Summary
Uso in vitro di tenociti degenerativa è essenziale quando indagare l'efficacia del trattamento novello su tendinopathy. Tuttavia, molti studi di ricerca utilizzano solo il modello animale o un sano tenocyte. Vi proponiamo il seguente protocollo per isolare tenociti degenerativa umana durante la chirurgia.
Abstract
Tendinopatie, una condizione dolorosa che si sviluppa in risposta alla degenerazione del tendine, sono in aumento nei paesi industrializzati a causa della crescente attività fisica e maggiore aspettativa di vita. Nonostante la sua prevalenza aumentante, la patogenesi di fondo rimane ancora poco chiara, e il trattamento è generalmente sintomatico. Recentemente, numerose opzioni terapeutiche, tra cui fattori di crescita, cellule staminali e terapia genica, sono state studiate nella speranza di migliorare la potenza di guarigione del tendine degenerante. Tuttavia, la maggior parte di questi studi sono stati condotti solo su modelli animali o tenociti umano sano. Nonostante alcuni studi utilizzando tenociti patologiche, al meglio della nostra conoscenza non c'è attualmente nessun protocollo che descrive come ottenere umano tenociti degenerativa. Lo scopo di questo studio è di descrivere un protocollo standard per l'acquisizione di tenociti degenerativa umana. Inizialmente, il tessuto del tendine è stato raccolto da un paziente con epicondilite laterale durante la chirurgia. Quindi i campioni di biopsia sono stati prelevati il tendine di brevis radialis dei carpi dell'estensore corrispondenti ai cambiamenti strutturali osservati al momento della chirurgia. Tutti i tendini raccolti è sembrato essere opaco, grigio, friabile ed edematosa, che li ha resi visivamente distinta da quelle sane. Tenociti erano coltivati e utilizzati per esperimenti. Nel frattempo, la metà dei tessuti raccolti sono stata analizzata istologicamente ed è stato indicato che condividevano le stesse caratteristiche chiave della tendinopatia (displasia angiofibroblastic o iperplasia). Un'analisi secondaria di immunocitochimica ha confermato che le cellule coltivate erano tenociti con la maggior parte delle cellule che hanno le macchie positive per le proteine mohawk e tenomodulin. Le qualità della natura degenerativa di tenociti sono stati quindi determinate confrontando le cellule con il controllo sano mediante un'analisi di proliferazione o qRT-PCR. Il tenocyte degenerativa visualizzato un più alto tasso di proliferazione e simili modelli di espressione genica di tendinopathy corrispondenti rapporti precedenti. Nel complesso, questo nuovo protocollo potrebbe fornire uno strumento utile per gli studi futuri di tendinopatia.
Introduction
Tendinopatia è una condizione muscolo-scheletrica degenerativa cronica che si sviluppa in varie parti del corpo. Recentemente, il numero di casi di tendinopathy è aumentato notevolmente nel mondo sviluppato a causa della crescente partecipazione in attività sportive e una maggiore aspettativa di vita1,2. La causa della tendinopatia è considerata multifattoriale e queste cause comprendono ischemia, lesioni di radicali liberi dell'ossigeno, uno squilibrio tra innervazione vasocostrittore e vasodilatatore, micro-strappi interni ed i cambiamenti neuro-regolamento3 ,4,5,6,7,8. Maggior parte dei trattamenti per tendinopatia solo alleviare i suoi sintomi. Inoltre, trattamenti senza rigenerazione tissutale richiedono molto tempo per la riabilitazione ed ottenere una risposta limitata da tendini feriti, che impone una sfida clinica per i medici9.
L'incompetenza di opzioni correnti di trattamento insieme alla mancanza di capacità di tendine degenerante di Self-Heal ha piombo ricercatori ad interessarsi di esplorare strategie di trattamento alternativo. Recentemente, nuovi studi segnalati molti risultati promettenti per migliorare l'efficacia curativa dei tendini tendinopatie utilizzando fattori di crescita, basata sulle cellule staminali terapia e gene terapia10,11,12.
Attraverso una revisione della letteratura, abbiamo trovato che gli studi coinvolti possono essere diviso in due categorie basate sulla loro materiali di analisi: modelli animali come un topo, un topo o un coniglio; e modelli umani. Per quanto riguarda il modello animale, attualmente ci sono due tecniche popolari per generare tendinopathy: induzione chimica di lesioni o meccanico sovraccaricare il modello. Tuttavia, ogni modello animale è stato limitato nel riprodurre le tendinopatie umana complessa patologia13,14.
Maggior parte delle carte utilizzando campioni umani sono stati analizzati istologicamente o eseguita l' in vitro esperimento basato su un tenocyte umano sano anziché un degenerativa tenocyte15,16,17,18 , 19 , 20 , 21. solo poche carte segnalato che hanno usato un umano tenocyte degenerativa, ma non ha descritto in dettaglio il protocollo utilizzato per ottenere il tenocyte degenerativa dal umano22,23. In questo contesto, si deve sottolineare che risultati di successo dal modello animale o il tessuto sano/tenocyte non possono necessariamente prevedere efficacia umana o dosaggio efficace perché la degenerazione del tendine è un processo complicato e la patogenesi è ancora non pienamente compreso.
Collettivamente, è necessario descrivere il protocollo standard per ottenere il tenocyte degenerativa dal tessuto umano senza causare effetti negativi al donatore. Questo articolo descrive un protocollo su come acquisire l'umana tenocyte degenerativa. Per convalidare il protocollo, i tessuti raccolti sono stati analizzati istologicamente. Quindi, le cellule in coltura è stata confermata come la tenocyte degenerativa mediante immunocitochimica (ICC), una reazione a catena della polimerasi di tempo reale quantitativa (qRT-PCR) e un'analisi di attuabilità.
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Protocol
Il protocollo è stato condotto in conformità con la dichiarazione di Helsinki e il protocollo è stato approvato dal comitato di revisione istituzionale CHA Bundang Medical Center.
1. degenerative dei tendini tessuto raccolto dal paziente
- Diagnosticare l'epicondilite laterale prendendo una storia medica e utilizzando i risultati di esame fisico: tenerezza sopra l'origine tendinous vicino epicondyle laterale; dolore evocato dall'estensione resistita dell'articolazione del polso.
- Utilizzare i seguenti criteri di inclusione: oltre 18 anni di età; una storia di epicondilite laterale per un minimo di sei mesi; recalcitranti per trattamento conservativo; almeno tre mesi sono passati da iniezione di corticosteroidi, plasma ricco di piastrine o tossina botulinica
- Escludere i seguenti: le donne incinte; pazienti con una storia di malattia cervicale della spina dorsale, gomito artrite, malattia reumatologica, chirurgia intorno a gomito e la sindrome da intrappolamento del nervo; pazienti che rifiutano di donare del tessuto.
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Tecnica chirurgica
Nota: Vedere Figura 124.- Dopo l'anestesia generale da isoflurane e l'intubazione endotracheale, metti il braccio sul tavolo e applicare un laccio emostatico. Quindi applicare betadine agente sull'intero braccio e drappo con un foglio di chirurgico asettico.
- Esporre il gomito laterale attraverso un'incisione di 3 – 5 cm con n ° 15 lama bisturi chirurgico anteromedial solo al epicondyle laterale e prossimale al livello dell'articolazione.
- Visivamente identificare il longus di radialis dei carpi dell'estensore (ECRL) e l'interfaccia di aponeurosi dell'estensore e fare una scissione Incisione 2 – 3 mm in profondità tra l'aponeurosi ECRL e dell'estensore con una lama di bisturi chirurgico Nr. 15 presso l'interfaccia identificata.
- Estrarre il ECRL anteriormente, che porterà l'origine di brevis (ECRB) patologica extensor carpi radialis longus sotto nella vista diretta.
- Identificare visivamente il tessuto patologico degenerativo dal suo caratteristico colore grigiastro opaco e tessuto solitamente edematoso e friabile.
- Dopo l'identificazione, attentamente resecare tutto il tessuto degenerativo acutamente utilizzando mini-lame e bisturi chirurgico n ° 15.
- Incorporare il tessuto resecato (circa 1 cm3) in tampone fosfato salino (PBS) immediatamente e rimuovere tutto il tessuto circostante ad eccezione del tessuto del tendine attentamente in circa 10 mL di PBS appena possibile.
- Nei casi con exostosis ossuto al epicondyle laterale, rimuovere exostosis utilizzando una Pinza ossivora ed lisciare con una raspa. Rendere più fori (diametro 1,6 mm, circa 6 – 8 fori) nel condilo anterolateral per migliorare il rifornimento vascolare. Questo è facoltativo.
- Chiudere la ferita a strati con materiale di sutura non assorbibile.
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Controllo sano tenocyte
- Ottenere sano tenociti dal restante tendine del tendine auto-tendine del ginocchio o auto-rotula durante la ricostruzione del legamento crociato anteriore e usarlo come il controllo per l' esperimento seguente25.
Nota: Il numero di campioni utilizzati in questo studio era tre in ogni gruppo.
- Ottenere sano tenociti dal restante tendine del tendine auto-tendine del ginocchio o auto-rotula durante la ricostruzione del legamento crociato anteriore e usarlo come il controllo per l' esperimento seguente25.
2. istologia
- Circa la metà del tessuto raccolto conservare in formalina 10% neutra tamponata in una cappa chimica o equivalente.
- Incorporare il tessuto in un blocco di paraffina (4 – 5 mL) e la sezione e nelle sezioni di 4 – 5 µm coronalmente.
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Macchia di sezioni da controllo e degenerative dei tendini con macchia ematossilina ed eosina (H & E) e la macchia blu di Alcian a pH 2.5. Eseguire H & E che macchia in una macchina automatizzata macchia come segue.
- Deparaffinizzare utilizzando xilene (3 volte, 5 min, rispettivamente).
- Idrato da alcoli Graduate all'acqua (100% alcool, 4 min; 100% alcool, 3 min; 95% alcool, 2 min; alcool al 70%, 1 min; acqua, 2 min).
- Macchia in ematossilina per 5 min, lavare bene in acqua per 2 min.
- Differenziare in alcool acido 1% (1% HCl in 70% di alcool) per 3 s. lavare bene in acqua per 3 min.
- Neutralizzare HCl mediante immersione in un 0,5% ammoniaca per 10 s, seguita da un lavaggio ad acqua 3 min.
- Macchia in Eosion per 5 min.
- Disidratare attraverso alcoli (80% di alcool, 30 s; 95% di alcol, 1 min; 100% alcool 1 min, 100% alcool 2 min).
- Chiaro in xilene (3 volte, 2 min, 2 min e 3 min, rispettivamente).
- Montare con un vetrino.
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Eseguire immunohistochemitry (IHC) utilizzando il kit di Bond polimero affinare rilevamento secondo le istruzioni del produttore con modifiche minori.
- Dopo Sparaffinatura utilizzando xilene, eseguire una procedura di ricupero dell'antigene utilizzando la soluzione di smascheramento dell'epitopo di Bond per 30 min a 100 ° C. Soluzione per lo smascheramento Bond contiene un tampone citrato basato e tensioattivo (1 L, pH 5.9-6.1).
- Placare la perossidasi endogene incubando il tessuto con acqua ossigenata per 5 min.
- Incubare le sezioni per 15 minuti ad una temperatura ambiente (21-22 ° C) con gli anticorpi primari contro il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) (1: 200), tenomodulin (1: 200) o mohawk (1: 200).
- Eseguire anticorpo secondario tagging con un sistema di biotina-libero polimerici rafano perossidasi-linker anticorpo coniugato.
- Uso secondario coniglio anti mouse IgG nel siero animale 10% (v/v) in soluzione 2-Methyl-4-isothiazolin-3-one saline/0.09% tamponata a localizzare gli anticorpi del mouse.
- Utilizzare anti-coniglio polimero poli-HRP-IgG (< 25 µ g/mL) che contiene il siero animale 10% (v/v) in saline/0.09% tamponata per la localizzazione di anticorpi di coniglio.
- Utilizzare 3, 3'-diaminobenzidina tetrahydrochloride idrato in una soluzione di stabilizzatore per visualizzare il complesso via un precipitato marrone.
- Colorante di contrasto con < 0,1% ematossilina (blu) per visualizzare i nuclei cellulari.
- Osservare i vetrini colorati con H & E, Alcian blu macchie e IHC per VEGF, tenomodulin e mohawk sotto il microscopio chiaro e ottenere immagini microscopiche rappresentativi di ogni diapositiva sotto campo uno ad alta potenza (400 X).
3. Tenocyte cultura
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Preparazione tessuto
- Preparare il campione di tendine rimuovendo tutto il tessuto circostante accuratamente con micro-forbici e pinze.
- Lavate con PBS e sminuzzare in piccoli pezzi (circa 1 mm3 o meno).
- Digerire tessuto per 1 h a 30 mL di Medium per volta dell'Aquila di Dulbecco (DMEM) completate con collagenasi II 30 mg/mL a 37 ° C.
- Passare le cellule attraverso un colino di cella di 100 µm.
- Disattivare collagenosi II aggiungendo 1 mL di siero bovino fetale (FBS).
- Centrifugare a 196 x g per 5 min.
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Coltura cellulare
- 3 x 105 celle di semi in un piatto di 100 mm e cultura con DMEM completati con 10% FBS e 1% soluzione antibiotico antimicotico a 37 ° C in un incubatore di 5% CO2 per 1 settimana.
- Cambiare il terreno di coltura ogni tre giorni fino a quando si verifica la confluenza di 80%. Della coltura sia buona salute di controllo e campioni degenerativa delle cellule fino al passaggio 4 e utilizzare per l'esperimento.
4. immunocitochimica (ICC)
- Trasferire 200 µ l di cellule in coltura (2 x 105 cellule) otto pozzetti di una diapositiva di camera e crescere le cellule alla confluenza con l'aggiunta di mezzi freschi per 1 giorni.
- Lavare le cellule con PBS e difficoltà con 500 µ l di formaldeide al 4% per pozzetto.
- Incubare i vetrini con 0,5% Triton X-100 in PBS per 10 min per permeabilizzazione delle membrane.
- Blocco in PBS con 1% di albumina di siero bovino e 0.05% TWEEN-20 per mohawk e tenomodulin, rispettivamente.
- Incubare per una notte al buio con anticorpo monoclonale di topo anti-mohawk (diluizione 1: 100) e l'anticorpo di capra anti-tenomodulin (diluizione 1: 100) a 4 ° C.
- Incubare gli anticorpi secondari (Alexa 555-anti capra (1: 200) per tenomodulin; Alexa 488 anti-murine (1: 200) per mohawk) al buio per 1 h a temperatura ambiente.
- Montare con 0,5 µ l di un mezzo di montaggio di fluorescenza.
- Analizzare utilizzando un microscopio a fluorescenza (400 X).
5. proliferazione Assay
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Viabilità di cella di misura utilizzando tetrazolium solubile in acqua (WST) -1.
- Semi di cellule sia sane e degenerante in 96 pozzetti ad una densità di 2 x 103 cellule per pozzetto per 24, 72 e 120 ore.
- Dopo l'incubazione, aggiungere 10 µ l di soluzione di WST-1 al 10% ad ogni pozzetto.
- Incubare le piastre per 3 h a 37 ° C in 5% CO2.
- Misurare la densità ottica a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre. Prendere letture almeno tre volte a tutti i punti di tempo per ogni campione.
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Quantità di DNA cellulare misura usando l'analisi di BrdU.
- Seme sia sani e degenerativa delle cellule in 96 pozzetti ad una densità di 2 x 103 cellule per pozzetto per 24, 72 e 120 ore.
- Dopo l'incubazione, aggiungere 10 µ l di soluzione di BrdU 10% ad ogni pozzetto.
- Incubare le piastre per 3 h a 37 ° C in 5% CO2.
- Aggiungere 100 µ l/pozzetto di soluzione di fissaggio/denaturare (60 – 70% di etanolo, 0,1 – 0,5% idrossido di sodio) e tenere la piastra a temperatura ambiente per 30 min.
- Aggiungere 100 µ l/pozzetto preparato 1 x soluzione di anticorpo di rilevazione e tenere la piastra a temperatura ambiente per 1 h.
- Soluzione di rimuovere e lavare tre volte con tampone di lavaggio 1X.
- Aggiungere 100 µ l/pozzetto preparato soluzione anticorpo secondario coniugato HRP 1x e tenere la piastra a temperatura ambiente per 30 min.
- Rimuovere la piastra di soluzione e lavare tre volte con tampone di lavaggio 1X.
- Aggiungere 100 µ l di substrato TMB al 50%.
- Incubare per 30 min a temperatura ambiente.
- Aggiungere 100 µ l di soluzione bloccante.
- Misurare la densità ottica a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre.
Nota: Letture di prendere almeno tre volte a tutti tempo punti per ciascun campione.
6. elaborazione statistica
- Raccogliere e analizzare i dati utilizzando SPSS.
- Raffigurano dati da media ± errore standard della media.
- Test di Mann Whitney U uso.
- Considerare le differenze statisticamente significative quando il valore di p è minore di 0,05 (p < 0,05).
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Representative Results
Le analisi istologiche hanno rivelato che il tessuto raccolto da epicondilite laterale ha avuto le caratteristiche di un tendine di tendinopathic. Sezione H & E di tendinopatia degenerativa del tendine ha rivelato un bundle di collagene disorganizzato con una perdita di polarità e strutture di fibra parallela dritto, fortemente pranzo fine. Segni istologici indicativi di degenerazione come più alto cellularity e nuclei ingrandetti senza la forma tipica dell'alberino erano comuni nei campioni. Inoltre, fasci di collagene del tendine degenerato erano relativamente debole eosina macchiato da H & E, ma sono stati macchiati positivamente di Alcian blu che indica una maggiore sostanza dei proteoglicani e dei glicosaminoglicani.
In tutti i casi, i vasi sanguigni sono stati aumentati di numero e aggregati occupando spazi incorporati tra le fibre sono stati confrontati ai vasi sanguigni di fendere-come normali. Nella macchiatura IHC, cellule dei tendini degenerati hanno mostrato citoplasmico granulare reazione positiva al VEGF rispetto la reazione negativa di controllo quelli. Collettivamente, questi risultati hanno confermato che i tessuti raccolti da epicondilite laterale erano tessuti degenerative e adatto per la cultura tenocyte degenerativa (Vedi Figura 2).
Le cellule coltivate sono state confermate come tenociti da ICC e i tessuti raccolti sono stati confermati da IHC come tessuto del tendine. La maggior parte delle cellule coltivate e le cellule nel tessuto del tendine ha mostrato una macchia positiva per gli indicatori di tenocyte rappresentante noto come mohawk (verde) e proteine tenomodulin (rosso) con un aspetto allungato sotto microscopia (Vedi Figura 3). Inoltre, i tessuti raccolti avevano la macchiatura positiva per proteine mohawk e tenomodulin proteine immunohistochemically (vedere complementare figura 1). Questi hanno suggerito che i tessuti raccolti sono stati composti dal tessuto del tendine.
Tenociti coltivate dal tessuto raccolto di epicondilite laterale ha avuto le caratteristiche che corrispondono alle tendinopatie. Tenociti degenerative e sia sani sono state coltivate per 4 giorni nella stessa circostanza. In ogni punto del tempo, il tasso di proliferazione è stato misurato dall'analisi di BrdU e analisi WST-1. I risultati hanno mostrato che il tasso di proliferazione delle cellule degeneranti era significativamente più alto rispetto ai controlli come precedentemente riportati (p < 0,05) (Vedi Figura 4A).
Cinque geni che sono noti per essere up-regolato nel tendine degenerante sono stati analizzati mediante qRT-PCR. Espressioni dei geni, COL3A1, ACTA2, TAC1 (SP), TAC recettore 1, e PTGS2 (COX2) sono stati aumentati più significativamente in cellule coltivate dal tendine degenerante che nelle cellule da quelle sane. Le espressioni relative per tutti i geni sono mostrate in Figura 4B e supplementare nella figura 2.
Figura 1 : Chirurgico foto della vendemmia degenerative dei tendini. (A) dopo incisione della pelle e la dissezione, il tessuto patologico degenerativo sull'origine comune dell'estensore è stato esposto, mostrando un caratteristico colore grigiastro opaco con il cambiamento edematico (linea rossa). Al contrario, l'aspetto generale del tessuto normale del tendine era lucido e duro con un tono leggermente grigiastro (linea nera). (B) tutti i tessuti degenerativi identificati sono stati resecati acutamente e quindi l'osso testa radiale è stato esposto. (C) tutti i tessuti resecati sono stati incorporati in tampone fosfato salino immediatamente e il tessuto circostante non-tendinous attentamente è stato sezionato appena possibile. ECRB: radialis dei carpi dell'estensore brevis. EDC: digitorum dell'estensore communis. ECU: estensore ulnaris dei carpi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Conferma di degenerative dei tendini istologicamente. (A) In the H & E colorazione, degenerativi campioni di epicondilite laterale avevano disorganizzato pacchi del collageno con perdita di polarità e aumentato numero di cellule rispetto al controllo sano. (B). Alcian blu macchiatura ha mostrato che il tendine degenerante aveva aumentato la sostanza a terra consistente dei proteoglicani e dei glicosaminoglicani con diverse patch mocosa e vacuoli tra fibre (freccia). (C). Inoltre, VEGF immunohistochemistry ha dimostrato aumentata colorazione nella formazione del vaso in campioni degenerative dei tendini rispetto ai campioni di controllo. VEGF: Fattore di crescita endoteliale vascolare. Barra della scala = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Identificazione di tenocyte da ICC. Le cellule coltivate e le cellule nel tessuto del tendine sono state confermate come tenocyte di ICC. La maggior parte delle cellule ha mostrato la macchia positiva per il marcatore tenocyte rappresentante, tra cui mohawk (verde) e tenomodulin (rosso) con aspetto allungato sotto microscopia. Condrociti è stato usato come controllo negativo. ICC: immunocitochimica. Barra della scala = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Caratteristiche del tenocyte degenerativa. (A, B) Degenerativa tenociti (rosso) ha avuto un più alto tasso di proliferazione con un notevole aumento in cellularità. (C) cinque geni che sono noti per essere correlati allo sviluppo di tendinopatia sono stati elevati significativamente nei tenociti degenerativa. Livelli di espressione genica sono stati normalizzati contro GAPDH. *: significa < 0.05, * *: significa < 0.01, rispettivamente. SP: sostanza P. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Complementare figura 1: conferma istologica del tessuto raccolto come il tessuto tendineo. Il tessuto raccolto inoltre è stato analizzato mediante IHC per mohawk e tenomodulin per determinare se il tessuto raccolto aveva le adeguate caratteristiche del tessuto del tendine. IHC: Immunohistochemistry. Barra della scala = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Complementare figura 2: espressione di tendinopathy relativi geni in tenocyte. Le trascrizioni di cinque geni normalizzate dall'espressione dell'actina sono stati significativamente elevate nei tenociti degenerativa e hanno un andamento simile alla Figura 4. Livelli di espressione genica sono stati normalizzati contro l'actina con una media < 0.05 e < 0.01, rispettivamente. SP: sostanza P. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Una serie di studi precedenti hanno riferito come creare modelli animali tendinopathic cronica, utilizzando diverse procedure quali collagenosi o kartogenin iniezione, tapis roulant in esecuzione e più26,27. Anche se numerosi studi hanno mostrato promettenti effetti terapeutici sulla base di questi modelli animali, esperimenti utilizzando il tenocyte degenerativa umana sarebbero stato fondamentali nel campo della tendinopatia al fine di riprodurre l'efficacia del trattamento. In questo articolo, abbiamo stabilito un protocollo per raccogliere e cultura umana tenociti degenerativa costantemente. Entrambi raccolte del tessuto del tendine e la tenocyte coltivate ha mostrato le caratteristiche comuni delle degenerativa del tendine e tenocyte7,28.
Nella nostra esperienza, per il raccolto di riuscita dei tessuti, è essenziale per comprendere i cambiamenti morfologici connessi frequentemente con degenerative dei tendini e delineare con precisione quella zona durante la chirurgia. Degenerativa dei tessuti sono in genere grigio o marrone in colore e il tessuto è sottile, fragile e disorganizzato con texture sciolto. I criteri di inclusione ed esclusione del protocollo dovrebbero essere mantenuti rigorosamente con un'attenta valutazione dei trattamenti precedenti prima del raccolto.
Dimensione del tessuto è anche importante per una coltura cellulare di successo. Si consiglia di raccogliere più di 1 cm3. Di solito, come tutta l'area degenerativa viene rimosso, la quantità di tessuto raccolto sarebbe sufficiente per la coltura delle cellule. Infine, non abbiamo usufruito tenociti sopra passaggio sei in tutti gli esperimenti. Fino al passaggio 6, crediamo che le cellule coltivate avevano ancora le caratteristiche di degenerazione.
Il nostro protocollo ha diversi vantaggi. Tali vantaggi non includono nessun danno al paziente, poiché il tessuto degenerativo doveva essere rimosso durante la chirurgia, l'efficienza poiché la quantità di tessuto necessaria è sufficiente per l'esperimento, altamente etico a causa di nessuna violazione dei tessuti sani, riproducibilità in quel tessuti patologici dagli esseri umani possono essere facilmente ottenuti durante la chirurgia, e, infine, la facilità delle tecniche di applicazione una volta chirurgica acquisire familiarità.
Tuttavia, riconosciamo che il nostro esperimento ha diversi limiti. In primo luogo, non possiamo escludere completamente l'effetto residuo di precedenti del corticosteroide o iniezione di plasma ricco di piastrine anche se abbiamo incluso solo i pazienti che avevano superato almeno tre mesi dalla ricezione di qualsiasi trattamento precedente. Inoltre, in questo protocollo, abbiamo solo raccolto il tendine ECRB e usato per cultura degenerativa tenociti poiché il tendine ECRB è un sito comune di tendinopatia per chirurgia con tendini di Achille e della cuffia dei rotatori. Ulteriori studi dovrebbero essere effettuati con una maggiore dimensione di esempio concentrandosi su eventuali differenze tra i vari siti di tendinopatia.
In conclusione, questo protocollo convalidato per l'acquisizione di tenociti degenerativa umana sarà uno strumento utile per le indagini future in biologia del tendine e per test nuovi interventi terapeutici.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta da una sovvenzione dalla Corea Health Technology R & D Project attraverso la Corea salute industria Development Institute (KHIDI), che è stato finanziato dal Ministero della salute & benessere, Repubblica di Corea (concessione numero: HI16C1559).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Scalpel | Kisanbio | KS-Q0306-15 | No. 15 |
| Mini-blade | Beaver | 374769 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco | 11995065 | |
| PBS | Gibco | 14190250 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| 50 mM ascorbic acid-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Gibco | 15240062 | |
| 4% formaldehyde | Bio-solution | BP031 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ml | |
| BSA | Rdtech | C0082 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ml | |
| MKX (C-5) | Santa cruz biotechnology | sc-515878 | |
| Tenomodulin (N-14) | Santa cruz biotechnology | sc-49325 | |
| Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| WST-1 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | |
| BrdU Cell Proliferation Assay Kit | Cell Signaling Technology | #6813 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8891 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
| GAPDH | Thermo Fisher Scientific | Hs02786624_g1 | |
| COL3A1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00943809_m1 | |
| ACTA2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00426835_g1 | |
| TAC1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00243225_m1 | |
| TACR1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00185530_m1 | |
| PTGS2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00153133_m1 | |
| ACTB | Thermo Fisher Scientific | Hs99999903_m1 | |
| Cell Strainers (100 µm) | Corning | 352360 | |
| 100mm culture dish | Thermo Fisher Scientific | 8188207 | |
| 8-well Chamber Slide | Thermo Fisher Scientific | 154534 | |
| 96 Well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3596 | |
| Nikon Eclipse 50i Microscope | Nikon | ||
| VERSA max microplate reader | Molecular Devices | ||
| CFX96 Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | ||
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Paraffins | Leica Biosystems | 3801340 | |
| Ethanol | JUNSEI CHEMICAL | 90303-2185 | |
| Hematoxylin | DAKO | CS70030-2 | |
| Eosin | DAKO | CS70130-2 | |
| Alcian blue | DAKO | AR16011-2 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Xylene | JUNSEI CHEMICAL | 25165-0430 | |
| Endogenous peroxidases | DAKO | S200380-2 | |
| Canada balsam | JUNSEI CHEMICAL | 23255-1210 | |
| Microtome Blade | FEATHER | A35 | |
| Slide glass | SUPERIOR | 1000612 | |
| Cover glass | Marienfeld-Superior | 101050 | |
| VEGF | Santa cruz biotechnology | sc-7269 | |
| SPSS Software | IBM | Ver. 18.0 | |
| Multi-purpose Centrifuge | LABOGENE | 1248R |
References
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