Vi beskriver hvordan mikro- og photomanipulation teknikker såsom FRAP og photoactivation aktiverer bestemmelse af motilitet parametre og spatiotemporelle dynamikken i proteiner inden for overflytning celler. Eksperimentelle udlæsninger omfatter subcellulært dynamics og omsætning af motilitet tilsynsmyndigheder eller de underliggende actin cytoskeleton.
Undersøge den spatiotemporelle dynamics af proteiner kan afsløre deres funktionelle betydning i forskellige sammenhænge. I denne artikel er det diskuterede hvordan fluorescerende opsving efter photobleaching (FRAP) og photoactivation teknikker kan bruges til at studere proteiner subcellulært steder spatiotemporelle dynamik. Vi viser også, hvordan disse teknikker giver enkel bestemmelse af forskellige parametre knyttet til aktin cytoskeletal forordning og celle motilitet. Derudover er mikroinjektion af celler desuden beskrevet som en alternativ behandling (potentielt forud for eller supplerer de førnævnte photomanipulation teknikker) udløser øjeblikkelige virkninger af omplantede proteiner på celle morfologi og funktion. Micromanipulation såsom protein injektion eller lokale anvendelse af plasma membran-gennemtrængelige narkotika eller cytoskeletal hæmmere kan tjene som kraftfuldt værktøj til at registrere umiddelbare konsekvenser af en given behandling på celle adfærd på en enkelt celle og subcellulært niveau. Dette eksemplificeres her ved umiddelbar induktion af lamellipodial celle kant fremspring ved injektion af rekombinant protein, Rac1, som etablerede et kvart århundrede siden. Derudover giver vi en protokol til bestemmelse af omsætningen af forbedrede grøn fluorescerende proteiner (EGFP)-VASP, en actin glødetrådens polymerase fremtrædende akkumulere på lamellipodial tips B16-F1 celler, beskæftiger FRAP og herunder tilknyttede data analyse og kurve montering. Vi præsenterer også retningslinjer for beregning af satserne for lamellipodial actin netværk polymerisering, som eksemplificeret af celler, der udtrykker EGFP-tagged β-actin. Endelig er instruktioner givet for at undersøge priser af actin monomer mobilitet i cellen cytoplasma, efterfulgt af actin indarbejdelse på websteder af hurtige glødetrådens forsamling, som tips af fremspringende lamellipodia, ved hjælp af photoactivation tilgange. Ingen af disse protokoller er begrænset til komponenter og regulatorer af actin cytoskeleton, men kan nemt udvides til at udforske i analog mode spatiotemporelle dynamik og funktion af proteiner i forskellige forskellige subcellulært strukturer eller funktionelle sammenhænge.
Overvågning spatiotemporelle dynamikken i proteiner og andre molekyler i levende celler er blevet et vigtigt værktøj i mange områder af celle- og molekylærbiologi. Avanceret Fluorescens mikroskopi-teknikker herunder fluorescens resonans energioverførsel (FRET) og FRET-fluorescens levetid imaging (FRET-FLIM), eller FRAP, fluorescens tab i photobleaching (FLIP) og photoactivation samt mange andre tillader for den tidsmæssige og rumlige sporing af protein-protein interaktioner, konformationelle ændringer, samt bestemmelse af kinetik af diffusion og lokalisering af forskellige proteiner i cellen1,2. FRAP og photoactivation teknikker, navnlig er alment gældende for behandlingen af regulatorer af actin cytoskelettet og celle migration. Disse teknikker kan anvendes alene eller i kombination med yderligere micromanipulation teknikker såsom mikroinjektion3og inddrage udtryk af fluorescently mærket proteiner. De tillade vurdering af kinetik af protein association til aktin-rige strukturer involveret i celle migration, såsom filopodia eller lamellipodia, af proteiner i fokale sammenvoksninger4, omsætning eller forgrenet actin netværk5. De gør det også muligt bestemmelse af lamellipodial actin polymerisering priser, vurdering af spredningen af monomere actin i cytosol, sats af subcellulært actin monomer translokation til polymeriserende actin filamenter i fremspringende lamellipodia6, og andre parametre.
FRAP er en metode til at visualisere og kvantificering af proteiner i en levende celle, oprindelig udviklet i 1970 ‘ erne af Axelrod7mobilitet. En region af interesse (ROI) i en celle, befolket med fluorescently mærket proteiner, er forbigående udsat for en laser af høj intensitet, tilstrækkeligt til at forårsage blegning af fluorophore molekyler findes i denne region i en given kort periode. De ublegede, fluorescently mærket proteiner beliggende uden for ROI under blegning, vil diffuse og infiltrere den bleget region alt efter deres spatiotemporelle dynamics, forårsager forskydning af photobleached molekyler over tid. Af fluorescens dækningsgraden i bleget regioner er afhængige af forskellige faktorer, herunder størrelse og satsen for udbredelse af en given molekyle, og naturligvis dets omsætning sats inden for den formodede forbundet bleget struktur. Således opløselige proteiner vil mægle inddrivelse af fluorescens i bleget ROI hurtigt gennem diffusion, mens proteiner tæt forbundet med strukturer, som focal sammenvoksninger, vil have længere omsætning gange, som deres fluorescens recovery vil afhænger af både på udbredelsen af de opløselige brøkdel af den struktur-associerede fraktion protein og dissociation-foreningen kinetik. Fluorescens recovery er normalt erhvervet og kvantificeret indtil den første præ blegemiddel intensiteten af fluorescens nået. Dette forekommer dog ikke hvis en del af den oprindelige fluorescens intensitet tilhører den såkaldte immobile fraktion, som ikke skal genopfyldes ved diffusion eller er efterfyldning på meget langsomme satser i forhold til fleste af molekyler bestående af mobilen brøk. Bestem satsen af protein omsætning genereres FRAP kurver, der repræsenterer omfanget af fluorescens opsving over tid. Fra disse opsving kurver, kan halv-gennemsnitstider protein opsving beregnes. Ved at oprette kurven passer i den gennemsnitlige FRAP data, og dermed matematiske analyser, er det også muligt at udlede, hvorvidt den gennemsnitlige omsætning sats i den mobile brøk er sammensat af en homogen population af molekyler, eller om det er sammensat af to eller flere delpopulationer af molekyler drejning over til differentierede priser. Ud over estimering protein omsætning satser af kvantitative tilgange, kan tracking genopretning af photobleached områder i lamellipodia også tillade for nøjagtig kvantificering af lamellipodial motilitet parametre såsom retrograd flow, fremspring, og aktin polymerisering priser. FRAP udgør et alsidigt værktøj til at blive anvendt til at vurdere forskellige parametre inden for strukturer af levende celler.
Photoactivation er en metode til at spore diffusion og mobilitet af proteiner eller molekyler med oprindelse fra en udpeget cellular placering. Teknikken beskæftiger, for eksempel, en variant af grøn fluorescerende vildtypeprotein (NGL), oprindeligt udviklet af Patterson og Lippincott-Schwartz8, der er muteret på en måde, der tillader dens fluorescens øges stærkt ved udsættelse for ultraviolet (UV) lys (ca. 400 nm; her, 405 nm). Som beskrevet af Patterson mfl., wild-type normal god landbrugspraksis lysopfangende eksisterer som en blandet population af neutrale phenoler og anioniske phenolates, der producerer et større absorbans højdepunkt på ca 397 nm og en lille en på 475 nm, henholdsvis. Ved bestråling af proteinet med UV-lys gennemgår befolkningen photoconversion, skiftende retning af anioniske form. Når ophidset af 488 nm, photoconverted/photoactivated protein udstiller en 3-fold stigning i fluorescens, utilstrækkelig i praksis for at skelne mellem aktiveret og ikke-aktiveret normal god landbrugspraksis på grund af høj iboende baggrund fluorescens. Dog er der sket et fald i baggrunden intensitet ved at indføre en enkelt aminosyre mutation i normal god landbrugspraksis sekvens (histidin substitution på position 203). Den resulterende T203H mutant, også kendt som photoactivatable-normal god landbrugspraksis (PA-NGL) er karakteriseret ved en betydelig reduktion i absorbansen af den mindre peak, som ved bestråling med UV-lys er steget næsten 100 når efterfølgende ophidset af 488 nm lys. Overekspression af PA-normal god landbrugspraksis-tagged proteiner er derfor en udbredte tilgang, som giver mulighed for bestemmelse af diffusion og motilitet af molekyler i celler. Vi har tidligere anvendt PA-normal god landbrugspraksis-tagged actin Bestem satsen for spredning af actin monomerer fra cytosole regioner, giver ikke kun udforskning af deres mobilitet inden for cytosol, men også deres iblanding i den fremspringende lamellipodial actin netværk6. Nyere litteratur beskriver også roman, foto-cabriolet proteiner, som i princippet kan bruges på en tilsvarende måde, men husly den potentielle fordel for at være synlige allerede før foto-konvertering. For denne gruppe af fluorescerende proteiner eksempler Dendra2 og mEos29,10,11,12.
I denne artikel vil forklare vi metode af microinjecting celler med proteiner. Vi forklare yderligere, hvordan denne teknik kan kombineres med FRAP, af photobleaching proteiner involveret i actin cytoskeleton forordning og motilitet, og hvordan FRAP kurver og halv-time inddrivelse af mobile fraktioner kan udledes. Derudover giver vi et eksempel på hvordan FRAP teknik kan bruges til at bestemme actin polymerisering satser af lamellipodial netværk. Vi leverer også vejledning og tips om hvordan man udfører photoactivation eksperimenter, som kan bruges til at bestemme cytosole mobilitet af monomere actin og priser af actin indarbejdelse i lamellipodia. Disse teknikker er naturligvis ikke kun begrænset til sporing af actin cytoskeleton komponenter, men potentielt kræves moderat tilpasning eller optimering, kan i vid udstrækning anvendes til andre celletyper eller at undersøge forskellige proteiner, strukturer, og parametre.
Her kan vi diskutere kritisk trin i de teknikker, der beskrives i denne artikel, og hvordan de kan være optimeret til anvendelse i forskellige forsøgsbetingelser.
Mikroinjektion er en metode, der kan anvendes til at overvåge i celler de instant effekter fra at indføre eksogene proteiner, hæmmere eller narkotika. Det kan være særlig fordelagtig for bestemmelse af funktionerne af proteinerne i vanskelige at transfect celletyper eller i situationer, hvor langsigtede udtryk ikke er ønsket. Det skal bemærkes, at overlevelsen af visse celletyper varierer afhængigt af den ekstracellulære matrix de udsås på. Mest endotel, epithelial eller fibroblast-lignende celletyper, selv små lide fisk keratocytes (Se Dang et al. 21 og Anderson og Cross22) kan sprøjtes med succes. Men der er undtagelser, såsom B16-F1 celler seedede på laminin, der udgør en fremragende modelsystem af celle migration, men er uforenelig med indsprøjtning på denne type af undergrundens af ukendt årsag. For NIH3T3 fibroblastceller udføre vi rutinemæssigt injektioner på fibronektin undergrundens og yderligere photomanipulation teknikker såsom FRAP (selv med photoactivation, vist for B16-F1 celler her) kan udføres lige så godt i disse fibroblaster (jf. f.eks. Köstler et al. 3). det skal også overvejes, at forskellige proteiner, ifølge deres funktionelle egenskaber og eksperiment mål, kan tage forskellige mængder af tid til at forårsage ændringer, varierende fra sekunder til timer. En fordel ved teknikken er, at dosis/koncentration af udefrakommende agent kan styres mere præcist på det enkelte celle niveau end f.eks., når du bruger plasmid Transfektion. Derudover er fluorescerende tagging af et protein ikke en nødvendighed for at sikre sin tilstedeværelse i den celle, som kan øge fleksibiliteten, hvis simultan multi-kanal visualisering af andre fluorescently markeret proteiner er nødvendige. Mikroinjektion kan være særligt nyttigt for analyse instant effekter af specifikke proteiner eller protein blandinger på dynamiske ændringer i celle morfologi eller cytoskeleton (fx Dang et al. 21 for et eksempel på instant effekter på migration af Arp2/3 komplekse hæmmer Arpin). En ulempe ved teknikken er dens invasionsevne, som kan forårsage celleskader eller påvirke celle morfologi. Derfor en vigtig overvejelse, når du udfører microinjections overvågning celle levedygtighed. Metoden indført her er afhængig af manuelle manipulation. I betingelser, der er testet til at være kompatibel med vellykket injektioner, såsom fibroblaster vokser på fibronektin undergrundens, tillader manuel injektion protokollen beskrevet her en i nærheden af 100% succesrate; Dette er afgørende, når du kombinerer denne tilgang med avancerede og tidskrævende opfølgende forsøg herunder video mikroskopi eller FRAP, som er offentliggjort tidligere3. Dette udelukker ikke, at lejlighedsvis, individuelle celler måske lider af en mikroinjektion begivenhed, som sikkert kan genkendes af pludselige ændringer i kontrast af både kernen og cytoplasmaet, efterfulgt af celle kant retraktion. Disse sjældne eksperimentelle tilfælde er udelukket, og således ikke anses for yderligere analyser.
Men en halv-automatiske tilgang er også almindeligt anvendt, for eksempel ansættelse af hurtige (< 300 ms) maskine-kontrolleret nål sænke sammenfaldende med indsprøjtning pres stigning, således at nålen kun skal være placeret over hver celle før respektive injektion. Succesraten for halv-automatiske injektioner er pr. definition lavere end den manuelle metode beskrevet ovenfor, blot fordi det er optimeret til hastighed, efterfulgt af en analyse af flere celler, der med held at overlevet denne behandling; Det er således ikke afhængig vellykket injektion af en enkelt celle. Derfor, i stedet for enkelt celle analyse, halv-automatiske injektioner er bedre egnet til at analysere injektion effekter af flere hundrede celler, fx af video mikroskopi ved lav forstørrelse eller celle fiksering og farvning. Uanset den detaljerede temacenter mikroinjektion udgør ikke en end-point assay, men kan kombineres med en række teknikker, herunder FRAP eller photoactivation3.
Ved fastsættelsen af protein omsætning sats af FRAP, intensiteten af laser skal optimeres, afhængigt af mikroskop setup og billeddannelse (forstørrelse, mål, etc., samt celletype, struktur og fluorescerende proteiner for photobleaching). Bemærk, at på optimal laser power, effektiv blegning er kombineret med den mindst mulige solskader, for at undgå svind eller komplet retraktion af struktur under analyse (f.eks. lamellipodia eller filopodia) eller endda skader på cellulært niveau. Ideelt set bør mindst 70 – 80% af blegning effektivitet opnået, selv om komplet blegning kan blive hæmmet af ekstremt hurtig omsætning af protein, i hvilket tilfælde, noget over 50% kan også være acceptable. Optimal blegning magt for en given struktur og fluorescerende farvestof bør afprøves eksperimentelt, starter fra et lavt laser power efterfulgt af sin gradvis stigning. Naturligvis, enhver fluorescerende farvestof kan pr. definition være bleget med laserlys tæt på dens højdepunkt af excitation (488 nm til ofte anvendte grønne farvestoffer såsom FITC eller EGFP). Men lasere med kortere bølgelængder, som nær-UV-lasere, levere højere magter og kan dermed også bruges til effektiv blegning af almindeligt anvendte farvestoffer. Vi rutinemæssigt anvender en 405 nm diodelaser (120 mW) til blegning af både EGFP og røde fluorescerende farvestoffer (f.eks mCherry), omend med lidt lavere effektivitet i tilfælde af den sidstnævnte (data ikke vist). Som 405 nm-diode kan også bruges til photoactivation af PA-normal god landbrugspraksis (se nedenfor), forlener det dette system med maksimal fleksibilitet.
405 nm-laser beføjelser mellem 65 – 100 mW blev anvendt for B16-F1 cellestrukturer og fluorescerende proteiner photobleached her. Når du analyserer en photobleached region, er det vigtigt at overveje, om den givne struktur er bevaret i sin oprindelige form over analysen tidsperiode. For eksempel, når du analyserer omsætning af proteiner i lamellipodia tips, bør sikres om krumning af lamellipodia er væsentligt ændret over tid, som ændringer i krumning kan føre til unøjagtige resultater, hvis region/contour analyseres ikke fuldt ud omfatte helhed i strukturen i hver målte ramme. Derudover skal det bemærkes, at bundter indlejret i lamellipodia, såsom microspikes, kan medføre afvigelser i fluorescens intensitet. Som illustreret i figur 2b (hvid pil i 9 s tidsramme), en microspike-lignende struktur er beliggende ved siden af den målte photobleached region, men forbliver uden for det i hele varigheden af måling, og dermed hidføre ikke hvilken som helst unøjagtighed. Vigtige overvejelser ved valg af placering og størrelse af analyserede regioner er for analyse af protein omsætning, at deres fluorescens over tid ikke bør blive betydeligt påvirket af ændringer i celle morfologi eller faktorer andet end hårdt at undgå Køb photobleaching. Eksempelvis bør strukturer yder betydelige kvantitative bidrag til de analyserede struktur ikke flytte ud af den målte region under analysen; Derudover bør uafhængige, fluorescerende enheder såsom vesikulære strukturer, som tiltrækker proteinet ikke indgå felt af interesse under analysen. For fastsættelsen af den lamellipodial actin polymerisering, bør sikres at analyseres ingen tilbagetrækningskraften eller ruffling (dvs. opad foldning) lamellipodia, som dette vil stærkt påvirker nøjagtigheden af resultaterne. Derudover retraktion af lamellipodial regioner vises måske som hurtige bageste translokation, potentielt fører til overvurdering af satserne for lamellipodial actin polymerisering. En ekstra overvejelse er afstanden af intracellulære normalisering regioner (taget som reference standpunkter til korrektion af erhvervelse photobleaching) fra den faktiske placering af photobleaching, som bør være stor nok til at undgå direkte indflydelse af photobleached området.
Når du opretter optimale betingelser for photoactivation af PA-normal god landbrugspraksis-tagged konstruktioner, udvises forsigtighed bør undgå instant blegning under photoactivation. I vores arbejde, de bedste resultater blev opnået med laser beføjelser 5 – 10 gange lavere end normalt ansat til blegning af EGFP. For image erhvervelse af photoactivated molekyler, bør eksponeringstid og tidsintervallet mellem rammer optimeres ved at overveje størrelsen af regioner og strukturer til at være photoactivated og analyseret, samt den potentielle mobilitet af photoactivated proteiner til andre subcellulært placeringer. Som for alle typer af fluorescens imaging er vedligeholdelse af cellernes levedygtighed afgørende for at opnå fysiologisk relevante resultater.
I princippet, grøn til rød photoconversion af fluorescerende proteiner som mEos eller Dronpa varianter12 udgør en lige så kraftfuld metode til følgende dynamics og omsætning af subcellulært strukturer som lamellipodium (Se f.eks. Burnette et al. 23). fordelen, at den sidstnævnte metode i modsætning til PA-normal god landbrugspraksis ville være mulighed for at følge protein dynamics før og efter konvertering med to forskellige farver, uden at skulle Co udtrykke en ekstra røde fluorescerende proteiner. I vores foreløbige eksperimenter var kontrast ændring omfang og intensitet af fluorescerende signal opnået ved photoactivation af PA-normal god landbrugspraksis dog større i forhold til photoconverted sonder, måske på grund af de overlegne spektrale beskrivere grønne versus rød fluorescerende sonder (data ikke vist). Under alle omstændigheder har detaljerede undersøgelser af actin glødetrådens omsætning i celle-kant fremspring såsom lamellipodia eller Vaccinia virus-induceret actin haler hidtil kun været udgivet ved hjælp af PA-normal god landbrugspraksis derivater5,6,24.
Når man overvejer hvilken celle region at analysere efter photoactivation, flere faktorer skal tages i betragtning, som er drøftet ved hjælp af det specifikke eksempel vist her (indarbejdelse af actin monomerer frontviden celle ved aktivering i cytosol), men kan helt sikkert ekstrapoleres til forskellige analoge videnskabelige problemer. Først, når måling sats lamellipodial indarbejdelse af cytosolically photoactivated proteiner, for eksempel, i forskellige eksperimentelle betingelser (som vist i Dimchev et al. 6), størrelser af cytosole regioner og deres afstande til lamellipodial kanter skal være sammenlignelige mellem eksperimentelle grupper. Det er også vigtigt at overveje, når photoactivating cytosole regioner, celle-tykkelsen er større i synspunkter tættere til kernen. Aktivering tykkere cellulære regioner kan resultere i større mængder af aktiverede proteiner, at fordelingen af protein skal aktiveres fordeles homogen måde i cytosol. Endelig kan udtrykket niveauer af protein skal aktiveres, helt sikkert være meget varierende i individuelle celler. Alle disse overvejelser af variation er det afgørende at sammenligne indarbejdelse niveauer af cytosolically aktiveret proteiner andetsteds i cellen i forhold til den samlede fluorescens opnået ved aktivering i specifikke regioner.
Vi har beskrevet hvordan mikroinjektion kan bruges som et redskab til at undersøge virkningerne af proteiner på celle morfologi og har illustreret dette ved at demonstrere den potente induktion af lamellipodial strukturer i NIH3T3 fibroblastceller microinjected med den små GTPase Rac1. Vi har tidligere anvendt denne teknik til at blande sig med Arp2/3 funktion i celler microinjected med C-terminale WCA domæne af Scar/bølge3. Forskellige parametre i microinjected celler kan analyseres af andre assays, såsom FRAP eller photoactivation. Vi har beskrevet, hvordan FRAP og photoactivation kan være ansat for at undersøge subcellulært dynamics og mobilitet af actin monomerer. FRAP er blevet brugt af vores gruppe tidligere5 at undersøge omsætning af proteiner lokalisering til lamellipodia, såsom VASP, Abi, cortactin, cofilin, og capping protein eller belyse omsætningen af komponenter i fokale sammenvoksninger i tilstedeværelsen og fravær af Rac signalering4. Desuden måler actin polymerisering satser kan ske ved photobleaching EGFP-tagged β-actin5, men findes alternative metoder. Sporing fluorescerende inhomogeneities som set af levende celle imaging-kompatible sonder mærkning cellular actin filamenter, såsom Lifeact25, kan også være ansat6,26. Fordelen her er at overekspression af β-actin kan undgås, som er i stand til at øge celle kant fremspring og migration, og dermed potentielt interfererer med den specifikke analyse eller eksperimenterende spørgsmål (Se fx Kage et al. 26; Peckham et al. 27). en klar ulempe for Lifeact sonde udgør imidlertid sin hurtig on/off kinetik af binding til actin filamenter, således at blegning af actin glødetrådens strukturer mærket af Lifeact i cellerne indeholder oplysninger kun på sonden omsætning, men ikke omsætning af actin filamenter, som binder den25. Sporing af fluorescens inhomogeneities ansat tidligere6,26 giver et praktisk kompromis, meget lig den udbredte sporing af fluorescens prikker indarbejdet i trådformede cytoskeletal strukturer (Se fx laks og Waterman28), men kan ikke være så ligetil at bruge og så præcis som FRAP af EGFP-mærkede F-actin strukturer. Photoactivation er blevet anvendt ved os til estimering satser af monomere actin indarbejdelse i fremspringende lamellipodia, såvel som dens mobilitet i hele cytosol, i forbindelse med eksperimentelt tuned cytosole F-actin niveauer6. Teknikken er nyttig, når undersøge mobilitet og fordeling af proteiner fremstillet af relativt store områder, såsom cytosole regioner. Imidlertid fremstillet undersøge fordelingen af proteiner af forholdsvis små photoactivated strukturer; fx vækst kegler kan være udfordrende på grund af lavt antal fluorescerende molekyler aktiveret, svage signaler og dermed manglende følsomhed. Mulige alternative teknikker til photoactivation eller photoconversion af fluorescens (se ovenfor) kan omfatte inverse FRAP, som bygger på photobleaching hele cellen undtagen ROI, efterfulgt af tracking mobilitet af fluorescerende molekyler væk fra denne region. Teknikken kræver ikke overekspression photoactivatable versioner af proteiner, men altid indebærer udsættelse for en usædvanlig høj dosis af laser power, potentielt forårsager uønskede bivirkninger såsom solskader.
Klart, photoactivation og FRAP ikke kan skelne om proteiner er på vej som monomerer, dimerer eller selv små oligomerer, og om de flytter i kombination med yderligere bindende partnere. Oplysninger af denne art kan fås i stedet fra fluorescens korrelations-spektroskopi teknikker29 eller, alternativt, FLIM-FRET30. Ikke desto mindre udgør FRAP og photoactivation ligetil tilgange for at vurdere direkte lokale og globale protein dynamics i celler, uanset protein af interesse, subcellulært placering eller celletype studerede.
The authors have nothing to disclose.
Vi er taknemmelige til tyske Research Foundation (DFG) for økonomisk støtte (støtte Nr. RO2414/5-1 til KR).
B16-F1 mouse skin melanoma cells | American Type Culture Collection, Manassas, VA | CRL-6323 | |
NIH-3T3 cells | American Type Culture Collection, Manassas, VA | CRL-1658 | |
DMEM 4.5g/L glucose | Life Technologies, Thermno Fisher Scientific, Germany | 41965-039 | |
Ham’s F-12 medium | Sigma-Aldrich | N8641 | |
Fetal calf serum (FCS) | PAA Laboratories, Linz, Austria | A15-102 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich, Germany | F7524 | Lot054M3396 |
MEM Non essential amino acids | Gibco, ThermoFisher Scientific, Germany | 11140035 | |
L-Glumatine 200mM (100x) | Life Technolgies | 25030-024 | |
Pen-Strep 5000 U/mL | Life technologies | 15070063 | |
Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco, ThermoFisher Scientific, Germany | 11360-039 | |
Laminin | Sigma-Aldrich | L-2020 | |
Laminin coating buffer | Self-made: 50mM Tris ph7.4, 150mM NaCl | ||
Fibronectin from human plasma | Roche Diagnostics, Mannheim, Germany | 11 051 407 001 | |
Jetpei | Polyplus Transfection, Illkirch, France | 101-10N | |
JetPei buffer | Polyplus Transfection, Illkirch, France | 702-50 | 150mM NaCl |
PA-GFP-actin plasmid DNA | described in Koestler et al.2008 | ||
pEGFP-actin plasmid DNA | Clontech, Mountain View, CA, USA | ||
Rac1 protein for microinjection | Purified as GST-tagged version, and cleaved from GST prior to injection | ||
Microinjection buffer | Self-made: 100mM NaCl, 50mM Tris-HCl ph7.5, 5mM MgCl2, 1mM DTT | ||
Dextran, Texas Red, 70,000 MW, Lysine Fixable | Molecular Probes, Thermno Fisher Scientific, Germany | D1864 | |
Microscope circular cover glasses 15mm, No.1 | Karl Hecht, Aisstent, Sondheim, Germany | 1001/15 | |
Eppendorf Femtotips Microloader Tips | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5242 956 003 | |
Eppendorf Femtotip Microinjection Capillary Tips | Eppendorf, Hamburg, Germany | 930000035 | |
Silicone Grease | ACC Silicones, Bridgewater, England | SGM494 | |
Aluminium Open Diamond Bath Imaging Chamber | Warner instruments | RC-26 | |
Automatic temperature controller | Warner Instruments | TC-324B | |
Microscope: Axio Observer | Carl Zeiss, Jena, Germany | ||
CoolSnap-HQ2 camera | Photometrics, Tucson, AZ | ||
Lambda DG4 light source | Sutter Instrucment, Novato, CA | ||
Laser source | Visitron Systems | ||
Eppendorf FemtoJet microinjector | Eppendorf, Hamburg, Germany | With built-in compressor for pressure supply | |
Nikon Narishige Micromanipulator system | Nikon Instruments, Japan | ||
Visiview software v2.1.4 | Visitron Systems, Puchheim, Germany | ||
Metamorph software v7.8.10 | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
Sigma Plot v.12 | Systat Software Inc. |