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Biology

Micromanipulation Morphogenetic गतिशीलता और Cytoskeletal नियामकों के कारोबार के विश्लेषण की अनुमति तकनीक

Published: May 12, 2018 doi: 10.3791/57643
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Division of Molecular Cell Biology, Zoological Institute, Technische Universität Braunschweig, 2Department of Cell Biology, Helmholtz Centre for Infection Research

Summary

हम वर्णन कैसे सूक्ष्म और photomanipulation तकनीक जैसे frap है और photoactivation गतिशीलता मानकों और पलायन कोशिकाओं के भीतर प्रोटीन की spatiotemporal गतिशीलता का निर्धारण सक्षम करें । प्रयोगात्मक readouts उपसेलुलर गतिशीलता और गतिशीलता नियामकों या अंतर्निहित actin cytoskeleton के कारोबार शामिल हैं ।

Abstract

प्रोटीन की spatiotemporal गतिशीलता की जांच विभिंन संदर्भों में अपने कार्यात्मक महत्व प्रकट कर सकते हैं । इस अनुच्छेद में, यह चर्चा है कि कैसे photobleaching (frap है) और photoactivation तकनीक के बाद फ्लोरोसेंट वसूली के लिए उपसेलुलर स्थानों में प्रोटीन की spatiotemporal गतिशीलता का अध्ययन किया जा सकता है । हम यह भी बताएंगे कि कैसे इन तकनीकों actin cytoskeletal विनियमन और सेल गतिशीलता से जुड़े विभिंन मापदंडों का सीधा निर्धारण सक्षम करें । इसके अलावा, कोशिकाओं के microinjection इसके अतिरिक्त एक वैकल्पिक उपचार के रूप में वर्णित है (संभावित पूर्ववर्ती या aforementioned photomanipulation तकनीकों के पूरक) के लिए सेल पर translocated प्रोटीन के तात्कालिक प्रभाव ट्रिगर आकृति विज्ञान और समारोह । Micromanipulation जैसे प्रोटीन इंजेक्शन या प्लाज्मा झिल्ली के स्थानीय अनुप्रयोग-पारगंय दवाओं या cytoskeletal अवरोधकों एकल सेल और सेलुलर में सेल व्यवहार पर दिए गए उपचार के तत्काल परिणाम रिकॉर्ड करने के लिए शक्तिशाली उपकरण के रूप में सेवा कर सकते हैं स्तर. यह रिकॉमबिनेंट Rac1 प्रोटीन के इंजेक्शन द्वारा lamellipodial सेल एज की दखलंदाजी के तत्काल प्रेरण द्वारा यहां उदाहरण है, के रूप में एक चौथाई सदी पहले की स्थापना की । इसके अलावा, हम बढ़ाया ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन के कारोबार का निर्धारण करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान (EGFP)-वीएएसपी, एक actin रेशा पोलीमरेज़ lamellipodial के B16 सुझावों पर प्रमुखता से जमते-F1 कोशिकाओं, frap है को रोजगार और जुड़े डेटा सहित विश्लेषण और वक्र फिटिंग । हम भी lamellipodial actin नेटवर्क बहुलकीकरण की दरों का आकलन करने के लिए दिशानिर्देश उपस्थित, EGFP-टैग β-actin व्यक्त कोशिकाओं द्वारा उदाहरण के रूप में. अंत में, निर्देश दिए गए है कि कोशिका कोशिका द्रव्य के भीतर actin मोनोमर गतिशीलता की दरों की जांच कैसे की जाए, जिसके बाद तेजी से रेशा विधानसभा की साइटों पर actin शामिल किया जाए, जैसे कि lamellipodia का प्रयोग, photoactivation का उपयोग करना दृष्टिकोण. इन प्रोटोकॉल में से कोई भी घटकों या actin cytoskeleton के नियामकों के लिए प्रतिबंधित है, लेकिन आसानी से अनुरूप फैशन में spatiotemporal गतिशीलता और विभिंन विभिंन उपसेलुलर संरचनाओं या कार्यात्मक में प्रोटीन के समारोह का पता लगाने के लिए बढ़ाया जा सकता है संदर्भों.

Introduction

जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन और अंय अणुओं की spatiotemporal गतिशीलता की निगरानी सेल और आणविक जीवविज्ञान के कई क्षेत्रों में एक अनिवार्य उपकरण बन गया है । उंनत प्रतिदीप्ति प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण (झल्लाहट) और झल्लाहट-प्रतिदीप्ति लाइफटाइम इमेजिंग (झल्लाहट-FLIM), या frap है, प्रतिदीप्ति में photobleaching नुकसान (फ्लिप) और photoactivation के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कई दूसरों की अनुमति सहित माइक्रोस्कोपी तकनीक के लिए अस्थाई और स्थानिक प्रोटीन की ट्रैकिंग-प्रोटीन बातचीत, गठन परिवर्तन, के रूप में अच्छी तरह के रूप में प्रसार और सेल1में विभिंन प्रोटीन के स्थानीयकरण के कैनेटीक्स का निर्धारण,2। frap है और photoactivation तकनीक, विशेष रूप से, actin cytoskeleton और सेल माइग्रेशन के नियामकों की जांच के लिए व्यापक रूप से लागू होते हैं । इन तकनीकों को अकेले या अतिरिक्त micromanipulation तकनीकों के साथ संयोजन में ऐसे microinjection3के रूप में लागू किया जा सकता है, और फ्लोरोसेंट लेबल प्रोटीन की अभिव्यक्ति शामिल है । वे कोशिका प्रवास में शामिल actin-रिच संरचनाओं के लिए प्रोटीन एसोसिएशन के कैनेटीक्स के आकलन की अनुमति देते हैं, जैसे filopodia या lamellipodia, फोकल आसंजन में प्रोटीन का कारोबार4, या बंटी actin नेटवर्क्स5. वे lamellipodial actin बहुलकीकरण दरों के निर्धारण को भी सक्षम करते हैं, actin के भीतर monomeric cytosol के फैलाव का आकलन, उपसेलुलर actin मोनोमर की दर translocation में polymerizing actin रेशा फैलाने में lamellipodia6, और अंय पैरामीटर्स ।

frap है एक जीवित कोशिका के भीतर प्रोटीन की गतिशीलता को visualizing और बढ़ाता है, मूल रूप से 1970 के दशक में Axelrod द्वारा विकसित के लिए एक विधि है 7 । एक कोशिका के भीतर ब्याज का एक क्षेत्र (रॉय), फ्लोरोसेंट लेबल वाले प्रोटीन के साथ आबादी, क्षणिक उच्च तीव्रता के एक लेजर के संपर्क में है, समय की एक दी छोटी अवधि के दौरान इस क्षेत्र में मौजूद fluorophore अणुओं के ब्लीचिंग का कारण पर्याप्त है । ब्लीचिंग, फ्लोरोसेंट के दौरान ROI के बाहर स्थित प्रोटीन, उनके spatiotemporal गतिशीलता के आधार पर ब्लीचिंग क्षेत्र में फैलाना और घुसपैठ करेगा, जिससे समय के साथ photobleached अणुओं का विस्थापन होता है । ब्लीच्ड क्षेत्रों में प्रतिदीप्ति वसूली की दर विभिन्न कारकों पर निर्भर करती है, जिसमें दिए गए अणु के आकार और प्रसार की दर, और निश्चित रूप से ख्यात संबद्ध प्रक्षालित संरचना के भीतर अपनी कारोबार दर । इस प्रकार, घुलनशील प्रोटीन ब्लीच्ड रॉय के भीतर प्रतिदीप्ति की वसूली तेजी से प्रसार के माध्यम से मध्यस्थता करेंगे, जबकि प्रोटीन कसकर ऐसी फोकल आसंजन के रूप में संरचनाओं के साथ जुड़े, अब कारोबार समय होगा, के रूप में उनके प्रतिदीप्ति वसूली करेगा प्रोटीन और पृथक्करण संरचना के कैनेटीक्स-संबद्ध अंश के घुलनशील अंश के प्रसार पर दोनों निर्भर करते हैं । प्रतिदीप्ति की प्री-ब्लीच गहनता के प्रारंभिक स्तर तक पहुंच जाने तक प्रतिदीप्ति वसूली आमतौर पर अधिग्रहीत और quantified है । हालांकि, यह नहीं होती यदि प्रारंभिक प्रतिदीप्ति तीव्रता का एक हिस्सा तथाकथित मोबाइल अंश है, जो प्रसार द्वारा मंगाया जा करने में असमर्थ है या बहुत धीमी दरों पर मंगाया जा रहा है के अंतर्गत आता है के रूप में अणुओं के बहुमत की तुलना में मोबाइल शामिल अंश. प्रोटीन कारोबार की दर निर्धारित करने के लिए, frap है curves उत्पन्न कर रहे हैं, समय के साथ प्रतिदीप्ति वसूली की हद का प्रतिनिधित्व. इन रिकवरी curves से, प्रोटीन की औसत आधा समय वसूली की गणना की जा सकती है । औसत frap है डेटा के वक्र फिट बनाने के द्वारा, और इसलिए गणितीय विश्लेषण, यह भी deduce के लिए संभव है कि मोबाइल अंश की औसत टर्नओवर दर अणुओं की एक सजातीय आबादी का एक समग्र गठन, या कि क्या यह से बना है अंतर दर पर मोड़ अणुओं के दो या अधिक उपजनसंख्या । मात्रात्मक दृष्टिकोणों द्वारा प्रोटीन कारोबार की दर का आकलन करने के अलावा, lamellipodia में photobleached क्षेत्रों की वसूली पर नज़र रखने, प्रतिगामी प्रवाह, दखलंदाजी जैसे lamellipodial गतिशीलता मापदंडों के सटीक ठहराव के लिए भी अनुमति दे सकते हैं, आणि actin बहुलकीकरण व्याजदर आहे. इस प्रकार, frap है एक बहुमुखी उपकरण का गठन करने के लिए जीवित कोशिकाओं की संरचनाओं के भीतर विभिंन मापदंडों का आकलन करने के लिए लागू किया जाएगा ।

Photoactivation एक निर्दिष्ट सेलुलर स्थान से उद्भव प्रोटीन या अणुओं की प्रसार और गतिशीलता को ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया विधि है । तकनीक काम करते हैं, उदाहरण के लिए, जंगली प्रकार के एक संस्करण हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP), शुरू में पैटरसन और Lippincott द्वारा विकसित-Schwartz8, जो एक तरह से है कि अपने प्रतिदीप्ति को अत्यधिक जोखिम पर वृद्धि की अनुमति देता में रूपांतरित हो जाता है पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश (चारों ओर ४०० एनएम; यहां, ४०५ एनएम) । के रूप में पैटरसन एट अल., जंगली प्रकार GFP chromophores द्वारा वर्णित तटस्थ phenols और anionic phenolates, जो लगभग ३९७ एनएम में एक प्रमुख अवशोषक चोटी और ४७५ एनएम में एक छोटी सी एक, क्रमशः का उत्पादन की एक मिश्रित जनसंख्या के रूप में मौजूद हैं । यूवी प्रकाश के साथ प्रोटीन के विकिरण पर, जनसंख्या photoconversion से गुजरती है, anionic फार्म की ओर स्थानांतरण । जब ४८८ एनएम द्वारा उत्साहित, photoconverted/photoactivated प्रोटीन दर्शाती है एक 3-प्रतिदीप्ति में वृद्धि गुना, सक्रिय और गैर के बीच भेद करने के लिए व्यवहार में अपर्याप्त उच्च आंतरिक पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के कारण GFP सक्रिय । हालांकि, पृष्ठभूमि की तीव्रता में कमी GFP अनुक्रम में एक एकल एमिनो एसिड उत्परिवर्तन शुरू करने से प्राप्त किया गया है (histidine प्रतिस्थापन स्थिति में २०३) । जिसके परिणामस्वरूप T203H उत्परिवर्ती, भी photoactivatable के रूप में जाना-GFP (PA-GFP) मामूली चोटी, यूवी प्रकाश के साथ विकिरण पर जो लगभग १०० वृद्धि हुई है के अवशोषण में एक महत्वपूर्ण कमी की विशेषता है गुना जब बाद में ४८८ एनएम प्रकाश से उत्साहित । इसलिए, PA-GFP-टैग किए गए प्रोटीन का इजहार एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया दृष्टिकोण है, जो प्रसार और कोशिकाओं के भीतर अणुओं के गतिशीलता के निर्धारण की अनुमति देता है । हमने पहले PA-GFP-टैग actin लागू किया है cytosolic क्षेत्रों से दूर actin मोनोमर के फैलाव की दर निर्धारित करने के लिए, cytosol के भीतर अपनी गतिशीलता की न केवल अन्वेषण की अनुमति है, लेकिन यह भी फैलाने में अपने निगमन दर lamellipodial actin नेटवर्क6. अधिक हाल के साहित्य भी उपंयास, फोटो-परिवर्तनीय प्रोटीन का वर्णन है कि सिद्धांत में एक अनुरूप फैशन में इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन संभावित लाभ बंदरगाह पहले से ही तस्वीर रूपांतरण से पहले दिखाई । फ्लोरोसेंट प्रोटीन के इस समूह के लिए उदाहरण Dendra2 और mEos29,10,11,12शामिल हैं ।

इस लेख में, हम प्रोटीन के साथ microinjecting कोशिकाओं की कार्यप्रणाली की व्याख्या । हम आगे की व्याख्या कैसे इस तकनीक frap है के साथ संयुक्त किया जा सकता है, photobleaching प्रोटीन actin cytoskeleton विनियमन और गतिशीलता में शामिल द्वारा, और कैसे frap है घटता है और आधा मोबाइल भागों की वसूली के समय प्राप्त किया जा सकता है । इसके अलावा, हम कैसे frap है तकनीक lamellipodial नेटवर्क के actin बहुलकीकरण दरों का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का एक उदाहरण प्रदान करते हैं । हम यह भी निर्देश और कैसे photoactivation प्रयोगों, जो actin में lamellipodia निगमन की monomeric actin और दरों की cytosolic गतिशीलता का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है पर सुझाव प्रदान करते हैं । इन तकनीकों, ज़ाहिर है, केवल actin cytoskeleton घटकों पर नज़र रखने तक ही सीमित नहीं हैं, लेकिन संभावित उदारवादी अनुकूलन या अनुकूलन पर, व्यापक रूप से अन्य कोशिका प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है या विभिन्न प्रोटीन की जांच करने के लिए, संरचनाओं, और पैरामीटर.

Protocol

1. Coverslip धुलाई और नसबंदी

  1. 15 मिमी (व्यास) कवर चश्मे (नंबर 1) एक ५०० मिलीलीटर की कुप्पी में विसर्जित ४० मिलीलीटर ३७% एचसीएल और ६० मिलीलीटर १००% ेतोः (१०० मिलीलीटर धोने समाधान प्रति से अधिक नहीं coverslips) ।
    नोट: भले ही हौसले से खरीदा है, coverslips अपनी सतहों पर कोशिकाओं बोने से पहले इसरो साफ किया जाना चाहिए । यह है क्योंकि वे तेल की पतली फिल्मों, जो macroscopically अदृश्य हो सकता है, लेकिन कुशलता से आसंजन और जीने की कोशिकाओं के उचित प्रसार के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं । जबकि ऐसी फिल्मों को कुशलतापूर्वक अम्ल या आधार वाले समाधानों के साथ हटाया जा सकता है (फिशर एट अल देखें । 13), हम नियमित रूप से अम्ल/शराब मिश्रण का उपयोग ऊपर वर्णित है ।
  2. एक रोटेशन के बरतन पर 30 मिनट के लिए कवर चश्मे युक्त कुप्पी शेक । एक गति है कि कवर चश्मा स्वतंत्र रूप से घूमता है, लेकिन काफी धीमी गति से बचने के लिए अक्सर तोड़ने की अनुमति देता है चुनें । समाधान छानने का उपयोग अगर टूटे शीशे के टुकड़े को हटाने के लिए ।
  3. एक रोटेशन के साथ एक कुप्पी के लिए कवर चश्मा हस्तांतरण पानी की कम से २०० मिलीलीटर और एक घूर्णन शेखर पर गर्मी, जबकि बार जब तक पानी की जगह अंलीय गंध गायब हो गया है । कई घंटे से अधिक बहाकर एचसीएल-ेतोः अंश के पूर्ण उन्मूलन के लिए सिफारिश की जाती है ।
  4. फिल्टर कागज के एक पत्रक पर व्यक्तिगत कवर चश्मा सूखी ।
  5. एक 10 सेमी (व्यास) पेट्री डिश फिल्टर कागज के साथ कवर के तल पर कवर चश्मा प्लेस, और गर्मी शुष्क-निष्फल । autoclaving से बचें क्योंकि यह कवर चश्मे के साथ छड़ी के कारण होगा ।

2. कोशिकाओं का उपचार, अभिकर्मक, और Coverslips पर सीडिंग

  1. B16-F1 माउस मेलेनोमा कक्षों में मानक कक्ष संस्कृति शर्तों के अनुसार DMEM (४.५ g/L ग्लूकोज) 10% भ्रूण बछड़ा सीरम, 2 मिमी glutamine युक्त, और 1% पेनिसिलिन-streptomycin पर ३७ ° c, 7% CO2।
  2. मानक सेल संस्कृति शर्तों के अनुसार microinjections के लिए NIH3T3 fibroblast कोशिकाओं को विकसित (३७ डिग्री सेल्सियस पर ऊतक संस्कृति मशीन, 7% CO2) में DMEM (४.५ g/L ग्लूकोज) जिसमें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, 1x मेम गैर-आवश्यक अमीनो एसिड , 2 मिमी glutamine, और 1% पेनिसिलिन-streptomycin.
  3. transfections के लिए, B16-F1 कोशिकाओं के लिए एक 10 सेमी डिश में १००% संगम और एक 1:5 अनुपात में एक 3 सेमी (व्यास) प्लास्टिक डिश में पारित हो जाना ।
  4. उसी दिन, के बाद B16-F1 कोशिकाओं को कम से 6 ज, ५०० एनजी के साथ transfect के लिए पालन करने की अनुमति दी गई/photoactivatable PA-GFP-actin या EGFP-tagged β-actin प्लाज्मिड DNA. PA-GFP-actin के mCherry-एंकोडिंग वैक्टर के साथ सह-transfections के लिए, 3 सेमी डिश प्रति µ डीएनए के कुल 1 प्लाज्मिड g को मिलाएं ।
  5. Transfect B16-F1 कोशिकाओं अभिकर्मक रिएजेंट (सामग्री की तालिका) के साथ । एक 3 सेमी डिश के लिए, २०० µ एल का मिश्रण १५० मिमी NaCl के ५०० एनजी युक्त डीएनए के २०० µ एल के साथ निर्माण १५० mm NaCl के 1 µ l युक्त अभिकर्मक रिएजेंट (यानी, डीएनए (µ g): रिएजेंट (µ एल) अनुपात 1:2 का इस्तेमाल किया गया था).
  6. कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए अभिकर्मक मिश्रण मशीन (आरटी) और 3 सेमी कोशिकाओं से युक्त पकवान पर प्लास्टिक ड्रॉप वार । धीरे से मिश्रण और ३७ डिग्री सेल्सियस, 7% सह2पर रात भर के पकवान भंवर ।
  7. ५० mm Tris, पीएच ७.४ और १५० mm NaCl युक्त laminin कोटिंग बफर तैयार करें ।
  8. B16-F1 कोशिकाओं के लिए, कोट 15 मिमी laminin के १५० µ एल फैलाने के द्वारा कवर चश्मा (25 µ जी/laminin कोटिंग बफर में एमएल/ NIH3T3 कोशिकाओं के लिए, कोट fibronectin समाधान के साथ कवर चश्मा (25 µ g/एमएल में फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब)) और 1 एच के लिए आरटी पर मशीन ।
  9. पंजाबियों के साथ laminin-या fibronectin-मशीन कवर चश्मे को धोएं, फिर पंजाबियों को महाप्राण और 2 मिलीलीटर transfected कोशिकाओं को जोड़ें ।
  10. बीज transfected B16-F1 कोशिकाओं (एक धाराप्रवाह पकवान से 1:30 अनुपात में), अभिकर्मक के बाद दिन पर, laminin पर लेपित coverslips । NIH3T3 fibroblasts (एक धाराप्रवाह पकवान से 1:20 अनुपात में) fibronectin-लेपित coverslips पर बीज ।
  11. laminin पर प्रसार करने के लिए कोशिकाओं की अनुमति दें-या fibronectin-लेपित कवर एक ऊतक संस्कृति मशीन में रातोंरात ३७ डिग्री सेल्सियस से पहले माइक्रोस्कोपी करने के लिए । वैकल्पिक रूप से, सूक्ष्म प्रयोगों एक ही दिन पर शुरू किया जा सकता है, यह देखते हुए कि कोशिकाओं के लिए प्रसार करने के लिए अनुमति दी जाती है 2 – 3 h.

3. माइक्रोस्कोपी इमेजिंग चैंबर के विधानसभा

  1. माइक्रोस्कोपी के लिए एक हीट प्रवाहकीय आर सी-26 एल्यूमीनियम इमेजिंग चैंबर (चित्रा 1ए) का प्रयोग करें । एक सिरिंज (चित्रा 1बी) का उपयोग कर प्लास्टिक मुहर खोलने के समोच्च के आसपास सिलिकॉन तेल धब्बा.
  2. कवर ग्लास को कक्षों के साथ-साथ चैंबर पर रखें (चित्र 1c).
  3. coverslip और चैंबर के बीच एक सुरक्षित सील बनाने के लिए कवर ग्लास के शीर्ष पर प्लास्टिक मुहर लगाएं । मध्यम लीक (चित्रा 1डी) से बचने के लिए चैंबर पर फिसलने clamps पंगा लेना द्वारा प्लास्टिक मुहर (तिरछे coverslip टूटना से बचने के लिए) फिक्स ।
  4. पिपेट ३७ डिग्री सेल्सियस पूर्व मध्य क्षेत्र में गरम माइक्रोस्कोपी मध्यम । मध्यम autofluorescence में कम करने के लिए और इस प्रकार माइक्रोस्कोपी के लिए अनुकूलित, संस्कृति माध्यम के रूप में एक ही नुस्खा का उपयोग ऊपर वर्णित है, लेकिन साथ F12-हैम के बजाय DMEM, साथ ही 20 मिमी HEPES की अनुपस्थिति में कोशिकाओं के संवर्धन के लिए शामिल2 (चित्रा 1ई) ।
  5. चैंबर के नामित स्लॉट में हीट डिटेक्टर डालें और ३७ डिग्री सेल्सियस (चित्रा 1) के एक निरंतर तापमान को बनाए रखने के लिए एक टीसी-324B स्वत: तापमान नियंत्रक करने के लिए चैंबर के इलेक्ट्रोड लिंक.
  6. उद्देश्य पर विसर्जन तेल की एक छोटी सी बूंद प्लेस और शीर्ष पर चैंबर जगह है ।
  7. कम-से-30 मिनट के लिए कोशिकाओं के साथ इस कक्ष की मशीन उंहें बढ़ते के दौरान तापमान ड्रॉप से उबरने के लिए और माइक्रोस्कोपी माध्यम के लिए अनुकूल करने के लिए अनुमति देने के लिए ।
  8. इससे पहले कि माइक्रोस्कोपी शुरू की है, चैंबर के केंद्रीय जलाशय में संस्कृति माध्यम की जगह (लगभग ८०० µ एल) मध्यम वाष्पीकरण के कारण मध्यम घटकों और सीरम की अनुचित एकाग्रता से बचने के लिए. खुले कक्षों के साथ लंबे समय तक सूक्ष्म सत्र वाष्पीकरण माध्यम के नियमित बदलने की आवश्यकता होगी ।

4. Microinjection प्रक्रिया

  1. कोट coverslips, कोशिकाओं को तैयार है, और ऊपर वर्णित के रूप में इमेजिंग चैंबर को इकट्ठा ।
  2. गल एक aliquot शुद्ध प्रोटीन के लिए इंजेक्शन (आमतौर पर 10 µ एल या कम) और यह उचित microinjection बफर के साथ पतला ।
    नोट: बफ़र संरचना प्रोटीन और सेल प्रकार के अनुसार भिन्न हो सकते हैं, लेकिन ६.९५ और ८.०० के बीच एक पीएच का उपयोग करने के लिए ध्यान रखना और पंजाबियों का उपयोग करने से बचें, क्योंकि अधिकांश सेल को पंजाबियों के साथ इंजेक्शन होना पसंद नहीं है ।
  3. Rac1 microinjection के लिए, १०० mm NaCl, ५० mm Tris-एचसीएल नं० ७.५, 5 एमएम MgCl2, 1 एमएम डीटीटी युक्त बफर तैयार करें । मिलीग्राम2 + आयनों छोटे GTPase स्थिरता के लिए आवश्यक हैं ।
    नोट: प्रोटीन सांद्रता सामान्य रूप से 0.1 – 1 मिलीग्राम/एमएल के बीच भिन्नता (अधिकतम 2 मिलीग्राम/एमएल), प्रोटीन पर निर्भर करता है, प्रयोग के प्रकार, और सेल प्रकार.
  4. यदि लागू हो, ऐसे निष्क्रिय dextran (०.५ µ जी/एमएल, ७० केडीए) के रूप में फ्लोरोसेंट डाई जोड़ने के लिए प्रोटीन समाधान है, जो इंजेक्शन से पहले सुई प्रवाह की उपस्थिति की पुष्टि कर सकते है और प्रयोग के बाद सफल इंजेक्शन के प्रलेखन परमिट ।
    नोट: प्रयोग यहां इंजेक्शन Rac1 की गतिशीलता है, जो केवल प्रोटीन के प्रत्यक्ष प्रतिदीप्ति लेबल पर संभव होगा निंनलिखित के उद्देश्य से नहीं है । फ्लोरोसेंट रंजक या एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन फ्यूजन के साथ प्रोटीन के युग्मन संभव है, लेकिन यहां से परहेज के रूप में यह संकेतन समारोह के साथ हस्तक्षेप के जोखिम बंदरगाह, Rho-परिवार GTPase Rac1 (20 केडीए) की तरह छोटे प्रोटीन के विशेष रूप से ।
  5. १०,००० x g पर प्रोटीन समाधान के लिए कम से कम 30 मिनट के लिए प्रोटीन समुच्चय है कि सुई कॉलेस्ट्रॉल के लिए नेतृत्व अगर microinjection केशिका में मौजूद कर सकते है दूर केंद्रापसारक ।
  6. एक लचीला पिपेट टिप/microloader टिप का उपयोग पीछे की ओर से इंजेक्शन मिश्रण के 1 µ एल के साथ एक microinjection सुई (microinjection केशिका) लोड ।
  7. हवा के बुलबुले सुई टिप में मौजूद हैं, तो धीरे उन्हें हटाने के क्रम में सुई आधार नल. सुई कॉलेस्ट्रॉल के कारण हो सकता है, जो सुई टिप के सूखने से बचने के लिए तेजी से आगे बढ़ें ।
  8. ध्यान से micromanipulation डिवाइस पर सुई धारक समायोजित करें । यदि चरण कंट्रास्ट इमेजिंग के लिए एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग कर, सुई लोडिंग से पहले, यह सुनिश्चित करें कि सुई को ऊपर और नीचे माइक्रोस्कोप संघनित्र निरोधक बिना स्थानांतरित करने के लिए पर्याप्त स्थान है ।
  9. सुई धारक पर microcapillary पंगा लेना, पर दबाव लागू (20 – 50 hPa पृष्ठभूमि दबाव) सुई करने के लिए एक microinjection दबाव डिवाइस का उपयोग करने से पहले सुई टिप translocating सेल संस्कृति माध्यम में.
    नोट: सुई मध्यम से केशिका शक्ति द्वारा चूसा जा रहा है में परिणाम होगा जब दबाव को सक्रिय करने, और इस प्रकार ब्याज के समाधान के इंजेक्शन निषेध.
  10. दृश्य के क्षेत्र में सुई की स्थिति (कम आवर्धन उद्देश्यों का उपयोग करके सुविधा). microinjection प्रयोगों के लिए एक 40X शुष्क उद्देश्य यहां इस्तेमाल किया गया था ।
  11. स्थिति एक ऊर्ध्वाधर उद्देश्य लेंस के बीच के सापेक्ष स्थिति में सुई टिप macroscopically (यह सुई टिप खोजने में तेजी लाने जाएगा) । चरण के विपरीत प्रकाशिकी के साथ माइक्रोस्कोप का प्रयोग करें देखने के क्षेत्र के सापेक्ष क्षैतिज विमान में सुई टिप स्थानांतरित करने के लिए, एक ऑप्टिकल विमान में अच्छी तरह से ऊपर सेल परत ।
    नोट: सुई शुरू में देखने के क्षेत्र में एक छाया के रूप में दिखाई देगा और फोकस विमान तो टिप कल्पना करने के लिए समायोजित किया जा सकता है । एक बार सुई की नोक पाया जाता है, धीरे से नीचे एक स्थिति सेल परत करने के लिए नीचे सुई टिप के बाद ऑप्टिकल विमान कम ।
  12. एक फ्लोरोसेंट चैनल के लिए स्विचन जब फ्लोरोसेंट dextran का उपयोग करके सुई प्रवाह की जांच करें, और एक निरंतर "पृष्ठभूमि" प्रवाह प्राप्त करने के लिए दबाव डिवाइस का उपयोग कर प्रवाह धुन ।
    नोट: इस अनुच्छेद में, हम मैनुअल इंजेक्शन, जो लगातार सुई प्रवाह के दौरान सेल सतह और सुई टिप के कोमल आंदोलन को छूने के माध्यम से प्लाज्मा झिल्ली के माध्यम से तोड़ने की मध्यस्थता है का वर्णन । यह स्वत: इंजेक्शन उपकरणों के साथ क्रमादेशित सुई कम करने और सुई दबाव में वृद्धि के साथ किया जाना चाहिए इंजेक्शन की घटनाओं, जो एक बाद में सेल की आबादी के बाद उच्च कोशिका संख्या के इंजेक्शन के लिए और अधिक उपयुक्त हैं विश्लेषण. विधि यहां वर्णित समय से पहले चूक माइक्रोस्कोपी द्वारा एकल सेल विश्लेषण के लिए अनुकूलित है, के दौरान, और microinjection के बाद ।
  13. ब्याज की एक सेल का पता लगाएं और धीरे से सेल के ऊपर सुई कम ।
  14. जब microinject करने के लिए तैयार है, micromanipulator जॉयस्टिक के ठीक डैने का उपयोग कर कोशिका perinuclear क्षेत्र की ओर धीरे से सुई कम है, जबकि ध्यान में कोशिकाओं को रखते हुए.
  15. microinjection के लिए, धीरे सेल, जो सेल घुसना करने के लिए पर्याप्त हो सकता है की प्लाज्मा झिल्ली को छूने, या माइक्रोस्कोप सेटअप पर एक बहुत ही कोमल नल द्वारा क्षणिक झिल्ली टूटना सहायता ।
    नोट: सुई टिप पर एक सफेद बिंदु प्लाज्मा झिल्ली के साथ संपर्क के समय का संकेत होगा; झिल्ली टूटना के बाद, सुई टिप सेल में इंजेक्शन समाधान का एक कोमल प्रवाह के साथ फिर से सील होगा ।
  16. बंद इंजेक्शन प्रक्रिया के रूप में जल्द ही सेल में प्रवाह के रूप में दिखाई दे रहा है (आदर्श रूप में ०.३ एस के भीतर) मध्यम में सुई टिप चलती द्वारा । जब फ्लोरोसेंट dextran का उपयोग कर, सफल इंजेक्शन तुरंत प्रतिदीप्ति द्वारा प्रलेखित किया जा सकता है ।
  17. यदि वांछित, microinjection के पहले या बाद में समय चूक छवि अधिग्रहण आरंभ ।
    नोट: दवाओं या अवरोधकों के स्थानीय आवेदन सभी कदम यहां पर निष्पादित किया जा सकता है, microinjection घटना के लिए छोड़कर प्रति। स्थानीय अनुप्रयोगों के लिए, सक्रिय अणु के प्रसार प्रवाह दबाव द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है, और प्रतिदीप्ति द्वारा प्रलेखित, और सुई टिप वांछित ऊंचाई पर तैनात किया जा सकता है । स्थानीय अनुप्रयोग प्रयोगों के उदाहरणों के लिए, उदा., छोटे और Rottner14 या Kaverina एट अल देखें. 15
  18. microinjection के बाद, जब तक प्रोटीन का प्रभाव होता है रुको । विभिंन प्रोटीन के लिए और अपेक्षित परिणाम पर निर्भर करता है, मशीन समय भिंन हो सकते हैं । छोटे GTPase Rac1 के लिए, lamellipodium गठन की प्रतिक्रिया 1 मिनट या उससे कम के भीतर शुरू किया जा सकता है, लेकिन औसत पर लगभग 10-15 मिनट लगते है पूरी तरह से विकसित करने के लिए (चित्रा 1जी, एच) ।
  19. microinjection के बाद कोशिकाओं की व्यवहार्यता ंयायाधीश ।
    नोट: अनुचित या हानिकारक इंजेक्शन कोशिका क्षति का कारण बन सकते हैं, जो अक्सर गैर-विशिष्ट सेल-एज रिकर्षण या प्लाज्मा झिल्ली टूटना के साथ होता है ।
    1. ऊपर और नीचे प्लाज्मा झिल्ली, जो फ्लैट सेलुलर क्षेत्रों में इंजेक्शन के लिए हो सकता है दोनों के माध्यम से poking से बचें ।
      नोट: इंजेक्शन वॉल्यूम को न्यूनतम में रखा जाना चाहिए (आदर्श रूप में सेलुलर वॉल्यूम का < 5%) और आमतौर पर femtoliter रेंज में होगा । आवश्यक इंजेक्शन मात्रा भी एकाग्रता में परिवर्तन के द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है, लेकिन ध्यान दें कि प्रोटीन के लिए, सांद्रता > 2 मिलीग्राम/एमएल लगातार सुई कॉलेस्ट्रॉल के कारण अव्यावहारिक हो सकता है । हालांकि, यह भी शुद्ध प्रोटीन की गुणवत्ता और व्यवहार पर निर्भर करता है; उदा, फ्लोरोसेंट-युग्मित actin के इंजेक्शन, सुई टिप में एकाग्रता से निर्भर और अपरिहार्य बहुलकीकरण से जटिल है, और इसलिए यह शायद ही कभी आज निष्पादित होता है (छोटे एट अल देखें । 16).
  20. इससे पहले, के दौरान, या microinjection के प्रभाव के बाद, frap है या photoactivation एक ही सेल पर प्रदर्शन किया जा सकता है (अनुभाग 5 और 6 देखें).

5. frap है प्रक्रिया

  1. Transfect ब्याज के सेल प्रकार (B16-F1 यहां कोशिकाओं) प्लाज्मिड डीएनए के साथ एक फ्लोरोसेंट-टैग की गई ब्याज की प्रोटीन एंकोडिंग (यहां, β-actin के एक EGFP-टैग संस्करण का इस्तेमाल किया गया था) । बीज laminin-लेपित coverslips (चरण २.१०) पर कोशिकाओं ।
  2. इमेजिंग चैंबर (धारा 3) को इकट्ठा ।
  3. lamellipodial क्षेत्र के लिए निंन सेटिंग्स का उपयोग करें photobleaching: ६५ मेगावाट लेजर पावर (प्रायोगिक सेटअप और लेजर स्रोत के अनुसार चर); 10 पिक्सेल लेजर बीम व्यास; 1 एमएस ब्लीच आवास समय/ ५०० ms GFP एक्सपोज़र समय; १,५०० ms समय अंतराल । इस पत्र में प्रयोगात्मक परिणाम एक 100X 1.4 na apochromatic उद्देश्य के साथ प्रदर्शन किया गया ।
  4. photobleached क्षेत्र के आयामों में सटीकता सुनिश्चित करने के लिए लेजर अंशांकन निष्पादित करें । अंशांकन से पहले, किसी भी कक्ष की कमी वाले क्षेत्र को देखने के क्षेत्र में ले जाएं/प्रतिदीप्ति संकेत और प्रदर्शन पर चित्र का पालन करें ।
  5. संबंधित आवर्धन बटन पर क्लिक करके और "पैनल में लेजर पावर (3-5 मेगावाट) को कम करने के उद्देश्य आवर्धन का चयन करें । तीव्रता "मेनू । Visiview सॉफ्टवेयर (v 2.1.4) पर मैनुअल अंशांकन आरंभ करने के लिए, का चयन करें "कॉंफ़िगर । frap है "मेनू और पर क्लिक करें" जांचना । मैनुअल "मेनू समायोजित करें । सुनिश्चित करें कि लेजर एक तेज बिंदी के रूप में प्रतिष्ठित किया जा सकता है । यदि नहीं, तो refocus या लेजर हार्डवेयर समायोजित करें ।
  6. मैन्युअल रूप से पूर्व-निर्धारित सॉफ़्टवेयर X-Y निर्देशांक करने के लिए लेज़र मार्गदर्शक द्वारा अंशांकन निष्पादित करें । यह सॉफ़्टवेयर कैसे विशेष रूप से वर्तमान आवर्धन के लिए एक यूज़र-डिफ़ाइंड क्षेत्र के लिए लेज़र लक्ष्य करने के लिए अनुदेश देता है ।
  7. लेजर ट्रिगर करने से पहले, GFP चैनल के लिए स्विच और छवि शुरू/
  8. प्रदर्शन को देखते हुए GFP चैनल पर photobleached होने के लिए मैन्युअल रूप से क्षेत्र आरेखित करें.
  9. ४०५ एनएम लेजर के एक मैनुअल ट्रिगर द्वारा photobleaching शुरू, छवि अधिग्रहण की दीक्षा के बाद कम से कम 3-4 फ्रेम । बाद में डेटा विश्लेषण में छवि के सामान्यीकरण के लिए photobleaching से पहले फ़्रेम प्राप्त करना आवश्यक है.

6. Photoactivation प्रक्रिया

नोट: सॉफ्टवेयर, माइक्रोस्कोप सेटअप, और सेटिंग्स, लेजर शक्ति को छोड़कर, frap है के लिए उन लोगों के लिए समान हैं. photoactivation में, एक महत्वपूर्ण अंतर के रूप में frap है की तुलना में, यह है कि एक 405nm-लेजर काफी कम है कि photobleaching के लिए कार्यरत है, इस्तेमाल किया जाना चाहिए के लिए एक साथ GFP बिना पीए photobleaching को सक्रिय करने की शक्ति ।

  1. transfect के कक्ष प्रकार (B16-F1 यहां कक्षों; चरण २.५ देखें) प्लाज्मिड डीएनए एंकोडिंग PA-GFP-actin और एक और फ्लोरोसेंट-लेबल वाले प्रोटीन (जैसे, mCherry या mCherry-Lifeact) के साथ ।
    नोट: ज्यादातर मामलों में, mCherry-सकारात्मक कोशिकाओं को भी फिलीस्तीनी अथॉरिटी-GFP-actin वेक्टर के लिए सकारात्मक हो जाएगा, बाद आम तौर पर GFP चैनल पर photoactivation से पहले नहीं देखा । इस संभावना को बढ़ाने के लिए कि mCherry-पॉजिटिव कोशिकाएं भी पीए-GFP के लिए पॉजिटिव हैं, mCherry: pa-GFP-actin के 1:2 अभिकर्मक अनुपात का उपयोग करें । इस प्रोटोकॉल के बाद, mCherry व्यक्त कोशिकाओं के ९०% से अधिक PA-GFP-actin के सफल सक्रियण प्रदर्शित ।
  2. बीज B16-F1 laminin-लेपित coverslips (चरण २.१०) पर कोशिकाओं ।
  3. इमेजिंग चैंबर (धारा 3) को इकट्ठा ।
  4. photoactivation प्रयोगों को प्रारंभ करने से पहले, यदि आवश्यक हो, तो चयनित उद्देश्य के लिए लेज़र अंशांकन निष्पादित करें (चरण 5.4 – 5.6).
  5. ५०० एमएस एक्सपोजर और १,५०० एमएस समय अंतराल के लिए GFP/488 एनएम छवि अधिग्रहण सेट (प्रयोगात्मक डिजाइन पर निर्भर करता है) ।
  6. "तरंग दैर्ध्य श्रृंखला" वर्ग को चिह्नित करके या तो दोहरे चैनल या ट्रिपल चैनल समय चूक फिल्में प्राप्त करने के लिए सॉफ्टवेयर सेटिंग्स को समायोजित करें और "मोल में चैनलों की वांछित संख्या का चयन | तरंग दैर्ध्य मेनू "। यह समय चूक फिल्मों चरण कंट्रास्ट और GFP चैनलों के साथ प्राप्त कर रहे है कि सिफारिश की है ।
    1. वैकल्पिक रूप से, यह भी mCherry चैनल शामिल हैं; हालांकि, बहुत अधिक प्रकाश के साथ कोशिकाओं को उजागर धूप प्रेरित हो सकता है । इस तरह के Oxyrase के रूप में ऑक्सीजन मेहतरों के साथ बचा जा सकता है17, हालांकि प्रभावी उपचार सेल चैंबर सील की आवश्यकता है ।
  7. mCherry चैनल पर transfected कक्षों का पता लगाएं.
  8. लेजर ट्रिगर करने से पहले, प्रदर्शन को देखने के दौरान छवि/समय चूक अधिग्रहण शुरू करने और मैन्युअल रूप से चरण कंट्रास्ट चैनल पर photoactivated होने के लिए क्षेत्र को आकर्षित ।
  9. ४०५ एनएम लेजर के एक मैनुअल ट्रिगर द्वारा photoactivation आरंभ (तीव्रता सेट के बीच 5-15 मेगावाट से "पैनल । तीव्रता "मेनू), छवि अधिग्रहण दीक्षा के बाद कम से कम 3-4 फ्रेम ।

7. डेटा विश्लेषण और frap है परिणामों की प्रस्तुति

नोट: प्रस्तुत विधि एक प्रोटीन गतिशील actin विधानसभा की साइटों पर जमते के कारोबार की जांच के लिए प्रयोग किया जाता है, इस मामले वीएएसपी, जो आसंजन साइटों और फैलाया lamellipodia के सुझावों के साथ सहयोगियों में । हम lamellipodium टिप पर अपने कारोबार का विश्लेषण कर रहे हैं, लेकिन विश्लेषण के एक ही सिद्धांत वीएएसपी या किसी अंय प्रोटीन और अंय उपसेलुलर डिब्बों के कारोबार की जांच के लिए लागू किया जा सकता है ।

  1. Metamorph सॉफ्टवेयर पर Visiview से व्युत्पंन समय चूक फिल्में खोलो । इस आलेख में, Metamorph v 7.8.10 का उपयोग किया गया था ।
  2. मैन्युअल रूप से Metamorph पर संबंधित क्षेत्रों की रूपरेखा द्वारा photobleached क्षेत्रों के लिए तीव्रता मूल्यों प्राप्त. lamellipodium की नोक पर एक आकार ड्रा कि photobleached क्षेत्र के पूरे या भाग को शामिल किया गया है, और मैंयुअल रूप से बाद में फ्रेम पर अपनी स्थिति को समायोजित अगर जरूरत (यानी, अगर बढ़त फैला हुआ है), के लिए lamellipodial तीव्रता में परिवर्तन ट्रैक करने के लिए टिप विस्थापन के दौरान संबंधित घटक ।
  3. पृष्ठभूमि और photobleaching अधिग्रहण के सुधार के लिए, कक्ष के अंदर और बाहर क्षेत्रों का विश्लेषण । चित्रा 2को मापा तीव्रता के प्रतिनिधि क्षेत्रों के लिएएक देखें ।
  4. जबकि एक रॉय का चयन किया है, मेनू का उपयोग करके Metamorph पर इसकी तीव्रता मूल्यों को निकालने "उपाय । क्षेत्र माप "। सुनिश्चित करें कि "बीता हुआ समय" और "औसत तीव्रता" विकल्प "कॉन्फ़िगर करें" मेनू में चयनित हैं. "लॉग खोलें" पर क्लिक करें और "डायनेमिक डेटा एक्सचेंज" चुनें. किसी excel स्प्रेडशीट को खोलने के लिए "ठीक" क्लिक करें और Metamorph मानों को excel में चिपकाने के लिए फिर से "लॉग खोलें" बटन क्लिक करें ।
    नोट: ये मान प्रतिदीप्ति पुनर्प्राप्ति curves जनरेट करने के लिए उपयोग किए जाते हैं ।
  5. photobleached क्षेत्रों (photobleaching से पहले क्षेत्र तीव्रता के लिए सामान्यीकृत) के lamellipodium टिप पर प्रतिदीप्ति वसूली घटता पैदा करने के लिए, निम्न समीकरण लागू करें:
    Equation 1   समीकरण 1
    कहां: frap है तमिलनाडु ब्याज निंनलिखित photobleaching के प्रत्येक फ्रेम के लिए photobleached क्षेत्र तीव्रता है; तमिलनाडु के एक क्षेत्र की तीव्रता photobleaching निंनलिखित ब्याज की प्रत्येक फ्रेम के लिए सेल (पृष्ठभूमि) के बाहर ले लिया है; Insतमिलनाडु दो photobleaching निंनलिखित ब्याज की प्रत्येक फ्रेम के लिए क्षेत्र के अंदर औसत है (समय के अधिग्रहण photobleaching के लिए सामांय इस्तेमाल किया); frap हैटी- 1 photobleaching से पहले photobleached क्षेत्र तीव्रता है; बाहरटी-1 photobleaching से पहले एक क्षेत्र तीव्रता सेल के बाहर ले लिया (पृष्ठभूमि) है; और Insटी-1 photobleaching से पहले ब्याज की प्रत्येक सीमा के लिए क्षेत्र में दो औसत के अंदर है ।
  6. ब्याज की प्रत्येक समय सीमा के लिए, जांच करने के लिए सभी समय फ्रेम युक्त एक प्रतिदीप्ति वसूली वक्र प्राप्त करने के लिए समीकरण 1 का उपयोग करें । समय की लंबाई कड़ाई से जांच के तहत प्रोटीन पर निर्भर है । जब अज्ञात, प्रारंभिक प्रयोग करने के लिए प्रोटीन की टर्नओवर दर प्राप्त करते हैं ।
  7. पुनर्प्राप्ति के आधे समय की गणना करने के लिए, प्रतिदीप्ति पुनर्प्राप्ति वक्र के मान को इसी समय (सेकंड में) के साथ एक सिग्मा प्लॉट (v .12) में चिपकाएँ, और "डायनेमिक फ़िट विज़ार्ड" का उपयोग कर फ़िट वक्र निष्पादित करें । अधिकतम करने के लिए घातीय वृद्धि "उपकरण । चुनें मोनो-घातीय (एकल, 3 मापदंडों) या द्वि-घातीय (डबल, 4 पैरामीटर) कार्यों, सबसे अच्छा वक्र फिट पर निर्भर करता है ।
  8. मोनो-घातांक फ़ंक्शन के लिए निम्न सूत्र का उपयोग करें:
    Equation 2   समीकरण 2
  9. द्वि-घातांक फ़ंक्शन के लिए निम्न सूत्र का उपयोग करें:
    Equation 3   समीकरण 3
  10. पुनर्प्राप्ति के आधे समय की गणना करने के लिए Excel में "b" और "d" सिग्मा प्लॉट (समीकरण 2 या समीकरण 3) से व्युत्पंन पैरामीटर्स चिपकाएं । निंन समीकरण लागू करें:
    Equation 4   समीकरण 4
    या
    Equation 5   समीकरण 5
  11. जब मोनो-घातांक फ़ंक्शन एक सटीक वक्र में परिणाम फ़िट, केवल समीकरण 4लागू करें ।
  12. जब मोनो-घातांक फ़ंक्शन एक अच्छा वक्र फ़िट में परिणाम नहीं करता है, दोनों समीकरण 4 और समीकरण 5को हल करके द्वि-घातांक सूत्र लागू करें । परिणामस्वरूप दो दो अलग प्रोटीन भागों का प्रतिनिधित्व करने के रूप में वसूली के आधे समय पर विचार: एक तेजी से और एक धीरे आदान प्रदान अंश, क्रमशः ।

8. frap है द्वारा Lamellipodial Actin बहुलकीकरण दर का निर्धारण

  1. lamellipodial actin बहुलकीकरण दर, B16-tagged β-EGFP के साथ transfect actin-F1 कोशिकाओं का निर्धारण करने के लिए, और photobleach क्षेत्र (चरण ५.९) १.५ s समय अंतराल और ५०० ms lamellipodial एक्सपोज़र का उपयोग कर ।
  2. Metamorph में, Visiview से अधिग्रहीत समय चूक फिल्में खोलने के लिए और "माप द्वारा प्रयोग किया जाता उद्देश्य के अनुसार पिक्सेल/µm अनुपात जांचना । दूरी जांचना "उपकरण ।
  3. खेलते समय चूक फिल्म और फ्रेम पर रोक जब lamellipodial प्रतिदीप्ति वसूली, जो एक लाइन के रूप में lamella की ओर पीछे की तरफ बहती है, lamella तक पहुंच गया है और कोई आगे चरम प्रवाह ट्रैक किया जा सकता है ।
  4. lamellipodium की नोक और बरामद प्रतिदीप्ति के पीछे के बीच µm में दूरी को मापने । यह दूरी प्रतिगामी प्रवाह और दखलंदाजी दूरियों के योग से मेल खाती है ।
  5. वैकल्पिक रूप से, प्रतिगामी प्रवाह से दखल को अलग करने के लिए, photobleaching से पहले एक पंक्ति एक फ्रेम के साथ lamellipodial टिप निशान । photobleaching के समय lamellipodium टिप की मूल स्थिति को संदर्भित करने के लिए क्रमिक फ़्रेम में संदर्भ बिंदु के रूप में रेखा का उपयोग करें; संदर्भ बिंदु के लिए घुसपैठ की दूरी और प्रतिगामी प्रवाह को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  6. photobleaching होने के बाद प्रतिदीप्ति पुनर्प्राप्ति के लिए आवश्यक समय (सेकंड में) को नोट करें । समय मैंयुअल रूप से फ्रेम दर से गणना की जा सकती है या Metamorph द्वारा visualized के माध्यम से "उपाय । क्षेत्र माप "उपकरण ।
  7. (८.४ और ८.६ चरणों से Metamorph माप पर आधारित कुछ समीकरण पैरामीटर के साथ) निम्न समीकरण का उपयोग करके actin बहुलकीकरण दर व्युत्पन्न:
    Equation 6   समीकरण 6
    जहां actin बहुलकीकरण दर µm/मिनट में है, प्रतिगामी प्रवाह दूरी µm में है, lamellipodial की दखलंदाजी दूरी µm में है, और समय सेकंड में है ।

9. Photoactivation पर प्रोटीन प्रसार और गतिशीलता का विश्लेषण

ध्यान दें: यहां प्रस्तुत विधि PA-GFP से जुड़े actin के photoactivation को रोजगार द्वारा actin मोनोमर गतिशीलता के विश्लेषण का वर्णन करता है, जैसा कि दृश्य और ठहराव के माध्यम से प्रोटीन प्रसार के cytosol द्वारा सचित्र ।

  1. एक cytosolic क्षेत्र से दूर photoactivatable actin के प्रसार को मापने के लिए, साथ ही एक lamellipodial क्षेत्र के भीतर संचय, Metamorph का उपयोग करने के लिए निंनलिखित क्षेत्रों में समय पर तीव्रता का निर्धारण ( चित्रा 3में सचित्र ): अ cytosolic photoactivated क्षेत्र (पा); एक lamellipodial क्षेत्र, जिसमें photoactivated प्रोटीन समय (लाम) के साथ जमा होने की आशा है; पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति (आउट) के सामान्यीकरण के लिए उपयोग किए गए कक्ष के बाहर का एक क्षेत्र.
  2. जब cytosol के भीतर actin की गतिशीलता का निर्धारण, अलग cytosolic क्षेत्रों को मापने ( चित्रा 3ए, क्षेत्रों R1-R5) देखें. ध्यान दें कि photobleaching अधिग्रहण frap है के लिए एक समान फैशन में निर्धारित नहीं किया जा सकता है, फोकल में वृद्धि के कारण-और अंततः सेल-व्यापक प्रतिदीप्ति सक्रियण पर ।
  3. चरण ७.४ में वर्णित के रूप में एक Excel स्प्रेडशीट में Metamorph से सभी क्षेत्रों के लिए तीव्रता मान स्थानांतरित करें ।
  4. photoactivatable actin के विस्थापन की दर की जांच करने के लिए दूर cytosolic क्षेत्र के photoactivation या एक lamellipodial क्षेत्र में शामिल करने की अपनी दर (दोनों के रूप में प्रतिनिधित्व cytosolic photoactivated क्षेत्र के समय 0 में प्रतिशत तीव्रता) , चरण ९.३ में डेटा से प्रतिदीप्ति curves जनरेट करें । निंन समीकरण लागू करें:
    Equation 7   समीकरण 7
    Equation 8   समीकरण 8
    कहां: PAतमिलनाडु photoactivation निंनलिखित ब्याज की प्रत्येक फ्रेम के लिए एक cytosolic photoactivated क्षेत्र की तीव्रता है; लैमतमिलनाडु ब्याज की प्रत्येक फ्रेम के लिए एक lamellipodial क्षेत्र की तीव्रता के बाद photoactivation है; बाहरतमिलनाडु photoactivation निम्नलिखित ब्याज की प्रत्येक फ्रेम के लिए सेल (पृष्ठभूमि) के बाहर ले जाया क्षेत्र की तीव्रता है; PAT-1 photoactivation से पहले एक cytosolic photoactivated क्षेत्र की तीव्रता है; लैमटी-1 photoactivation से पहले एक lamellipodial क्षेत्र की तीव्रता है; बाहरटी-1 photoactivation से पहले सेल (पृष्ठभूमि) के बाहर ले लिया एक क्षेत्र की तीव्रता है; PAटी0 समय पर एक cytosolic photoactivated क्षेत्र की तीव्रता है 0 (यानी, photoactivation के बाद पहली फ्रेम); और बाहरटी0 एक क्षेत्र की तीव्रता (यानी, photoactivation के बाद पहली फ्रेम) समय 0 में सेल (पृष्ठभूमि) के बाहर ले लिया है ।
  5. वैकल्पिक रूप से, डेटा के बेहतर दृश्य के लिए, प्रत्येक बाद के फ्रेम से photoactivation के बाद पहले फ्रेम की तीव्रता घटाकर 0 करने के लिए तीव्रता curves को सामान्य ।
    नोट: निम्न विश्लेषण विधि (चरण 9.6-9.8) भी cytosol के भीतर photoactivated actin के cytosolic फैलाव की गणना की अनुमति देता है ।
  6. cytosolic क्षेत्रों के लिए तीव्रता को मापने, जो लगातार सक्रियण क्षेत्र से लंबे समय तक तैनात हैं ।
  7. photoactivated क्षेत्र के समय 0 पर प्रतिशत तीव्रता के रूप में इन क्षेत्रों के तनाव का प्रतिनिधित्व करने के लिए, समीकरण 8, जहां lamellipodial तीव्रता प्रत्येक cytosolic रॉय के लिए तीव्रता के साथ प्रतिस्थापित कर रहे है लागू होते हैं । आकार और क्षेत्रों की संख्या को मापा जा करने के लिए कक्ष आकार और dispersing दूरी के आधार पर भिन्न हो सकते हैं ।
  8. प्रत्येक cytosolic क्षेत्र में घुसपैठ photoactivated प्रोटीन की दर के लिए एक quantifiable मूल्य प्राप्त करने के लिए, सिग्मा साजिश में प्रत्येक क्षेत्र के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता वृद्धि की वक्र के समय और मूल्यों पेस्ट (धारा 7 में frap है विश्लेषण के समान), का उपयोग करें समीकरण 2 और समीकरण 4 प्रतिदीप्ति तीव्रता एक पठार तक पहुंचने के आधे समय प्राप्त करने के लिए । विभिंन प्रायोगिक समूहों के बीच टी1/2 मान की तुलना करें ।

Representative Results

चित्रा 1g , एच शो चरण एक NIH3T3 fibroblast सेल के विपरीत छवियों से पहले और 10 मिनट के बाद Rac1, जो एक छोटे Rho-परिवार GTPase लहर परिसर के साथ बातचीत के माध्यम से lamellipodia गठन उत्प्रेरण में सक्षम है की microinjection । सेल पहले microinjection (चित्रा 1जी), इसकी व्यवहार्यता और आकृति विज्ञान की पुष्टि करने के लिए, जैसे, lamellipodia की कमी से पहले visualized है । 10 मिनट के बाद microinjection में, सेल स्पष्ट रूप से अपनी आकृति विज्ञान, जो इस उपचार से अपेक्षित है बदल गया है, और एक सफल इंजेक्शन (चित्रा 1एच) इंगित करता है ।

सादगी और स्पष्टता के लिए, हम अगले frap है और कोशिकाओं में photoactivation विश्लेषण, जो इसके अलावा microinjected नहीं किया गया है के लिए अनुकरणीय परिणाम प्रदान करते हैं ।

lamellipodium टिप पर EGFP-टैग वीएएसपी के कारोबार का विश्लेषण चित्रा 2ए-एफमें दिखाया गया है । वीएएसपी में नवजात और फोकल आसंजन, छोटे और लंबी डॉट्स के लक्ष्य के अलावा सेल के इंटीरियर18,19में ध्यान दें । टिप पर एक स्पष्ट वीएएसपी संचय के साथ एक lamellipodial क्षेत्र के प्रतिदीप्ति तीव्रता ब्लीच किया गया था और प्रत्येक समय सीमा के लिए मापा, पहले रॉय के समोच्च का पालन करके, दौरान, और के रूप में ब्लीचिंग के बाद lamellipodium बहर आगे । के रूप में ब्लीच्ड EGFP-वीएएसपी प्रोटीन इन साइटों पर गैर प्रक्षालित अणुओं द्वारा पुनर्नवीनीकरण किया जा रहा है, प्रतिदीप्ति के क्रमिक वसूली (चित्रा 2बी) मनाया जाता है । frap है वसूली वक्र इस फैशन में प्राप्त की और पूर्व ब्लीच तीव्रता को सामान्यीकृत (1 के रूप में व्यक्त) चित्रा2 सी में देखा जा सकता है । Photobleaching दक्षता भिंन हो सकते है और इस उदाहरण में ब्लीचिंग से पहले मूल्य का लगभग 20% था, के रूप में टी0 पर मूल्य से निर्धारित (Photobleaching के बाद पहली फ्रेम) । प्रतिदीप्ति की वृद्धि ब्लीचिंग से पहले प्रतिदीप्ति के लगभग ८०% पर दिखाया उदाहरण में एक पठार तक पहुंचता है । प्रयोग के समय पाठ्यक्रम के दौरान एक स्थैतिक संरचना में, जैसे कि एक फोकल आसंजन के रूप में, पूर्व ब्लीच तीव्रता और पठार के बीच अंतर वसूली के बाद पहुंच प्रतिदीप्ति के रूप में परिभाषित किया गया है (यदि, लाल तीर में चित्रा 2 सी, ई), जबकि ब्लीचिंग और पूर्ण वसूली के समय के बीच बरामद प्रतिदीप्ति की मात्रा को मोबाइल अंश के रूप में परिभाषित किया गया है ( चित्रा 2सी, ईमें डबल-सिरों वाले तीर). ध्यान दें कि इस तरह के lamellipodium टिप के रूप में एक गतिशील रूप से बदलती संरचना में यहां का विश्लेषण किया, की हद तक अगर न केवल unmobile अणुओं का प्रतिनिधित्व हो सकता है, लेकिन यह भी एक प्रकार की कमी से प्राप्त करने की गति, EGFP के रूप में-वीएएसपी तीव्रता इस पर निर्भर करने के लिए जाना जाता है पैरामीटर18। वसूली के आधे समय की गणना करने के लिए, एक फिट वक्र सिग्मा भूखंड पर बनाया गया था (चित्रा 2डी). इस मामले में, "b" पैरामीटर का मान समीकरण 2 को हल करने से निकाले गए ०.०७५४, के बराबर है, जो जब लघुगणकीय फ़ंक्शन (समीकरण 4) के लिए लागू किया गया है, तो ९.१९ s (चित्रा 2d की पुनर्प्राप्ति का अनुमानित आधे समय में परिणाम , अभी तक सही पैनल), जो इस विशेष सेल में अपेक्षाकृत तेजी से है के रूप में पहले5प्रकाशित औसत की तुलना में । यह नोट किया जाना चाहिए कि पुनर्प्राप्ति आधा-बार कभी-कभार समान जनसंख्या के भीतर कक्ष से कक्ष तक भिंन हो सकती है । इसलिए, प्रतिनिधि परिणाम प्राप्त करने के लिए, हम अनुशंसा करते है कि इस पैरामीटर का निर्धारण औसत से कम 15-20 कक्षों से । प्रसरण की डिग्री समझाने के लिए, प्रत्येक बार-पॉइंट के लिए 15 कक्षों से औसत EGFP-वीएएसपी पुनर्प्राप्ति का अंकगणित अर्थ (चित्र 2ई) जनरेट किया गया था, और एक अनुरूप फैशन में औसत वक्र बनाया गया और प्रदर्शित होता है (आकृति 2 च).

lamellipodial actin नेटवर्क की बहुलकीकरण दर में आगे नेटवर्क की दखलंदाजी और प्रतिगामी प्रवाह का योग शामिल है । frap है transfecting कोशिकाओं द्वारा actin बहुलकीकरण दर को मापने के लिए लागू किया जा सकता है (इस मामले में B16-F1) के साथ EGFP-tagged β-actin और photobleaching एक फैला हुआ lamellipodial क्षेत्र (चित्रा2 जी). lamellipodial actin नेटवर्क बहुलकीकरण के विश्लेषण के लिए, EGFP-tagged β-actin के ब्लीचिंग पर प्रतिदीप्ति वसूली समय के साथ मूल्यांकन किया है । actin मोनोमर के बहुलकीकरण के रूप में lamellipodial actin रेशा के कंटीले छोर पर प्रगति करता है (जो सामने की ओर सभी बिंदु20), नेटवर्क लगातार translocated rearwards है और आगे प्रगति, जो की दरों को आसानी से किया जा सकता है photobleaching पर प्रतिदीप्ति के ध्रुवीकरण वसूली के माध्यम से प्राप्त की । lamellipodium की प्रतिदीप्ति वसूली के रूप में जल्द ही पूरा हो गया है के रूप में ब्लीच्ड जोन lamellipodium और lamella के पीछे के हिस्से के बीच संक्रमण क्षेत्र में पहुंच गया है, जो अधिक क्षैतिज-व्यवस्थित रेशा बंडलों की एक कम घनत्व की विशेषता है क्या lamellipodium में मनाया जाता है की तुलना में बहुत अधिक धीरे मोड़ । जैसा कि चित्रा 2जीमें सचित्र, प्रतिदीप्ति वसूली एक किनारे को क्षैतिज रेखा के रूप में visualized किया जा सकता है और lamella, जो दखलंदाजी और प्रतिगामी प्रवाह की दूरी को मापने की अनुमति देता है की ओर पीछे की तरफ बह (व्यक्तिगत प्रतिनिधित्व चित्रा 2के सुदूर दाहिने पैनल मेंजी के रूप में नारंगी और लाल डबल सिरों वाले तीर, क्रमशः) ।

हम भी B16-F1 transfected कोशिकाओं में photoactivation आवेदन किया है PA-GFP-actin के actin मोनोमर के भीतर गतिशीलता को ट्रैक करने के लिए और उनके निगमन की दर में फैला हुआ cytosol के भीतर । जैसा कि चित्रा 3ए, बीमें सचित्र, एक cytosolic क्षेत्र एक ४०५ एनएम लेजर के लिए जोखिम से photoactivated था, जबकि छवियों GFP चैनल हर १.५ एस पर GFP के वितरण visualizing के लिए अधिग्रहीत किया गया-टैग, photoactivated actin । Photoactivated GFP-actin को चित्रा 3बीमें cytosolic क्षेत्र से बाहर फैलाना देखा जा सकता है । photoactivated cytosolic क्षेत्र में प्रतिदीप्ति तीव्रता घटने की दर टी0 पर आरंभिक तीव्रता के प्रतिशत के रूप में दर्शायी गई है (photoactivation के बाद पहला फ़्रेम; चित्र 3 ग). Photoactivated actin भी lamellipodia के सुझावों पर एकीकृत करता है, जहां नई actin मोनोमर में दखलंदाजी के दौरान actin रेशा के बढ़ते कंटीले सिरों को जोड़ दिया जाता है. lamellipodial निगमन की दर का अनुमान लगाने के लिए, हम चौड़ाई में लगभग 5 µm और ऊंचाई में 1 µm के एक दो आयामी समोच्च/क्षेत्र के समय पर प्रतिदीप्ति तीव्रता मापा; क्षेत्र लगातार फिर से lamellipodium की नोक पर तैनात के रूप में यह फैला हुआ था । Actin टी0 में photoactivated cytosolic क्षेत्र के प्रतिदीप्ति तीव्रता के प्रतिशत के रूप में प्रतिनिधित्व किया गया था (चित्रा 3डी) । actin रेशा के बढ़ाव के रूप में, नई actin मोनोमर lamellipodial मोर्चे पर शामिल किया गया । इन actin मोनोमर का एक अंश cytosolic पूल से प्राप्त stochastically था जहाँ मोनोमर photoactivated थे. photoactivation के बाद पहले 20 एस में lamellipodia में प्रतिदीप्ति की तेजी से वृद्धि में यह परिणाम है । के रूप में नए मोनोमर lamellipodial सामने जोड़ा जा रहा है, पहले से शामिल actin मोनोमर प्रतिगामी प्रवाह द्वारा lamella की ओर तंतु के साथ प्रवाह । समय के साथ, रॉय पूरी तरह से फ्लोरोसेंट मोनोमर और प्रतिदीप्ति में एक पठार से भरा है (चित्रा 3डी) तक पहुंच गया है । प्रतिदीप्ति में एक क्रमिक ड्रॉप तो जब, सेल भर में photoactivated मोनोमर के प्रसार के बाद मनाया जाता है, गैर photoactivated actin मोनोमर तेजी से किया जा रहा है फिर से lamellipodial सामने जोड़ा । प्रतिदीप्ति में इस कमी से एक नया पठार मिल जाएगा, जो photoactivated और गैर-photoactivated मोनोमर के बीच पूरी सेल में एक संतुलन के रूप में पहुँच जाएगा (डेटा नहीं दिखाया गया है).

cytosol भर में actin मोनोमर की गतिशीलता photoactivated क्षेत्र से अधिक से अधिक तैनात समान आकार के क्षेत्रों में प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने के द्वारा व्युत्पंन किया गया था ( चित्रा 3पर उदाहरण रंग कोडित क्षेत्रों द्वारा लेबल R1-R5) । के रूप में चित्रा 3ईमें सचित्र, इन क्षेत्रों में से प्रत्येक में प्रतिदीप्ति तीव्रता धीरे cytosolically photoactivated क्षेत्र से दूर कम हो रही है, के रूप में photoactivated actin मोनोमर के अंश तेजी से पतला हो जाता है गैर सक्रिय (यानी, गैर फ्लोरोसेंट) मोनोमर । इसके अलावा, प्रतिदीप्ति के शिखर बाद में पहुंच जाता है: और अधिक दूर मापा क्षेत्र photoactivated क्षेत्र से स्थित है, अब समय है कि actin मोनोमर के लिए आवश्यक है इन क्षेत्रों में फैलाना । प्रत्येक क्षेत्र में actin मोनोमर घुसपैठ की डिग्री के लिए एक प्रतिनिधि मूल्य प्रतिदीप्ति पठार तक पहुंचने के आधे समय को बढ़ाता है द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । अधिक दूर क्षेत्र, अब यह photoactivated actin के लिए लेता है इसे में फैलाना, और इस प्रकार अधिक समय फ्लोरोसेंट पठार के लिए आवश्यक तक पहुंच सकता है, अंततः एक उच्च टी1/2 मूल्य (चित्रा 3ई) के लिए अग्रणी ।

Figure 1
चित्र 1 : इमेजिंग चैंबर असेंबली और microinjection कार्यविधि. (a) इमेजिंग चैंबर अवयव । (ख) सिलिकॉन तेल सावधानी से एक प्लास्टिक मुहर के उद्घाटन के आसपास लिप्त है । (ग) coverslip सेल के साथ तैनात है साइड इमेजिंग चैंबर खोलने के केंद्र में सामना करना पड़ रहा है । (d) एक सुरक्षित सील स्थिति द्वारा coverslip के शीर्ष पर प्लास्टिक मुहर और पक्ष clamps कस द्वारा स्थापित किया गया है । (ङ) माइक्रोस्कोपी मीडियम को चैम्बर स्लॉट में pipetted जाता है. (च) इमेजिंग चैंबर माइक्रोस्कोप मंच पर तैनात किया गया है, हीट डिटेक्टर और इलेक्ट्रोड एक हीटिंग इकाई पूर्व सेट करने के लिए ३७ ° c करने के लिए लिंक कर रहे हैं, और कोशिकाओं माइक्रोस्कोपी शुरू करने से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए अनुकूलन करने की अनुमति दी जाती है. इस उदाहरण में, माइक्रोस्कोप स्टेज भी microinjections प्रदर्शन के लिए एक micromanipulator से सुसज्जित है, और microinjection सुई इमेजिंग चैंबर में कोशिका परत को कवर माध्यम में डूबा हुआ है. (g) एक NIH3T3 fibroblast कोशिका चरण-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप द्वारा microinjection से पहले visualized है । perinuclear डिब्बे में रेड क्रॉस भविष्य microinjection के स्थान को इंगित करता है, जो भारी नाभिक के निकट निकटता के कारण एक उच्च cytoplasmic क्षेत्र से मेल खाती है । (h) 10 मिनट Rac1 के साथ microinjection के बाद, सेल पूरे कोशिका परिधि के चारों ओर lamellipodia के प्रमुख गठन से प्रतिक्रिया करता है (हरे तीर से संकेत मिलता है) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: frap है प्रोटीन कारोबार या lamellipodial actin बहुलकीकरण की दर निर्धारित करने की अनुमति देता है । (क) B16-F1 सेल के प्रतिनिधि उदाहरण व्यक्त EGFP-वीएएसपी एक lamellipodial क्षेत्र के photobleaching से पहले संकेत के रूप में । अलग रंग आकृति/आकार इंगित करने के लिए जो क्षेत्र समय के साथ प्रतिदीप्ति तीव्रता माप के लिए विचार किया गया लेबल हैं । नोट एक विस्मयादिबोधक चिह्न के साथ चिह्नित लाल समोच्च, जो एक cytosolic क्षेत्र एक से अधिक बुलबुले और कोशिका की सतह पर असंतोष युक्त क्षेत्र में तैनात लेबल । इस तरह गतिशील क्षेत्रों प्रतिदीप्ति संदर्भ के क्षेत्रों के चयन के लिए बचा जाना चाहिए, के रूप में वे मजबूत अल्पकालिक प्रतिदीप्ति के उतार चढ़ाव की विशेषता है, संभावित गलत परिणाम पैदा कर रहे हैं । (ख) Lamellipodial क्षेत्र के EGFP-वीएएसपी एक्सप्रेस सेल से पहले और बाद में photobleaching । बैंगनी में चिह्नित क्षेत्र के भीतर photobleaching के बाद फ्लोरोसेंट संकेत की वसूली समय के साथ कल्पना की है । तीर एक microspike की नोक इंगित करता है, वीएएसपी actin रेशा के उच्च घनत्व के कारण होने की संभावना के लिए समृद्ध polymerizing वहाँ19. (ग) के रूप में एक frap है वसूली वक्र का एक उदाहरण बी में photobleached lamellipodium (बैंगनी समोच्च) की फ्लोरोसेंट तीव्रता को बढ़ाता है सही पर लाल और हरी लाइनों से संकेत मिलता है, क्रमशः, मोबाइल और मोबाइल अंशों । (d) c में frap है पुनर्प्राप्ति वक्र का एक फ़िट (बायां फलक) और पुनर्प्राप्ति आधा समय (दायां फलक) प्राप्त करने के लिए उपयोग की जाने वाली परिकलन विधि का एक उदाहरण । (ई) एक frap है वसूली वक्र 15 कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति वसूली curves औसत से व्युत्पंन का एक उदाहरण है, SEM नमूना जनसंख्या के भीतर परिवर्तनशीलता की डिग्री का संकेत सलाखों के साथ । (च) एक वक्र फिट frap है वसूली वक्र के औसत से व्युत्पंन 15 कोशिकाओं (बाएं पैनल) के फिट बैठता है और गणना की वसूली आधा समय (सही पैनल) प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया विधि का एक उदाहरण । (g) एक B16-F1 सेल एक्सप्रेस EGFP-टैग β-actin से पहले और बाद के रूप में एक lamellipodial क्षेत्र के ब्लीचिंग संकेत के रूप में फैलाया lamellipodium के समय चूक पैनलों, प्रतिदीप्ति में lamellipodium वसूली द्वारा समय के बाद । दूर सही पैनल पर, दखल और प्रतिगामी दूरी के लिए मापा मूल्यों (नारंगी और लाल, क्रमशः में) प्रदान की जाती हैं । छवि पैनलों के तहत गणना कैसे दखलंदाजी और प्रतिगामी दूरी का योग lamellipodial actin नेटवर्क के बहुलकीकरण दर प्राप्त करने के लिए उपयोग किया जाता है पता चलता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: Photoactivation ऑफ पीए-GFP-actin के लिए मोनोमर ट्रैकिंग सेल भर. (क) एक B16-F1 सेल एक्सप्रेस PA-GFP-actin एक cytosolic क्षेत्र में photoactivation ट्रिगर के रूप में लाल वृत्त (फिलीस्तीनी अथॉरिटी) द्वारा संकेत से पहले एक प्रतिनिधि उदाहरण । अलग रंग की आकृति का संकेत है जो क्षेत्रों समय के साथ प्रतिदीप्ति तीव्रता माप के लिए विचार किया गया लेबल कर रहे हैं । (b) PA-GFP-actin निंन photoactivation के लौकिक वितरण का चित्रण । photoactivated, cytosolic क्षेत्र (लाल वृत्त) में प्रतिदीप्ति की क्रमिक कमी को ध्यान में रखें, जैसा कि photoactivated actin से दूर फैलाना है । नेटवर्क में सामने और विधानसभा के लिए उनके प्रसार के कारण, photoactivated actin मोनोमर धीरे-lamellipodia (सियान क्षेत्र) में और cytosol (अलग रंग-कोडित क्षेत्रों) में एक दूरी और समय पर निर्भर फैशन भर में बढ़ाया जाता है । (ग) प्रतिनिधि, photoactivated cytosolic क्षेत्र के भीतर प्रतिदीप्ति के अस्थाई गिरावट (बी में लाल समोच्च) । (घ) lamellipodial क्षेत्र में प्रतिदीप्ति तीव्रता में लौकिक परिवर्तन (सियान समोच्च बी) । (ङ) photoactivation के क्षेत्र से चर दूरी में स्थिति के कारण cytosolic क्षेत्रों के प्रतिदीप्ति तीव्रता में लौकिक परिवर्तन (ख में रंग कोडित) के प्रतिनिधि घटता है । नोट कैसे आधा प्रतिदीप्ति पठार तक पहुंचने के समय (सही पर कथा में संकेत) photoactivation के क्षेत्र के लिए दी क्षेत्र की दूरी के साथ वृद्धि, की संभावना बढ़ actin मोनोमर के प्रसार के लिए आवश्यक समय के साथ correlating संबंधित क्षेत्र । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

यहां हम इस लेख में वर्णित तकनीकों में महत्वपूर्ण कदम पर चर्चा, और कैसे वे विभिंन प्रायोगिक स्थितियों में आवेदन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

Microinjection एक तरीका है कि कोशिकाओं में exogenous प्रोटीन, अवरोधकों, या दवाओं शुरू करने से तुरंत प्रभाव पर नजर रखने के लिए लागू किया जा सकता है । यह विशेष रूप से transfect कोशिका प्रकार या स्थितियों में मुश्किल में प्रोटीन के कार्यों का निर्धारण करने के लिए लाभप्रद हो सकता है जब दीर्घकालिक अभिव्यक्ति वांछित नहीं है । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि कुछ कोशिका प्रकार के अस्तित्व पर निर्भर करता है extracellular मैट्रिक्स वे पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं । अधिकांश endothelial, उपकला, या fibroblast तरह कोशिका प्रकार, मछली keratocytes की तरह भी छोटे वाले (डांग एट अल देखें. 21 और एंडरसन और22पार) को सफलतापूर्वक इंजेक्ट किया जा सकता है । हालांकि, वहां अपवाद हैं, जैसे B16-F1 कोशिकाओं laminin, जो सेल प्रवास के एक उत्कृष्ट मॉडल प्रणाली का गठन पर वरीयता प्राप्त है, लेकिन इंजेक्शन के साथ इस प्रकार की अज्ञात कारण के लिए बुनियाद पर असंगत हैं । NIH3T3 fibroblast कोशिकाओं के लिए, हम नियमित रूप से fibronectin बुनियाद पर इंजेक्शन प्रदर्शन, और frap है के रूप में अतिरिक्त photomanipulation तकनीक (यहां तक कि photoactivation के साथ, B16-F1 यहां कोशिकाओं के लिए दिखाया गया है) समान रूप से अच्छी तरह से इन fibroblasts में प्रदर्शन किया जा सकता है (देखें उदा., Köstler एट अल. 3). यह भी विचार किया जाना चाहिए कि विभिंन प्रोटीन, उनके कार्यात्मक गुण और प्रयोग के लक्ष्यों के अनुसार, समय की विभिंन मात्रा में परिवर्तन का कारण लग सकता है, सेकंड से घंटे अलग । तकनीक का एक लाभ यह है कि खुराक/exogenous एजेंट की एकाग्रता और अधिक सही रूप से एक सेल स्तर पर नियंत्रित किया जा सकता है जैसे, जब प्लाज्मिड अभिकर्मक का उपयोग कर । इसके अलावा, एक प्रोटीन की फ्लोरोसेंट टैगिंग एक आवश्यकता के लिए सेल में अपनी उपस्थिति की गारंटी नहीं है, जो लचीलापन बढ़ा सकते है अगर एक साथ बहु अंय फ्लोरोसेंट के चैनल दृश्य-प्रोटीन की आवश्यकता है टैग । Microinjection विशिष्ट प्रोटीन या कोशिका आकृति विज्ञान या cytoskeleton (जैसे, डांग एट अल के गतिशील परिवर्तन पर प्रोटीन मिश्रण के तत्काल प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है । Arp2/3 परिसर अवरोध करनेवाला Arpin द्वारा प्रवास पर तत्काल प्रभाव का एक उदाहरण के लिए 21 ). तकनीक का एक नुकसान अपनी इनवेसिव, जो कोशिका क्षति या सेल आकृति विज्ञान प्रभाव पैदा कर सकता है । इसलिए, एक महत्वपूर्ण विचार जब microinjections प्रदर्शन कर रहा है सेल व्यवहार्यता की निगरानी । यहां शुरू की विधि मैनुअल हेरफेर पर निर्भर करता है । स्थिति में सफल इंजेक्शन के साथ संगत होने का परीक्षण किया, जैसे fibroblasts fibronectin पर बढ़ रही है, मैनुअल इंजेक्शन प्रोटोकॉल यहां वर्णित एक के पास १००% सफलता दर की अनुमति देता है; यह आवश्यक है जब परिष्कृत और समय लेने वाली अनुवर्ती वीडियो माइक्रोस्कोपी या frap है सहित प्रयोगों अनुवर्ती के साथ इस दृष्टिकोण के संयोजन के रूप में पहले से 3 प्रकाशित । यह कभी नहीं बाहर है कि, व्यक्तिगत कोशिकाओं को एक microinjection घटना है, जो सुरक्षित रूप से दोनों नाभिक और कोशिका द्रव्य, सेल एज reकर्षण के बाद के विपरीत के अचानक परिवर्तन से पहचाना जा सकता है से पीड़ित हो सकता है । इस तरह के दुर्लभ प्रयोगात्मक मामलों और बाहर इस तरह के विश्लेषण के लिए नहीं माना जाता है ।

हालांकि, एक आधा स्वचालित दृष्टिकोण भी आम तौर पर इस्तेमाल किया है, उदाहरण के लिए तेजी से रोजगार (< 300 ms) मशीन नियंत्रित सुई इंजेक्शन दबाव वृद्धि के साथ संयोग कम है, ताकि सुई केवल प्रत्येक कोशिका के ऊपर तैनात करने से पहले संबंधित है इंजेक्शन. आधे स्वत: इंजेक्शन की सफलता की दर परिभाषा द्वारा मैनुअल दृष्टिकोण ऊपर वर्णित की तुलना में कम है, सिर्फ इसलिए कि यह गति के लिए अनुकूलित है, कई कोशिकाओं है कि सफलतापूर्वक इस उपचार बच के विश्लेषण के बाद; इस प्रकार यह एक व्यक्तिगत कोशिका के सफल इंजेक्शन पर भरोसा नहीं करता है । इसलिए, के रूप में एकल सेल विश्लेषण करने के लिए विरोध किया, आधे स्वचालित इंजेक्शन बेहतर कई सौ कोशिकाओं के इंजेक्शन प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए अनुकूल हैं, उदा, कम आवर्धन पर या सेल निर्धारण और धुंधला पर वीडियो माइक्रोस्कोपी द्वारा. विस्तृत दृष्टिकोण के बावजूद कार्यरत, microinjection एक अंत बिंदु परख का गठन नहीं करता है, लेकिन तकनीक की एक किस्म के साथ जोड़ा जा सकता है, frap है या photoactivation 3 सहित ।

जब frap है द्वारा प्रोटीन टर्नओवर दर का निर्धारण, लेजर की तीव्रता, माइक्रोस्कोप सेटअप और इमेजिंग शर्तों (आवर्धन, उद्देश्यों ,आदि के आधार पर अनुकूलित किया जाना चाहिए, और साथ ही सेल प्रकार, संरचना, और के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन photobleaching) । ध्यान दें कि इष्टतम लेजर शक्ति पर, कुशल ब्लीचिंग कम संभव धूप के साथ संयुक्त है, सिकुड़ना या विश्लेषण के तहत संरचना की पूरी reकर्षण से बचने के लिए (जैसे, lamellipodia या filopodia) या भी सेलुलर स्तर पर नुकसान । आदर्श रूप में, ब्लीचिंग दक्षता का कम-से-80%, प्राप्त किया जाना चाहिए, हालांकि पूर्ण ब्लीचिंग प्रोटीन के बहुत तेजी से कारोबार से प्रभावित हो सकता है, जिस स्थिति में, ५०% से ऊपर कुछ भी स्वीकार्य हो सकता है । एक दिया संरचना और फ्लोरोसेंट डाई के लिए इष्टतम ब्लीचिंग शक्ति प्रयोगात्मक परीक्षण किया जाना चाहिए, एक कम लेजर अपनी क्रमिक वृद्धि के बाद शक्ति से शुरू । बेशक, किसी भी फ्लोरोसेंट डाई परिभाषा द्वारा कर सकते है लेजर प्रकाश के साथ प्रक्षालित किया जा सकता है उत्तेजना के अपने चरम (४८८ एनएम के लिए अक्सर ऐसे FITC या EGFP के रूप में हरी रंजक इस्तेमाल के लिए) । हालांकि, कम तरंग दैर्ध्य, जैसे कि पास-यूवी पराबैंगनीकिरण के साथ पराबैंगनीकिरण, उच्च शक्तियों उद्धार और इस प्रकार भी आमतौर पर इस्तेमाल किया रंजक के कुशल ब्लीचिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हम नियमित रूप से (ऐसे mCherry के रूप में) दोनों EGFP और लाल फ्लोरोसेंट रंजक के ब्लीचिंग के लिए एक ४०५ एनएम डायोड लेजर (१२० मेगावाट) का काम है, हालांकि बाद के मामले में थोड़ा कम दक्षता के साथ (नहीं दिखाया गया डेटा) । के रूप में ४०५ एनएम-डायोड भी PA-GFP के photoactivation के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (नीचे देखें), यह अधिक से अधिक लचीलापन के साथ इस प्रणाली endows ।

B16-F1 सेल संरचनाओं और फ्लोरोसेंट प्रोटीन photobleached के लिए यहां, ४०५ एनएम-65 के बीच लेजर शक्तियों-100 मेगावाट लागू किया गया । किसी photobleached क्षेत्र का विश्लेषण करते समय, यह विचार करना महत्वपूर्ण है कि क्या दिया गया ढांचा विश्लेषण समयावधि में उसके मूल आकार में संरक्षित है । उदाहरण के लिए, जब lamellipodia सुझावों पर प्रोटीन के कारोबार का विश्लेषण, देखभाल लिया जाना चाहिए कि lamellipodia की वक्रता काफी समय के साथ बदल गया है, वक्रता में परिवर्तन के रूप में गलत परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते है यदि क्षेत्र/ पूरी तरह से प्रत्येक मापा फ्रेम में संरचना की पूर्णरूप से घेरना । इसके अलावा, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि lamellipodia में एंबेडेड बंडलों, जैसे microspikes, प्रतिदीप्ति तीव्रता में विचलन का कारण हो सकता है । के रूप में चित्रा 2बी में सचित्र (9 एस समय सीमा में सफेद तीर), एक microspike संरचना की तरह मापा photobleached क्षेत्र के बगल में स्थित है, लेकिन इसके बारे में माप की अवधि के दौरान बाहर रहता है, और इस प्रकार कोई कारण नहीं है अशुद्धि. प्रोटीन कारोबार के विश्लेषण के लिए, महत्वपूर्ण विचार जब स्थान और विश्लेषण क्षेत्रों के आकार का चयन कर रहे है कि समय के साथ उनके प्रतिदीप्ति काफी से बचने के लिए मुश्किल के अलावा कक्ष आकृति विज्ञान या कारकों में परिवर्तन से प्रभावित नहीं होना चाहिए अर्ज photobleaching. उदाहरण के लिए, विश्लेषण संरचना में महत्वपूर्ण मात्रात्मक योगदान प्रदान करने वाली संरचनाओं को विश्लेषण के दौरान मापा क्षेत्र से बाहर नहीं जाना चाहिए; इसके अलावा, असंबंधित, ऐसे vesicular संरचनाओं के रूप में फ्लोरोसेंट संस्थाओं कि प्रोटीन को आकर्षित विश्लेषण के दौरान ब्याज के क्षेत्र में प्रवेश नहीं करना चाहिए । lamellipodial actin बहुलकीकरण की दर निर्धारित करने के लिए, ध्यान रखा जाना चाहिए कि कोई मुकर या ruffling (यानी, ऊपर की ओर तह) lamellipodia विश्लेषण कर रहे हैं, के रूप में यह दृढ़ता से परिणामों की सटीकता को प्रभावित करेगा । इसके अलावा, lamellipodial क्षेत्रों के कर्षण तेजी से चरम translocation के रूप में प्रकट हो सकता है, संभवतः lamellipodial actin बहुलकीकरण की दरों के अधिक अनुमान लगाने के लिए अग्रणी । एक अतिरिक्त विचार intracellular सामान्यीकरण क्षेत्रों की दूरी (अधिग्रहण photobleaching के सुधार के लिए संदर्भ पदों के रूप में लिया) photobleaching की वास्तविक स्थिति से है, जो प्रत्यक्ष से बचने के लिए काफी बड़ा होना चाहिए photobleached क्षेत्र द्वारा प्रभाव ।

PA-GFP-tagged construction के photoactivation के लिए इष्टतम शर्तें सेट करते समय, photoactivation के दौरान झटपट ब्लीचिंग से बचने के लिए देखभाल की जानी चाहिए । हमारे काम में, सबसे अच्छा परिणाम लेजर शक्तियों के साथ प्राप्त किया गया 5-10 बार सामान्य रूप से EGFP के ब्लीचिंग के लिए कार्यरत की तुलना में कम. photoactivated अणुओं की छवि अधिग्रहण के लिए, जोखिम समय और फ्रेम के बीच समय अंतराल क्षेत्रों और संरचनाओं के आकार पर विचार करके अनुकूलित किया जाना चाहिए photoactivated और विश्लेषण किया, साथ ही साथ photoactivated की क्षमता गतिशीलता अंय उपसेलुलर स्थानों के लिए प्रोटीन । प्रतिदीप्ति इमेजिंग के सभी प्रकार के लिए के रूप में, कोशिका व्यवहार्यता के रखरखाव शारीरिक रूप से प्रासंगिक परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

सिद्धांत रूप में, ग्रीन करने वाली लाल photoconversion जैसे mEos या Dronpa वेरिएंट के रूप में फ्लोरोसेंट प्रोटीन की एक समान रूप से शक्तिशाली विधि का गठन किया है और lamellipodium के रूप में उपसेलुलर संरचनाओं के कारोबार की गतिशीलता (उदाहरण के लिए देखें , Burnette एट अल. 23). बाद विधि का लाभ के रूप में पीए-GFP संभावना को प्रोटीन गतिशीलता का पालन करने से पहले और दो अलग रंग के साथ रूपांतरण के बाद होगा, के लिए सह की आवश्यकता के बिना एक अतिरिक्त लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करते हैं । हालांकि, हमारे प्रारंभिक प्रयोगों में, इसके विपरीत परिवर्तन की हद और फ्लोरोसेंट संकेत की तीव्रता PA-GFP के photoactivation पर हासिल की photoconverted जांच की तुलना में बड़ा था, शायद हरे बनाम लाल की बेहतर वर्णक्रमीय सुविधाओं के कारण फ्लोरोसेंट जांच (डेटा नहीं दिखाया गया है) । किसी भी मामले में, सेल में actin रेशा कारोबार पर विस्तृत अध्ययन जैसे lamellipodia या Vaccinia वायरस प्रेरित actin पूंछ के रूप में बढ़त की दखलंदाजी अब तक केवल PA-GFP डेरिवेटिव5,6,24का उपयोग कर प्रकाशित किया गया है ।

जब विचार जो कोशिका क्षेत्र के बाद photoactivation विश्लेषण, कई कारकों को ध्यान में रखा जाना चाहिए, जो विशिष्ट यहां दिखाया उदाहरण का उपयोग कर चर्चा कर रहे है (cytosol में सक्रियण पर सेल एज में actin मोनोमर के शामिल), लेकिन निश्चित रूप से विभिन्न अनुरूप वैज्ञानिक समस्याओं को extrapolated जा सकता है. पहला, जब cytosolically photoactivated प्रोटीन के lamellipodial निगमन की दर को मापने, उदाहरण के लिए, अलग प्रयोगात्मक स्थितियों में (के रूप में Dimchev एट अल में दिखाया गया है । 6), cytosolic क्षेत्रों के आकार और lamellipodial किनारों के लिए उनकी दूरी प्रयोगात्मक समूहों के बीच तुलनीय होना चाहिए । यह भी विचार करना महत्वपूर्ण है कि जब photoactivating cytosolic क्षेत्रों, कोशिका मोटाई नाभिक के करीब पदों में अधिक है । मोटा सेलुलर क्षेत्रों सक्रिय प्रोटीन की उच्च मात्रा में परिणाम हो सकता है सक्रिय करने के लिए, यह देखते हुए कि homogenously cytosol में वितरित किया जाता है । अन्त में, प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर को सक्रिय किया जा करने के लिए निश्चित रूप से व्यक्तिगत कोशिकाओं में अत्यधिक चर सकता है । परिवर्तनशीलता के इन सभी कारणों के कारण, यह महत्वपूर्ण है cytosolically के शामिल होने के स्तर की तुलना में कहीं अधिक सक्रिय प्रोटीन विशिष्ट क्षेत्रों में सक्रियण पर प्राप्त कुल प्रतिदीप्ति के सापेक्ष कक्ष में ।

हमने वर्णन किया है कि कैसे microinjection सेल आकृति विज्ञान पर प्रोटीन के प्रभाव की जांच के लिए एक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है और NIH3T3 fibroblast कोशिकाओं microinjected में lamellipodial संरचनाओं के प्रबल प्रेरण का प्रदर्शन करके इस उदाहरण है छोटा GTPase Rac1. हम पहले इस तकनीक के साथ हस्तक्षेप करने के लिए लागू किया है Arp2/3 कोशिकाओं में समारोह सी के साथ microinjected-टर्मिनल WCA निशान के डोमेन/ microinjected कोशिकाओं में विभिन्न मापदंडों ऐसे frap है या photoactivation के रूप में अन्य परख, द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है. हमने वर्णन किया है कि कैसे frap है और photoactivation actin मोनोमर की उपसेलुलर गतिशीलता और गतिशीलता की जांच के लिए नियोजित किया जा सकता है । frap है हमारे समूह द्वारा प्रयोग किया गया है पहले 5 lamellipodia के लिए स्थानीयकरण प्रोटीन के कारोबार की जांच करने के लिए, जैसे वीएएसपी, अबी, cortactin, cofilin, और कैपिंग प्रोटीन, या elucidating की उपस्थिति में फोकल आसंजन में घटकों का कारोबार और आरएसी सिगनल की अनुपस्थिति4. इसके अलावा, actin बहुलकीकरण दरों को मापने photobleaching EGFP द्वारा पूरा किया जा सकता है-β-actin5टैग, लेकिन वैकल्पिक तरीके मौजूद हैं । लाइव सेल इमेजिंग-संगत जांच द्वारा देखा के रूप में फ्लोरोसेंट सजातीयताओं ट्रैकिंग सेलुलर actin रेशा, ऐसे Lifeact के रूप में25, भी6,26कार्यरत हो सकते हैं । यहां लाभ यह है कि β-actin की अधिकता से बचा जा सकता है, जो सेल एज दखलंदाजी और प्रवास में वृद्धि करने में सक्षम है, और इस प्रकार संभवतः विशिष्ट परख या प्रयोगात्मक प्रश्न के साथ हस्तक्षेप (देखें जैसे, कागे एट अल । 26; Peckham एट अल. 27). तथापि, Lifeact जांच के एक विशिष्ट नुकसान actin रेशा के लिए बाध्यकारी के कैनेटीक्स पर अपनी तेजी से गठन किया है, ताकि कोशिकाओं में Lifeact द्वारा लेबल actin रेशा संरचनाओं की ब्लीचिंग केवल जांच कारोबार पर जानकारी प्रदान करता है, लेकिन actin रेशा के कारोबार नहीं है, जो इसे25बांध । पहले6,26 कार्यरत प्रतिदीप्ति सजातीयताओं के ट्रैकिंग एक व्यावहारिक समझौता प्रदान करता है, बहुत प्रतिदीप्ति speckles के व्यापक रूप से इस्तेमाल किया ट्रैकिंग के समान रेशा cytoskeletal में शामिल संरचनाओं ( जैसे, सामन और डांडी28देखें), लेकिन के रूप में सीधे आगे का उपयोग करें और के रूप में EGFP के frap है के रूप में सटीक-F-actin संरचनाओं टैग नहीं हो सकता है । Photoactivation lamellipodia में monomeric actin निगमन की दरों का आकलन करने के लिए हमारे द्वारा लागू किया गया है, के रूप में अच्छी तरह से cytosol भर में अपनी गतिशीलता, प्रयोगात्मक देखते cytosolic F-actin स्तर6के संदर्भ में. तकनीक उपयोगी है जब गतिशीलता और cytosolic क्षेत्रों जैसे अपेक्षाकृत बड़े क्षेत्रों से व्युत्पंन प्रोटीन के वितरण की जांच । हालांकि, अपेक्षाकृत छोटे photoactivated संरचनाओं से व्युत्पंन प्रोटीन के वितरण की जांच; उदाहरण के लिए , विकास शंकु सक्रिय फ्लोरोसेंट अणुओं की कम संख्या के कारण चुनौतीपूर्ण हो सकता है, कमजोर संकेतों, और इस प्रकार संवेदनशीलता की कमी है । photoactivation या प्रतिदीप्ति के photoconversion के लिए संभावित वैकल्पिक तकनीक (ऊपर देखें) व्युत्क्रम frap है, जो रॉय को छोड़कर पूरे सेल photobleaching पर निर्भर शामिल हो सकते हैं, फ्लोरोसेंट अणुओं की गतिशीलता से दूर ट्रैकिंग के बाद इस क्षेत्र । तकनीक प्रोटीन के photoactivatable संस्करणों को व्यक्त करने की आवश्यकता नहीं है, लेकिन हमेशा लेजर शक्ति का एक असामांय रूप से उच्च खुराक के लिए जोखिम शामिल होगा, संभावित अवांछित दुष्प्रभावों जैसे धूप के कारण ।

जाहिर है, photoactivation और frap है अंतर नहीं कर सकते कि प्रोटीन मोनोमर, dimers, या यहां तक कि छोटे oligomers के रूप में बढ़ रहे हैं, और क्या वे अतिरिक्त बाध्यकारी भागीदारों के साथ संयोजन में चलते हैं । उस तरह की जानकारी के बजाय प्रतिदीप्ति सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी तकनीकों29 या, वैकल्पिक रूप से, FLIM-30झल्लाहट से प्राप्त किया जा सकता है । फिर भी, frap है और photoactivation सीधे दृष्टिकोण का गठन करने के लिए कोशिकाओं में स्थानीय और वैश्विक प्रोटीन गतिशीलता का आकलन, ब्याज की प्रोटीन की परवाह किए बिना, सेलुलर स्थान, या सेल प्रकार का अध्ययन किया ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम वित्तीय सहायता (ग्रांट Nr. RO2414/5-1 से केआर) के लिए जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (DFG) के आभारी हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
B16-F1 mouse skin melanoma cells  American Type Culture Collection, Manassas, VA CRL-6323
NIH-3T3 cells American Type Culture Collection, Manassas, VA CRL-1658
DMEM 4.5g/L glucose  Life Technologies, Thermno Fisher Scientific, Germany 41965-039
Ham’s F-12 medium Sigma-Aldrich N8641
Fetal calf serum  (FCS) PAA Laboratories, Linz, Austria A15-102
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich, Germany F7524 Lot054M3396
MEM Non essential amino acids  Gibco, ThermoFisher Scientific, Germany 11140035
L-Glumatine 200mM (100x) Life Technolgies 25030-024
Pen-Strep 5000 U/mL Life technologies 15070063
Sodium Pyruvate (100 mM) Gibco, ThermoFisher Scientific, Germany 11360-039
Laminin Sigma-Aldrich L-2020
Laminin coating buffer  Self-made: 50mM Tris ph7.4, 150mM NaCl
Fibronectin from human plasma  Roche Diagnostics, Mannheim, Germany 11 051 407 001
Jetpei Polyplus Transfection, Illkirch, France 101-10N
JetPei buffer Polyplus Transfection, Illkirch, France 702-50 150mM NaCl
PA-GFP-actin plasmid DNA  described in Koestler et al.2008
pEGFP-actin plasmid DNA Clontech, Mountain View, CA, USA
Rac1 protein for microinjection Purified as GST-tagged version, and cleaved from GST prior to injection
Microinjection buffer Self-made: 100mM NaCl, 50mM Tris-HCl ph7.5, 5mM MgCl2, 1mM DTT
Dextran, Texas Red, 70,000 MW, Lysine Fixable Molecular Probes, Thermno Fisher Scientific, Germany D1864
Microscope circular cover glasses 15mm, No.1  Karl Hecht, Aisstent, Sondheim, Germany 1001/15
Eppendorf Femtotips Microloader Tips Eppendorf, Hamburg, Germany 5242 956 003
Eppendorf Femtotip Microinjection Capillary Tips Eppendorf, Hamburg, Germany 930000035
Silicone Grease  ACC Silicones, Bridgewater, England SGM494
Aluminium Open Diamond Bath Imaging Chamber Warner instruments RC-26
Automatic temperature controller Warner Instruments TC-324B
Microscope: Axio Observer  Carl Zeiss, Jena, Germany
CoolSnap-HQ2 camera  Photometrics, Tucson, AZ
Lambda DG4 light source  Sutter Instrucment, Novato, CA
Laser source  Visitron Systems
Eppendorf FemtoJet microinjector  Eppendorf, Hamburg, Germany With built-in compressor for pressure supply
Nikon Narishige Micromanipulator system Nikon Instruments, Japan
Visiview software v2.1.4 Visitron Systems, Puchheim, Germany
Metamorph software v7.8.10 Molecular Devices, Sunnyvale, CA
Sigma Plot v.12 Systat Software Inc.

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References

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जीव विज्ञान अंक १३५ Microinjection frap है photoactivation पा-GFP actin lamellipodium cytoskeleton प्रवास
Micromanipulation Morphogenetic गतिशीलता और Cytoskeletal नियामकों के कारोबार के विश्लेषण की अनुमति तकनीक
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Dimchev, G., Rottner, K. Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators. J. Vis. Exp. (135), e57643, doi:10.3791/57643 (2018).

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