Descriviamo come tecniche di micro – e photomanipulation come FRAP e fotoattivazione permettono la determinazione dei parametri di motilità e la dinamica spazio-temporale delle proteine all’interno di migrazione delle cellule. Letture sperimentali includono subcellulare dinamiche e fatturato dei regolatori della motilità o del citoscheletro di actina sottostante.
Esaminando la dinamica spazio-temporale delle proteine può rivelare loro importanza funzionale in vari contesti. In questo articolo, è discusso come fluorescente recupero dopo photobleaching (FRAP) e tecniche di fotoattivazione può essere utilizzato per studiare la dinamica spazio-temporale delle proteine nelle posizioni sottocellulari. Mostriamo anche come queste tecniche consentono la semplice determinazione di vari parametri collegati all’actina del citoscheletro regolamento cellulare motilità e. Inoltre, il microinjection delle cellule inoltre è descritto come un trattamento alternativo (potenzialmente precede o integrando le tecniche suddette photomanipulation) a grilletto effetti istantanei delle proteine spostati sulla cella morfologia e funzione. Micromanipolazione come proteina iniezione o l’applicazione locale di farmaci membrana plasmatica-permeabile o inibitori del citoscheletro può servire come potente strumento per registrare le conseguenze immediate di un dato trattamento il comportamento delle cellule presso la singola cella e subcellulare livello. Questo è esemplificato qui da induzione immediata della sporgenza bordo di lamellipodial delle cellule tramite l’iniezione di proteine ricombinanti di Rac1, come stabilito un quarto di secolo fa. Inoltre, mettiamo a disposizione un protocollo per la determinazione del fatturato di migliorata della proteina fluorescente verde (EGFP)-VASP, una polimerasi del filamento di actina prominente accumulando alle punte di lamellipodial delle cellule B16-F1, impiegando FRAP e compresi dati associati analisi e adattamento della curva. Siamo presenti anche linee guida per la stima dei tassi di polimerizzazione di rete lamellipodial dell’actina, come esemplificato dalle cellule che esprimono EGFP-Tag β-actina. Infine, le istruzioni sono date per come analizzare i tassi di mobilità di monomero di actina all’interno del citoplasma delle cellule, seguito dall’incorporazione di actina in siti di Assemblea del filamento rapida, ad esempio le punte sporgenti lamellipodi, utilizzando fotoattivazione si avvicina. Nessuno di questi protocolli è limitata ai componenti o regolatori del citoscheletro, ma può essere facilmente esteso per esplorare in moda analoga la dinamica spazio-temporale e funzione delle proteine in varie strutture subcellulari differenti o funzionale contesti.
Monitoraggio la dinamica spazio-temporale delle proteine e altre molecole nelle cellule viventi è diventato uno strumento essenziale in molti campi della biologia cellulare e molecolare. Tecniche di microscopia compreso trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET) e la durata di FRET-fluorescenza (FRET-FLIM) di imaging avanzate di fluorescenza, o consentire FRAP, perdita di fluorescenza in photobleaching (FLIP) e fotoattivazione, così come molti altri per il temporale e spaziale di rilevamento delle interazioni proteina-proteina, cambiamenti conformazionali, nonché su come determinare la cinetica di diffusione e localizzazione delle proteine differenti in cella1,2. FRAP e fotoattivazione tecniche, in particolare, sono ampiamente applicabili per l’esame i regolatori della migrazione delle cellule e del citoscheletro di actina. Queste tecniche possono essere applicate da solo o in combinazione con tecniche di micromanipolazione aggiuntive quali microiniezione3e coinvolgono l’espressione delle proteine fluorescente etichettati. Consentono la valutazione della cinetica di associazione di proteine actina ricche strutture coinvolte nella migrazione cellulare, ad esempio filopodi o lamellipodi, il fatturato delle proteine in adesioni focali4, o ramificata actina reti5. Essi consentono anche la determinazione dei tassi di polimerizzazione dell’actina lamellipodial, la valutazione della dispersione di actina monomerica nel citosol, il tasso di traslocazione monomero subcellulare actina polimerizzazione filamenti dell’actina in sporgenti lamellipodi6e altri parametri.
FRAP è un metodo per visualizzare e quantificare la mobilità delle proteine all’interno di una cellula vivente, originariamente sviluppato nel 1970 da Axelrod7. Una regione di interesse (ROI) all’interno di una cella, popolata con proteine fluorescente identificate, transitoriamente è esposto ad un laser di alta intensità, sufficiente a causare lo sbiancamento delle molecole fluoroforo presenti in questa regione durante un dato periodo breve di tempo. La greggia, fluorescente etichettato proteine localizzate all’esterno il ROI durante lo sbiancamento, diffusa e infiltrarsi regione sbiancata in funzione della loro dinamica spazio-temporale, causando lo spostamento di molecole photobleached nel tempo. Il tasso di recupero di fluorescenza in regioni sbiancate dipende da vari fattori, tra cui le dimensioni e il tasso di diffusione di una data molecola, e naturalmente suo tasso di fatturato entro il presunto associato struttura sbiancato. Così, proteine solubili medierà il recupero della fluorescenza all’interno il ROI sbiancato rapidamente attraverso la diffusione, mentre proteine strettamente associate a strutture, quali adesioni focali, avrà tempi più lunghi di fatturato, così come loro recupero di fluorescenza dipendono entrambi sulla diffusione della frazione solubile della proteina e dissociazione-associazione cinetica della frazione struttura-collegata. Recupero di fluorescenza è solitamente acquisita e quantificato fino a quando non viene raggiunto il livello iniziale di pre-candeggina intensità di fluorescenza. Tuttavia, questo non si verifica se una parte dell’intensità di fluorescenza iniziale appartiene alla cosiddetta frazione immobile, che è in grado di essere rifornito tramite diffusione o è reintegro al prezzo molto lento rispetto la maggior parte delle molecole che comprende il mobile frazione. Per determinare il tasso di turnover delle proteine, FRAP curve sono generate, che rappresenta il grado di fluorescenza recupero nel corso del tempo. Da queste curve di recupero, metà-tempi medi di recupero della proteina possono essere calcolati. Con la creazione si adatta curva del medio FRAP dati e analisi quindi matematiche, è anche possibile dedurre se il tasso di turnover medio della frazione mobile costituisce un composito di una popolazione omogenea di molecole, o se è composto da due o più sottopopolazioni di molecole girarsi al differenziale di prezzo. Oltre alla stima di tassi di turnover delle proteine dopo approcci quantitativi, il recupero delle regioni photobleached lamellipodi di rilevamento può anche permettere per quantificazione accurata dei parametri di motilità di lamellipodial come flusso retrogrado, protrusione, e tassi di polimerizzazione dell’actina. Così, FRAP costituisce uno strumento versatile per essere applicato per valutare diversi parametri all’interno delle strutture delle cellule viventi.
Fotoattivazione è un metodo utilizzato per rilevare la diffusione e la mobilità delle proteine o molecole provenienti da una posizione cellulare designata. La tecnica utilizza, per esempio, una variante del selvaggio-tipo proteina fluorescente verde (GFP), inizialmente sviluppata da Patterson e Lippincott-Schwartz8, che è mutato in un modo che permette la sua fluorescenza altamente essere aumentato sopra l’esposizione ad luce ultravioletta (UV) (circa 400 nm; qui, 405 nm). Come descritto da Patterson et al., cromofori GFP wild type esistano come una popolazione mista di fenoli neutri e phenolates anionici, che producono un picco di assorbanza principali a circa 397 nm e una minore a 475 nm, rispettivamente. All’irradiazione della proteina con luce UV, la popolazione subisce fotoconversione, spostando verso la forma anionica. Quando sono eccitati da 488 nm, la proteina di photoconverted/fotoattivazione esibisce un aumento di 3 volte in fluorescenza, insufficiente in pratica per distinguere tra non attivati e GFP dovuto la fluorescenza di fondo intrinseco elevato. Tuttavia, una diminuzione nell’intensità di sfondo è stata realizzata con l’introduzione di una mutazione di singolo amminoacido nella sequenza di GFP (sostituzione dell’istidina alla posizione 203). Il mutante di T203H risultante, anche conosciuto come fuse-GFP (PA-GFP) è caratterizzata da una riduzione significativa di assorbanza del picco minore, che al momento di irradiazione con luce UV è aumentato quasi 100 volte quando successivamente eccitato dalla luce di 488 nm. Quindi, l’iperespressione delle proteine PA-GFP-etichettato è un approccio ampiamente utilizzato, che permette la determinazione di diffusione e la motilità delle molecole all’interno delle cellule. In precedenza abbiamo applicato PA-GFP-etichettato di actina per determinare il tasso di dispersione di monomeri di actina via dalle regioni citosoliche, permettendo non solo l’esplorazione della loro mobilità all’interno del citosol, ma anche il loro tasso di incorporazione in sporgente l’actina lamellipodial rete6. Letteratura più recente descrive anche proteine romanzo, foto-convertibile che possono essere utilizzate in maniera analoga, in linea di principio ma che harboring il vantaggio potenziale per essere visibili già prima della conversione di foto. Gli esempi per questo gruppo di proteine fluorescenti includono Dendra2 e mEos29,10,11,12.
In questo articolo, spiegheremo la metodologia delle cellule microinjecting con proteine. Abbiamo ulteriormente spiegare come questa tecnica può essere combinata con FRAP, di photobleaching proteine coinvolte nella regolazione del citoscheletro di actina e la motilità, e come può essere derivati FRAP curve e metà-tempo di recupero delle frazioni mobile. Inoltre, forniamo un esempio di come la tecnica FRAP può essere utilizzata per determinare i tassi di polimerizzazione dell’actina di lamellipodial reti. Forniamo anche le istruzioni e suggerimenti su come eseguire esperimenti di fotoattivazione, che possono essere utilizzati per determinare la mobilità citosolico di actina monomerica e tassi di incorporazione dell’actina lamellipodi. Queste tecniche, naturalmente, non sono solo limitati a rilevamento dei componenti del citoscheletro di actina, ma al momento potenzialmente richiesto adattamento moderato o ottimizzazione, può essere ampiamente applicato ad altri tipi di cella o per indagare le diverse proteine, strutture, e parametri.
Qui discutiamo passaggi critici nelle tecniche descritte in questo articolo, e come possono essere ottimizzati per l’applicazione in differenti condizioni sperimentali.
Microiniezione è un metodo che può essere applicato per monitorare in cellule effetti istantanei da introdurre proteine esogene, inibitori o farmaci. Può essere particolarmente vantaggioso per determinare le funzioni delle proteine nelle difficili a transfect tipi cellulari o nelle situazioni in cui espressione a lungo termine non è desiderato. Si deve constatare che la sopravvivenza di alcuni tipi di cellule varia a seconda della matrice extracellulare che sono seminati su. Più delle cellule endoteliali, epiteliali o fibroblasto-come tipi, anche piccoli come keratocytes di pesce (Vedi Dang et al. 21 e Anderson e croce22) può essere iniettati con successo. Tuttavia, ci sono eccezioni, come cellule B16-F1 seminate su laminina, che costituiscono un sistema eccellente modello di migrazione delle cellule, ma non sono compatibili con iniezione su questo tipo di substrato per motivo sconosciuto. Per le cellule dei fibroblasti NIH3T3, eseguiamo regolarmente iniezioni su substrato di fibronectina e photomanipulation ulteriori tecniche come FRAP (anche con fotoattivazione; indicato per cellule B16-F1 qui) può essere eseguita ugualmente bene in questi fibroblasti (Vedi ad esempio, Köstler et al. 3). si deve anche considerare che le proteine differenti, secondo le loro proprietà funzionali e gli obiettivi dell’esperimento, potrebbero richiedere diverse quantità di tempo per causare i cambiamenti, variando da secondi a ore. Un vantaggio della tecnica è che la dose/concentrazione di agente esogeno può essere controllata con maggiore precisione a livello di singola cellula rispetto ad esempio, quando si utilizza la transfezione di plasmide. Inoltre, etichettatura fluorescente di una proteina non è una necessità per garantire la sua presenza nella cellula, che può aumentare la flessibilità se simultanea visualizzazione multi-canale di altre proteine fluorescente-tag è necessaria. Microiniezione può essere particolarmente utile per analizzare gli effetti immediati di specifiche proteine o miscele della proteina su cambiamenti dinamici della morfologia delle cellule o del citoscheletro (es., Dang et al. 21 per un esempio di effetti istantanei sulla migrazione dall’inibitore complesso Arp2/3 Arpin). Uno svantaggio della tecnica è la sua invasività, che può causare danni alle cellule o influenzare la morfologia delle cellule. Di conseguenza, una considerazione importante quando si eseguono microiniezioni sta monitorando l’attuabilità delle cellule. Il metodo introdotto qui si basa sulla manipolazione manuale. In condizioni testate per essere compatibile con iniezioni di successo, come i fibroblasti che cresce su substrato di fibronectin, il protocollo di iniezione manuale descritto qui permette un tasso di successo del 100% nei pressi; Questo è essenziale quando si combinano questo approccio con gli esperimenti di follow-up sofisticati e richiede molto tempo tra cui video microscopia o FRAP, come pubblicato in precedenza3. Ciò non esclude che occasionalmente, singole celle potrebbero soffrire di un evento di microiniezione, che possa essere riconosciuto in modo sicuro da improvvisi cambiamenti di contrasto del nucleo e del citoplasma, seguita da retrazione del bordo di cella. Questi rari casi sperimentali sono esclusi e quindi non considerati per ulteriori analisi.
Tuttavia, un approccio semi-automatico è inoltre comunemente usato, per esempio impiegando rapida (< 300 ms) macchina controllata dell'ago abbassamento coincidente con aumento della pressione di iniezione, che l'ago deve essere posizionato sopra ogni cella prima del rispettivo iniezione. Il tasso di successo delle iniezioni semiautomatica è per definizione inferiore rispetto all'approccio manuale descritto in precedenza, semplicemente perché è ottimizzato per la velocità, seguita da analisi di più celle che con successo è sopravvissuto questo trattamento; così esso non si basa sull'iniezione di successo di una singola cella. Pertanto, al contrario di analisi unicellulare, semi-automatico iniezioni sono più adatte per analizzare gli effetti della iniezione di parecchie centinaia cellule, ad esempio, mediante video microscopia ad ingrandimento basso o su richiesta di fissazione delle cellule e la macchiatura. Qualunque sia l’approccio dettagliato impiegato, microinjection non costituisce un’analisi di punto finale, ma può essere combinato con una varietà di tecniche, tra cui FRAP o fotoattivazione3.
Quando si determina il tasso di turnover proteico da FRAP, l’intensità del laser deve essere ottimizzato, a seconda delle condizioni di installazione e la formazione immagine del microscopio (ingrandimento, obiettivi, ecc., così come il tipo di cella, la struttura e la proteina fluorescente per photobleaching). Si noti che alla potenza ottimale del laser, candeggio efficiente è combinato con il photodamage meno possibile, per evitare il restringimento o completare la retrazione della struttura sotto analisi (ad es., lamellipodi o filopodi) o persino danni a livello cellulare. Idealmente, almeno il 70 – 80% di efficienza di sbiancamento deve essere raggiunto, anche se lo sbiancamento completo può essere ostacolato da estremamente rapido turnover della proteina, in cui caso, nulla oltre il 50% potrebbe anche essere accettabile. Potenza candeggina ottimale per una determinata struttura e tintura fluorescente deve essere testata sperimentalmente, a partire da una potenza di laser a basso seguita da suo aumento graduale. Naturalmente, qualsiasi colorante fluorescente può per definizione essere sbiancato con luce vicino al suo picco di eccitazione laser (488 nm per coloranti utilizzati di frequente verde ad esempio FITC o EGFP). Tuttavia, laser con lunghezze d’onda più corta, come il vicino-UV laser, fornire potenze superiori e quindi può essere utilizzato anche per lo sbiancamento efficiente di coloranti comunemente utilizzati. Impieghiamo ordinariamente un diodo laser 405 nm (120 mW) per il candeggio di EGFP e rosse tinture fluorescenti (ad esempio mCherry), seppur con efficienza leggermente inferiore nel caso di quest’ultimi (dati non mostrati). Come il 405 nm-diodo può anche essere usato per fotoattivazione di PA-GFP (Vedi sotto), dota di questo sistema con massima flessibilità.
Per le strutture delle cellule B16-F1 e proteine fluorescenti photobleached qui, 405 potenze laser nm tra 65 – 100 mW sono state applicate. Quando si analizza una regione di photobleached, è importante considerare se la struttura specificata è conservata nella sua forma originale sopra l’analisi periodo di tempo. Per esempio, quando si analizza il turnover delle proteine alle punte di lamellipodi, prestare attenzione se la curvatura di lamellipodi è alterata significativamente nel corso del tempo, come cambiamenti nella curvatura potrebbero portare a risultati imprecisi se il regione/contorno analizzato non comprendere pienamente la totalità della struttura in ogni fotogramma misurato. Inoltre, dovrebbe essere notato che fasci incorporati in lamellipodi, come microspikes, potrebbero causare deviazioni nell’intensità di fluorescenza. Come illustrato nella Figura 2b (freccia bianca nel lasso di tempo s 9), una struttura microspike è situata vicino alla regione della photobleached misurato, ma rimane di fuori di esso per tutta la durata della misura e pertanto non causa qualsiasi inesattezza. Per l’analisi del turnover delle proteine, considerazioni importanti quando selezionando la posizione e le dimensioni di analizzato regioni sono che loro fluorescenza nel corso del tempo non dovrebbe essere significativamente influenzato dai cambiamenti nella morfologia delle cellule o fattori diversi da quelli duramente per evitare acquisizione photobleaching. Per esempio, strutture che forniscono quantitativo significativo contributo alla struttura analizzata non devono muoversi fuori della regione di misurata durante l’analisi; Inoltre, entità indipendenti, fluorescenti quali strutture vescicolari che ottenere la proteina non dovrebbe entrare nel campo di interesse durante l’analisi. Per determinare il tasso di polimerizzazione dell’actina lamellipodial, dovrebbe prestare attenzione che non retrattile o Scapigliatura (cioè, verso l’alto pieghevole) lamellipodi sono analizzati, come questo influenzerà fortemente la precisione dei risultati. Inoltre, retrazione delle regioni lamellipodial potrebbe essere visualizzato come rapido spostamento all’indietro, potrebbe condurre alla sopravvalutazione dei tassi di polimerizzazione dell’actina di lamellipodial. Un’ulteriore considerazione è la distanza delle regioni di normalizzazione intracellulare (preso come posizioni di riferimento per la correzione di acquisizione photobleaching) dalla posizione effettiva di photobleaching, che dovrebbe essere abbastanza grandi per evitare diretto influenza della zona di photobleached.
Quando si impostano le condizioni ottimali per fotoattivazione di costrutti di PA-GFP-etichettato, si dovrebbe prestare attenzione per evitare lo sbiancamento immediato durante la fotoattivazione. Nel nostro lavoro, i risultati migliori sono stati ottenuti con potenze laser 5 – 10 volte inferiore a quello normalmente impiegato per lo sbiancamento di EGFP. Per acquisizione di immagini di molecole di fotoattivazione, tempo di esposizione e intervallo di tempo tra i fotogrammi dovrebbe essere ottimizzati considerando la dimensione delle regioni e delle strutture per essere fotoattivazione e analizzati, così come la mobilità potenziale di fotoattivazione proteine ad altre posizioni sottocellulari. Per quanto riguarda tutti i tipi di formazione immagine di fluorescenza, manutenzione di attuabilità delle cellule è fondamentale per l’ottenimento di risultati fisiologicamente rilevanti.
In linea di principio, verde-rosso fotoconversione di proteine fluorescenti come mEos o Dronpa varianti12 costituisce un metodo altrettanto potente delle seguenti dinamiche e fatturato delle strutture subcellulari quali il lamellipodio (Vedi ad es., Burnette et al. 23). il vantaggio del metodo quest’ultimo al contrario di PA-GFP sarebbe la possibilità di seguire la dinamica di proteine prima e dopo la conversione con due colori distinti, senza la necessità di co-esprimono una proteina fluorescente rossa ulteriore. Tuttavia, nei nostri esperimenti preliminari, la portata del cambiamento di contrasto e l’intensità del segnale fluorescente raggiunto su fotoattivazione di PA-GFP era più grande rispetto alle sonde photoconverted, forse a causa delle caratteristiche spettrali superiore di verde contro rosso sonde fluorescenti (dati non mostrati). In ogni caso, studi dettagliati sul fatturato di filamento di actina in sporgenze di bordo di cella come lamellipodi o code di Vaccinia virus-indotta actina sono finora solo stati pubblicati utilizzando PA-GFP derivati5,6,24.
Quando si considera quale regione di cella per analizzare in seguito fotoattivazione, parecchi fattori dovrebbero essere tenuti conto, che sono discussi con lo specifico esempio mostrato qui (incorporazione di monomeri di actina al bordo delle cellule al momento dell’attivazione nel citosol), ma certamente possono essere estrapolati per vari problemi scientifici analoghi. In primo luogo, quando si misura il tasso di incorporazione di lamellipodial di cytosolically fotoattivazione di proteine, per esempio, in diverse condizioni sperimentali (come mostrato nella Dimchev et al. 6), dimensioni delle regioni citosoliche e loro distanze ai bordi di lamellipodial dovrebbero essere comparabili tra i gruppi sperimentali. È anche importante considerare che quando provveduto citosolico regioni, lo spessore delle cellule è maggiore in posizioni più vicino al nucleo. Attivazione cellulare più spessore regioni potrebbe comportare una maggiore quantità di proteine attivate, dato che la distribuzione della proteina deve essere attivato è distribuita omogeneamente nel citosol. Infine, i livelli di espressione della proteina deve essere attivato possono certamente essere altamente variabili in singole celle. A causa di tutte queste considerazioni di variabilità, è fondamentale confrontare i livelli di incorporazione di proteine cytosolically attivate altrove nella cella relativa la fluorescenza totale ottenuta al momento dell’attivazione in specifiche regioni.
Abbiamo descritto come microiniezione può essere utilizzato come strumento per indagare gli effetti delle proteine sulla morfologia delle cellule e questo hanno esemplificato dimostrando l’induzione potente delle strutture lamellipodial in NIH3T3 cellule del fibroblasto microiniettate con il piccolo GTPase Rac1. In precedenza abbiamo applicato questa tecnica per interferire con la funzione di Arp2/3 in cellule microiniettati con il dominio C-terminale WCA di Scar/WAVE3. Vari parametri in cellule iniettati possono essere analizzati da altri saggi, quali FRAP o fotoattivazione. Abbiamo descritto come FRAP e fotoattivazione può essere impiegata per investigare la dinamica subcellulare e mobilità di monomeri di actina. FRAP è stato utilizzato dal nostro gruppo in precedenza5 per indagare il fatturato delle proteine eseguendo la localizzazione lamellipodi, quali Abi, cortactin, VASP, cofilina e tappatura della proteina, o per il delucidamento il fatturato delle componenti in adesioni focali in presenza e assenza di Rac4di segnalazione. Inoltre, tassi di polimerizzazione dell’actina di misura può essere compiuta da photobleaching EGFP-Tag β-actina5, ma esistono metodi alternativi. Rilevamento delle disomogeneità fluorescente come visto dalle sonde di imaging-compatibile di cellule vive etichettatura filamenti dell’actina cellulare, ad esempio Lifeact25, può anche essere autonomo6,26. Il vantaggio è che la sovraespressione di β-actina può essere evitata, che è capace di aumentare la sporgenza del bordo di cella e migrazione e quindi potenzialmente interferisce con l’analisi specifica o la domanda sperimentale (Vedi ad es., Kage et al. 26; Peckham et al. 27). Tuttavia, un netto svantaggio della sonda Lifeact costituisce sua rapida accensione/spegnimento cinetica dell’associazione ai filamenti dell’actina, in modo che lo sbiancamento delle strutture di filamento di actina etichettati da Lifeact in cellule fornisce informazioni solo sul fatturato sonda, ma non il fatturato dei filamenti dell’actina, a cui si lega il25. Il tracciamento delle disomogeneità di fluorescenza precedentemente impiegato6,26 forniscono un compromesso pratico, molto simile al tracciamento ampiamente usato di fluorescenza macchioline incorporate in filamentose del citoscheletro strutture (Vedi ad es., salmone e Waterman28), ma non può essere come semplice da utilizzare e preciso come FRAP delle strutture di EGFP-etichetta F-actina. Fotoattivazione è stata applicata da noi per stimare i tassi di incorporazione di actina monomerica in sporgenti lamellipodi, come pure la sua mobilità in tutto il citosol, nel contesto di livelli di F-actina sperimentalmente sintonizzati citosolico6. La tecnica è utile quando esaminando la mobilità e la distribuzione delle proteine derivate da relativamente grandi aree, quali le regioni citosoliche. Tuttavia, esaminando la distribuzione delle proteine derivate da strutture di fotoattivazione relativamente piccola; ad esempio, i coni di crescita potrebbero essere impegnativi a causa del basso numero di molecole fluorescenti attivati, segnali deboli e così mancanza di sensibilità. Tecniche alternative potenziali di fotoattivazione o fotoconversione della fluorescenza (Vedi sopra) possono includere inverso FRAP, che si basa sul photobleaching l’intera cella tranne il ROI, seguito da rilevamento la mobilità delle molecole fluorescenti lontano da in questa regione. La tecnica non richiede che overexpressing fuse versioni delle proteine, ma comporterà sempre l’esposizione a una dose insolitamente elevata di potenza laser, potenzialmente causando effetti collaterali indesiderati quali photodamage.
Chiaramente, la fotoattivazione e FRAP non può distinguere se le proteine si stanno muove come monomeri, dimeri o anche piccoli oligomeri e se si muovono insieme a partner di associazione aggiuntive. Informazioni di questo tipo possono essere ottenuti invece da fluorescenza correlazione spettroscopia tecniche29 o, in alternativa, FLIM-FRET30. Ciò nonostante, FRAP e fotoattivazione costituiscono semplici approcci per valutare direttamente le dinamiche locali e globali della proteina in cellule, indipendentemente dalla proteina di interesse, posizione subcellulare o tipo di cellula ha studiato.
The authors have nothing to disclose.
Siamo grati per la Fondazione di ricerca tedesca (DFG) per il sostegno finanziario (grant Nr. RO2414/5-1 a KR).
B16-F1 mouse skin melanoma cells | American Type Culture Collection, Manassas, VA | CRL-6323 | |
NIH-3T3 cells | American Type Culture Collection, Manassas, VA | CRL-1658 | |
DMEM 4.5g/L glucose | Life Technologies, Thermno Fisher Scientific, Germany | 41965-039 | |
Ham’s F-12 medium | Sigma-Aldrich | N8641 | |
Fetal calf serum (FCS) | PAA Laboratories, Linz, Austria | A15-102 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich, Germany | F7524 | Lot054M3396 |
MEM Non essential amino acids | Gibco, ThermoFisher Scientific, Germany | 11140035 | |
L-Glumatine 200mM (100x) | Life Technolgies | 25030-024 | |
Pen-Strep 5000 U/mL | Life technologies | 15070063 | |
Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco, ThermoFisher Scientific, Germany | 11360-039 | |
Laminin | Sigma-Aldrich | L-2020 | |
Laminin coating buffer | Self-made: 50mM Tris ph7.4, 150mM NaCl | ||
Fibronectin from human plasma | Roche Diagnostics, Mannheim, Germany | 11 051 407 001 | |
Jetpei | Polyplus Transfection, Illkirch, France | 101-10N | |
JetPei buffer | Polyplus Transfection, Illkirch, France | 702-50 | 150mM NaCl |
PA-GFP-actin plasmid DNA | described in Koestler et al.2008 | ||
pEGFP-actin plasmid DNA | Clontech, Mountain View, CA, USA | ||
Rac1 protein for microinjection | Purified as GST-tagged version, and cleaved from GST prior to injection | ||
Microinjection buffer | Self-made: 100mM NaCl, 50mM Tris-HCl ph7.5, 5mM MgCl2, 1mM DTT | ||
Dextran, Texas Red, 70,000 MW, Lysine Fixable | Molecular Probes, Thermno Fisher Scientific, Germany | D1864 | |
Microscope circular cover glasses 15mm, No.1 | Karl Hecht, Aisstent, Sondheim, Germany | 1001/15 | |
Eppendorf Femtotips Microloader Tips | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5242 956 003 | |
Eppendorf Femtotip Microinjection Capillary Tips | Eppendorf, Hamburg, Germany | 930000035 | |
Silicone Grease | ACC Silicones, Bridgewater, England | SGM494 | |
Aluminium Open Diamond Bath Imaging Chamber | Warner instruments | RC-26 | |
Automatic temperature controller | Warner Instruments | TC-324B | |
Microscope: Axio Observer | Carl Zeiss, Jena, Germany | ||
CoolSnap-HQ2 camera | Photometrics, Tucson, AZ | ||
Lambda DG4 light source | Sutter Instrucment, Novato, CA | ||
Laser source | Visitron Systems | ||
Eppendorf FemtoJet microinjector | Eppendorf, Hamburg, Germany | With built-in compressor for pressure supply | |
Nikon Narishige Micromanipulator system | Nikon Instruments, Japan | ||
Visiview software v2.1.4 | Visitron Systems, Puchheim, Germany | ||
Metamorph software v7.8.10 | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
Sigma Plot v.12 | Systat Software Inc. |