हम वर्णन कैसे सूक्ष्म और photomanipulation तकनीक जैसे frap है और photoactivation गतिशीलता मानकों और पलायन कोशिकाओं के भीतर प्रोटीन की spatiotemporal गतिशीलता का निर्धारण सक्षम करें । प्रयोगात्मक readouts उपसेलुलर गतिशीलता और गतिशीलता नियामकों या अंतर्निहित actin cytoskeleton के कारोबार शामिल हैं ।
प्रोटीन की spatiotemporal गतिशीलता की जांच विभिंन संदर्भों में अपने कार्यात्मक महत्व प्रकट कर सकते हैं । इस अनुच्छेद में, यह चर्चा है कि कैसे photobleaching (frap है) और photoactivation तकनीक के बाद फ्लोरोसेंट वसूली के लिए उपसेलुलर स्थानों में प्रोटीन की spatiotemporal गतिशीलता का अध्ययन किया जा सकता है । हम यह भी बताएंगे कि कैसे इन तकनीकों actin cytoskeletal विनियमन और सेल गतिशीलता से जुड़े विभिंन मापदंडों का सीधा निर्धारण सक्षम करें । इसके अलावा, कोशिकाओं के microinjection इसके अतिरिक्त एक वैकल्पिक उपचार के रूप में वर्णित है (संभावित पूर्ववर्ती या aforementioned photomanipulation तकनीकों के पूरक) के लिए सेल पर translocated प्रोटीन के तात्कालिक प्रभाव ट्रिगर आकृति विज्ञान और समारोह । Micromanipulation जैसे प्रोटीन इंजेक्शन या प्लाज्मा झिल्ली के स्थानीय अनुप्रयोग-पारगंय दवाओं या cytoskeletal अवरोधकों एकल सेल और सेलुलर में सेल व्यवहार पर दिए गए उपचार के तत्काल परिणाम रिकॉर्ड करने के लिए शक्तिशाली उपकरण के रूप में सेवा कर सकते हैं स्तर. यह रिकॉमबिनेंट Rac1 प्रोटीन के इंजेक्शन द्वारा lamellipodial सेल एज की दखलंदाजी के तत्काल प्रेरण द्वारा यहां उदाहरण है, के रूप में एक चौथाई सदी पहले की स्थापना की । इसके अलावा, हम बढ़ाया ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन के कारोबार का निर्धारण करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान (EGFP)-वीएएसपी, एक actin रेशा पोलीमरेज़ lamellipodial के B16 सुझावों पर प्रमुखता से जमते-F1 कोशिकाओं, frap है को रोजगार और जुड़े डेटा सहित विश्लेषण और वक्र फिटिंग । हम भी lamellipodial actin नेटवर्क बहुलकीकरण की दरों का आकलन करने के लिए दिशानिर्देश उपस्थित, EGFP-टैग β-actin व्यक्त कोशिकाओं द्वारा उदाहरण के रूप में. अंत में, निर्देश दिए गए है कि कोशिका कोशिका द्रव्य के भीतर actin मोनोमर गतिशीलता की दरों की जांच कैसे की जाए, जिसके बाद तेजी से रेशा विधानसभा की साइटों पर actin शामिल किया जाए, जैसे कि lamellipodia का प्रयोग, photoactivation का उपयोग करना दृष्टिकोण. इन प्रोटोकॉल में से कोई भी घटकों या actin cytoskeleton के नियामकों के लिए प्रतिबंधित है, लेकिन आसानी से अनुरूप फैशन में spatiotemporal गतिशीलता और विभिंन विभिंन उपसेलुलर संरचनाओं या कार्यात्मक में प्रोटीन के समारोह का पता लगाने के लिए बढ़ाया जा सकता है संदर्भों.
जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन और अंय अणुओं की spatiotemporal गतिशीलता की निगरानी सेल और आणविक जीवविज्ञान के कई क्षेत्रों में एक अनिवार्य उपकरण बन गया है । उंनत प्रतिदीप्ति प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण (झल्लाहट) और झल्लाहट-प्रतिदीप्ति लाइफटाइम इमेजिंग (झल्लाहट-FLIM), या frap है, प्रतिदीप्ति में photobleaching नुकसान (फ्लिप) और photoactivation के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कई दूसरों की अनुमति सहित माइक्रोस्कोपी तकनीक के लिए अस्थाई और स्थानिक प्रोटीन की ट्रैकिंग-प्रोटीन बातचीत, गठन परिवर्तन, के रूप में अच्छी तरह के रूप में प्रसार और सेल1में विभिंन प्रोटीन के स्थानीयकरण के कैनेटीक्स का निर्धारण,2। frap है और photoactivation तकनीक, विशेष रूप से, actin cytoskeleton और सेल माइग्रेशन के नियामकों की जांच के लिए व्यापक रूप से लागू होते हैं । इन तकनीकों को अकेले या अतिरिक्त micromanipulation तकनीकों के साथ संयोजन में ऐसे microinjection3के रूप में लागू किया जा सकता है, और फ्लोरोसेंट लेबल प्रोटीन की अभिव्यक्ति शामिल है । वे कोशिका प्रवास में शामिल actin-रिच संरचनाओं के लिए प्रोटीन एसोसिएशन के कैनेटीक्स के आकलन की अनुमति देते हैं, जैसे filopodia या lamellipodia, फोकल आसंजन में प्रोटीन का कारोबार4, या बंटी actin नेटवर्क्स5. वे lamellipodial actin बहुलकीकरण दरों के निर्धारण को भी सक्षम करते हैं, actin के भीतर monomeric cytosol के फैलाव का आकलन, उपसेलुलर actin मोनोमर की दर translocation में polymerizing actin रेशा फैलाने में lamellipodia6, और अंय पैरामीटर्स ।
frap है एक जीवित कोशिका के भीतर प्रोटीन की गतिशीलता को visualizing और बढ़ाता है, मूल रूप से 1970 के दशक में Axelrod द्वारा विकसित के लिए एक विधि है 7 । एक कोशिका के भीतर ब्याज का एक क्षेत्र (रॉय), फ्लोरोसेंट लेबल वाले प्रोटीन के साथ आबादी, क्षणिक उच्च तीव्रता के एक लेजर के संपर्क में है, समय की एक दी छोटी अवधि के दौरान इस क्षेत्र में मौजूद fluorophore अणुओं के ब्लीचिंग का कारण पर्याप्त है । ब्लीचिंग, फ्लोरोसेंट के दौरान ROI के बाहर स्थित प्रोटीन, उनके spatiotemporal गतिशीलता के आधार पर ब्लीचिंग क्षेत्र में फैलाना और घुसपैठ करेगा, जिससे समय के साथ photobleached अणुओं का विस्थापन होता है । ब्लीच्ड क्षेत्रों में प्रतिदीप्ति वसूली की दर विभिन्न कारकों पर निर्भर करती है, जिसमें दिए गए अणु के आकार और प्रसार की दर, और निश्चित रूप से ख्यात संबद्ध प्रक्षालित संरचना के भीतर अपनी कारोबार दर । इस प्रकार, घुलनशील प्रोटीन ब्लीच्ड रॉय के भीतर प्रतिदीप्ति की वसूली तेजी से प्रसार के माध्यम से मध्यस्थता करेंगे, जबकि प्रोटीन कसकर ऐसी फोकल आसंजन के रूप में संरचनाओं के साथ जुड़े, अब कारोबार समय होगा, के रूप में उनके प्रतिदीप्ति वसूली करेगा प्रोटीन और पृथक्करण संरचना के कैनेटीक्स-संबद्ध अंश के घुलनशील अंश के प्रसार पर दोनों निर्भर करते हैं । प्रतिदीप्ति की प्री-ब्लीच गहनता के प्रारंभिक स्तर तक पहुंच जाने तक प्रतिदीप्ति वसूली आमतौर पर अधिग्रहीत और quantified है । हालांकि, यह नहीं होती यदि प्रारंभिक प्रतिदीप्ति तीव्रता का एक हिस्सा तथाकथित मोबाइल अंश है, जो प्रसार द्वारा मंगाया जा करने में असमर्थ है या बहुत धीमी दरों पर मंगाया जा रहा है के अंतर्गत आता है के रूप में अणुओं के बहुमत की तुलना में मोबाइल शामिल अंश. प्रोटीन कारोबार की दर निर्धारित करने के लिए, frap है curves उत्पन्न कर रहे हैं, समय के साथ प्रतिदीप्ति वसूली की हद का प्रतिनिधित्व. इन रिकवरी curves से, प्रोटीन की औसत आधा समय वसूली की गणना की जा सकती है । औसत frap है डेटा के वक्र फिट बनाने के द्वारा, और इसलिए गणितीय विश्लेषण, यह भी deduce के लिए संभव है कि मोबाइल अंश की औसत टर्नओवर दर अणुओं की एक सजातीय आबादी का एक समग्र गठन, या कि क्या यह से बना है अंतर दर पर मोड़ अणुओं के दो या अधिक उपजनसंख्या । मात्रात्मक दृष्टिकोणों द्वारा प्रोटीन कारोबार की दर का आकलन करने के अलावा, lamellipodia में photobleached क्षेत्रों की वसूली पर नज़र रखने, प्रतिगामी प्रवाह, दखलंदाजी जैसे lamellipodial गतिशीलता मापदंडों के सटीक ठहराव के लिए भी अनुमति दे सकते हैं, आणि actin बहुलकीकरण व्याजदर आहे. इस प्रकार, frap है एक बहुमुखी उपकरण का गठन करने के लिए जीवित कोशिकाओं की संरचनाओं के भीतर विभिंन मापदंडों का आकलन करने के लिए लागू किया जाएगा ।
Photoactivation एक निर्दिष्ट सेलुलर स्थान से उद्भव प्रोटीन या अणुओं की प्रसार और गतिशीलता को ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया विधि है । तकनीक काम करते हैं, उदाहरण के लिए, जंगली प्रकार के एक संस्करण हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP), शुरू में पैटरसन और Lippincott द्वारा विकसित-Schwartz8, जो एक तरह से है कि अपने प्रतिदीप्ति को अत्यधिक जोखिम पर वृद्धि की अनुमति देता में रूपांतरित हो जाता है पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश (चारों ओर ४०० एनएम; यहां, ४०५ एनएम) । के रूप में पैटरसन एट अल., जंगली प्रकार GFP chromophores द्वारा वर्णित तटस्थ phenols और anionic phenolates, जो लगभग ३९७ एनएम में एक प्रमुख अवशोषक चोटी और ४७५ एनएम में एक छोटी सी एक, क्रमशः का उत्पादन की एक मिश्रित जनसंख्या के रूप में मौजूद हैं । यूवी प्रकाश के साथ प्रोटीन के विकिरण पर, जनसंख्या photoconversion से गुजरती है, anionic फार्म की ओर स्थानांतरण । जब ४८८ एनएम द्वारा उत्साहित, photoconverted/photoactivated प्रोटीन दर्शाती है एक 3-प्रतिदीप्ति में वृद्धि गुना, सक्रिय और गैर के बीच भेद करने के लिए व्यवहार में अपर्याप्त उच्च आंतरिक पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के कारण GFP सक्रिय । हालांकि, पृष्ठभूमि की तीव्रता में कमी GFP अनुक्रम में एक एकल एमिनो एसिड उत्परिवर्तन शुरू करने से प्राप्त किया गया है (histidine प्रतिस्थापन स्थिति में २०३) । जिसके परिणामस्वरूप T203H उत्परिवर्ती, भी photoactivatable के रूप में जाना-GFP (PA-GFP) मामूली चोटी, यूवी प्रकाश के साथ विकिरण पर जो लगभग १०० वृद्धि हुई है के अवशोषण में एक महत्वपूर्ण कमी की विशेषता है गुना जब बाद में ४८८ एनएम प्रकाश से उत्साहित । इसलिए, PA-GFP-टैग किए गए प्रोटीन का इजहार एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया दृष्टिकोण है, जो प्रसार और कोशिकाओं के भीतर अणुओं के गतिशीलता के निर्धारण की अनुमति देता है । हमने पहले PA-GFP-टैग actin लागू किया है cytosolic क्षेत्रों से दूर actin मोनोमर के फैलाव की दर निर्धारित करने के लिए, cytosol के भीतर अपनी गतिशीलता की न केवल अन्वेषण की अनुमति है, लेकिन यह भी फैलाने में अपने निगमन दर lamellipodial actin नेटवर्क6. अधिक हाल के साहित्य भी उपंयास, फोटो-परिवर्तनीय प्रोटीन का वर्णन है कि सिद्धांत में एक अनुरूप फैशन में इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन संभावित लाभ बंदरगाह पहले से ही तस्वीर रूपांतरण से पहले दिखाई । फ्लोरोसेंट प्रोटीन के इस समूह के लिए उदाहरण Dendra2 और mEos29,10,11,12शामिल हैं ।
इस लेख में, हम प्रोटीन के साथ microinjecting कोशिकाओं की कार्यप्रणाली की व्याख्या । हम आगे की व्याख्या कैसे इस तकनीक frap है के साथ संयुक्त किया जा सकता है, photobleaching प्रोटीन actin cytoskeleton विनियमन और गतिशीलता में शामिल द्वारा, और कैसे frap है घटता है और आधा मोबाइल भागों की वसूली के समय प्राप्त किया जा सकता है । इसके अलावा, हम कैसे frap है तकनीक lamellipodial नेटवर्क के actin बहुलकीकरण दरों का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का एक उदाहरण प्रदान करते हैं । हम यह भी निर्देश और कैसे photoactivation प्रयोगों, जो actin में lamellipodia निगमन की monomeric actin और दरों की cytosolic गतिशीलता का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है पर सुझाव प्रदान करते हैं । इन तकनीकों, ज़ाहिर है, केवल actin cytoskeleton घटकों पर नज़र रखने तक ही सीमित नहीं हैं, लेकिन संभावित उदारवादी अनुकूलन या अनुकूलन पर, व्यापक रूप से अन्य कोशिका प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है या विभिन्न प्रोटीन की जांच करने के लिए, संरचनाओं, और पैरामीटर.
यहां हम इस लेख में वर्णित तकनीकों में महत्वपूर्ण कदम पर चर्चा, और कैसे वे विभिंन प्रायोगिक स्थितियों में आवेदन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।
Microinjection एक तरीका है कि कोशिकाओं में exogenous प्रोटीन, अवरोधकों, या दवाओं शुरू करने से तुरंत प्रभाव पर नजर रखने के लिए लागू किया जा सकता है । यह विशेष रूप से transfect कोशिका प्रकार या स्थितियों में मुश्किल में प्रोटीन के कार्यों का निर्धारण करने के लिए लाभप्रद हो सकता है जब दीर्घकालिक अभिव्यक्ति वांछित नहीं है । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि कुछ कोशिका प्रकार के अस्तित्व पर निर्भर करता है extracellular मैट्रिक्स वे पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं । अधिकांश endothelial, उपकला, या fibroblast तरह कोशिका प्रकार, मछली keratocytes की तरह भी छोटे वाले (डांग एट अल देखें. 21 और एंडरसन और22पार) को सफलतापूर्वक इंजेक्ट किया जा सकता है । हालांकि, वहां अपवाद हैं, जैसे B16-F1 कोशिकाओं laminin, जो सेल प्रवास के एक उत्कृष्ट मॉडल प्रणाली का गठन पर वरीयता प्राप्त है, लेकिन इंजेक्शन के साथ इस प्रकार की अज्ञात कारण के लिए बुनियाद पर असंगत हैं । NIH3T3 fibroblast कोशिकाओं के लिए, हम नियमित रूप से fibronectin बुनियाद पर इंजेक्शन प्रदर्शन, और frap है के रूप में अतिरिक्त photomanipulation तकनीक (यहां तक कि photoactivation के साथ, B16-F1 यहां कोशिकाओं के लिए दिखाया गया है) समान रूप से अच्छी तरह से इन fibroblasts में प्रदर्शन किया जा सकता है (देखें उदा., Köstler एट अल. 3). यह भी विचार किया जाना चाहिए कि विभिंन प्रोटीन, उनके कार्यात्मक गुण और प्रयोग के लक्ष्यों के अनुसार, समय की विभिंन मात्रा में परिवर्तन का कारण लग सकता है, सेकंड से घंटे अलग । तकनीक का एक लाभ यह है कि खुराक/exogenous एजेंट की एकाग्रता और अधिक सही रूप से एक सेल स्तर पर नियंत्रित किया जा सकता है जैसे, जब प्लाज्मिड अभिकर्मक का उपयोग कर । इसके अलावा, एक प्रोटीन की फ्लोरोसेंट टैगिंग एक आवश्यकता के लिए सेल में अपनी उपस्थिति की गारंटी नहीं है, जो लचीलापन बढ़ा सकते है अगर एक साथ बहु अंय फ्लोरोसेंट के चैनल दृश्य-प्रोटीन की आवश्यकता है टैग । Microinjection विशिष्ट प्रोटीन या कोशिका आकृति विज्ञान या cytoskeleton (जैसे, डांग एट अल के गतिशील परिवर्तन पर प्रोटीन मिश्रण के तत्काल प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है । Arp2/3 परिसर अवरोध करनेवाला Arpin द्वारा प्रवास पर तत्काल प्रभाव का एक उदाहरण के लिए 21 ). तकनीक का एक नुकसान अपनी इनवेसिव, जो कोशिका क्षति या सेल आकृति विज्ञान प्रभाव पैदा कर सकता है । इसलिए, एक महत्वपूर्ण विचार जब microinjections प्रदर्शन कर रहा है सेल व्यवहार्यता की निगरानी । यहां शुरू की विधि मैनुअल हेरफेर पर निर्भर करता है । स्थिति में सफल इंजेक्शन के साथ संगत होने का परीक्षण किया, जैसे fibroblasts fibronectin पर बढ़ रही है, मैनुअल इंजेक्शन प्रोटोकॉल यहां वर्णित एक के पास १००% सफलता दर की अनुमति देता है; यह आवश्यक है जब परिष्कृत और समय लेने वाली अनुवर्ती वीडियो माइक्रोस्कोपी या frap है सहित प्रयोगों अनुवर्ती के साथ इस दृष्टिकोण के संयोजन के रूप में पहले से 3 प्रकाशित । यह कभी नहीं बाहर है कि, व्यक्तिगत कोशिकाओं को एक microinjection घटना है, जो सुरक्षित रूप से दोनों नाभिक और कोशिका द्रव्य, सेल एज reकर्षण के बाद के विपरीत के अचानक परिवर्तन से पहचाना जा सकता है से पीड़ित हो सकता है । इस तरह के दुर्लभ प्रयोगात्मक मामलों और बाहर इस तरह के विश्लेषण के लिए नहीं माना जाता है ।
हालांकि, एक आधा स्वचालित दृष्टिकोण भी आम तौर पर इस्तेमाल किया है, उदाहरण के लिए तेजी से रोजगार (< 300 ms) मशीन नियंत्रित सुई इंजेक्शन दबाव वृद्धि के साथ संयोग कम है, ताकि सुई केवल प्रत्येक कोशिका के ऊपर तैनात करने से पहले संबंधित है इंजेक्शन. आधे स्वत: इंजेक्शन की सफलता की दर परिभाषा द्वारा मैनुअल दृष्टिकोण ऊपर वर्णित की तुलना में कम है, सिर्फ इसलिए कि यह गति के लिए अनुकूलित है, कई कोशिकाओं है कि सफलतापूर्वक इस उपचार बच के विश्लेषण के बाद; इस प्रकार यह एक व्यक्तिगत कोशिका के सफल इंजेक्शन पर भरोसा नहीं करता है । इसलिए, के रूप में एकल सेल विश्लेषण करने के लिए विरोध किया, आधे स्वचालित इंजेक्शन बेहतर कई सौ कोशिकाओं के इंजेक्शन प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए अनुकूल हैं, उदा, कम आवर्धन पर या सेल निर्धारण और धुंधला पर वीडियो माइक्रोस्कोपी द्वारा. विस्तृत दृष्टिकोण के बावजूद कार्यरत, microinjection एक अंत बिंदु परख का गठन नहीं करता है, लेकिन तकनीक की एक किस्म के साथ जोड़ा जा सकता है, frap है या photoactivation 3 सहित ।
जब frap है द्वारा प्रोटीन टर्नओवर दर का निर्धारण, लेजर की तीव्रता, माइक्रोस्कोप सेटअप और इमेजिंग शर्तों (आवर्धन, उद्देश्यों ,आदि के आधार पर अनुकूलित किया जाना चाहिए, और साथ ही सेल प्रकार, संरचना, और के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन photobleaching) । ध्यान दें कि इष्टतम लेजर शक्ति पर, कुशल ब्लीचिंग कम संभव धूप के साथ संयुक्त है, सिकुड़ना या विश्लेषण के तहत संरचना की पूरी reकर्षण से बचने के लिए (जैसे, lamellipodia या filopodia) या भी सेलुलर स्तर पर नुकसान । आदर्श रूप में, ब्लीचिंग दक्षता का कम-से-80%, प्राप्त किया जाना चाहिए, हालांकि पूर्ण ब्लीचिंग प्रोटीन के बहुत तेजी से कारोबार से प्रभावित हो सकता है, जिस स्थिति में, ५०% से ऊपर कुछ भी स्वीकार्य हो सकता है । एक दिया संरचना और फ्लोरोसेंट डाई के लिए इष्टतम ब्लीचिंग शक्ति प्रयोगात्मक परीक्षण किया जाना चाहिए, एक कम लेजर अपनी क्रमिक वृद्धि के बाद शक्ति से शुरू । बेशक, किसी भी फ्लोरोसेंट डाई परिभाषा द्वारा कर सकते है लेजर प्रकाश के साथ प्रक्षालित किया जा सकता है उत्तेजना के अपने चरम (४८८ एनएम के लिए अक्सर ऐसे FITC या EGFP के रूप में हरी रंजक इस्तेमाल के लिए) । हालांकि, कम तरंग दैर्ध्य, जैसे कि पास-यूवी पराबैंगनीकिरण के साथ पराबैंगनीकिरण, उच्च शक्तियों उद्धार और इस प्रकार भी आमतौर पर इस्तेमाल किया रंजक के कुशल ब्लीचिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हम नियमित रूप से (ऐसे mCherry के रूप में) दोनों EGFP और लाल फ्लोरोसेंट रंजक के ब्लीचिंग के लिए एक ४०५ एनएम डायोड लेजर (१२० मेगावाट) का काम है, हालांकि बाद के मामले में थोड़ा कम दक्षता के साथ (नहीं दिखाया गया डेटा) । के रूप में ४०५ एनएम-डायोड भी PA-GFP के photoactivation के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (नीचे देखें), यह अधिक से अधिक लचीलापन के साथ इस प्रणाली endows ।
B16-F1 सेल संरचनाओं और फ्लोरोसेंट प्रोटीन photobleached के लिए यहां, ४०५ एनएम-65 के बीच लेजर शक्तियों-100 मेगावाट लागू किया गया । किसी photobleached क्षेत्र का विश्लेषण करते समय, यह विचार करना महत्वपूर्ण है कि क्या दिया गया ढांचा विश्लेषण समयावधि में उसके मूल आकार में संरक्षित है । उदाहरण के लिए, जब lamellipodia सुझावों पर प्रोटीन के कारोबार का विश्लेषण, देखभाल लिया जाना चाहिए कि lamellipodia की वक्रता काफी समय के साथ बदल गया है, वक्रता में परिवर्तन के रूप में गलत परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते है यदि क्षेत्र/ पूरी तरह से प्रत्येक मापा फ्रेम में संरचना की पूर्णरूप से घेरना । इसके अलावा, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि lamellipodia में एंबेडेड बंडलों, जैसे microspikes, प्रतिदीप्ति तीव्रता में विचलन का कारण हो सकता है । के रूप में चित्रा 2बी में सचित्र (9 एस समय सीमा में सफेद तीर), एक microspike संरचना की तरह मापा photobleached क्षेत्र के बगल में स्थित है, लेकिन इसके बारे में माप की अवधि के दौरान बाहर रहता है, और इस प्रकार कोई कारण नहीं है अशुद्धि. प्रोटीन कारोबार के विश्लेषण के लिए, महत्वपूर्ण विचार जब स्थान और विश्लेषण क्षेत्रों के आकार का चयन कर रहे है कि समय के साथ उनके प्रतिदीप्ति काफी से बचने के लिए मुश्किल के अलावा कक्ष आकृति विज्ञान या कारकों में परिवर्तन से प्रभावित नहीं होना चाहिए अर्ज photobleaching. उदाहरण के लिए, विश्लेषण संरचना में महत्वपूर्ण मात्रात्मक योगदान प्रदान करने वाली संरचनाओं को विश्लेषण के दौरान मापा क्षेत्र से बाहर नहीं जाना चाहिए; इसके अलावा, असंबंधित, ऐसे vesicular संरचनाओं के रूप में फ्लोरोसेंट संस्थाओं कि प्रोटीन को आकर्षित विश्लेषण के दौरान ब्याज के क्षेत्र में प्रवेश नहीं करना चाहिए । lamellipodial actin बहुलकीकरण की दर निर्धारित करने के लिए, ध्यान रखा जाना चाहिए कि कोई मुकर या ruffling (यानी, ऊपर की ओर तह) lamellipodia विश्लेषण कर रहे हैं, के रूप में यह दृढ़ता से परिणामों की सटीकता को प्रभावित करेगा । इसके अलावा, lamellipodial क्षेत्रों के कर्षण तेजी से चरम translocation के रूप में प्रकट हो सकता है, संभवतः lamellipodial actin बहुलकीकरण की दरों के अधिक अनुमान लगाने के लिए अग्रणी । एक अतिरिक्त विचार intracellular सामान्यीकरण क्षेत्रों की दूरी (अधिग्रहण photobleaching के सुधार के लिए संदर्भ पदों के रूप में लिया) photobleaching की वास्तविक स्थिति से है, जो प्रत्यक्ष से बचने के लिए काफी बड़ा होना चाहिए photobleached क्षेत्र द्वारा प्रभाव ।
PA-GFP-tagged construction के photoactivation के लिए इष्टतम शर्तें सेट करते समय, photoactivation के दौरान झटपट ब्लीचिंग से बचने के लिए देखभाल की जानी चाहिए । हमारे काम में, सबसे अच्छा परिणाम लेजर शक्तियों के साथ प्राप्त किया गया 5-10 बार सामान्य रूप से EGFP के ब्लीचिंग के लिए कार्यरत की तुलना में कम. photoactivated अणुओं की छवि अधिग्रहण के लिए, जोखिम समय और फ्रेम के बीच समय अंतराल क्षेत्रों और संरचनाओं के आकार पर विचार करके अनुकूलित किया जाना चाहिए photoactivated और विश्लेषण किया, साथ ही साथ photoactivated की क्षमता गतिशीलता अंय उपसेलुलर स्थानों के लिए प्रोटीन । प्रतिदीप्ति इमेजिंग के सभी प्रकार के लिए के रूप में, कोशिका व्यवहार्यता के रखरखाव शारीरिक रूप से प्रासंगिक परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
सिद्धांत रूप में, ग्रीन करने वाली लाल photoconversion जैसे mEos या Dronpa वेरिएंट के रूप में फ्लोरोसेंट प्रोटीन की एक समान रूप से शक्तिशाली विधि का गठन किया है और lamellipodium के रूप में उपसेलुलर संरचनाओं के कारोबार की गतिशीलता (उदाहरण के लिए देखें , Burnette एट अल. 23). बाद विधि का लाभ के रूप में पीए-GFP संभावना को प्रोटीन गतिशीलता का पालन करने से पहले और दो अलग रंग के साथ रूपांतरण के बाद होगा, के लिए सह की आवश्यकता के बिना एक अतिरिक्त लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करते हैं । हालांकि, हमारे प्रारंभिक प्रयोगों में, इसके विपरीत परिवर्तन की हद और फ्लोरोसेंट संकेत की तीव्रता PA-GFP के photoactivation पर हासिल की photoconverted जांच की तुलना में बड़ा था, शायद हरे बनाम लाल की बेहतर वर्णक्रमीय सुविधाओं के कारण फ्लोरोसेंट जांच (डेटा नहीं दिखाया गया है) । किसी भी मामले में, सेल में actin रेशा कारोबार पर विस्तृत अध्ययन जैसे lamellipodia या Vaccinia वायरस प्रेरित actin पूंछ के रूप में बढ़त की दखलंदाजी अब तक केवल PA-GFP डेरिवेटिव5,6,24का उपयोग कर प्रकाशित किया गया है ।
जब विचार जो कोशिका क्षेत्र के बाद photoactivation विश्लेषण, कई कारकों को ध्यान में रखा जाना चाहिए, जो विशिष्ट यहां दिखाया उदाहरण का उपयोग कर चर्चा कर रहे है (cytosol में सक्रियण पर सेल एज में actin मोनोमर के शामिल), लेकिन निश्चित रूप से विभिन्न अनुरूप वैज्ञानिक समस्याओं को extrapolated जा सकता है. पहला, जब cytosolically photoactivated प्रोटीन के lamellipodial निगमन की दर को मापने, उदाहरण के लिए, अलग प्रयोगात्मक स्थितियों में (के रूप में Dimchev एट अल में दिखाया गया है । 6), cytosolic क्षेत्रों के आकार और lamellipodial किनारों के लिए उनकी दूरी प्रयोगात्मक समूहों के बीच तुलनीय होना चाहिए । यह भी विचार करना महत्वपूर्ण है कि जब photoactivating cytosolic क्षेत्रों, कोशिका मोटाई नाभिक के करीब पदों में अधिक है । मोटा सेलुलर क्षेत्रों सक्रिय प्रोटीन की उच्च मात्रा में परिणाम हो सकता है सक्रिय करने के लिए, यह देखते हुए कि homogenously cytosol में वितरित किया जाता है । अन्त में, प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर को सक्रिय किया जा करने के लिए निश्चित रूप से व्यक्तिगत कोशिकाओं में अत्यधिक चर सकता है । परिवर्तनशीलता के इन सभी कारणों के कारण, यह महत्वपूर्ण है cytosolically के शामिल होने के स्तर की तुलना में कहीं अधिक सक्रिय प्रोटीन विशिष्ट क्षेत्रों में सक्रियण पर प्राप्त कुल प्रतिदीप्ति के सापेक्ष कक्ष में ।
हमने वर्णन किया है कि कैसे microinjection सेल आकृति विज्ञान पर प्रोटीन के प्रभाव की जांच के लिए एक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है और NIH3T3 fibroblast कोशिकाओं microinjected में lamellipodial संरचनाओं के प्रबल प्रेरण का प्रदर्शन करके इस उदाहरण है छोटा GTPase Rac1. हम पहले इस तकनीक के साथ हस्तक्षेप करने के लिए लागू किया है Arp2/3 कोशिकाओं में समारोह सी के साथ microinjected-टर्मिनल WCA निशान के डोमेन/ microinjected कोशिकाओं में विभिन्न मापदंडों ऐसे frap है या photoactivation के रूप में अन्य परख, द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है. हमने वर्णन किया है कि कैसे frap है और photoactivation actin मोनोमर की उपसेलुलर गतिशीलता और गतिशीलता की जांच के लिए नियोजित किया जा सकता है । frap है हमारे समूह द्वारा प्रयोग किया गया है पहले 5 lamellipodia के लिए स्थानीयकरण प्रोटीन के कारोबार की जांच करने के लिए, जैसे वीएएसपी, अबी, cortactin, cofilin, और कैपिंग प्रोटीन, या elucidating की उपस्थिति में फोकल आसंजन में घटकों का कारोबार और आरएसी सिगनल की अनुपस्थिति4. इसके अलावा, actin बहुलकीकरण दरों को मापने photobleaching EGFP द्वारा पूरा किया जा सकता है-β-actin5टैग, लेकिन वैकल्पिक तरीके मौजूद हैं । लाइव सेल इमेजिंग-संगत जांच द्वारा देखा के रूप में फ्लोरोसेंट सजातीयताओं ट्रैकिंग सेलुलर actin रेशा, ऐसे Lifeact के रूप में25, भी6,26कार्यरत हो सकते हैं । यहां लाभ यह है कि β-actin की अधिकता से बचा जा सकता है, जो सेल एज दखलंदाजी और प्रवास में वृद्धि करने में सक्षम है, और इस प्रकार संभवतः विशिष्ट परख या प्रयोगात्मक प्रश्न के साथ हस्तक्षेप (देखें जैसे, कागे एट अल । 26; Peckham एट अल. 27). तथापि, Lifeact जांच के एक विशिष्ट नुकसान actin रेशा के लिए बाध्यकारी के कैनेटीक्स पर अपनी तेजी से गठन किया है, ताकि कोशिकाओं में Lifeact द्वारा लेबल actin रेशा संरचनाओं की ब्लीचिंग केवल जांच कारोबार पर जानकारी प्रदान करता है, लेकिन actin रेशा के कारोबार नहीं है, जो इसे25बांध । पहले6,26 कार्यरत प्रतिदीप्ति सजातीयताओं के ट्रैकिंग एक व्यावहारिक समझौता प्रदान करता है, बहुत प्रतिदीप्ति speckles के व्यापक रूप से इस्तेमाल किया ट्रैकिंग के समान रेशा cytoskeletal में शामिल संरचनाओं ( जैसे, सामन और डांडी28देखें), लेकिन के रूप में सीधे आगे का उपयोग करें और के रूप में EGFP के frap है के रूप में सटीक-F-actin संरचनाओं टैग नहीं हो सकता है । Photoactivation lamellipodia में monomeric actin निगमन की दरों का आकलन करने के लिए हमारे द्वारा लागू किया गया है, के रूप में अच्छी तरह से cytosol भर में अपनी गतिशीलता, प्रयोगात्मक देखते cytosolic F-actin स्तर6के संदर्भ में. तकनीक उपयोगी है जब गतिशीलता और cytosolic क्षेत्रों जैसे अपेक्षाकृत बड़े क्षेत्रों से व्युत्पंन प्रोटीन के वितरण की जांच । हालांकि, अपेक्षाकृत छोटे photoactivated संरचनाओं से व्युत्पंन प्रोटीन के वितरण की जांच; उदाहरण के लिए , विकास शंकु सक्रिय फ्लोरोसेंट अणुओं की कम संख्या के कारण चुनौतीपूर्ण हो सकता है, कमजोर संकेतों, और इस प्रकार संवेदनशीलता की कमी है । photoactivation या प्रतिदीप्ति के photoconversion के लिए संभावित वैकल्पिक तकनीक (ऊपर देखें) व्युत्क्रम frap है, जो रॉय को छोड़कर पूरे सेल photobleaching पर निर्भर शामिल हो सकते हैं, फ्लोरोसेंट अणुओं की गतिशीलता से दूर ट्रैकिंग के बाद इस क्षेत्र । तकनीक प्रोटीन के photoactivatable संस्करणों को व्यक्त करने की आवश्यकता नहीं है, लेकिन हमेशा लेजर शक्ति का एक असामांय रूप से उच्च खुराक के लिए जोखिम शामिल होगा, संभावित अवांछित दुष्प्रभावों जैसे धूप के कारण ।
जाहिर है, photoactivation और frap है अंतर नहीं कर सकते कि प्रोटीन मोनोमर, dimers, या यहां तक कि छोटे oligomers के रूप में बढ़ रहे हैं, और क्या वे अतिरिक्त बाध्यकारी भागीदारों के साथ संयोजन में चलते हैं । उस तरह की जानकारी के बजाय प्रतिदीप्ति सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी तकनीकों29 या, वैकल्पिक रूप से, FLIM-30झल्लाहट से प्राप्त किया जा सकता है । फिर भी, frap है और photoactivation सीधे दृष्टिकोण का गठन करने के लिए कोशिकाओं में स्थानीय और वैश्विक प्रोटीन गतिशीलता का आकलन, ब्याज की प्रोटीन की परवाह किए बिना, सेलुलर स्थान, या सेल प्रकार का अध्ययन किया ।
The authors have nothing to disclose.
हम वित्तीय सहायता (ग्रांट Nr. RO2414/5-1 से केआर) के लिए जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (DFG) के आभारी हैं ।
B16-F1 mouse skin melanoma cells | American Type Culture Collection, Manassas, VA | CRL-6323 | |
NIH-3T3 cells | American Type Culture Collection, Manassas, VA | CRL-1658 | |
DMEM 4.5g/L glucose | Life Technologies, Thermno Fisher Scientific, Germany | 41965-039 | |
Ham’s F-12 medium | Sigma-Aldrich | N8641 | |
Fetal calf serum (FCS) | PAA Laboratories, Linz, Austria | A15-102 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich, Germany | F7524 | Lot054M3396 |
MEM Non essential amino acids | Gibco, ThermoFisher Scientific, Germany | 11140035 | |
L-Glumatine 200mM (100x) | Life Technolgies | 25030-024 | |
Pen-Strep 5000 U/mL | Life technologies | 15070063 | |
Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco, ThermoFisher Scientific, Germany | 11360-039 | |
Laminin | Sigma-Aldrich | L-2020 | |
Laminin coating buffer | Self-made: 50mM Tris ph7.4, 150mM NaCl | ||
Fibronectin from human plasma | Roche Diagnostics, Mannheim, Germany | 11 051 407 001 | |
Jetpei | Polyplus Transfection, Illkirch, France | 101-10N | |
JetPei buffer | Polyplus Transfection, Illkirch, France | 702-50 | 150mM NaCl |
PA-GFP-actin plasmid DNA | described in Koestler et al.2008 | ||
pEGFP-actin plasmid DNA | Clontech, Mountain View, CA, USA | ||
Rac1 protein for microinjection | Purified as GST-tagged version, and cleaved from GST prior to injection | ||
Microinjection buffer | Self-made: 100mM NaCl, 50mM Tris-HCl ph7.5, 5mM MgCl2, 1mM DTT | ||
Dextran, Texas Red, 70,000 MW, Lysine Fixable | Molecular Probes, Thermno Fisher Scientific, Germany | D1864 | |
Microscope circular cover glasses 15mm, No.1 | Karl Hecht, Aisstent, Sondheim, Germany | 1001/15 | |
Eppendorf Femtotips Microloader Tips | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5242 956 003 | |
Eppendorf Femtotip Microinjection Capillary Tips | Eppendorf, Hamburg, Germany | 930000035 | |
Silicone Grease | ACC Silicones, Bridgewater, England | SGM494 | |
Aluminium Open Diamond Bath Imaging Chamber | Warner instruments | RC-26 | |
Automatic temperature controller | Warner Instruments | TC-324B | |
Microscope: Axio Observer | Carl Zeiss, Jena, Germany | ||
CoolSnap-HQ2 camera | Photometrics, Tucson, AZ | ||
Lambda DG4 light source | Sutter Instrucment, Novato, CA | ||
Laser source | Visitron Systems | ||
Eppendorf FemtoJet microinjector | Eppendorf, Hamburg, Germany | With built-in compressor for pressure supply | |
Nikon Narishige Micromanipulator system | Nikon Instruments, Japan | ||
Visiview software v2.1.4 | Visitron Systems, Puchheim, Germany | ||
Metamorph software v7.8.10 | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
Sigma Plot v.12 | Systat Software Inc. |