我们描述了微和 photomanipulation 技术, 如酶和 photoactivation 如何能够确定运动参数和蛋白质在迁移细胞内的时空动力学。实验读数包括亚细胞动力学和运动调节器的更替或底层肌动蛋白骨架。
研究蛋白质的时空动力学可以揭示它们在不同语境中的功能重要性。本文讨论了漂白 (酶) 和 photoactivation 技术后荧光恢复方法在亚细胞位置蛋白质时空动力学研究中的应用。我们还展示了这些技术如何能够直接确定与肌动蛋白骨架调节和细胞运动有关的各种参数。此外, 细胞的显微注射还被描述为一种替代疗法 (可能之前或补充上述 photomanipulation 技术), 以触发移位蛋白对细胞的瞬时影响形态和功能。微操作系统, 如蛋白质注射或局部应用血浆膜通透性药物或骨架抑制剂, 可以作为一个强有力的工具, 以记录特定治疗的直接后果的细胞行为在单细胞和亚细胞水平。这是在这里的例子, 立即诱导 lamellipodial 细胞边缘突出的注射重组 Rac1 蛋白, 建立了一个季度前。此外, 我们提供了一个协议, 以确定增强的绿色荧光蛋白 (EGFP)-虚拟的营业额, 肌动蛋白长丝聚合酶显著积累在 lamellipodial 提示 B16-F1 细胞, 使用酶和包括相关数据分析和曲线拟合。我们还提出了评估 lamellipodial 肌动蛋白网络聚合速率的指导原则, 如表达 EGFP 标记β肌动蛋白的细胞所示。最后, 给出了如何调查细胞胞浆内肌动蛋白单体流动率的指示, 其次是肌动蛋白在快速灯丝组装部位的 lamellipodia, 如突出的小贴士, 使用 photoactivation方法。这些协议都不限于肌动蛋白细胞骨架的成分或调节器, 但可以很容易地扩展到类似的方式探索蛋白质在不同亚细胞结构或功能中的时空动力学和功能上下文。
在细胞和分子生物学的许多领域中, 监测蛋白质和其他分子的时空动力学已经成为一个必不可少的工具。先进的荧光显微技术包括荧光共振能量转移 (烦恼) 和焦虑荧光寿命成像 (烦恼-电影), 或酶, 荧光损失漂白 (翻转) 和 photoactivation 以及许多其他允许对于蛋白质-蛋白质相互作用的时空跟踪, 构象的变化, 以及在细胞1,2中确定不同蛋白质的扩散和定位的动力学。酶和 photoactivation 技术, 特别是, 广泛适用于检查调节肌动蛋白细胞骨架和细胞迁移。这些技术可以单独应用或与附加的微操作系统技术 (如显微注射 3) 结合使用, 并涉及荧光标记蛋白的表达.它们允许将蛋白质联想的动力学估计为参与细胞迁移的富含肌动蛋白的结构, 如丝状伪足或 lamellipodia、病灶粘连中蛋白质的更替4或分支肌动蛋白网络 5.它们还能确定 lamellipodial 肌动蛋白聚合速率, 单体肌动蛋白在细胞质内的分散度, 亚细胞肌动蛋白单体易位率在突出lamellipodia6和其他参数。
酶是一种可视化和量化在活细胞内蛋白质流动性的方法, 最初在二十世纪七十年代由阿克塞尔罗德7开发。一个在细胞内的感兴趣区域 (ROI), 用荧光标记的蛋白质填充, 瞬时暴露在高强度的激光中, 足以导致在给定的短时间内对该区域中的荧光分子进行漂白。在漂白过程中, 未漂白的、荧光标记的蛋白质, 会根据它们的时空动力学, 扩散和渗透到漂白的区域, 从而导致 photobleached 分子随着时间的推移而迁移。漂白地区荧光回收率的大小取决于各种因素, 包括给定分子的扩散率和传播速率, 以及在假定相关的漂白结构中的更替率。因此, 可溶性蛋白质将通过扩散迅速地在漂白的 ROI 中调节荧光的恢复, 而与结构紧密相关的蛋白质, 如焦粘连, 将有更长的周转时间, 因为它们的荧光恢复将依赖于蛋白质可溶性分数的扩散和结构相关分数的离解-联想动力学。荧光恢复通常是获得和量化, 直到初始水平的前漂白强度的荧光达到。但是, 如果初始荧光强度的一部分属于所谓的不动分数, 则无法通过扩散补充或以非常慢的速率补充, 而与包括移动的大多数分子相比, 这种情况不会发生。分数。为了确定蛋白质更替率, 酶曲线的产生, 代表了荧光恢复的程度随着时间的推移。从这些恢复曲线可以计算蛋白质回收率的平均半倍。通过创建平均酶数据的曲线拟合, 进而进行数学分析, 也可以推断流动分数的平均周转率是否构成一个分子的均匀种群的组合, 或者它是否由两个或更多的分子亚群在不同的速率翻转。除了通过定量方法估计蛋白质周转率外, 跟踪 lamellipodia 中 photobleached 区域的恢复也可以精确量化 lamellipodial 运动参数, 如逆行流、突起、和肌动蛋白聚合速率。因此, 酶构成了一种多功能工具, 用于评估活细胞结构中的各种参数。
Photoactivation 是一种用于跟踪来自指定细胞位置的蛋白质或分子的扩散和流动性的方法。例如, 该技术采用了一种野生型绿色荧光蛋白 (GFP) 的变体, 最初由帕特森和利平科特8开发, 这种变异方式使其荧光在接触到紫外线 (紫外线) 光 (大约400毫微米; 这里, 405 毫微米)。正如帕特森et al所描述的, 野生型 GFP 染色体作为中性酚类和阴离子 phenolates 的混合种群存在, 其产生的吸光度峰值约为 397 nm, 较小的是 475 nm。在紫外光照射下, 种群经历 photoconversion, 向阴离子形态转移。当兴奋 488 nm, photoconverted/光活化作用蛋白表现出3倍的荧光增加, 在实践中缺乏区分激活和非活化 GFP 由于高内在背景荧光。然而, 通过在 GFP 序列中引入单一氨基酸突变 (在位置 203), 降低了背景强度。由此产生的 T203H 突变体, 也称为 photoactivatable-gfp (PA-gfp) 的特点是显著降低了小峰的吸光度, 这在辐照与紫外线照射后增加近100倍, 随后激发 488 nm 光。因此, 过度表达的 PA-GFP 标记蛋白是一种广泛使用的方法, 它允许测定分子在细胞内的扩散和运动。我们以前应用了 PA-GFP 标记肌动蛋白, 以确定肌动蛋白单体分散的速率从胞浆区域, 不仅允许探索他们的流动性在细胞质, 而且他们的合并率到突出lamellipodial 肌动蛋白网络6。最近的文献还介绍了新颖的, 可转换的蛋白质, 原则上可以使用类似的方式, 但窝藏潜在的优势已经可见, 在照片转换之前。这组荧光蛋白的例子包括 Dendra2 和 mEos29,10,11,12。
在本文中, 我们解释了 microinjecting 细胞与蛋白质的方法。我们进一步解释了这项技术如何与酶结合, 通过漂白蛋白参与肌动蛋白细胞骨架调节和运动, 以及如何酶曲线和半时间恢复的移动分数可以获得。此外, 我们提供了一个例子, 酶技术如何可以用来确定肌动蛋白聚合速率的 lamellipodial 网络。我们还提供有关如何执行 photoactivation 实验的指示和提示, 可用于确定单体肌动蛋白的胞浆流动性和肌动蛋白在 lamellipodia 中的比例。当然, 这些技术不仅限于跟踪肌动蛋白骨架成分, 而且在可能需要适度的适应或优化的情况下, 可以广泛应用于其他细胞类型或研究不同的蛋白质、结构和参数。
在这里, 我们讨论了本文所描述的技术中的关键步骤, 以及如何在不同的实验条件下优化它们的应用。
显微注射是一种方法, 可用于监测细胞的即时效应, 从引进外源蛋白, 抑制剂, 或药物。它可以特别有利于确定蛋白质的功能在困难的染细胞类型或在情况下, 长期表达不需要。必须指出的是, 某些细胞类型的存活取决于它们所播种的细胞外基质。大多数内皮, 上皮, 或成纤维细胞类, 甚至小的像鱼基质 (见当et 等人21和安德森和交叉22) 可以成功地注入。然而, 也有一些例外, 例如在层粘连蛋白上播种的 B16-F1 细胞, 它构成了一个优良的细胞迁移模型系统, 但与这种类型的基质注射不相容, 原因不明。对于 NIH3T3 成纤维细胞, 我们通常在纤维粘连蛋白基底上进行注射, 以及其他 photomanipulation 技术, 如酶 (即使有 photoactivation; 在此显示的 B16-F1 细胞) 可以同样良好地执行在这些成纤维细胞 (见例如,Köstler et 。3). 还必须考虑到, 不同的蛋白质, 根据其功能特性和实验目标, 可能需要不同的时间来引起变化, 从几秒钟到几小时不等。该技术的优点是, 在使用质粒转染时, 在单细胞水平比例如更精确地控制外源剂的用量/浓度。此外, 荧光标记的蛋白质是不必要的, 以保证其存在的细胞, 这可以增加灵活性, 如果同时多通道可视化其他荧光标签的蛋白质是必需的。显微注射对于分析特定蛋白质或蛋白质混合物对细胞形态或细胞骨架的动态变化的即时影响特别有用 (例如,. 21 Arp2/3 复合抑制剂 Arpin 对迁移的即时影响示例)。技术的缺点是它的侵袭性, 可能导致细胞损伤或影响细胞形态学。因此, 在执行 microinjections 时, 一个重要的考虑因素是监测细胞的生存能力。此处介绍的方法依赖于手动操作。在测试的条件, 以配合成功的注射, 如成纤维细胞生长在纤维连接层, 这里所描述的手动注射协议允许近100% 成功率;这是必要的, 当结合这种方法与复杂和耗时的后续实验, 包括视频显微镜或酶, 如以前发布的3。这并不排除偶尔, 个别细胞可能会遭受微注射事件, 这可以被安全地识别的突然变化, 细胞核和细胞质的对比, 其次是细胞边缘退缩。这样罕见的实验性案例被排除并且因而不考虑为进一步分析。
然而, 半自动方法也通常被使用, 例如使用快速 (< 300 ms) 机器控制的针降低与射入压力增量重合, 因此针只必须在每个细胞之上被安置在各自之前注射。半自动注射的成功率低于上面描述的人工方法, 这仅仅是因为它对速度进行了优化, 接着分析了成功地在这种治疗中幸存下来的多个细胞;因而它不依靠成功的射入单独细胞。因此, 相对于单细胞分析, 半自动注射更适合分析数个百细胞的注射效果,例如,通过视频显微镜在低放大率或在细胞固定和染色。无论采用何种详细的方法, 显微注射都不构成终点化验, 但可以结合多种技术, 包括酶或 photoactivation3。
当通过酶确定蛋白质周转率时, 必须优化激光强度, 具体取决于显微镜的设置和成像条件 (放大、目标、等, 以及细胞类型、结构和荧光蛋白等。漂白)。请注意, 在最佳激光功率下, 高效漂白与最小可能的光损伤相结合, 以避免在分析 (例如, lamellipodia 或丝状伪足) 中的结构收缩或完全收缩, 甚至在细胞层面上造成损害。理想的情况是, 至少70–80% 的漂白效率应该达到, 虽然完全漂白可能会受到极快的蛋白质周转的阻碍, 在这种情况下, 任何50% 以上的东西也可以接受。对给定结构和荧光染料的最佳漂白功率应进行实验测试, 从低激光功率开始, 然后逐渐增加。当然, 任何荧光染料可以根据定义被漂白与激光接近其峰值的励磁 (488 毫微米为常用的绿色染料, 如 FITC 或 EGFP)。然而, 波长较短的激光, 如近紫外激光器, 提供了更高的功率, 因此也可用于有效漂白常用染料。我们通常使用405纳米二极管激光器 (120 兆瓦) 漂白的 EGFP 和红色荧光染料 (如 mCherry), 虽然其效率略低的情况下 (不显示数据)。由于405纳米二极管也可以用于 photoactivation (见下文), 它赋予这个系统最大的灵活性。
对于 B16-F1 细胞结构和荧光蛋白 photobleached, 在65–100兆瓦之间应用了405纳米激光功率。在分析 photobleached 区域时, 重要的是要考虑给定的结构是否保留在其原始形状上。例如, 在分析 lamellipodia 尖端蛋白质的周转时, 应注意 lamellipodia 的曲率是否随着时间的推移而显著改变, 因为如果分析的区域/轮廓不完全包含整个结构在每个被测量的框架。此外, 应该指出, 嵌入到 lamellipodia 中的捆绑, 如 microspikes, 可能会导致荧光强度的偏差。如图 2b (在9的时间帧中为白色箭头) 所示, 一个类似 microspike 的结构位于测量的 photobleached 区域的旁边, 但在整个测量期间仍处于外部, 因此不会导致任何误差。对于蛋白质周转的分析, 在选择分析区域的位置和大小时, 重要的考虑因素是它们的荧光随时间变化不应受到细胞形态学或其它因素的改变的显著影响, 而不是很难避免购置漂白。例如, 对所分析结构提供大量定量贡献的结构, 在分析过程中不应脱离实测区域;此外, 不相关的, 荧光实体, 如水泡结构, 吸引蛋白质不应该进入兴趣领域的分析。为确定 lamellipodial 肌动蛋白聚合的速率, 应注意不要对缩回或梳理 (即,向上折叠) lamellipodia 进行分析, 因为这将强烈影响结果的准确性。此外, lamellipodial 地区的退缩可能会出现快速向后移位, 有可能导致高估 lamellipodial 肌动蛋白聚合速率。另外考虑的是细胞内正常化区域的距离 (作为获取漂白校正的参考位置) 从漂白的实际位置, 应该足够大, 以避免直接photobleached 地区的影响。
在建立 photoactivation 绿色荧光标记结构的最佳条件时, 应注意避免 photoactivation 中的瞬时漂白。在我们的工作中, 获得的最佳结果是激光功率低于通常使用的 EGFP 漂白的5-10 倍。对于光活化作用分子的图像获取, 应通过考虑要光活化作用和分析的区域和结构的大小以及光活化作用的潜在移动性来优化帧间的曝光时间和时间间隔。蛋白质到其他亚细胞位置。对于所有类型的荧光成像, 维持细胞的生存能力是至关重要的获得生理相关的结果。
原则上, 荧光蛋白 (如 mEos 或 Dronpa 变体) 的绿-红 photoconversion 是一种同样强大的方法, 跟随 lamellipodium 的亚细胞结构的动态和更替 (见 例如,Burnette et 。23). 后一种方法相对于 PA-GFP 的优势是在转换前后采用两种不同颜色的蛋白质动力学的可能性, 而不需要共同表达额外的红色荧光蛋白。然而, 在我们的初步实验中, 与 photoconverted 探针相比, 在 photoactivation 上实现的荧光信号的对比度变化和强度更大, 可能是由于绿色与红色的优越光谱特征。荧光探针 (未显示数据)。在任何情况下, 对肌动蛋白长丝周转的详细研究, 如 lamellipodia 或痘苗病毒诱导的肌动蛋白的尾巴迄今只发表了使用 PA-GFP 衍生物5,6,24。
在考虑哪一个细胞区域来分析以下 photoactivation 时, 应该考虑几个因素, 这是用这里所示的具体例子来讨论的 (在细胞质激活后, 在细胞边缘加入肌动蛋白单体), 但当然可以推断出各种类似的科学问题。首先, 当测量 cytosolically 光活化作用蛋白的 lamellipodial 合并率时, 例如, 在不同的实验条件下 (如Dimchev et 所示)。6), 胞浆区域的大小及其与 lamellipodial 边缘的距离应在实验组之间比较。同样重要的是, 当 photoactivating 胞浆区域时, 细胞厚度在靠近细胞核的位置更大。激活较厚的细胞区域可能导致更多的活化蛋白, 因为在细胞质中 homogenously 分布的蛋白质的分布。最后, 被激活的蛋白质的表达水平在个体细胞肯定是高度可变的。由于所有这些可变性的考虑, 重要的是要比较在细胞中其他地方的 cytosolically 活化蛋白相对于在特定区域激活后获得的总荧光的合并水平。
我们已经描述了如何使用显微注射作为一个工具, 以调查蛋白质对细胞形态学的影响, 并表明了这一点, 证明了有效诱导 lamellipodial 结构在 NIH3T3 成纤维细胞杏仁与小 GTPase Rac1。我们以前应用这一技术来干扰细胞中的 Arp2/3 功能杏仁与 C 终端 WCA 领域的疤痕/波3。杏仁细胞中的各种参数可以通过其他的化验方法来分析, 如酶或 photoactivation。我们描述了酶和 photoactivation 如何用于研究肌动蛋白单体的亚细胞动力学和流动性。我们的小组以前使用过酶5来调查定位到 lamellipodia 的蛋白质的更替情况, 如虚拟、Abi、cortactin、cofilin 和上限蛋白, 或用于阐明在存在中的病灶粘连中成分的更替情况。和没有 Rac 信号4。此外, 测量肌动蛋白聚合速率可以通过漂白 EGFP 标记的β肌动蛋白5来完成, 但存在替代方法。跟踪荧光不均匀性的实时细胞成像-兼容探针标记细胞肌动蛋白花丝,如Lifeact25, 也可以使用6, 26.这里的优点是可以避免β肌动蛋白的过度表达, 它能够增加细胞边缘突起和迁移, 从而可能干扰特定的化验或实验问题 (参见例如,凯奇et 。26;Peckham et 。27). 然而, Lifeact 探针的一个明显的缺点是它的快速的开/关动力学与肌动蛋白花丝结合, 因此, 在细胞中标记的肌动蛋白长丝结构的漂白只提供探针更替的信息,但不是肌动蛋白花丝的营业额, 它绑定25。以前使用的荧光不均匀性的跟踪6, 26 确实提供了一个实际的折衷, 类似于广泛使用的跟踪荧光斑点纳入丝状骨架结构 (请参见例如鲑鱼和酶28), 但可能不像 EGFP 标记的 F 肌动蛋白结构那样直接使用和精确。Photoactivation 已经被我们应用于估计单体肌动蛋白在凸 lamellipodia 中的比例, 以及它在细胞质的移动, 在实验性地调整胞浆 F 肌动蛋白水平6。该技术在检查从相对较大的区域 (如胞浆区域) 衍生的蛋白质的流动性和分布方面是有用的。然而, 研究从相对较小的光活化作用结构中提取的蛋白质的分布;例如,由于激活的荧光分子数量少, 信号微弱, 因而缺乏灵敏度, 因此生长锥可能具有挑战性。荧光 photoactivation 或 photoconversion 的潜在替代技术 (见上文) 可能包括逆酶, 它依赖于漂白整个细胞, 除了 ROI, 然后跟踪荧光分子的流动性远离这个地区。该技术不需要 overexpressing photoactivatable 版本的蛋白质, 但将始终涉及暴露在异常高剂量的激光功率, 可能导致不必要的副作用, 如光损伤。
显然, photoactivation 和酶不能区分蛋白质是否作为单体、脂肪酸、甚至小的低聚物移动, 以及它们是否与附加的结合性伙伴相结合。这类信息可以通过荧光相关光谱学技术 (29 ) 来获得, 或者是电影-烦恼30。尽管如此, 酶和 photoactivation 是直接评估细胞内局部和全球蛋白质动态的简单方法, 而不管感兴趣的蛋白质、亚细胞位置或研究的类型。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢德国研究基金会 (DFG) 提供财政支持 (RO2414/5-1 给 KR)。
B16-F1 mouse skin melanoma cells | American Type Culture Collection, Manassas, VA | CRL-6323 | |
NIH-3T3 cells | American Type Culture Collection, Manassas, VA | CRL-1658 | |
DMEM 4.5g/L glucose | Life Technologies, Thermno Fisher Scientific, Germany | 41965-039 | |
Ham’s F-12 medium | Sigma-Aldrich | N8641 | |
Fetal calf serum (FCS) | PAA Laboratories, Linz, Austria | A15-102 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich, Germany | F7524 | Lot054M3396 |
MEM Non essential amino acids | Gibco, ThermoFisher Scientific, Germany | 11140035 | |
L-Glumatine 200mM (100x) | Life Technolgies | 25030-024 | |
Pen-Strep 5000 U/mL | Life technologies | 15070063 | |
Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco, ThermoFisher Scientific, Germany | 11360-039 | |
Laminin | Sigma-Aldrich | L-2020 | |
Laminin coating buffer | Self-made: 50mM Tris ph7.4, 150mM NaCl | ||
Fibronectin from human plasma | Roche Diagnostics, Mannheim, Germany | 11 051 407 001 | |
Jetpei | Polyplus Transfection, Illkirch, France | 101-10N | |
JetPei buffer | Polyplus Transfection, Illkirch, France | 702-50 | 150mM NaCl |
PA-GFP-actin plasmid DNA | described in Koestler et al.2008 | ||
pEGFP-actin plasmid DNA | Clontech, Mountain View, CA, USA | ||
Rac1 protein for microinjection | Purified as GST-tagged version, and cleaved from GST prior to injection | ||
Microinjection buffer | Self-made: 100mM NaCl, 50mM Tris-HCl ph7.5, 5mM MgCl2, 1mM DTT | ||
Dextran, Texas Red, 70,000 MW, Lysine Fixable | Molecular Probes, Thermno Fisher Scientific, Germany | D1864 | |
Microscope circular cover glasses 15mm, No.1 | Karl Hecht, Aisstent, Sondheim, Germany | 1001/15 | |
Eppendorf Femtotips Microloader Tips | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5242 956 003 | |
Eppendorf Femtotip Microinjection Capillary Tips | Eppendorf, Hamburg, Germany | 930000035 | |
Silicone Grease | ACC Silicones, Bridgewater, England | SGM494 | |
Aluminium Open Diamond Bath Imaging Chamber | Warner instruments | RC-26 | |
Automatic temperature controller | Warner Instruments | TC-324B | |
Microscope: Axio Observer | Carl Zeiss, Jena, Germany | ||
CoolSnap-HQ2 camera | Photometrics, Tucson, AZ | ||
Lambda DG4 light source | Sutter Instrucment, Novato, CA | ||
Laser source | Visitron Systems | ||
Eppendorf FemtoJet microinjector | Eppendorf, Hamburg, Germany | With built-in compressor for pressure supply | |
Nikon Narishige Micromanipulator system | Nikon Instruments, Japan | ||
Visiview software v2.1.4 | Visitron Systems, Puchheim, Germany | ||
Metamorph software v7.8.10 | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
Sigma Plot v.12 | Systat Software Inc. |