Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Micromanipulation technieken waardoor analyse van morfogenetische dynamiek en een omzet van Cytoskeletal regelgevers

Published: May 12, 2018 doi: 10.3791/57643
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Division of Molecular Cell Biology, Zoological Institute, Technische Universität Braunschweig, 2Department of Cell Biology, Helmholtz Centre for Infection Research

Summary

We beschrijven hoe micro- en photomanipulation technieken zoals FRAP en photoactivation inschakelen de bepaling van de parameters van de beweeglijkheid en de spatio dynamiek van eiwitten in het migreren van cellen. Experimentele uitlezingen omvatten subcellular dynamiek en omzet van beweeglijkheid toezichthouders of van de onderliggende actine cytoskelet.

Abstract

Behandeling van de spatio dynamiek van eiwitten kan onthullen hun functionele belang in verschillende contexten. In dit artikel is het besproken hoe fluorescerende herstel na photobleaching (FRAP) en photoactivation technieken kan worden gebruikt voor het bestuderen van de spatio dynamiek van eiwitten in subcellular locaties. Ook laten we zien hoe deze technieken in staat stellen eenvoudige bepaling van verschillende parameters die zijn gekoppeld aan cytoskeletal regelgeving en cel beweeglijkheid van actine. Bovendien, de protocollen van cellen wordt bovendien beschreven als een alternatieve behandeling (potentieel voorafgaand aan of als aanvulling op de bovengenoemde photomanipulation technieken) trigger momentane effecten van translocated eiwitten op cel morfologie en functie. Micromanipulation zoals eiwit injectie of lokale toepassing van plasmamembraan-permeabele drugs of cytoskeletal-remmers kan dienen als krachtige tool om de onmiddellijke gevolgen van een bepaalde behandeling op cel gedrag op de eencellige en subcellular opnemen niveau. Dit wordt geïllustreerd hier door onmiddellijke inductie van lamellipodial cel rand uitsteeksel door de injectie van recombinante Rac1 eiwit, zoals een kwart eeuw geleden opgericht. Daarnaast bieden we een protocol voor het bepalen van de omzet van verbeterde groen fluorescent proteïne (EGFP)-VASP, een actine-filament polymerase prominent accumuleren op lamellipodial toppen van B16-F1 cellen, dienst FRAP en inclusief gekoppelde gegevens analyse en curve-fitting. Wij presenteren ook richtlijnen voor het inschatten van de tarieven van lamellipodial actine netwerk polymerisatie, zoals wordt geïllustreerd door cellen uiten van EGFP-gelabeld β-actine. Ten slotte, instructies worden gegeven voor het onderzoeken van de tarieven van actine monomeer mobiliteit binnen het cytoplasma van de cel, gevolgd door opneming van de actine op sites van snelle gloeidraad vergadering, zoals de toppen van de uitstekende lamellipodia, met behulp van photoactivation benaderingen. Geen van deze protocollen is beperkt tot onderdelen of toezichthouders van het cytoskelet actine, maar kan gemakkelijk worden uitgebreid om te verkennen in analoge mode de spatio dynamiek en functie van eiwitten in diverse verschillende subcellular structuren of functionele contexten.

Introduction

Toezicht op de spatio dynamiek van eiwitten en andere moleculen in levende cellen is uitgegroeid tot een essentieel instrument in vele gebieden van cel- en moleculaire biologie. Geavanceerde fluorescentie microscopie technieken waaronder fluorescentie resonance energy transfer (FRET) en FRET-fluorescentie levensduur imaging (FRET-FLIM) of FRAP, fluorescentie verlies in photobleaching (FLIP) en photoactivation, evenals vele anderen toestaan voor de tijdelijke en ruimtelijke bijhouden eiwit-eiwitinteractie, conformationele veranderingen, evenals het bepalen van de kinetiek van diffusie en localisatie van verschillende proteïnen in de cel1,2. FRAP en photoactivation technieken, in het bijzonder zijn breed toepasbaar is voor de behandeling van de regelgevers van de actine cytoskelet en cel migratie. Deze technieken kunnen worden toegepast, alleen of in combinatie met extra micromanipulation technieken zoals microinjection3, en betrekken de expressie van fluorescently gelabelde proteïnen. Zij de schatting van de kinetiek van eiwit vereniging actine-rijke structuren die betrokken zijn bij cel migratie, zoals filopodia of lamellipodia, de omzet van eiwitten in de concentratiesectoren van verklevingen4, toestaan of vertakte actine netwerken5. Ze kunnen ook de bepaling van lamellipodial actine polymerisatie tarieven, de beoordeling van de spreiding van de monomere actine binnen het cytosol, het tarief van subcellular actine monomeer translocatie aan het actine-filamenten in uitstekende actinemonomeren lamellipodia6, en andere parameters.

FRAP is een methode voor het visualiseren en kwantificeren van de mobiliteit van eiwitten binnen een levende cel, oorspronkelijk ontwikkeld in de jaren 1970 door Axelrod7. Een gebied van belang (ROI) in een cel, gevuld met fluorescently gelabelde proteïnen, Transient blootgesteld aan een laser van hoge intensiteit, voldoende te veroorzaken bleken van de fluorophore moleculen aanwezig in dit gebied gedurende een bepaalde korte periode van tijd. De ongebleekt, fluorescently eiwitten gelegen buiten de ROI tijdens het bleken, het label zal diffuse en infiltreren de gebleekte regio afhankelijk van hun Spatio dynamiek, veroorzaakt door de verplaatsing van photobleached moleculen na verloop van tijd. Het percentage fluorescentie nuttige gebleekte regio is afhankelijk van verschillende factoren, waaronder de grootte en de snelheid van diffusie van een bepaalde molecule, en natuurlijk het percentage van de omzet binnen de vermeende bijbehorende gebleekte structuur. Dus, oplosbare eiwitten zal het herstel van de fluorescentie binnen de gebleekte ROI snel door diffusie, terwijl eiwitten strak gekoppeld structuren, zoals focal verklevingen bemiddelen, zal hebben langere tijden van de omzet, net als hun fluorescentie-herstel hangen van beide op de verspreiding van de oplosbare fractie van de eiwitten en dissociatie-vereniging kinetiek van de structuur-geassocieerde breuk. Fluorescentie herstel is meestal verworven en gekwantificeerd tot het oorspronkelijke niveau van pre bleekmiddel intensiteit van de fluorescentie is bereikt. Dit treedt echter niet op als een onderdeel van de eerste fluorescentie intensiteit behoort tot de zogenaamde immobiel breuk, die niet kan worden aangevuld door diffusie of aanvullen is in een zeer traag tempo in vergelijking met de meeste moleculen bestaande uit de mobiele breuk. Om te bepalen van het percentage eiwit omzet, worden FRAP curven gegenereerd, die de mate van herstel van de fluorescentie na verloop van tijd. Uit deze herstel krommen, kunnen gemiddelde half-tijden van eiwit herstel worden berekend. Door het creëren van kromme vlagen van de gemiddelde FRAP-gegevens, en vandaar wiskundige analyses, is het ook mogelijk afleiden of het tarief van de gemiddelde omzet van de mobiele breuk vormt een vierkleurendruk van een homogene bevolking van moleculen, of dat het is samengesteld uit twee of meer subpopulaties van moleculen draaien op differentiële tarieven. Naast schatten eiwit omzet tarieven door kwantitatieve benaderingen, kan het bijhouden van het herstel van de photobleached regio's in lamellipodia ook zorgen voor een nauwkeurige kwantificering van lamellipodial motiliteit parameters zoals retrograde stroom, uitsteeksel, en actine polymerisatie tarieven. FRAP vormt dus, een veelzijdig hulpmiddel om te worden toegepast voor de beoordeling van de verschillende parameters binnen de structuren van levende cellen.

Photoactivation is een methode die wordt gebruikt voor het bijhouden van de verspreiding en de mobiliteit van proteïnen of moleculen die afkomstig zijn van een aangewezen cellulaire locatie. De techniek maakt gebruik van, bijvoorbeeld, een variant van wild-type groen fluorescente proteïne (GFP), oorspronkelijk is ontwikkeld door Patterson en Lippincott-Schwartz8, die is gemuteerd in een manier waarmee de fluorescentie wordt sterk verhoogd bij blootstelling aan ultraviolet (UV)-licht (ongeveer 400 nm; hier, 405 nm). Zoals beschreven door Patterson et al.., wild-type GFP chromophores bestaan als een gemengde bevolking van neutrale fenolen en anionogene phenolates, die een grote extinctie piek op circa 397 produceren nm en een kleine een op 475 nm, respectievelijk. Na bestraling van het eiwit met UV-licht ondergaat de bevolking photoconversion, verschuift naar de anionische vorm. Als opgewonden door 488 nm, het eiwit photoconverted/photoactivated vertoont een stijging van 3-voudig in fluorescentie, onvoldoende in de praktijk voor onderscheid te maken tussen geactiveerd en niet-GFP als gevolg van de hoge intrinsieke achtergrond fluorescentie geactiveerde. Echter, een afname van de achtergrond intensiteit is bereikt door de invoering van een één aminozuur-mutatie in het GFP-reeks (histidine substitutie op positie 203). De resulterende T203H mutant, ook bekend als photoactivatable-GFP (PA-GFP) wordt gekenmerkt door een aanzienlijke vermindering in de absorptie van de kleine piek, die na bestraling met UV-licht bijna 100-fold wordt verhoogd wanneer vervolgens opgewonden door licht van 488 nm. Vandaar, overexpressie van PA-GFP-gelabelde proteïnen is een veel gebruikte aanpak, waarmee de bepaling van de verspreiding en beweeglijkheid van moleculen binnen de cellen. Wij hebben eerder toegepast actine PA-GFP-gelabeld om te bepalen van het tempo van de dispersie van actine monomeren uit de buurt van cytosolische regio's, waardoor niet alleen de exploratie van hun mobiliteit binnen het cytosol, maar ook hun bijmengingsgehalte in de uitstekende lamellipodial actine netwerk6. Meer recente literatuur beschrijft ook roman, foto-cabriolet eiwitten die kunnen in principe worden gebruikt op een soortgelijke manier, maar het potentiële voordeel te zichtbaar al vóór de foto-conversie herbergen. Voorbeelden voor deze groep van fluorescente proteïnen zijn Dendra2 en mEos29,10,11,12.

In dit artikel leggen we uit de methodologie van microinjecting cellen met eiwitten. Verder leggen wij uit hoe deze techniek kan worden gecombineerd met FRAP, door photobleaching eiwitten die betrokken zijn in de actine cytoskelet verordening en motiliteit, en hoe FRAP krommen en halftijds van terugwinning van mobiele breuken kunnen worden afgeleid. Daarnaast bieden wij een voorbeeld van hoe de FRAP-techniek kan worden gebruikt om te bepalen van actine polymerisatie tarieven van lamellipodial netwerken. We bieden ook instructies en tips over hoe om uit te voeren van de experimenten van de photoactivation, die kunnen worden gebruikt om te bepalen van cytosolische mobiliteit van monomeer actine en tarieven van actine opneming in lamellipodia. Deze technieken, natuurlijk, zijn niet alleen beperkt tot het bijhouden van actine cytoskelet onderdelen, maar op potentieel vereist gematigde aanpassing of optimalisatie, het kunnen worden alom toegepast op andere celtypes of te onderzoeken van verschillende eiwitten, structuren, en parameters.

Protocol

1. dekglaasje aan wassen en sterilisatie

  1. 15 mm (diameter) cover bril (no.1) in een maatkolf van 500 mL met een mengsel van 40 mL 37% HCl en 60 mL 100% onderdompelen EtOH (niet meer dan 100 coverslips per 100 mL oplossing wassen).
    Opmerking: zelfs als vers gekocht, coverslips moet strikt gereinigd worden vóór het zaaien van de cellen op hun oppervlak. Dit is omdat ze dunne films van vet, die macroscopisch onzichtbaar, maar efficiënt kunnen interfereren met de hechting en een passende verspreiding van levende cellen kunnen bevatten. Overwegende dat dergelijke films efficiënt kunnen worden verwijderd met oplossingen met zuur of base (Zie Fischer et al. 13), gebruiken we regelmatig de zuur/alcohol mengsel hierboven beschreven.
  2. Schud de kolf met de glazen cover voor 30 min op een rotatie shaker. Kies een snelheid waarmee de glazen cover worden wervelde vrij, maar langzaam genoeg om te voorkomen dat frequente breken. De oplossing voor het verwijderen van stukjes van gebroken glas als hergebruik filtraat.
  3. De glazen cover overbrengen in een maatkolf met ten minste 200 mL steriel water en uit te broeden op een rotatie shaker, terwijl herhaaldelijk ter vervanging van het water tot de zure geur is verdwenen. Meerdere wasbeurten over enkele uren worden aanbevolen voor volledige uitbanning van HCL-EtOH sporen.
  4. Droog individuele cover bril op een vel filtreerpapier.
  5. Plaats de cover glazen onderaan in een petrischaal 10 cm (diameter) bedekt met filtreerpapier en hitte droog-steriliseren. Vermijd autoclaaf omdat hierdoor cover bril bij elkaar blijven.

2. behandeling van de cellen, transfectie en zaaien op Coverslips

  1. Groeien B16-F1 muis melanoom cellen volgens standaard cel kweekomstandigheden in DMEM (4.5 g/L glucose) met 10% foetaal kalfsserum, 2 mM glutamine en 1% penicilline-streptomycine bij 37 ° C, 7% CO2.
  2. NIH3T3 cellen van de fibroblast voor microinjections volgens standaard cel kweekomstandigheden (weefselkweek incubator bij 37 ° C, 7% CO2) groeien in DMEM (4.5 g/L glucose) met 10% foetale runderserum, 1 mM natrium pyruvaat, 1 x MEM niet-essentiële aminozuren , 2 mM glutamine, en 1% penicilline-streptomycine.
  3. Voor transfections, B16-F1 cellen aan de samenvloeiing van de 100% in een 10 cm schotel en passage bij een verhouding van 1:5 in een kunststof schotel van 3 cm (diameter) te groeien.
  4. Op dezelfde dag, nadat de cellen B16-F1 houden voor ten minste 6 uur mochten, transfect met 500 ng/schotel van photoactivatable PA-GFP-actine of β-actine EGFP-gelabeld plasmide DNA. Meng voor de co transfections van PA-GFP-actine met mCherry-encoding vectoren, een totaal van 1 µg plasmide DNA per 3 cm schotel.
  5. Transfect de B16-F1 cellen met de transfectiereagens (Tabel van materialen). Voor een 3 cm schotel, meng 200 µL van 150 mM NaCl met 500 ng van DNA construeren met 200 µL van 150 mM met 1 µL van transfectiereagens NaCl (d.w.z., DNA (µg): reagens (µL) verhouding 1:2 werd gebruikt).
  6. Incubeer de transfectie mengsel gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (RT) en Pipetteer drop-wise op de 3 cm schotel met de cellen. Zachtjes swirl de schotel te mengen en na een nacht bebroeden bij 37 ° C, 7% CO2.
  7. Bereid de laminin coating buffer met 50 mM Tris, pH 7.4 en 150 mM NaCl.
  8. Voor de B16-F1-cellen, 15 mm cover bril door het verspreiden van 150 µL van laminin (25 µg Mo/mL in laminin coating buffer) jas en incubeer gedurende 1 h op RT. Voor de NIH3T3 cellen, de glazen cover met fibronectine oplossing (25 µg Mo/mL in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)) jas en incubeer gedurende 1 h op RT.
  9. Laminin - of fibronectine-bebroede cover bril met PBS, wassen dan de PBS gecombineerd en voeg toe 2 mL transfected cellen.
  10. Zaad van transfected cellen B16-F1 (in 1:30 verhouding van een confluente schotel), op de dag na de transfectie, op laminin-gecoate coverslips. Zaad van de fibroblasten NIH3T3 (in 1:20 verhouding van een confluente schotel) op fibronectine beklede coverslips.
  11. De cellen te verspreiden op laminin - of fibronectine-coated cover bril 's nachts in een incubator weefselkweek bij 37 ° C vóór microscopie toestaan. Als alternatief, microscopie experimenten kunnen worden geïnitieerd op dezelfde dag, gezien het feit dat de cellen kunnen worden verspreid gedurende ten minste 2-3 uur.

3. assemblage van microscopie Imaging kamer

  1. Gebruik een warmte geleidende RC-26 aluminium imaging kamer voor microscopie (Figuur 1een). Uitstrijkje van de Siliconenvet rondom de contour van de opening van de kunststof sealer met een injectiespuit (Figuur 1b).
  2. Plaats het glas van de cover met de cellen kant-up op de kamer (Figuur 1c).
  3. Plaats de kunststof sealer bovenop het glas van de omslag te maken van een veilige afdichting tussen het dekglaasje aan en de kamer. De kunststof sealer (diagonaal Voorkom dekglaasje aan breuk) vast door schroeven van de glijdende klemmen op de kamer om te voorkomen dat het medium lekken (Figuur 1d).
  4. Pipetteer 37 ° C voorverwarmde microscopie medium in het centrum. Voor medium in autofluorescence verlaagd en dus geoptimaliseerd voor microscopie, gebruiken hetzelfde recept als kweekmedium beschreven hierboven, maar met de F12-HAM in plaats van DMEM, daarnaast met 20 mM HEPES voor het kweken van cellen in de afwezigheid van CO2 (figuur 1e).
  5. Plaats van de detector van de warmte in de aangewezen sleuf van de kamer en de elektroden van de kamer koppelen aan een automatische temperatuurregelaar van handhaving van een constante temperatuur van 37 ° C (Figuur 1f) TC-324B.
  6. Plaats een kleine daling van onderdompeling olie op het doel en plaats van de kamer op de top.
  7. Incubeer de zaal met cellen voor ten minste 10 – 30 min. te laten om te herstellen van de temperatuurdaling van de tijdens de montage en aan te passen aan het medium microscopie.
  8. Voordat microscopie wordt gestart, vervangt u het kweekmedium in het centrale reservoir van de kamer (ongeveer 800 µL) om te voorkomen dat ongepaste concentratie van middellange onderdelen en serum toe te schrijven aan de middelgrote verdamping. Langdurige microscopie sessies met open kamers zal moeten veranderen van de routine van het verdampende medium.

4. microinjection Procedure

  1. Jas de coverslips, bereiden de cellen, en monteren van de beeldvorming kamer zoals hierboven beschreven.
  2. Ontdooi een aliquoot gedeelte van het gezuiverde eiwit te worden geïnjecteerd (meestal 10 µL of minder) en Verdun het met de juiste microinjection buffer.
    Opmerking: Buffer samenstelling kan variëren afhankelijk van eiwitten en cel type, maar de zorg te gebruiken een pH tussen 6,95 en 8,00 en Vermijd het gebruik van PBS, als de meeste cel niet graag worden geïnjecteerd met PBS.
  3. Rac1 microinjection, opstellen buffer met 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT. De Mg2 + -ionen zijn essentieel voor kleine GTPase stabiliteit.
    Opmerking: Eiwit concentraties normaal variëren tussen 0,1-1 mg/mL (maximale 2 mg/mL), afhankelijk van het eiwit, soort experiment, en cel type.
  4. Indien van toepassing, de fluorescente kleurstof, zoals inerte dextran (0,5 µg/mL, 70 kDa) aan de eiwit-oplossing, die de aanwezigheid van de afname van de naald vóór injecties kan bevestigen en de documentatie van succesvolle injecties na het experiment toelaat toevoegen.
    Opmerking: Het experiment hier is niet gericht op na de dynamiek van geïnjecteerd Rac1, die zou alleen mogelijk zijn op directe fluorescentie labeling van het eiwit. Koppeling van eiwitten met fluorescente kleurstoffen of fusie aan een fluorescente proteïne is mogelijk, maar vermeden hier zoals het herbergt het risico van inmenging met de signalering functie, in het bijzonder van kleine eiwitten zoals het Rho-familie GTPase Rac1 (20 kDa).
  5. Centrifugeer het eiwit oplossing bij 10.000 x g gedurende ten minste 30 min. Schakel eiwit-aggregaten die leiden kunnen tot naald verstopping indien aanwezig in de capillaire microinjection.
  6. Een naald van microinjection (microinjection capillaire) met 1 µL van het mengsel van de injectie van de achterkant met behulp van een flexibele pipette uiteinde/microloader tip laden.
  7. Luchtbellen in de naald tip aanwezig zijn, zachtjes Tik op als de naald base om te verwijderen. Snel om te voorkomen dat het drogen van de naald-tip, die leiden verstopping van de naald tot kan.
  8. Zorgvuldig aanpassen de houder van de naald op het micromanipulation-apparaat. Als met behulp van een omgekeerde Microscoop voor fase contrast imaging, vóór het laden van de naald, zorgen is er genoeg ruimte om de naald omhoog en omlaag zonder te belemmeren de Microscoop condensor.
  9. Bij de schroeven van de microcapillary op de houder van de naald, druk (20 – 50 hPa achtergrond druk) van toepassing op de naald met behulp van een apparaat van microinjection Druk voordat de naald tip translocating in het kweekmedium cel.
    Opmerking: Het activeren van de druk wordt de naald in het medium zal resulteren in het medium wordt opgezogen door de capillaire werking, en daarom verbieden injectie van de oplossing van belang.
  10. Plaats de naald in het gezichtsveld (vergemakkelijkt met behulp van lage vergroting doelstellingen). Een 40 X droge doelstelling voor microinjection experimenten werd hier gebruikt.
  11. Plaats de naald tip macroscopisch in een verticale positie ten opzichte van het midden van het objectief (dit zal versnellen het vinden van de naald-tip). Met de microscoop met fase-contrast optiek kunt u het uiteinde van de naald in het horizontale vlak ten opzichte van het gezichtsveld, op een optische vliegtuig goed-boven de cellaag.
    Opmerking: De naald wordt in eerste instantie weergegeven als een schaduw in het gezichtsveld en het vlak van de focus vervolgens kan worden aangepast om te visualiseren van de tip. Zodra het puntje van de naald wordt gevonden, geleidelijk verlagen het optische vliegtuig gevolgd door de tip van de naald tot een ligging dicht bij de cellaag.
  12. De naald stroom door over te schakelen naar een fluorescerende kanaal bij gebruik van TL dextran controleren en afstemmen van de stroom met behulp van het druk-apparaat te verkrijgen van een constante "achtergrond"-stroom.
    Opmerking: In dit artikel beschrijven we Handleiding injectie, die door het doorbreken van het plasmamembraan via het aanraken van de cel is gemedieerde oppervlakte en zachte beweging van de naald tip tijdens constante naald stroom. Dit moet worden onderscheiden van automatische injectie apparaten vergezeld van geprogrammeerde naald verlagen en naald drukverhoging tijdens injectie gebeurtenissen, die meer geschikt zijn voor de injectie van hogere cel nummers, gevolgd door een latere celpopulatie analyse. De hier beschreven methode is geoptimaliseerd voor eencellige analyse door time-lapse microscopie vóór, tijdens en na de microinjection.
  13. Een cel van belang vinden en geleidelijk lager de naald boven de cel.
  14. Als u klaar bent om te microinject, lager dan de naald geleidelijk naar de cel perinuclear regio met behulp van de fijne rondsel van de joystick van de micromanipulator, terwijl het houden van de cellen in focus.
  15. Voor microinjection, touch zachtjes het plasma-membraan van de cel, die kan volstaan om te doordringen van de cel, of steun van voorbijgaande membraan breuk door een zeer zachte kraan op de installatie van Microscoop.
    Opmerking: Een witte stip op het puntje van de naald geeft de tijd van contact met het plasmamembraan; na de breuk van de membraan, zal de naald tip verzegelen, vergezeld van een zachte stroom voor oplossing voor injectie in de cel.
  16. Het injectie stopt zodra de stroom in de cel zichtbaar is (idealiter binnen 0,3 s) door het bewegen van de naald-tip in het medium. Bij gebruik van TL dextran, kunnen de succesvolle injecties onmiddellijk worden gedocumenteerd door fluorescentie.
  17. Indien gewenst, initiëren time-lapse Beeldacquisitie vóór of na de microinjection.
    Opmerking: Lokale toepassing van drugs of remmers kan worden uitgevoerd op alle stappen hier, met uitzondering van de microinjection gebeurtenis per se. Voor lokale applicaties, de verspreiding van het actieve molecuul kan worden gecontroleerd door de waterdruk en gedocumenteerd door fluorescentie, en het uiteinde van de naald kan worden geplaatst op de gewenste hoogte. Zie voor voorbeelden van lokale toepassing experimenten, bijvoorbeeld kleine en Rottner14 of Kaverina et al. 15
  18. Na de microinjection, wachten totdat het effect van het eiwit optreedt. Voor verschillende eiwitten en afhankelijk van het verwachte resultaat, kunnen incubatie tijden variëren. Voor de kleine GTPase Rac1, de reactie van de vorming van de lamellipodium kan worden geïnitieerd binnen 1 min of minder, maar duurt ongeveer 10-15 min gemiddeld om volledig (Figuur 1g, h).
  19. Beoordelen van de levensvatbaarheid van cellen na de microinjection.
    Opmerking: Ongepast of schadelijke injecties kunnen veroorzaken celbeschadiging, die vaak gepaard met niet-specifieke cel-rand retractie of plasmamembraan breuk gaat.
    1. Vermijd porren via zowel de boven- en onderkant plasmamembraan, die zich voor injecties in plat cellulaire gebieden voordoen kunnen.
      Opmerking: Injectie volumes moeten tot een minimum worden beperkt (idealiter < 5% van de cellulaire volume) en zal meestal in het bereik femtoliter. Nodig injectie volumes kunnen ook worden gecontroleerd door veranderingen in de concentratie, maar merk op dat voor eiwitten, concentraties > 2 mg/mL onpraktisch als gevolg van frequente naald verstopt kunnen worden. Echter, dit ook afhankelijk van de kwaliteit en het gedrag van de gezuiverde eiwit; bijvoorbeeldinjectie van fluorescently-coupled actine wordt bemoeilijkt door concentratie-afhankelijk en onvermijdelijke polymerisatie in de naald tip, en dus het is zelden vandaag uitgevoerd (Zie kleine et al. 16).
  20. Vóór, tijdens of na het effect van de microinjection, FRAP of photoactivation kan worden uitgevoerd op dezelfde cel (zie hoofdstuk 5 en 6).

5. FRAP Procedure

  1. Transfect van het celtype van belang (hier B16-F1-cellen) met plasmide DNA codering een fluorescently-tagged proteïne van belang (hier, een EGFP-gelabelde versie van β-actine werd gebruikt). Zaad de cellen op laminin beklede coverslips (stap 2.10).
  2. Monteer de imaging kamer (sectie 3).
  3. Gebruik de volgende instellingen voor de lamellipodial regio photobleaching: 65 mW laser macht (variabele volgens experimentele setup en laser bron); 10 laser beam pixeldiameter; 1 ms bleekmiddel Nadruktijd tijd/pixel; 500 ms GFP belichtingstijd; 1.500 ms tijdsinterval. Experimentele resultaten in dit document werden uitgevoerd met een 100 X 1.4NA apochromatische doelstelling.
  4. Uitvoeren van laser kalibratie om ervoor te zorgen nauwkeurigheid in de afmetingen van de photobleached-regio. Voor kalibratie, verplaatst het gezichtsveld naar een gebied ontbreekt elke cellen/fluorescentie-signaal en observeren van de afbeelding op het display.
  5. Selecteer de objectieve vergroting door te klikken op de knop van de respectieve vergroting en verminderen van de macht van de laser (3 – 5 mW) in het "Panel | Intensiteit"menu. Om te beginnen handmatige kalibratie op Visiview software (v2.1.4), selecteer de "Configure | FRAP"menu en klik op de" Calibrate | Handleiding aanpassen"menu. Zorg ervoor dat de laser kan worden onderscheiden als een scherpe punt. Zo niet, of heroriënteren of aanpassen van de laser-hardware.
  6. De kalibratie uit te voeren door handmatig de laser te begeleiden naar vooraf bepaalde software X-en Y-coördinaten. Dit leest de software hoe speciaal te richten op de laser een door de gebruiker gedefinieerde regio voor de huidige vergroting.
  7. Voordat triggering de laser, overschakelen naar het GFP-kanaal en initiëren van afbeelding/tijd vervallen acquisitie.
  8. Handmatig tekenen de regio te photobleached op het GFP-kanaal, tijdens het bekijken van het scherm.
  9. Initiëren photobleaching door een handmatige trigger van de 405 nm laser, ten minste 3-4 frames na inleiding van Beeldacquisitie. Verwerven van frames vóór photobleaching is vereist voor de normalisatie van de afbeelding in latere data-analyse.

6. Photoactivation Procedure

Opmerking: Software, Microscoop setup en instellingen, met uitzondering van de macht van de laser, zijn vergelijkbaar met die voor FRAP. In photoactivation, een belangrijk verschil ten opzichte van FRAP, is dat een 405nm-laser macht aanzienlijk lager is dan die photobleaching moet worden gebruikt dienst voor het activeren van de PA-GFP zonder tegelijkertijd photobleaching het.

  1. Co transfect het celtype van belang (B16-F1 cellen hier; zie stap 2.5) met plasmide DNA codering PA-GFP-actine en een ander fluorescently-geëtiketteerden eiwit (bijvoorbeeld mCherry of mCherry-Lifeact).
    Opmerking: In de meeste gevallen, mCherry-positieve cellen ook positief zal zijn voor de PA-GFP-actine-vector, de laatste niet normaal gezien op het GFP-kanaal voorafgaand aan photoactivation. Ter verhoging van de kans dat de mCherry-positieve cellen ook positief voor PA-GFP zijn, gebruiken een verhouding van 1:2 transfectie van mCherry:PA-GFP-actine. Na dit protocol, meer dan 90% van de cellen uiten mCherry weergegeven succesvol activeren van de PA-GFP-actine.
  2. De cellen van het zaad de B16-F1 op laminin beklede coverslips (stap 2.10).
  3. Monteer de imaging kamer (sectie 3).
  4. Voordat de photoactivation-experimenten, indien nodig, de laser-kalibratie voor uitvoeren het geselecteerde doel (stap 5.4-5.6)
  5. Stel de GFP/488 nm Beeldacquisitie aan 500 ms blootstelling en 1.500 ms tijdsinterval (afhankelijk van de proefopzet).
  6. De software-instellingen aanpassen voor het verwerven van dual channel of triple-channel time-lapse films markering op het plein "Golflengte serie" en selecteer het gewenste aantal kanalen in de "ophaal | Golflengte"menu. Het wordt aanbevolen dat de tijd-tijdspanne films zijn verworven met fase contrast en GFP kanalen.
    1. U kunt desgewenst ook het mCherry-kanaal; Als u echter cellen met teveel licht bloot, misschien photodamage induceren. Dit kan worden voorkomen met zuurstof aaseters zoals Oxyrase17, hoewel effectieve behandeling cel kamer afdichting vereist.
  7. Vind de transfected cellen op het mCherry-kanaal.
  8. Voordat de laser triggering, afbeelding/tijd vervallen overname initiëren en handmatig tekenen de regio te photoactivated op de fase contrast kanaal, tijdens het bekijken van het scherm.
  9. Initiëren van photoactivation door een handmatige trigger van de 405 nm laser (intensiteit instellen tussen 5-15 mW uit het "Panel | Intensiteit"menu), ten minste 3-4 frames na afbeelding overname inleiding.

7. de gegevensanalyse en presentaties van FRAP resultaten

Opmerking: De methode gepresenteerd wordt gebruikt voor het onderzoeken van de omzet van een eiwit accumuleren op sites van dynamische actine vergadering, in dit geval VASP, die gekoppeld aan de sites van de hechting en de toppen van uitstekende lamellipodia. Wij zijn het analyseren van haar omzet aan het uiteinde van de lamellipodium, maar dezelfde principes van analyse kunnen worden toegepast voor het onderzoeken van de omzet van VASP of elke andere eiwitten en andere subcellular compartimenten.

  1. Open de time-lapse films die afkomstig zijn van Visiview betreffende de Metamorph software. In dit artikel, werd Metamorph v7.8.10 gebruikt.
  2. Ontlenen intensiteitswaarden voor photobleached regio's door handmatig overzichten Metamorph respectieve regio's. Een shape op het puntje van de lamellipodium die dekt het gehele of een deel van het photobleached-gebied, en haar positie op latere frames handmatig aanpassen indien nodig (dat wil zeggen, als de rand uitsteekt is), in om wijzigingen bijhouden in lamellipodial intensiteiten van gelijkspel de respectieve component tijdens de verplaatsing van de tip.
  3. Analyseren voor correctie van achtergrond en photobleaching verwerving, regio's binnen en buiten de cel. Zie Figuur 2een voor representatieve gebieden van gemeten intensiteiten.
  4. Terwijl een ROI is geselecteerd, zijn intensiteitswaarden op Metamorph extraheren met behulp van het menu "maatregel | Regio metingen". Zorgen "Verstreken tijd" en "Gemiddelde intensiteit" opties zijn geselecteerd in het menu "Configure". Klik op "Open logboek" en selecteer "Dynamic Data Exchange". Klik op "OK" om te openen van een Excel-werkblad en klik op de knop 'Open logbestand' opnieuw om de Metamorph waarden in Excel plakken.
    Opmerking: Deze waarden worden gebruikt voor het genereren van de fluorescentie herstel bochten.
  5. Voor het genereren van fluorescentie herstel curven aan het uiteinde van de lamellipodium van de photobleached regio's (genormaliseerd naar de intensiteit van de regio vóór photobleaching), gelden de volgende vergelijking:
    Equation 1   Vergelijking 1
    waar: FRAPTn is de intensiteit van de regio photobleached voor elk frame van belang na photobleaching; UitTn volgt een intensiteit van de regio genomen buiten de cel (achtergrond) voor elk frame van belang photobleaching; InsTn is twee gemiddeld binnen regio intensiteiten voor elke frame van belang na photobleaching (gebruikt om te normaliseren voor overname photobleaching na verloop van tijd); FRAP-T-1 is de intensiteit van de regio photobleached vóór photobleaching; UitT-1 is een intensiteit van de regio genomen buiten de cel (achtergrond) vóór photobleaching; en InsT-1 is twee gemiddeld binnen regio intensiteiten voor elke frame van belang voor photobleaching.
  6. Gebruik voor elk frame van de tijd van belang, vergelijking 1 te verkrijgen van een fluorescentie herstel curve met alle termijnen moeten worden onderzocht. De tijdsduur is strikt afhankelijk van het eiwit onderzocht. Uitvoeren als onbekend, voorbereidende experimenten om het verwerven van het percentage van de omzet van het eiwit.
  7. Voor de berekening van de helft van de tijd van herstel, de waarden van de fluorescentie herstel curve met de bijbehorende tijd (in seconden) in een Sigma perceel (v.12) plakken en uitvoeren van een curve aanpassen met behulp van de "Dynamic Fit Wizard | Hulpmiddel exponentiële stijging tot maximum". Selecteer mono-exponentiële (single, 3 parameters) of bi-exponentiële (dubbel, 4 parameters) functies, afhankelijk van de beste curve past.
  8. Gebruik de volgende formule voor mono-exponentiële functie:
    Equation 2   Vergelijking 2
  9. Gebruik de volgende formule voor bi-exponentiële functie:
    Equation 3   Vergelijking 3
  10. Plak parameters "b" en "d" afgeleid van Sigma Plot (vergelijking 2 of vergelijking 3) in Excel voor het berekenen van de helft van de tijd van herstel. Toepassing van de volgende vergelijkingen:
    Equation 4   Vergelijking 4
    of
    Equation 5   Vergelijking 5
  11. Wanneer de mono-exponentiële functie in een nauwkeurige curve past resulteert, van toepassing slechts 4 van de vergelijking.
  12. Als mono-exponentiële functie niet in een goede curve past resulteert, van toepassing de bi-exponentiële formule door het oplossen van zowel vergelijking 4 als artikel 5 van de vergelijking. De resulterende twee half-tijden van herstel als het vertegenwoordigen van twee verschillende eiwitfracties overwegen: een snel en een langzaam uitwisselen Fractie, respectievelijk.

8. de vaststelling van het tarief van de polymerisatie Lamellipodial actine door FRAP

  1. Om te bepalen van het lamellipodial tarief voor de polymerisatie van de actine, B16-F1 cellen met EGFP-gelabeld β-actine, transfect en photobleach de lamellipodial-regio (stap 5,9) met behulp van 1.5 s tijdsinterval en 500 ms GFP blootstelling.
  2. Open de time-lapse films verworven van Visiview in Metamorph, en kalibreren van de verhouding van de pixel/µm volgens de objectieve gebruikt door de "maatregel | Kalibreren afstanden"tool.
  3. De time-lapse film afspelen en stoppen op het frame wanneer de lamellipodial fluorescentie herstel, dat terug naar de lamel als een lijn stroomt, de lamel heeft bereikt en niet verder naar achteren stroom kan worden bijgehouden.
  4. Meet de afstand in tussen het uiteinde van de lamellipodium en de achterkant van de herstelde fluorescentie µm. Deze afstand komt overeen met de som van de retrograde stroom en uitsteeksel afstanden.
  5. Anderzijds te scheiden van het uitsteeksel van retrograde flow, markeren de lamellipodial tip met een lijn van één frame voordat de photobleaching. Gebruik de lijn als een referentie punt in volgende frames te verwijzen naar de oorspronkelijke positie van de lamellipodium tip op het moment van photobleaching; het referentiepunt kan worden gebruikt om het uitsteeksel afstand en retrograde stroom te meten.
  6. Opmerking de tijd (in seconden) die nodig is voor herstel van de fluorescentie na photobleaching optreden. De tijd kan worden handmatig berekend op basis van de framerate of gevisualiseerd door Metamorph via de "maatregel | Regio metingen"tool.
  7. Ontlenen de actine polymerisatie tarief met behulp van de volgende vergelijking (met enkele vergelijking parameters gebaseerd op Metamorph metingen uit stap 8.4 en 8.6):
    Equation 6   Vergelijking 6
    waar actine polymerisatie bedraagt in µm/min, retrograde stroom afstand is in µm, lamellipodial uitsteeksel afstand is in µm, en tijd is in seconden.

9. analyse van eiwit diffusie en mobiliteit op Photoactivation

Opmerking: De hier gepresenteerde methode beschrijft de analyse van actine monomeer mobiliteit door photoactivation van actine gesmolten aan PA-GFP, zoals wordt geïllustreerd door visualisatie en kwantificering van eiwit verspreiding via het cytosol.

  1. Voor het meten van de verspreiding van photoactivatable actine van een cytosolische regio, evenals de accumulatie in een lamellipodial gebied, Metamorph te gebruiken om te bepalen van de intensiteit na verloop van tijd in de volgende regio's (geïllustreerd in Figuur 3een ): een cytosolische photoactivated regio (PA); een lamellipodial-streek, in welke photoactivated eiwitten naar verwachting zullen accumuleren in de tijd (Lam); een gebied buiten de cel gebruikt voor normalisering van achtergrond fluorescentie (OUT).
  2. Bij het bepalen van de mobiliteit van actine binnen het cytosol, meten verschillende cytosolische regio's (Zie Figuur 3een, regio's R1-R5). Merk op dat de overname photobleaching kan niet worden bepaald in een soortgelijke wijze als FRAP, als gevolg van een toename van de focal- en uiteindelijk cel bestrijkende fluorescentie na activatie.
  3. Breng de intensiteitswaarden voor alle regio's van Metamorph in een Excel-werkblad, zoals beschreven in stap 7.4.
  4. Voor de behandeling van het tempo van de verplaatsing van photoactivatable actine weg van de cytosolische regio van photoactivation of het tarief van opneming in een lamellipodial gebied (zowel weergegeven als percentage van de intensiteit van de regio cytosolische photoactivated op moment 0) , curven van de fluorescentie te genereren van de gegevens in stap 9.3. Toepassing van de volgende vergelijkingen:
    Equation 7   Vergelijking 7
    Equation 8   Vergelijking 8
    waar: PATn is de intensiteit van een cytosolische photoactivated regio voor elk frame van belang na photoactivation; LAMTn is de intensiteit van een regio van de lamellipodial voor elk frame van belang na photoactivation; UITTn volgt de intensiteit van een regio genomen buiten de cel (achtergrond) voor elk frame van belang photoactivation; PAT-1 is de intensiteit van een regio van cytosolische photoactivated voor photoactivation; LAMT-1 is de intensiteit van een regio van de lamellipodial voor photoactivation; UITT-1 is de intensiteit van een regio genomen buiten de cel (achtergrond) vóór photoactivation; PAT0 is de intensiteit van een regio van cytosolische photoactivated op moment 0 (dat wil zeggen , het eerste frame na photoactivation); en uitT0 is de intensiteit van een regio genomen buiten de cel (achtergrond) op moment 0 (dat wil zeggen, het eerste frame na photoactivation).
  5. Optioneel, voor betere visualisatie van de gegevens, normaliseren de intensiteit bochten op 0 door de intensiteit van het eerste frame na de photoactivation van elke opeenvolgende frame af te trekken.
    Opmerking: De volgende analysemethode (stappen 9,6 – 9,8) ook maakt het mogelijk de cytosolische spreiding van de photoactivated actine binnen het cytosol berekenen.
  6. Meet de intensiteiten voor cytosolische regio's, die achter elkaar, distally van de activering regio geplaatst worden.
  7. Toepassing te vertegenwoordigen de intensiteiten van deze regio's als percentage van de intensiteit van de photoactivated-regio op moment 0, vergelijking 8, waar lamellipodial intensiteiten zijn vervangen door intensiteiten voor elke cytosolische ROI. Aantal van de regio's en de grootte kunnen variëren afhankelijk van de cel grootte en versnippering afstand te meten.
  8. Aan een meetbare waarde voor het aantal photoactivated eiwit infiltreren elke cytosolische regio ontlenen, de tijd en de waarden van de curve van de verhoging van de intensiteit van de fluorescentie voor elke regio plakken met Sigma perceel (vergelijkbaar met de analyse van de FRAP in afdeling 7), gebruik van Vergelijking 2 en vergelijking 4 voor het afleiden van de helft van de tijd van de intensiteit van de fluorescentie een plateau te bereiken. Vergelijk de t-1/2 waarden tussen verschillende experimentele groepen.

Representative Results

Figuur 1 g h Toon fase contrast beelden van een NIH3T3 fibroblast cel voorafgaande en 10 min na microinjection van Rac1, die een kleine Rho-familie GTPase staat inducerende lamellipodia vorming door zijn interactie met de golf complex. De cel is het eerste gevisualiseerd voordat de microinjection (Figuur 1g), om de levensvatbaarheid en de morfologie, bijvoorbeeld, het ontbreken van lamellipodia te bevestigen. Op 10 min na microinjection, heeft de cel zijn morfologie, die wordt verwacht van deze behandeling, en een succesvolle injectie (Figuur 1h) geeft duidelijk veranderd.

Voor eenvoud en duidelijkheid voorzien we volgende voorbeeldige resultaten FRAP en photoactivation analyse in cellen, die hebben niet verder microinjected.

Analyse van de omzet van EGFP-gelabeld VASP aan het uiteinde van de lamellipodium wordt weergegeven in Figuur 2a-f. Merk op dat VASP Daarnaast richt zich naar de ontluikende en focale verklevingen, kleine en langwerpig stippen in de cel interieur18,19. De intensiteit van de fluorescentie van een lamellipodial-regio met een duidelijk VASP accumulatie op het puntje was gebleekt en gemeten voor elke termijn, door het volgen van de contour van de ROI vóór, tijdens en na het ontkleuren aangebracht zoals de lamellipodium vooruit steekt. Zoals gebleekte EGFP-VASP eiwitten worden gerecycled door niet-gebleekt moleculen op deze sites, wordt geleidelijk herstel van de fluorescentie waargenomen (Figuur 2b). De FRAP herstel curve verkregen op deze manier en op de intensiteit van de pre bleekmiddel (uitgedrukt in 1) genormaliseerd kan worden gezien in Figuur 2c. Photobleaching efficiëntie kan variëren en was ongeveer 20% van de waarde vóór het bleken in dit voorbeeld, zoals bepaald door de waarde bij t0 (het eerste frame na photobleaching). De verhoging van fluorescentie bereikt een plateau in het voorbeeld op ongeveer 80% van de fluorescentie voordat bleken. In een statische-structuurdiagram in de tijdsverloop van het experiment, zoals een focale adhesie, het verschil tussen de intensiteit van de pre bleekmiddel en de fluorescentie plateau bereikt nadat herstel is gedefinieerd als het immobiel breuk (IF, rode pijl in Figuur 2 c, e), terwijl de hoeveelheid fluorescentie teruggevonden tussen het moment van bleken en volledige herstel wordt gedefinieerd als de mobiele breuk (groene pijl in Figuur 2c, e). Merk op dat in een dynamisch veranderende structuur zoals de lamellipodium tip hier geanalyseerd, de omvang van de IF misschien niet alleen immobiel moleculen vertegenwoordigen, maar ook worden afgeleid uit een vermindering van de snelheid van het uitsteeksel, genoemd EGFP-VASP intensiteit is afhankelijk van dit met de parameter18. Voor het berekenen van de helft van de tijd van herstel, ontstond een fit curve op Sigma perceel (Figuur 2d). In dit geval de waarde van de parameter van de "b" is onttrokken oplossen van vergelijking 2 is gelijk aan 0.0754, welke wanneer toegepast op de logaritmische functie (vergelijking 4) resultaten in een geschatte halftijds van terugwinning van 9.19 s (Figuur 2d , uiterst rechts paneel), die is relatief snel in deze bepaalde cel ten opzichte van het gemiddelde gepubliceerd eerder5. Opgemerkt moet worden dat half-hersteltijden soms aanzienlijk van cel naar cel binnen dezelfde populatie verschillen kunnen. Daarom, voor het verkrijgen van representatieve resultaten, raadzaam deze parameter bepalen door een gemiddelde te nemen van ten minste 15-20 cellen. Ter illustratie van de mate van variantie, rekenkundig middelen van EGFP-VASP herstel gemiddeld uit 15 cellen voor elk tijdstip werden gegenereerd (Figuur 2e), en gemiddelde curve past gemaakt en weergegeven in een analoog mode (Figuur 2 f).

Het tarief van de polymerisatie van het lamellipodial actine netwerk bestaat uit de som van voorwaartse netwerk uitsteeksel en retrograde stroom. FRAP kan worden toegepast voor het meten van de snelheid van de polymerisatie actine door transfecting cellen (in dit geval B16-F1) met β-actine EGFP-gelabeld en photobleaching een vooruitstekende lamellipodial regio (Figuur 2g). Voor analyse van lamellipodial actine netwerk polymerisatie, wordt het herstel van de fluorescentie bij het bleken van EGFP-gelabeld β-actine beoordeeld na verloop van tijd. Als de polymerisatie van actine monomeren vordert op de prikkeldraad uiteinden van lamellipodial actine-filamenten (die alle verwijzen naar de voorste20), is het netwerk voortdurend translocated naar achteren en naar voren, vordert de tarieven die gemakkelijk kunnen worden verkregen via gepolariseerde herstel van fluorescentie op photobleaching. Fluorescentie herstel van de lamellipodium is voltooid zodra de gebleekte zone heeft bereikt de overgangszone tussen het achterste deel van de lamellipodium en de lamel, die wordt gekenmerkt door een lagere dichtheid van meer horizontaal gerangschikt gloeidraad bundels veel langzamer dan wat is waargenomen in de lamellipodium draaien. Zoals geïllustreerd in Figuur 2g, kan fluorescentie herstel worden gevisualiseerd als een lijn die horizontaal ten opzichte van de rand en stroomt terug naar de lamel, die het mogelijk het meten van de afstanden van uitsteeksel en retrograde stroom maakt (individueel vertegenwoordigd in het rechtse paneel van Figuur 2g als oranje en rode tweepuntige pijlen, respectievelijk).

Wij hebben ook photoactivation in B16-F1 cellen transfected met PA-GFP-actine om bij te houden van de mobiliteit van actine monomeren binnen het cytosol en het tempo van hun integratie binnen het uitstekende lamellipodia toegepast. Zoals geïllustreerd in Figuur 3, ondera, b, een cytosolische regio was photoactivated door blootstelling aan een 405 nm laser, terwijl beelden werden verworven op de GFP kanaal elke 1.5 s voor het visualiseren van de verdeling van GFP-gelabeld, photoactivated actine. Photoactivated GFP-actine kan worden gezien uit de cytosolische regio in Figuur 3bverspreiden. Het tempo van de daling van de intensiteit van de fluorescentie photoactivated cytosolische regio wordt vertegenwoordigd als het percentage van de oorspronkelijke intensiteit op t0 (eerste frame na photoactivation; Figuur 3 c). Photoactivated actine integreert ook op de toppen van de lamellipodia, waar nieuwe actine monomeren worden toegevoegd aan de groeiende prikkeldraad uiteinden van het grondvlak van de actine-filamenten tijdens uitsteeksel. Om een schatting van de mate van integratie van de lamellipodial, we de intensiteit van de fluorescentie gemeten na verloop van tijd een tweedimensionale contour/regio ongeveer 5 µm in breedte en 1 µm in hoogte; de regio was voortdurend opnieuw gepositioneerd op het puntje van de lamellipodium als het staken. Actin opneming was vertegenwoordigd als het percentage van de intensiteit van de fluorescentie van de regio photoactivated cytosolische op t0 (Figuur 3d). Zoals rek van actine-filamenten vorderde, werden nieuwe actine monomeren opgenomen lamellipodial vooraan. Een fractie van deze actine monomeren was stochastically afgeleid van het cytosolische zwembad waar monomeren photoactivated waren. Dit resulteert in de snelle verhoging van fluorescentie in lamellipodia in de eerste 20 s na photoactivation. Als nieuwe monomeren worden toegevoegd aan de voorkant van de lamellipodial, eerder opgenomen actine monomeren stroom met een door samensmelting van filamenten richting de lamel door retrograde stroom. Na verloop van tijd de ROI is volledig gevuld met fluorescerende monomeren en een plateau in fluorescentie (Figuur 3d) is bereikt. Een geleidelijke daling van de fluorescentie wordt vervolgens waargenomen wanneer, na verspreiding van photoactivated monomeren in de cel, worden niet-photoactivated actine monomeren steeds opnieuw toegevoegd aan de voorkant van de lamellipodial. Deze afname van de fluorescentie vindt een nieuwe plateau, die zal worden bereikt, zodra een evenwicht in de gehele cel tussen photoactivated en niet-photoactivated monomeren is bereikt (gegevens niet worden weergegeven).

De mobiliteit van actine monomeren in het cytosol werd afgeleid door het meten van de intensiteit van de fluorescentie in regio's van gelijke grootte geplaatst, distally van de photoactivated-regio (wordt geïllustreerd op afbeelding 3een kleurcode regio's met het label R1-R5). Zoals geïllustreerd in Figuur 3e, fluorescentie intensiteit in elk van deze gebieden geleidelijk afneemt weg van de cytosolically photoactivated de regio, als het deel van photoactivated actine monomeren wordt steeds meer verdund met niet-geactiveerde (dat wil zeggen, niet-belichting fluorescerende) monomeren. Bovendien, het hoogtepunt van de fluorescentie later is bereikt: de meer afgelegen de gemeten regio ligt uit de photoactivated regio, des te langer de tijd die nodig is voor actine monomeren te verspreiden in deze gebieden. Een representatieve waarde voor de mate van actine monomeer infiltratie in elke regio kan worden afgeleid door de helft van de tijd voor het bereiken van het plateau van de fluorescentie te kwantificeren. De meer afgelegen regio, des te langer het duurt voor de photoactivated actine te verspreiden in het, en dus meer tijd nodig is voor het fluorescerende plateau te bereiken, wat uiteindelijk leidt tot een hogere waarde van de t1/2 (Figuur 3e).

Figure 1
Figuur 1 : Imaging kamer vergadering en microinjection procedure. (een) Imaging kamer onderdelen. (b) siliconen vet is zorgvuldig gesmeerd rond de opening van een kunststof sealer. (c) het dekglaasje aan is geplaatst met de cel-zijde naar boven in het midden van de beeldvorming kamer openen. (d) een veilige zegel wordt vastgesteld door de positionering van de kunststof sealer bovenop het dekglaasje aan en door aanscherping van de kant klemmen. (e) microscopie medium is afgepipetteerde in de sleuf van de kamer. (f) de imaging kamer is gepositioneerd in het werkgebied van de Microscoop, warmte detector en elektroden zijn gekoppeld aan een eenheid van de verwarming vooraf ingesteld op 37 ° C en cellen aan te passen voor minstens 30 min voordat microscopie wordt gestart zijn toegestaan. In dit voorbeeld de Microscoop fase is ook uitgerust met een micromanipulator voor het uitvoeren van microinjections en de microinjection naald wordt ondergedompeld in het medium die betrekking hebben op de cellaag in de beeldvorming zaal. (g) een NIH3T3 fibroblast cel is vóór microinjection gevisualiseerd door fase contrast microscopie. Het Rode Kruis in het compartiment van de perinuclear geeft de locatie van het toekomstige microinjection, hetgeen overeenkomt met een hoge cytoplasmatische regio als gevolg van de nabijheid van de omvangrijke kern. (h) 10 min na microinjection met Rac1, de cel reageert door prominente vorming van lamellipodia langs de rand van de gehele cel (aangeduid door groene pijlen). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: FRAP kunt bepalen van de tarieven van eiwit omzet of lamellipodial actine polymerisatie. (een) representatief voorbeeld van B16-F1 cel EGFP-VASP uiten voordat photobleaching een lamellipodial regio zoals aangegeven. Verschillend gekleurde contouren/vormen worden aangeduid om aan te geven welke regio werden geacht voor fluorescentie intensiteit metingen na verloop van tijd. Opmerking de rode omtrek gemarkeerd met een uitroepteken, waarmee een cytosolische regio geplaatst in een omgeving met meerdere blaasjes en cel oppervlakte ruches labels. Dynamische gebieden zoals dit moeten worden vermeden voor het selecteren van de regio's van de fluorescentie verwijzing, zoals ze worden gekenmerkt door sterke kortetermijnfluctuaties van fluorescentie, mogelijk veroorzaakt door onnauwkeurige resultaten. (b) Lamellipodial regio van de EGFP-VASP waarin cel vóór en na photobleaching. Het herstel van fluorescent signaal nadat photobleaching binnen de regio gemarkeerd in paars is gevisualiseerd na verloop van tijd. Pijl geeft aan dat het puntje van een microspike, verrijkt voor VASP waarschijnlijk te wijten aan de hoge dichtheid van actine-filamenten actinemonomeren er19. (c) een voorbeeld van een FRAP herstel curve als afgeleid van het kwantificeren van de fluorescerende intensiteit van de photobleached lamellipodium (paarse contour) in b. rode en groene regels aan de rechterkant geven aan, respectievelijk, immobiel en mobiele breuken. (d) een passen van de FRAP herstel curve in c (linkerdeel) en een voorbeeld van de berekeningsmethode gebruikt voor het afleiden van de hersteltijd voor de helft (rechtervenster). (e) een voorbeeld van een FRAP-herstel kromme afgeleid van de fluorescentie herstel curven van 15 cellen, gemiddeld met SEM balken geven de mate van variabiliteit in de steekproef bevolking. (f) een bocht pasvorm afgeleid van gemiddeld de FRAP herstel kromme vlagen van 15 cellen (linkerdeel) en een voorbeeld van de berekeningsmethode gebruikt voor het afleiden van de hersteltijd voor de helft (rechtervenster). (g) Time-lapse panelen van het uitstekende lamellipodium van een cel van de B16-F1 uiting van EGFP-gelabeld β-actine vóór en na het bleken van een regio van de lamellipodial zoals aangegeven, gevolgd door fluorescentie herstel in de lamellipodium na verloop van tijd. Op het rechtse paneel, gemeten waarden voor uitsteeksel en retrograde afstanden worden geleverd (in oranje en rood, respectievelijk). Berekeningen onder de afbeelding panelen onthullen hoe de som van het uitsteeksel en retrograde afstanden worden gebruikt voor het afleiden van de polymerisatie tarief van het actine-netwerk van lamellipodial. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: Photoactivation van PA-GFP-actine voor monomeer bijhouden in de cel. (een) A representatief voorbeeld van een cel van de B16-F1 PA-GFP-actine uiten voordat triggering van photoactivation in een cytosolische regio zoals aangegeven door de rode cirkel (PA). Verschillend gekleurde contouren worden aangeduid om aan te geven welke regio werden geacht voor fluorescentie intensiteit metingen na verloop van tijd. (b) een illustratie van de Tijdsdistributie van PA-GFP-actine volgende photoactivation. Neem nota van de geleidelijke vermindering van de fluorescentie in de photoactivated, cytosolische regio (rode cirkel), aangezien de photoactivated actine away from it diffundeert. Als gevolg van hun verspreiding aan de voorzijde en de vergadering in het netwerk, zijn de photoactivated actine monomeren geleidelijk verbeterd in lamellipodia (cyaan regio) en de rest het cytosol (verschillende gekleurde gebieden) op een afstand - en tijd-afhankelijke manier. (c) vertegenwoordiger, tijdelijke daling van de fluorescentie binnen de photoactivated cytosolische regio (rode contour in b). (d) temporale veranderingen in de intensiteit van de fluorescentie in de lamellipodial regio (cyaan contour in b). (e) bochten vertegenwoordiger van de temporele veranderingen in intensiteit van de fluorescentie van cytosolische regio's (vergelijkende in b) vanwege positionering in variabele afstanden uit het gebied van photoactivation. Merk op hoe de helft-tijden van het bereiken van de fluorescentie plateau (aangegeven in de legenda op het recht) toenemen met de afstand van gegeven regio op het gebied van photoactivation, waarschijnlijk correleren met de verhoogde keer die nodig zijn voor de verspreiding van actine monomeren in de respectieve regio. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

Hier bespreken we kritische stappen in de technieken beschreven in dit artikel, en hoe ze kunnen worden geoptimaliseerd voor toepassing in verschillende experimentele omstandigheden.

Microinjection is een methode die kan worden toegepast om te controleren in de cellen van de onmiddellijke gevolgen van de invoering van exogene eiwitten, remmers, of drugs. Het kan vooral nuttig zijn voor het bepalen van de functies van eiwitten in moeilijk te transfect celtypes of in situaties wanneer op lange termijn expressie is niet gewenst. Opgemerkt moet worden dat voortbestaan van bepaalde celtypen afhankelijk is van de extracellulaire matrix, die ze worden overgeënt op. Meest endotheel, epitheliale of fibroblast-achtige celtypes, zelfs kleine graag vis keratocytes (Zie Dang et al. 21 en Anderson en Cross22) kunnen met succes worden geïnjecteerd. Er zijn echter uitzonderingen, zoals B16-F1 cellen ontpit op laminin, en die vormen een uitstekende modelsysteem voor cel migratie, maar zijn niet compatibel met injectie op dit soort substraat om onbekende reden. Voor NIH3T3 fibroblast cellen uitvoeren we routinematig injecties op fibronectine substraat en extra photomanipulation technieken zoals FRAP (zelfs met photoactivation; B16-F1 cellen hier getoond) even goed kan worden uitgevoerd in deze fibroblasten (Zie bijvoorbeeld, Köstler et al. 3). het moet ook worden overwogen dat verschillende eiwitten, volgens hun functionele eigenschappen en de doelstellingen van het experiment, verschillende hoeveelheden tijd tot veranderingen, variërend van seconden tot uren kunnen duren. Een voordeel van de techniek is dat de dosis/concentratie van exogene agent nauwkeuriger op het niveau van de eencellige dan bijvoorbeeld, kan worden gecontroleerd, bij het gebruik van plasmiden transfectie. Bovendien, is fluorescerende tagging van een eiwit niet een noodzaak om te garanderen van haar aanwezigheid in de cel, die flexibiliteit toenemen kan als gelijktijdige meerkanaals visualisatie van andere fluorescently-gelabelde proteïnen vereist is. Microinjection kunnen bijzonder nuttig zijn voor het analyseren van de onmiddellijke gevolgen van specifieke proteïnen of eiwit mengsels voor dynamische veranderingen in de morfologie van de cel of het cytoskelet (bijvoorbeeld Dang et al. 21 voor een voorbeeld van onmiddellijke effecten op de migratie door de complexe Arp2/3-remmer Arpin). Een nadeel van de techniek is de invasiviteit, die kan leiden tot celbeschadiging of invloed van cel morfologie. Daarom is een belangrijke overweging bij het uitvoeren van de microinjections toezicht op de levensvatbaarheid van de cellen. De methode die hier wordt ingevoerd, is afhankelijk van manuele manipulatie. In omstandigheden getest zodat deze compatibel is met succesvolle injecties, zoals fibroblasten groeien op fibronectine substraat, staat de handleiding injectie protocol hier beschreven een in de omgeving van 100% slagingspercentage; Dit is essentieel bij het combineren van deze aanpak met verfijnde en tijdrovende follow-up experimenten met videomicroscopie of FRAP, zoals gepubliceerd eerder3. Dit sluit niet uit dat soms, afzonderlijke cellen zou kunnen lijden aan een gebeurtenis van microinjection, die veilig kan worden herkend door de abrupte veranderingen van contrast van zowel de celkern en het cytoplasma, gevolgd door cel rand retractie. Dergelijke zeldzame experimentele gevallen zijn uitgesloten en daarom niet beschouwd voor verdere analyses.

Een half-automatische aanpak wordt echter ook vaak gebruikt, bijvoorbeeld met snelle (< 300 ms) machine-gecontroleerde naald verlagen samenvallen met de verhoging van de druk van de injectie, zodat de naald moet alleen worden gepositioneerd boven elke cel voorafgaand aan de respectieve injectie. Het slagingspercentage van half-automatische injecties is per definitie lager is dan de manuele aanpak die hierboven beschreven, gewoon omdat het is geoptimaliseerd voor snelheid, gevolgd door analyse van meerdere cellen die met succes deze behandeling overleefde; dus afhankelijk het niet is van succesvolle injectie van een afzonderlijke cel. Dus, in tegenstelling tot de eencellige analyse, half-automatische injecties zijn beter geschikt voor het analyseren van de gevolgen van de injectie van meerdere honderd cellen, bijvoorbeeld door videomicroscopie bij lage vergroting of op cel fixatie en kleuring. Los van de gedetailleerde benadering werkzaam, microinjection vormt geen een eindpunt assay, maar kan worden gecombineerd met een scala aan technieken, waaronder FRAP of photoactivation3.

Bij het bepalen van de Verwerkingsfrequentie van de eiwitten door FRAP, de intensiteit van de laser moet worden geoptimaliseerd, afhankelijk van de setup en imaging voorwaarden van Microscoop (vergroting, doelstellingen, enz., evenals het celtype, structuur en fluorescente proteïne voor photobleaching). Merk op dat op optimale laser kracht, efficiënt bleken wordt gecombineerd met de minste mogelijke photodamage, om krimp te voorkomen of tot intrekking van de structuur onder de analyse (bijvoorbeeld lamellipodia of filopodia) of zelfs schade op cellulair niveau te voltooien. In het ideale geval moet ten minste 70-80% van het bleken van efficiëntie worden bereikt, hoewel volledige bleken gehinderd zou kan worden door zeer snel omzet van het eiwit, in dat geval iets meer dan 50% ook acceptabel wellicht. Optimale bleken power voor een bepaalde structuur en fluorescente kleurstof moet experimenteel worden getest, vanaf een lage laser macht gevolgd door de geleidelijke verhoging. Natuurlijk, elke fluorescente kleurstof kan per definitie worden gebleekt met laserlicht dicht bij het hoogtepunt van excitatie (488 nm voor veelgebruikte groene kleurstoffen zoals FITC of EGFP). Echter lasers met kortere golflengtes, zoals in de buurt van-UV lasers, leveren hogere machten en kunnen dus ook worden gebruikt voor het efficiënt bleken van gebruikte kleurstoffen. Routinematig hanteren wij een 405 nm diodelaser (120 mW) voor het bleken van EGFP zowel rode fluorescente kleurstoffen (zoals mCherry), zij het met iets lagere efficiëntie in het geval van de laatste (gegevens niet worden weergegeven). Aangezien de 405 nm-diode kan ook worden gebruikt voor photoactivation van PA-GFP (zie hieronder), schenkt het dit systeem met maximale flexibiliteit.

Voor de B16-F1 cel structuren en fluorescente proteïnen photobleached hier, werden 405 nm-laser bevoegdheden tussen 65-100 mW toegepast. Wanneer het analyseren van een photobleached-regio, is het belangrijk om te overwegen of de gegeven structuur behouden in haar oorspronkelijke vorm over de analyse periode blijft. Bijvoorbeeld, bij het analyseren van omzet van eiwitten op lamellipodia tips, moet worden gewaakt of de kromming van de lamellipodia is ingrijpend veranderd na verloop van tijd, zoals veranderingen in kromming zou kunnen tot onnauwkeurige resultaten leiden als de regio/contour geanalyseerd niet volledig omvatten het geheel van de structuur in elk gemeten frame. Bovendien moet opgemerkt worden dat bundels ingebed in lamellipodia, zoals microspikes, afwijkingen in de intensiteit van de fluorescentie kunnen veroorzaken. Zoals geïllustreerd in Figuur 2b (witte pijl in 9 s tijdsbestek), een microspike-achtige structuur is gelegen naast de gemeten photobleached regio, maar blijft buiten het tijdens de gehele duur van de meting, en dus niet leidt tot een onnauwkeurigheid. Voor analyse van eiwit omzet zijn belangrijke overwegingen bij het selecteren van de locatie en grootte van regio's geanalyseerd dat hun fluorescentie na verloop van tijd moet niet worden aanzienlijk beïnvloed door veranderingen in de morfologie van de cel of factoren anders dan hard om te voorkomen dat overname photobleaching. Bijvoorbeeld, moeten structuren bieden belangrijke kwantitatieve bijdrage aan de geanalyseerde structuur niet verplaatsen uit de gemeten regio tijdens de analyse; Bovendien moeten ongerelateerde, fluorescerend entiteiten zoals vesiculaire structuren die het aantrekken van het eiwit niet invoeren van het veld van belang tijdens de analyse. Voor de bepaling van het tarief van lamellipodial actine polymerisatie, moet worden gezorgd dat geen oprollen benodigde of ruffling (dat wil zeggen, omhoog vouwen) lamellipodia worden geanalyseerd, aangezien dit de nauwkeurigheid van de resultaten sterk beïnvloedt. Daarnaast retractie van lamellipodial regio's kan worden weergegeven als snel naar achteren translocatie, potentieel leidt tot overschatting van de tarieven van lamellipodial actine polymerisatie. Een extra overweging is de afstand van intracellulaire normalisatie regio's (genomen als referentie posities voor de correctie van overname photobleaching) van de huidige positie van photobleaching, die moet groot genoeg zijn om directe beïnvloeden door het photobleached-gebied.

Bij het opzetten van optimale voorwaarden voor de photoactivation van PA-GFP-gelabeld constructies, moet worden gezorgd om te voorkomen dat onmiddellijke bleken tijdens photoactivation. In ons werk, de beste resultaten werden verkregen met laser bevoegdheden 5 - 10 keer lager dan normaal werknemer voor het bleken van EGFP. Voor image aquisition van photoactivated moleculen, moeten belichtingstijd tijdsinterval tussen frames worden geoptimaliseerd door gezien de omvang van de regio's en structuren als photoactivated en geanalyseerd, evenals de potentiële mobiliteit van photoactivated eiwitten naar andere subcellular locaties. Wat betreft alle soorten fluorescentie imaging is onderhoud van de levensvatbaarheid van de cellen cruciaal voor het verkrijgen van fysiologisch relevante resultaten.

In principe, groen-naar-rood photoconversion van fluorescente proteïnen zoals mEos of Dronpa varianten12 vormt een even krachtige methode van volgende dynamiek en omzet van subcellular structuren zoals de lamellipodium (Zie bijvoorbeeld Burnette et al. 23). het voordeel van de laatste methode in tegenstelling tot PA-GFP zou de mogelijkheid te volgen van eiwit dynamics vóór en na de conversie met twee verschillende kleuren, zonder de noodzaak om mede express een extra rode fluorescerende eiwit. Echter in onze voorbereidende experimenten was de mate van verandering van contrast en intensiteit van fluorescent signaal bereikt op de photoactivation van PA-GFP groter in vergelijking met photoconverted de sondes, misschien als gevolg van de superieure spectrale kenmerken van groen versus rood fluorescerende sondes (gegevens niet worden weergegeven). In ieder geval zijn gedetailleerde studies over het actine-filament omzet in cel-rand uitsteeksels zoals lamellipodia of Vaccinia virus-geïnduceerde actine staarten tot nu toe alleen gepubliceerd met behulp van de PA-GFP derivaten5,6,24.

Bij het overwegen welke cel regio te analyseren na photoactivation, verschillende factoren moeten rekening worden gehouden, die worden besproken met behulp van dit specifieke voorbeeld (opneming van actine monomeren aan de rand van de cel na activatie in het cytosol), maar zeker kunnen worden geëxtrapoleerd naar verschillende analoog wetenschappelijke problemen. Eerst meten wanneer het tarief van lamellipodial opneming van cytosolically photoactivated eiwitten, bijvoorbeeld in verschillende experimentele omstandigheden (zoals in Dimchev et al. 6), maten van cytosolische regio's en hun afstanden naar lamellipodial randen vergelijkbaar moeten zijn tussen experimentele groepen. Het is ook belangrijk om te overwegen dat wanneer photoactivating cytosolische regio's, de dikte van de cel groter in standpunten dichter aan de kern is. Activeren van dikkere cellulaire gebieden kan leiden tot hogere bedragen van geactiveerde eiwitten, gezien het feit dat de verdeling van de proteïne worden geactiveerd wordt homogeen verspreid in het cytosol. Ten slotte, uitdrukking niveaus van de proteïne worden geactiveerd kunnen ongetwijfeld zeer variabel in afzonderlijke cellen. Als gevolg van al deze overwegingen van variabiliteit is het van cruciaal belang om te vergelijken opneming niveaus van cytosolically geactiveerd eiwitten elders in de cel ten opzichte van de totale fluorescentie verkregen na activatie in de specifieke regio's.

Wij hebben beschreven hoe microinjection kan worden gebruikt als een hulpmiddel voor het onderzoeken van de effecten van eiwitten op cel morfologie en hebben dit geïllustreerd door aan te tonen de potente inductie van lamellipodial structuren in de cellen van de fibroblast microinjected met NIH3T3 de kleine GTPase Rac1. Wij hebben deze techniek te mengen met Arp2/3 functie in de cellen met het domein van de C-terminal WCA voor litteken/WAVE3microinjected eerder toegepast. Verschillende parameters in de microinjected cellen kunnen door andere testen, zoals FRAP of photoactivation worden geanalyseerd. Wij hebben beschreven hoe FRAP en photoactivation kunnen worden gebruikt voor het onderzoeken van de dynamiek van de subcellular en mobiliteit van actine monomeren. FRAP is gebruikt door onze fractie eerder5 te onderzoeken van de omzet van eiwitten aan lamellipodia, zoals VASP Abi, cortactin, cofilin, lokaliseren en eiwit aftopping, of voor het ophelderen van de omzet van componenten in focal verklevingen in de aanwezigheid en de afwezigheid van Rac signalering4. Bovendien meten van actine polymerisatie tarieven kan worden bereikt door photobleaching EGFP-gelabeld β-actine5, maar alternatieve methoden bestaan. Fluorescerende inhomogeneities bijhouden, zoals gezien door de levende cel imaging-compatibele sondes labeling van cellulaire actine-filamenten, zoals Lifeact25, ook kan werknemer6,26. Het voordeel hier is dat de overexpressie van β-actine worden, vermeden kan die in staat van toenemende cel rand uitsteeksel en migratie is en dus potentieel interfereert met de specifieke bepaling of experimentele vraag (Zie bijvoorbeeld Kage et al. 26; Peckham et al. 27). een duidelijke nadeel van de Lifeact sonde vormt echter de snelle aan/uit de kinetiek van de binding met door samensmelting van filamenten actine, zodat alleen op de omzet van de sonde, bleken van actine-filament structuren gelabeld door Lifeact in cellen informatie maar niet de omzet van de actine-filamenten, waarnaar het bindt25. Het volgen van fluorescentie inhomogeneities dienst eerder6,26 biedt een praktisch compromis, veel lijkt op het gebruikte volgen van fluorescentie spikkels opgenomen in draadvormige cytoskeletal structuren (Zie bijvoorbeeld zalm en Waterman28), maar kan niet zo ongecompliceerd om te gebruiken en zo exact FRAP van EGFP-gelabeld F-actine structuren. Photoactivation is voor het inschatten van de tarieven van monomeer actine opneming in uitstekende lamellipodia, evenals de mobiliteit in het cytosol, in het kader van experimenteel tuned cytosolische F-actine niveaus6door ons toegepast. De techniek is handig als behandeling van mobiliteit en distributie van eiwitten afkomstig van relatief grote gebieden, zoals cytosolische regio's. Behandeling van de verdeling van de eiwitten echter afgeleid van relatief kleine photoactivated structuren; bijvoorbeeld groei kegels misschien wel uitdagend vanwege de lage aantallen van fluorescerende moleculen geactiveerd, zwakke signalen, en dus gebrek aan gevoeligheid. Mogelijke alternatieve technieken om photoactivation of photoconversion voor fluorescentie (zie hierboven) kunnen omvatten inverse FRAP, die op photobleaching de gehele cel behalve de ROI steunt, gevolgd door het bijhouden van de mobiliteit van fluorescerende moleculen weg van deze regio. De techniek vereist geen overexpressing photoactivatable versies van eiwitten, maar altijd blootstelling aan een ongebruikelijk hoge dosis van laser macht, mogelijk veroorzaakt ongewenste bijwerkingen zoals photodamage zal betrekken.

Duidelijk, photoactivation en FRAP kan geen onderscheid maken of eiwitten als monomeren, dimeren of zelfs kleine oligomeren evolueren, en of ze bewegen in combinatie met extra bindende partners. Dergelijke informatie kan worden verkregen in plaats daarvan fluorescentie correlatie spectroscopie technieken29 of, subsidiair, FLIM-FRET30. FRAP en photoactivation vormen echter eenvoudig benaderingen om te beoordelen direct de dynamiek van de lokale en globale eiwitten in cellen, ongeacht de proteïne van belang, subcellular locatie of celtype studeerde.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Wij zijn dankbaar aan de Duitse Research Foundation (DFG) voor financiële steun (grant Nr. RO2414/5-1 te KR).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
B16-F1 mouse skin melanoma cells  American Type Culture Collection, Manassas, VA CRL-6323
NIH-3T3 cells American Type Culture Collection, Manassas, VA CRL-1658
DMEM 4.5g/L glucose  Life Technologies, Thermno Fisher Scientific, Germany 41965-039
Ham’s F-12 medium Sigma-Aldrich N8641
Fetal calf serum  (FCS) PAA Laboratories, Linz, Austria A15-102
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich, Germany F7524 Lot054M3396
MEM Non essential amino acids  Gibco, ThermoFisher Scientific, Germany 11140035
L-Glumatine 200mM (100x) Life Technolgies 25030-024
Pen-Strep 5000 U/mL Life technologies 15070063
Sodium Pyruvate (100 mM) Gibco, ThermoFisher Scientific, Germany 11360-039
Laminin Sigma-Aldrich L-2020
Laminin coating buffer  Self-made: 50mM Tris ph7.4, 150mM NaCl
Fibronectin from human plasma  Roche Diagnostics, Mannheim, Germany 11 051 407 001
Jetpei Polyplus Transfection, Illkirch, France 101-10N
JetPei buffer Polyplus Transfection, Illkirch, France 702-50 150mM NaCl
PA-GFP-actin plasmid DNA  described in Koestler et al.2008
pEGFP-actin plasmid DNA Clontech, Mountain View, CA, USA
Rac1 protein for microinjection Purified as GST-tagged version, and cleaved from GST prior to injection
Microinjection buffer Self-made: 100mM NaCl, 50mM Tris-HCl ph7.5, 5mM MgCl2, 1mM DTT
Dextran, Texas Red, 70,000 MW, Lysine Fixable Molecular Probes, Thermno Fisher Scientific, Germany D1864
Microscope circular cover glasses 15mm, No.1  Karl Hecht, Aisstent, Sondheim, Germany 1001/15
Eppendorf Femtotips Microloader Tips Eppendorf, Hamburg, Germany 5242 956 003
Eppendorf Femtotip Microinjection Capillary Tips Eppendorf, Hamburg, Germany 930000035
Silicone Grease  ACC Silicones, Bridgewater, England SGM494
Aluminium Open Diamond Bath Imaging Chamber Warner instruments RC-26
Automatic temperature controller Warner Instruments TC-324B
Microscope: Axio Observer  Carl Zeiss, Jena, Germany
CoolSnap-HQ2 camera  Photometrics, Tucson, AZ
Lambda DG4 light source  Sutter Instrucment, Novato, CA
Laser source  Visitron Systems
Eppendorf FemtoJet microinjector  Eppendorf, Hamburg, Germany With built-in compressor for pressure supply
Nikon Narishige Micromanipulator system Nikon Instruments, Japan
Visiview software v2.1.4 Visitron Systems, Puchheim, Germany
Metamorph software v7.8.10 Molecular Devices, Sunnyvale, CA
Sigma Plot v.12 Systat Software Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).
  2. Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
  3. Koestler, S. A., et al. Arp2/3 complex is essential for actin network treadmilling as well as for targeting of capping protein and cofilin. Mol Biol Cell. 24 (18), 2861-2875 (2013).
  4. Steffen, A., et al. Rac function is crucial for cell migration but is not required for spreading and focal adhesion formation. J Cell Sci. 126, Pt 20 4572-4588 (2013).
  5. Lai, F. P., et al. Arp2/3 complex interactions and actin network turnover in lamellipodia. EMBO J. 27 (7), 982-992 (2008).
  6. Dimchev, G., et al. Efficiency of lamellipodia protrusion is determined by the extent of cytosolic actin assembly. Mol Biol Cell. 28 (10), 1311-1325 (2017).
  7. Koppel, D. E., Axelrod, D., Schlessinger, J., Elson, E. L., Webb, W. W. Dynamics of fluorescence marker concentration as a probe of mobility. Biophys J. 16 (11), 1315-1329 (1976).
  8. Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).
  9. McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nat Methods. 6 (2), 131-133 (2009).
  10. Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).
  11. Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging. Trends Cell Biol. 19 (11), 555-565 (2009).
  12. Kremers, G. J., Piston, D. Photoconversion of purified fluorescent proteins and dual-probe optical highlighting in live cells. J Vis Exp. (40), (2010).
  13. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Preparation of slides and coverslips for microscopy. CSH Protoc. 2008, 4988 (2008).
  14. Small, J. V., Rottner, K. Actin-based Motility. Carlier, M. F. , Springer. Dordrecht. (2010).
  15. Kaverina, I., et al. Enforced polarisation and locomotion of fibroblasts lacking microtubules. Curr Biol. 10 (12), 739-742 (2000).
  16. Small, J., Rottner, K., Hahne, P., Anderson, K. I. Visualising the actin cytoskeleton. Microsc Res Tech. 47 (1), 3-17 (1999).
  17. Mikhailov, A. V., Gundersen, G. G. Centripetal transport of microtubules in motile cells. Cell Motil Cytoskeleton. 32 (3), 173-186 (1995).
  18. Rottner, K., Behrendt, B., Small, J. V., Wehland, J. VASP dynamics during lamellipodia protrusion. Nat Cell Biol. 1 (5), 321-322 (1999).
  19. Svitkina, T. M., et al. Mechanism of filopodia initiation by reorganization of a dendritic network. J Cell Biol. 160 (3), 409-421 (2003).
  20. Small, J. V., Isenberg, G., Celis, J. E. Polarity of actin at the leading edge of cultured cells. Nature. 272 (5654), 638-639 (1978).
  21. Dang, I., et al. Inhibitory signalling to the Arp2/3 complex steers cell migration. Nature. 503 (7475), 281-284 (2013).
  22. Anderson, K. I., Cross, R. Contact dynamics during keratocyte motility. Curr Biol. 10 (5), 253-260 (2000).
  23. Burnette, D. T., et al. A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells. Nat Cell Biol. 13 (4), 371-381 (2011).
  24. Humphries, A. C., et al. Clathrin potentiates vaccinia-induced actin polymerization to facilitate viral spread. Cell Host Microbe. 12 (3), 346-359 (2012).
  25. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  26. Kage, F., et al. FMNL formins boost lamellipodial force generation. Nat Commun. 8, 14832 (2017).
  27. Peckham, M., Miller, G., Wells, C., Zicha, D., Dunn, G. A. Specific changes to the mechanism of cell locomotion induced by overexpression of beta-actin. J Cell Sci. 114, Pt 7 1367-1377 (2001).
  28. Salmon, E. D., Waterman, C. M. How we discovered fluorescent speckle microscopy. Mol Biol Cell. 22 (21), 3940-3942 (2011).
  29. Machan, R., Wohland, T. Recent applications of fluorescence correlation spectroscopy in live systems. FEBS Lett. 588 (19), 3571-3584 (2014).
  30. Becker, W. Fluorescence lifetime imaging--techniques and applications. J Microsc. 247 (2), 119-136 (2012).

Tags

Biologie kwestie 135 Microinjection FRAP photoactivation PA-GFP met actine lamellipodium cytoskelet migratie
Micromanipulation technieken waardoor analyse van morfogenetische dynamiek en een omzet van Cytoskeletal regelgevers
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dimchev, G., Rottner, K.… More

Dimchev, G., Rottner, K. Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators. J. Vis. Exp. (135), e57643, doi:10.3791/57643 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter