide kvinner; pasienter med en historie av cervical ryggraden sykdom, albue leddgikt, rheumatologic sykdom, kirurgi rundt albuen og nerve entrapment syndrom; pasienter nekter å donere vev.
-
Kirurgisk teknikk
Merk: Se figur 124.- Etter narkose ved isoflurane og endotracheal intubasjon, la armen på bordet og søke en tourniquet. Deretter bruke betadine agent på hele armen og drapere med en steril kirurgisk ark.
- Utsett lateral albuen gjennom en 3-5 cm snitt med nei 15 kirurgisk skalpell blad bare anteromedial av lateral epicondyle og proksimale til nivået av felles.
- Visuelt identifisere extensor carpi radialis longus (ECRL) og extensor aponeurosis grensesnittet og gjøre en splitting snitt 2-3 mm i dybde mellom ECRL og extensor aponeurosis med nei 15 kirurgisk skalpell blad på identifiserte grensesnittet.
- Pakk ECRL peke, som vil bringe patologisk extensor carpi radialis longus brevis (ECRB) opprinnelse nedenfor til direkte visning.
- Visuelt finne patologisk degenerative vev ved sin karakteristiske kjedelig grayish farge og vanligvis edematous og basert vev.
- Etter identifikasjon, nøye resect alle degenerative tissue benytter kraftig nr 15 kirurgisk skalpell og mini-blader.
- Bygge inn resected vev (ca 1 cm3) i fosfat bufret saltvann (PBS) umiddelbart og fjerne alle de omkringliggende vev unntatt sene vev nøye i ca 10 mL av PBS så snart som mulig.
- I tilfeller med benete exostosis på den laterale epicondyle, fjerne exostosis bruker en rongeur og smoothen det med en rasp. Gjøre flere borehull (diameter 1,6 mm, ca 6-8 hull) i anterolaterale condyle å øke vascular forsyning. Dette er valgfritt.
- Lukke såret lagvis med ikke-absorberbare Sutur materiale.
-
Sunn kontroll tenocyte
- Få sunn tenocytes fra gjenværende senen av auto-hamstring eller auto-patella senen under fremre korsbånd gjenoppbygging, og bruke den som kontrollen for følgende eksperiment25.
Merk: Antall prøver som brukes i denne studien var tre i hver gruppe.
- Få sunn tenocytes fra gjenværende senen av auto-hamstring eller auto-patella senen under fremre korsbånd gjenoppbygging, og bruke den som kontrollen for følgende eksperiment25.
2. histology
- Lagre omtrent halvparten av høstet vev i nøytral bufrede 10% formalin i en kjemisk avtrekksvifte eller tilsvarende.
- Embed vevet i en parafin blokk (4-5 mL) og del det i 4 – 5 µm deler coronally.
-
Stain inndelinger fra kontroll og degenerative sene med Hematoxylin og Eosin flekk (H & E) og Alcian blå flekker på en pH på 2,5. Utføre H & E farging i en automatisert flekken maskin som følger.
- Deparaffinize bruker xylen (3 ganger, 5 min, henholdsvis).
- Fukt fra gradert alkoholer vann (100% alkohol, 4 min, 100% alkohol, 3 min, 95% alkohol, 2 min, 70% alkohol, 1 min, vann, 2 min).
- Stain i Hematoxylin for 5 min. vaske i vann i 2 minutter.
- Skille i 1% syre alkohol (1% HCl i 70% alkohol) for 3 s. vask godt i vann i 3 minutter.
- Nøytralisere HCl av dipping i en 0,5% ammoniakk for 10 s, etterfulgt av en 3 min vann vask.
- Stain i Eosion i 5 minutter.
- Tørke gjennom alkoholer (80% alkohol, 30 s 95% alkohol, 1 min; 100% alkohol 1 min, 100% alkohol 2 min).
- Klart i xylen (3 ganger, 2 minutter, 2 min og 3 min., henholdsvis).
- Montere med Skyv dekselet.
-
Utføre immunohistochemitry (IHC) Bond Polymer avgrense oppdagelsen utstyr i henhold til produsentens instruksjoner med mindre endringer.
- Etter deparaffinization bruker xylen, bruke en antigen henting fremgangsmåten bruker Bond Epitope henting løsning for 30 min på 100 ° C. Bond Epitope henting løsningen inneholder en citrate basert buffer og surfactant (1 L, pH 5.9-6.1).
- Slukke endogene peroxidases av rugende vevet med hydrogenperoksid i 5 min.
- Inkuber delene i 15 min ved en omgivelsestemperatur (21-22 ° C) med primære antistoffer mot vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) (1:200), tenomodulin (1:200) eller mohawk (1:200).
- Utføre sekundære antistoff merking med biotin-fri polymere pepperrot peroxidase-linker antistoff konjugat system.
- Bruk sekundære kanin anti musen IgG i 10% (v/v) dyr serum i Tris-bufret saline/0.09% 2-Methyl-4-isothiazolin-3-one løsning å lokalisere muse-antistoffer.
- Bruke polymer anti-kanin Poly-HRP-IgG (< 25 µg/mL) som inneholder 10% (v/v) dyr serum i Tris-bufret saline/0.09% å lokalisere kanin antistoffer.
- Bruk 3, 3-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrat i en stabilisator løsning å visualisere komplekset via en brun utløse.
- Counterstain med < 0,1% hematoxylin (blå) å visualisere celle kjerner.
- Observere lysbildene med H & E, Alcian blå flekker og IHC for VEGF, tenomodulin og mohawk under lys mikroskop og få representativt mikroskopiske bilder av hvert lysbilde under en høy makt-feltet (400 X).
3. Tenocyte kultur
-
Vev forberedelse
- Forberede sene prøven ved å fjerne alle de omkringliggende vev grundig med mikro-saks og tang.
- Vask med PBS og hakke i små biter (om 1 mm3 eller mindre).
- Fordøye vev 1t i 30 mL av Dulbeccos endret Eagle's Medium (DMEM) med 30 mg/mL Collagenase II på 37 ° C.
- Passere en 100 µm celle sil celler.
- Deaktivere Collagenase II ved å legge til 1 mL av fetal bovin serum (FBS).
- Sentrifuge 196 x g i 5 min.
-
Cellekultur
- Frø 3 x 105 celler i en 100 mm parabol og kultur med DMEM supplert med 10% FBS og 1% antibiotika-Antimycotic løsning på 37 ° C i en 5% CO2 inkubator for 1 uke.
- Endre kultur medium hver tre dager inntil 80% samløpet oppstår. Kultur både sunn kontroll og degenerative celle prøver før passering fire og bruker for eksperimentet.
4. Immunocytochemistry (ICC)
- Overføre 200 µL kulturperler cellen (2 x 105 celler) åtte fordelt av et kammer lysbilde og vokse cellene til samløpet med tillegg av fersk media for en dag.
- Vask cellene med PBS og fikse med 500 µL av 4% formaldehyd per brønn.
- Inkuber lysbildene med 0,5% Triton X-100 i PBS i 10 min for permeabilization av membraner.
- Blokkere i PBS med 1% bovin serum albumin og 0,05% TWEEN-20 mohawk og tenomodulin, henholdsvis.
- Inkuber i mørket med musen anti-mohawk monoklonalt antistoff (1: 100 fortynning) og geit anti-tenomodulin antistoff (1: 100 fortynning) på 4 ° C over natten.
- Inkuber sekundære antistoffer (Alexa 555-anti geit (1:200) til tenomodulin; Alexa 488-anti mus (1:200) for mohawk) i mørket 1t ved romtemperatur.
- Montere med 0,5 µL av en fluorescens montering medium.
- Analysere bruker fluorescens mikroskop (400 X).
5. spredning analysen
-
Måle celle viabilities ved hjelp av vannløselige tetrazolium (WST) -1.
- Frø både sunn og degenerative celler i 96 bra plater på en tetthet av 2 x 103 celler per brønn for 24 og 72 120 timer.
- Etter inkubasjon Legg 10 µL av 10% WST-1-løsning i hver brønn.
- Inkuber platene for 3t på 37 ° C i 5% CO2.
- Måle de optiske tettheter ved 450 nm likner en microplate. Ta målinger minst tre ganger på alle tidspunkt for hver prøve.
-
Mål mobilnettet DNA beløpet med BrdU analysen.
- Frø både sunn og degenerative celle i 96 plater godt på en tetthet av 2 x 103 celler per brønn for 24 og 72 120 timer.
- Etter inkubasjon Legg 10 µL av 10% BrdU løsning i hver brønn.
- Inkuber platene for 3t på 37 ° C i 5% CO2.
- Legge til 100 µL/vel av fikse/Denaturing løsning (60-70% etanol, 0.1-0,5% natriumhydroksid) og holde platen ved romtemperatur for 30 min.
- Tilsett 100 µL/godt tilberedt 1 x oppdagelsen antistoff løsning og holde platen ved romtemperatur 1t.
- Fjerne løsning og vask plate tre ganger med 1 x vaskebuffer.
- Tilsett 100 µL/godt tilberedt 1 x HRP-konjugerte antistoffer sekundær løsning og holde platen ved romtemperatur for 30 min.
- Fjern løsningen og vaske platen tre ganger med 1 x vaskebuffer.
- Legg 100 µL av 50% TMB-substratet.
- Inkuber i 30 min ved romtemperatur.
- Legg 100 µL av stopp løsning.
- Måle de optiske tettheter ved 450 nm likner en microplate.
Merk: Ta målinger minst tre ganger på hele tiden poeng for hvert utvalg.
6. statistisk analyse
- Samle inn og analysere data ved hjelp av SPSS.
- Vise data av gjennomsnittlig ± standardfeil betyr.
- Bruk Mann Whitney U test.
- Vurdere forskjeller statistisk signifikant når p -verdien er mindre enn 0.05 (p < 0,05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Histologiske analyser viste at det høstes vev fra lateral epikondylitis(leddsmerter) hadde egenskapene til en tendinopathic sene. H & E delen av tendinopathy degenerative sene avslørte en uorganisert kollagen bunt med tap av polaritet og fine rett, sterkt pakket parallelle fiber strukturer. Histologiske tegn suggestiv av netthinnen som høyere cellularity og forstørret kjerner uten typisk spindel figuren var vanlig i prøvene. I tillegg kollagen bunter av degenerert senen var relativt svake eosin farget av H & E men var positivt farget av Alcian blå indikerer økt proteoglycans og glycosaminoglycans stoff.
I alle tilfeller blodkar økte i antall og aggregat opptar mellomrom innebygd mellom fiber ble sammenlignet med normal splitt-lignende blodkar. I IHC farging viste cellene i degenerert sener cytoplasmatiske detaljert positiv reaksjon på VEGF i forhold til kontrollen de negative reaksjonen. Samlet disse funnene bekreftet at høstet vev fra lateral epikondylitis(leddsmerter) var degenerative vev og egnet for degenerative tenocyte kultur (se figur 2).
Kultivert cellene ble bekreftet som tenocytes av ICC og høstet vev ble bekreftet av IHC som sene vev. De fleste av de kulturperler cellene og i sene vev viste en positiv flekk for representant tenocyte indikatorene kjent som mohawk (grønn) proteiner og tenomodulin (rød) proteiner med en langstrakt opptreden under mikroskopi (se fig. 3). Også hadde høstet vev den positive flekker for mohawk proteiner og tenomodulin proteiner immunohistochemically (se utfyllende figur 1). Dette foreslo at høstet vev er komponert av sene vevet.
Kultivert tenocytes fra høstet vev av lateral epikondylitis(leddsmerter) hadde de karakteristiske trekk som tilsvarer tendinopathy. Både degenerative og sunt tenocytes ble kultivert for 4 dager under samme betingelse. På hvert punkt, ble spredning hastigheten målt ved BrdU analysen og WST-1 analysen. Resultatene viste at spredning frekvensen av degenerative cellene var betydelig høyere enn kontrollene som tidligere rapportert (p < 0,05) (se Figur 4A).
Fem gener som er kjent for å være opp-regulert i degenerative senen ble analysert av qRT PCR. Uttrykk for genene, COL3A1, ACTA2, TAC1 (SP), TAC reseptor 1, og PTGS2 (COX2) økte mer betydelig i kulturperler cellene fra degenerative senen enn i cellene fra de sunne. De relative uttrykkene for alle gener er vist i Figur 4B og supplerende figur 2.
Figur 1 : Kirurgisk bilde av degenerative sene harvest. (A) etter huden snitt og disseksjon, patologisk degenerative vevet felles extensor opprinnelse ble utsatt, viser en karakteristisk kjedelig grålig farge med edematous endring (rød linje). Derimot var det generelle utseendet av normal sene vev skinnende og fast med en litt grayish tone (svart linje). (B) alle identifiserte degenerative vev ble kappet kraftig og deretter radial hodet bein ble utsatt. (C) alle resected vev var innebygd i fosfat bufret saltkildene umiddelbart og de omkringliggende ikke-tendinous vev ble omhyggelig dissekert så snart som mulig. ECRB: extensor carpi radialis brevis. EDC: extensor digitorum communis. ECU: extensor carpi ulnaris. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Bekreftelse av degenerative sene histologisk. (A) i H & E flekker, degenerative prøver fra den laterale epikondylitis(leddsmerter) hadde uorganisert kollagen bunt med tap av polaritet og økt celle nummer i forhold til sunn kontrollen. (B). Alcian blå flekker viste at degenerative senen hadde økt bakken rusmiddel bestående av proteoglycans og glycosaminoglycans med flere mucoid patcher og vacuoles mellom fiber (pil). (C). dessuten VEGF immunohistochemistry demonstrert økt farging i fartøyet formasjon i degenerative sene prøver i forhold til kontrollen prøvene. VEGF: Vaskulær endotelial vekstfaktor. Skala bar = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Identifikasjon av tenocyte av ICC. Kultivert celler og celler i sene vev ble bekreftet som tenocyte av ICC. De fleste av cellene viste positiv flekken for representant tenocyte markøren, inkludert mohawk (grønn) og tenomodulin (rød) med langstrakt utseende under mikroskopi. Chondrocyte ble brukt som kontrollen negative. ICC: Immunocytochemistry. Skala bar = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Kjennetegner degenerative tenocyte. (A, B) Degenerative tenocytes (rød) hadde en høyere spredning rate med en merkbar økning i cellularity. (C) fem gener som er kjent for å være relatert i utviklingen av tendinopathy var betydelig opphøyet i det utarte tenocytes. Gene expression nivåer var normalisert mot GAPDH. *: mener < 0,05, **: mener < 0,01, henholdsvis. SP: stoff P. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 1: histologiske bekreftelse av høstet vev som sene vevet. Høstet vevet var også analysert ved IHC mohawk og tenomodulin å avgjøre om høstet vevet hadde tilstrekkelig kjennetegner sene vev. IHC: Immunohistochemistry. Skala bar = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 2: uttrykk for tendinopathy relaterte gener i tenocyte. Utskrifter av fem gener normalisert ved utgangen uttrykk var betydelig opphøyet i det utarte tenocytes og har lignende trender Figur 4. Gene expression nivåer var normalisert mot utgangen med en gjennomsnittlig < 0,05 og < 0,01, henholdsvis. SP: stoff P. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En rekke tidligere studier har rapportert opprette kronisk tendinopathic dyr modeller med ulike prosedyrer som collagenase eller kartogenin injeksjon, tredemølle kjører og mer26,27. Selv om mange studier viste lovende terapeutiske effekter basert på disse dyr modeller, ville eksperimenter ved hjelp av den menneskelige degenerative tenocyte være avgjørende innen tendinopathy for å reprodusere effekten av behandlingen. I denne artikkelen etablert vi en protokoll for å kunne høste og kultur menneskelige degenerative tenocytes konsekvent. Begge høstet sene vev og kultivert tenocyte viste de felles kjennetegnene ved de degenerative sene og tenocyte7,28.
I vår erfaring er for vellykket vev innhøstingen, det viktig å forstå morfologiske endringene ofte assosiert med degenerative sene og nøyaktig avgrense området under operasjonen. Degenerative vev er vanligvis grå eller brun i fargen og vev er tynn, skjøre og uorganisert med løs struktur. Inkludering og ekskludering kriteriene for protokollen bør holdes strengt med nøye vurdering av tidligere behandlinger før innhøsting.
Vev er også viktig for en vellykket cellekultur. Vi anbefaler høsting mer enn 1 cm3. Vanligvis så lenge alle de degenerative området fjernes, ville mengden innsamlede vev være nok for cellekultur. Til slutt, vi ikke brukte tenocytes over passasjen seks i alle eksperimentene. Før passering seks tror vi at kulturperler cellene fortsatt hadde egenskapene til degenerasjon.
Våre protokollen har flere fordeler. Fordelene inkluderer ingen skade pasienten siden degenerative vevet skulle fjernes under operasjonen, effektivitet siden mengden vev kreves er nok for eksperimentet, høyt etisk ingen brudd sunt vev, reproduserbarhet at patologisk vev fra mennesker kan lett oppnås under operasjonen, og til slutt, enkel program en gang kirurgiske teknikker kjent.
Men erkjenner vi at vår eksperimentet har flere begrensninger. Først, vi kan ikke helt utelukke rest effekten av tidligere kortikosteroid eller blodplater rik plasma injeksjon selv om vi inkludert bare pasienter som hadde passert minst tre måneder fra noen tidligere behandling. I tillegg i denne protokollen, vi bare høstet ECRB sene og anvendt den å kultur degenerative tenocytes siden ECRB sene er en felles tendinopathy nettsted for kirurgi med Akilles og rotatorcuff sener. Videre studier bør utføres med en større fokus på alle forskjeller mellom ulike tendinopathy nettsteder.
Avslutningsvis vil denne validert protokollen for å skaffe menneskelige degenerative tenocytes være et nyttig verktøy for fremtidige undersøkelser i sene biologi og testing romanen terapeutisk intervensjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av et stipend fra Korea helse teknologi R & D prosjektet gjennom den Korea helse industri Development Institute (KHIDI), som ble finansiert av helse og velferd, Sør-Korea (gi nummer: HI16C1559).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Scalpel | Kisanbio | KS-Q0306-15 | No. 15 |
| Mini-blade | Beaver | 374769 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco | 11995065 | |
| PBS | Gibco | 14190250 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| 50 mM ascorbic acid-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Gibco | 15240062 | |
| 4% formaldehyde | Bio-solution | BP031 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ml | |
| BSA | Rdtech | C0082 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ml | |
| MKX (C-5) | Santa cruz biotechnology | sc-515878 | |
| Tenomodulin (N-14) | Santa cruz biotechnology | sc-49325 | |
| Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| WST-1 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | |
| BrdU Cell Proliferation Assay Kit | Cell Signaling Technology | #6813 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8891 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
| GAPDH | Thermo Fisher Scientific | Hs02786624_g1 | |
| COL3A1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00943809_m1 | |
| ACTA2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00426835_g1 | |
| TAC1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00243225_m1 | |
| TACR1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00185530_m1 | |
| PTGS2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00153133_m1 | |
| ACTB | Thermo Fisher Scientific | Hs99999903_m1 | |
| Cell Strainers (100 µm) | Corning | 352360 | |
| 100mm culture dish | Thermo Fisher Scientific | 8188207 | |
| 8-well Chamber Slide | Thermo Fisher Scientific | 154534 | |
| 96 Well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3596 | |
| Nikon Eclipse 50i Microscope | Nikon | ||
| VERSA max microplate reader | Molecular Devices | ||
| CFX96 Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | ||
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Paraffins | Leica Biosystems | 3801340 | |
| Ethanol | JUNSEI CHEMICAL | 90303-2185 | |
| Hematoxylin | DAKO | CS70030-2 | |
| Eosin | DAKO | CS70130-2 | |
| Alcian blue | DAKO | AR16011-2 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Xylene | JUNSEI CHEMICAL | 25165-0430 | |
| Endogenous peroxidases | DAKO | S200380-2 | |
| Canada balsam | JUNSEI CHEMICAL | 23255-1210 | |
| Microtome Blade | FEATHER | A35 | |
| Slide glass | SUPERIOR | 1000612 | |
| Cover glass | Marienfeld-Superior | 101050 | |
| VEGF | Santa cruz biotechnology | sc-7269 | |
| SPSS Software | IBM | Ver. 18.0 | |
| Multi-purpose Centrifuge | LABOGENE | 1248R |
References
- Ackermann, P. W., Renstrom, P. Tendinopathy in sport. Sports Health. 4 (3), 193-201 (2012).
- Maffulli, N., Wong, J., Almekinders, L. C. Types and epidemiology of tendinopathy. Clinical Sports Medicine. 22 (4), 675-692 (2003).
- Lui, P. P., Chan, L. S., Fu, S. C., Chan, K. M. Expression of sensory neuropeptides in tendon is associated with failed healing and activity-related tendon pain in collagenase-induced tendon injury. American Journal of Sports Medicine. 38 (4), 757-764 (2010).
- Han, S. H., et al. Effects of corticosteroid on the expressions of neuropeptide and cytokine mRNA and on tenocyte viability in lateral epicondylitis. Journal of Inflammation (London). 9 (1), 40 (2012).
- Uchio, Y., et al. Expression of neuropeptides and cytokines at the extensor carpi radialis brevis muscle origin. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 11 (6), 570-575 (2002).
- Lieber, R. L., Loren, G. J., Friden, J. In vivo measurement of human wrist extensor muscle sarcomere length changes. Journal of Neurophysiology. 71 (3), 874-881 (1994).
- Regan, W., Wold, L. E., Coonrad, R., Morrey, B. F. Microscopic histopathology of chronic refractory lateral epicondylitis. American Journal of Sports Medicine. 20 (6), 746-749 (1992).
- Sharma, P., Maffulli, N. Tendon injury and tendinopathy: healing and repair. Journal of Bone and Joint Surgery American volume. 87 (1), 187-202 (2005).
- Lui, P. P. Stem cell technology for tendon regeneration: current status, challenges, and future research directions. Stem Cells Cloning. 8, 163-174 (2015).
- Dahlgren, L. A., van der Meulen, M. C., Bertram, J. E., Starrak, G. S., Nixon, A. J. Insulin-like growth factor-I improves cellular and molecular aspects of healing in a collagenase-induced model of flexor tendinitis. Journal of Orthopedic Research. 20 (5), 910-919 (2002).
- Schnabel, L. V., et al. Mesenchymal stem cells and insulin-like growth factor-I gene-enhanced mesenchymal stem cells improve structural aspects of healing in equine flexor digitorum superficialis tendons. Journal of Orthopedic Research. 27 (10), 1392-1398 (2009).
- Durgam, S. S., Stewart, A. A., Sivaguru, M., Wagoner Johnson, A. J., Stewart, M. C. Tendon-derived progenitor cells improve healing of collagenase-induced flexor tendinitis. Journal of Orthopedic Research. 34 (12), 2162-2171 (2016).
- Titan, A., Andarawis-Puri, N. Tendinopathy: Investigating the Intersection of Clinical and Animal Research to Identify Progress and Hurdles in the Field. Journal of Bone and Joint Surgery Review. 4 (10), (2016).
- Dirks, R. C., Warden, S. J. Models for the study of tendinopathy. Journal of Musculoskeletal Neuronal Interaction. 11 (2), 141-149 (2011).
- de Mos, M., et al. Can platelet-rich plasma enhance tendon repair? A cell culture study. American Journal of Sports Medicine. 36 (6), 1171-1178 (2008).
- Scherb, M. B., Han, S. H., Courneya, J. P., Guyton, G. P., Schon, L. C. Effect of bupivacaine on cultured tenocytes. Orthopedics. 32 (1), 26 (2009).
- Wong, M. W., et al. Effect of dexamethasone on cultured human tenocytes and its reversibility by platelet-derived growth factor. Journal of Bone and Joint Surgery American Volume. 85 (10), 1914-1920 (2003).
- Tempfer, H., et al. Effects of crystalline glucocorticoid triamcinolone acetonide on cultered human supraspinatus tendon cells. Acta Orthopaedics. 80 (3), 357-362 (2009).
- Menon, A., et al. New insights in extracellular matrix remodeling and collagen turnover related pathways in cultured human tenocytes after ciprofloxacin administration. Muscles Ligaments Tendons J. 3 (3), 122-131 (2013).
- Backman, L. J., Fong, G., Andersson, G., Scott, A., Danielson, P. Substance P is a mechanoresponsive, autocrine regulator of human tenocyte proliferation. PLoS One. 6 (11), 27209 (2011).
- Backman, L. J., Eriksson, D. E., Danielson, P. Substance P reduces TNF-alpha-induced apoptosis in human tenocytes through NK-1 receptor stimulation. Britich Journal of Sports Medicine. 48 (19), 1414-1420 (2014).
- Rolf, C. G., Fu, B. S., Pau, A., Wang, W., Chan, B. Increased cell proliferation and associated expression of PDGFRbeta causing hypercellularity in patellar tendinosis. Rheumatology (Oxford). 40 (3), 256-261 (2001).
- Hoppe, S., et al. Tenocytes of chronic rotator cuff tendon tears can be stimulated by platelet-released growth factors. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 22 (3), 340-349 (2013).
- Schipper, O. N., Dunn, J. H., Ochiai, D. H., Donovan, J. S., Nirschl, R. P. Nirschl surgical technique for concomitant lateral and medial elbow tendinosis: a retrospective review of 53 elbows with a mean follow-up of 11.7 years. American Journal of Sports Medicine. 39 (5), 972-976 (2011).
- Cook, J. L., Feller, J. A., Bonar, S. F., Khan, K. M. Abnormal tenocyte morphology is more prevalent than collagen disruption in asymptomatic athletes' patellar tendons. Journal of Orthopedic Research. 22 (2), 334-338 (2004).
- Yuan, T., et al. Creating an Animal Model of Tendinopathy by Inducing Chondrogenic Differentiation with Kartogenin. PLoS One. 11 (2), 0148557 (2016).
- Lui, P. P., Maffulli, N., Rolf, C., Smith, R. K. What are the validated animal models for tendinopathy. Scandinavian Journal of Medical Scientific Sports. 21 (1), 3-17 (2011).
- Wilhelm, A. Lateral epicondylitis review and current concepts. Journal of Hand Surgery American Volume. 34 (7), author reply 1359-1360 1359-1360 (2009).
